consejo nacional de ciencia y tecnologia -concyt- secretaria nacional de...
TRANSCRIPT
CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -CONCYT-
SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -SENACYT-
FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -FONACYT-
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Y FARMACIA
UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA
INFORME FINAL
ESTUDIO QUÍMICO DE LOS ACEITES ESENCIALES Y METABOLITOS
SECUNDARIOS DE TRES PLANTAS DEL GÉNERO Lantana
(VERBENACEAE).
PROYECTO FODECYT No. 011-2007
JUAN FRANCISCO PÉREZ SABINO
Investigador Principal
GUATEMALA, AGOSTO DE 2011.
AGRADECIMIENTOS:
La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del
Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología, -FONACYT-, otorgado por La Secretaría
Nacional de Ciencia y Tecnología -SENACYT- y al Consejo Nacional de Ciencia y
Tecnología -CONCYT-.
Biografía académica de los autores:
Dr. Juan Francisco Pérez Sabino.
Químico graduado de la Universidad de San Carlos, MBA por ESEADE, Universidad
Francisco Marroquín y M.Sc. en Estudios Ambientales por la Universidad del Valle de
Guatemala. Es Doctor en Química de Productos Naturales, por el Núcleo de Pesquisas de
Productos Naturales de la Universidad Federal de Río de Janeiro, Brasil. Ha hecho estudios
de especialización en Química Analítica Nuclear en la Universidad de Lund, Suecia, y en
la Universidad de Viena, Austria, y de microcontaminantes orgánicos en medio ambiente
en los Laboratorios del OIEA en Seibersdorff, Austria, y en el Instituto Biológico, Sao
Paulo, Brasil. Profesor Titular de la Escuela de Química de la USAC desde 1998, actual
Director de la misma, ha impartido cursos de Química Orgánica, Análisis Instrumental y
Fisicoquímica desde 1993. Anteriormente se desempeñó como Jefe del Laboratorio de
Radiactividad Ambiental de la Dirección General de Energía Nuclear (1990-1997). Ha
participado en más de 25 proyectos de investigación relacionados con la Química
Ambiental, Radiactividad Ambiental, Química Analítica y Química de Productos
Naturales. Es Autor y Co-autor de 12 publicaciones nacionales y más de 30
internacionales.
M.A. Sully Margot Cruz Velásquez
Química Farmacéutica, Maestría Multidisciplinaria en la Producción y Uso de Plantas
Medicinales (MUPLAM) graduada de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de la
Universidad de San Carlos. Profesora a nivel Licenciatura de los cursos Farmacognosia y
Fitoquímica, profesora a nivel de posgrado de los cursos Farmacología y Toxicología,
Técnicas Instrumentales de Análisis. Se ha capacitado en técnicas instrumentales,
caracterización fitoquímica y evaluación de bioactividad de extractos vegetales,
formulación de productos cosméticos y medicinales en INETI Portugal, Universidad
Federal de Rio Grande do Sul, Universidad de Niteroi en Brasil y Centro de Investigación
de la Flora Panameña de la Universidad de Panamá. Ha participado como Coordinadora
e Investigadora en proyectos nacionales e internacionales sobre química de productos
naturales, fitocosmética, farmacología, agrotecnología, biotecnología. Autora y coautora
en doce publicaciones nacionales e internacionales.
M.Sc. Pedro Guillermo Jayes Reyes
Químico graduado de la Escuela de Química de la USAC, habiendo sido acreedor al
Premio a la mejor tesis del año por la USAC en 1996. M.Sc. en Formulación y Evaluación
de Proyectos, Faculta de Economía, USAC. Ha hecho estudios de especialización en
Ciencia y Tecnología Ambiental por la Universidad de Cádiz, y Nanotecnología en la
USAC. Es Profesional Analista e Investigador de la Unidad de Análisis Instrumental de la
Escuela de Química. Ha impartido cursos de Fisicoquímica, Gerencia y Garantía de la
Calidad y Formulación y Evaluación de Proyectos de la Escuela de Química. Ha
participado como coordinador e investigador en proyectos de investigación en el área de la
Química de Productos Naturales. Cuenta con tres publicaciones nacionales y una
internacional.
Lic. Fabiola Prado de Micheo
Química Farmacéutica, graduada de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de la
Universidad de San Carlos. Investigadora y Analista Profesional del Departamento de
Toxicología de la USAC desde 1997. Laboró de 1972 a 1996 como Investigadora y
analista en el ICAITI. Tiene especialización en Cultivo de Tejidos efectuada en el Centro
Agronómico Tropical de investigación y Enseñanza), Turrialba, Costa Rica y en Técnicas
Cromatográficas de Análisis en los Laboratorios de la Armada de los EE.UU. en Natick,
Massachussets, Estados Unidos. Ha asesorado siete tesis de graduación en la Facultad de
Ciencias Químicas y Farmacia de la USAC y tiene trece publicaciones internacionales en el
área de la Química Agrícola.
M.Sc. Bessie Oliva Hernández de Sandoval
Química graduada de la Universidad de San Carlos. Obtuvo su M.Sc. en Estudios
Ambientales en la Universidad del Valle de Guatemala. Profesora de la Escuela de
Química de la USAC desde 1998, ha impartido cursos de Química Orgánica, Análisis
Instrumental y Fisicoquímica des 1993. Realizó estudios de especialización en Análisis de
Metales Traza en el Centro de Energía Nuclear en la Agricultura (CENA), Piracicaba,
Brasil, y en la Universidad Católica del Norte, Antofagasta, Chile, y de Garantía de la
Calidad, en la Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia. Anteriormente se
desempeñó como Jefe del Laboratorio de Fluorescencia de Rayos X de la Dirección
General de Energía Nuclear (1992-1996). Ha participado en más de 25 proyectos de
investigación relacionados con la Química Ambiental, Química Analítica y Química de
Productos Naturales. Es Co-autora de 10 publicaciones nacionales y más de 20
internacionales.
M.A. Christian Daniel Farfán.
Químico graduado de la Escuela de Química de la USAC. Maestro en Uso y Producción de
Plantas Medicinales por la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de la USAC. Se ha
capacitado en Nanotecnología en la USAC y en Cristalografía Matemática en Universidad
de La Habana, Cuba. Cuenta con cinco años de experiencia en proyectos relacionados a la
Química de Productos Naturales en la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia. Se ha
desempeñado también en la docencia relacionada con Química Orgánica y Análisis
Instrumental. Es Autor de 2 publicaciones nacionales y Co-Autor de 5 publicaciones
nacionales e internacionales.
También participaron en este proyecto:
Lic. Armando Cáceres
Lic. Marco Vinicio García Sarán
Licda. Odra Babette Lara
Max Samuel Mérida Reyes
I
INDICE
ABREVIATURAS _________________________________________________ i
RESUMEN iii
SUMMARY (ABSTRACT) iv
PARTE I
I.1 INTRODUCCIÓN 1
I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 3
I.2.1 Antecedentes 3
I.2.1.1 Plantas a estudiar 3
I.2.1.2 Lantana camara 3
I.2.1.3 Lantana hispida HBK 4
I.2.1.4 Lantana trifolia L. 4
I.2.1.5 Estudios de polimorfismo de aceites esenciales de diferentes plantas 4
I.2.1.6 Estudios de actividad antimicrobiana de aceites esenciales de plantas
en América Latina 5
I.2.2 Justificación del trabajo de investigación 7
I.3 OBJETIVOS E HIPÓTESIS 8
I.3.1 Objetivos 8
I.3.1.1 General 8
I.3.1.2 Específicos 8
I.3.2 Hipótesis 9
I.4 METODOLOGÍA 9
I.4.1 Localización 9
I.4.2 Las variables 10
I.4.2.1 Variables dependientes 10
I.4.2.2 Variables independientes 10
I.4.3 Indicadores 10
I.4.3.1 Aceites esenciales 10
I.4.3.2 Metabolitos secundarios 10
I.4.4 Estrategia Metodológica 11
I.4.4.1 Población y Muestra 11
I.4.5 El Método 11
I.4.5.1 Muestreo 11
I.4.5.2 Preparación de la muestra 11
I.4.5.3 Determinación de humedad 11
I.4.5.4 Determinación de contenido de cenizas 12
I.4.5.5 Extracción de aceites esenciales por hidrodestilación con
aparato tipo Clevenger 12
I.4.5.6 Extracción de metabolitos secundarios por maceración con diclorometano
y metanol 12
I.4.5.7 Análisis cromatográfico de los aceites esenciales 12
I.4.5.8 Tamizaje fitoquímico 13
II
I.4.5.8.1 Investigación de alcaloides 13
I.4.5.8.2 Investigación de flavonoides y antocianinas 14
I.4.5.8.3 Investigación de antraquinonas 15
I.4.5.8.4 Investigación de cumarinas 15
I.4.5.8.5 Investigación de saponinas 16
I.4.5.8.6 Investigación de principios amargos 17
I.4.5.8.7 Investigación de taninos 17
I.4.5.9 Actividad biocida de metabolitos secundarios aislados
y aceites esenciales 17
I.4.5.10 Indice de refracción de aceites esenciales 17
I.4.6 La técnica estadística 17
I.4.7 Los instrumentos utilizados 18
PARTE II MARCO TEÓRICO (CONCEPTUAL)
II.1 ACEITES ESENCIALES 19
II.1.1 Biosíntesis 21
II.1.1.2 Terpenos 21
II.1.1.3 Fenilpropanoides 22
II.1.1.4 Extracción de los aceites esenciales 22
II.1.2 Polimorfismo químico 23
II.1.3 Actividad antioxidante 24
II.1.4 Actividad antioxidante de aceites esenciales 24
II.1.5 Actividad biológica de aceites esenciales 25
II.1.6. Métodos de análisis de actividad antimicrobiana 26
II.1.6.1 Métodos de difusión en agar 26
II.1.6.2 Métodos bioautográficos 26
II.1.6.3 Métodos de dilución 27
II.1.7 Bioautografía directa 27
II.1.8 Análisis de los aceites esenciales 27
II.1.8.1 Cromatografía de gases (CG) 28
II.1.8.2 Espectrometría de masas (EM) 29
II.1.8.3 Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (CG-EM) 29
II.2 FLAVONOIDES 29
II.2.1 Funciones de los flavonoides 31
II.2.2 Actividad antioxidante de los Flavonoides 31
II.2.3 Anti-carcinogénesis 32
II.2.4 Evolución de la producción de flavonoides por plantas 33
PARTE III
III.1 RESULTADOS 35
III.1.1 Colecta de plantas 35
III.1.2 Determinación del porcentaje de humedad 37
III.1.3 Aceites esenciales 37
III.1.3.1 Rendimiento 37
III.1.3.2 Composición del aceite esencial de Lantana hispida 38
III
III.1.3.3 Composición del aceite esencial de Lantana camara 39
III.1.3.4 Composición del aceite esencial de Lantana trifolia 40
III.1.3.5 Evaluación de la actividad biológica, antioxidante e índice
de refracción de los aceites esenciales de las plantas de estudio 41
III.1.3.6 Actividad biocida y antioxidante de extractos con solvente de
las plantas de estudio _________________________________________ 42
III.1.4 Tamizaje fitoquímico 43
III.1.4.1 Alcaloides 43
III.1.4.2 Flavonoides y antocianinas 44
III.1.4.3 Saponinas 44
III.1.4.4 Antraquinonas, cumarinas, principios amargos y taninos 45
III.1.5 Extracción de metabolitos secundarios por maceración con
diclorometano y metanol 47
III.2 DISCUSIÓN DE RESULTADOS 48
III.2.1 Rendimiento de extracción de aceites esenciales 48
III.2.2 Composición de los aceites esenciales de las plantas de estudio 48
III.2.3 Tamizaje Fitoquímico y extractos diclorometánicos y metanólicos 49
III.2.4 Actividad biológica, antioxidante e índice de refracción de los aceites
esenciales de las plantas de estudio ______51
III.2.5 Actividad biológica y antioxidante de los extractos de las plantas de
Estudio obtenidos con solventes _________________________________51
PARTE IV
IV.1 CONCLUSIONES 53
IV.2 RECOMENDACIONES 55
IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 56
IV.4 ANEXOS 63
IV.4.1 ANEXO 1 CROMATOGRAMAS_______________________________ 64
IV.4.2 ANEXO 2. APARIENCIAS DE LOS EXTRACTOS________________ 68
IV.4.3 ANEXO 3. Determinación de actividad antioxidante de los
extractos de las plantas de estudio.________________________________71
PARTE V
V.1 INFORME FINANCIERO 73
IV
Lista de Ilustraciones
Figura 1. Ruta del ácido mevalónico en la biosíntesis de terpenos 21
Figura 2. Ruta de la 1-desoxi-Dixilulosa-5-fosfato en la biosíntesis de terpenos 23
Figura 3. Estructura de las principales clases de flavonoides 30
Figura 4. Actividad antioxidante de extractos de plantas del género Lantana____52
Figura 5. Cromatograma del aceite esencia de Lantana camara, muestra 1 64
Figura 6. Cromatograma del aceite esencial de Lantana camara, muestra 2 64
Figura 7. Cromatograma del aceite esencial de Lantana camara, muestra 3 65
Figura 8. Cromatograma del aceite esencial de Lantana hispida, muestra 1 65
Figura 9. Cromatograma del aceite esencial de Lantana hispida, muestra 2 66
Figura 10. Cromatograma del aceite esencial de Lantana trifolia, muestra 1 66
Figura 11. Cromatograma del aceite esencial de Lantana trifolia, muestra 2 67
Figura 12. Apariencia del extracto metanólico de Lantana camara 68
Figura 13. Apariencia del extracto metanólico de Lantana hispida 68
Figura 14. Apariencia del extracto metanólico de Lantana trifolia 69
Figura 15. Apariencia del extracto diclorometánico de Lantana camara 69
Figura 16. Apariencia del extracto diclorometánico de Lantana hispida 70
Figura 17. Apariencia del extracto diclorometánico de Lantana trifolia 70
Figura 18. Fotografía de la determinación de la actividad antioxidante del
extracto etanólico del residuo de la extracción con diclorometano de
Lantana hispida.______________________________________________71
Figura 19. Fotografía de la determinación de la actividad antioxidante del
extracto diclorometánico de Lantana hispida._______________________71
Figura 20. Fotografía de la determinación de la actividad antioxidante de la
solución etanólica de BHT______________________________________72
Lista de Tablas
Tabla 1. Ubicación geográfica de los sitios de colecta de muestras 9
Tabla 2. Códigos, localización geográfica y datos de rendimiento de aceite
esencial de las muestras de las plantas de estudio colectadas 35
Tabla 3. Porcentaje de humedad 37
Tabla 4. Rendimiento de extracción de aceite esencial por especie 38
Tabla 5. Resultados del análisis de muestras de Lantana hispida por
cromatografía de gases 38
Tabla 6. Resultados del análisis de muestras de Lantana camara por
cromatografía de gases 39
Tabla 7. Resultados del análisis de muestras de Lantana trifolia por
cromatografía de gases 40
Tabla 8. Actividad biológica, antioxidante e índice refracción
de los aceites esenciales 41
Tabla 9. Actividad biocida de extractos etanólicos de las especies de
Lantana a una concentración de 1 mg de extracto/mL ________________42
Tabla 10. Actividad antioxidante de extractos de las especies de Lantana
estudiadas y del antioxidante artificial BHT, expresada como IC50_______42
Tabla 11. Presencia de alcaloides en las plantas Lantana camara L.,
Lantana hispida HBK y Lantana trifolia L. 43
V
Tabla 12. Detección de alcaloides por CCF 43
Tabla 13. Detección de flavonoides y antocianinas por CCF 44
Tabla 14. Detección de saponinas mediante la prueba de espuma 44
Tabla 15. Detección de saponinas por CCF 44
Tabla 16. Presencia de antraquinonas 45
Tabla 17. Presencia de cumarinas 45
Tabla 18. Cromatografía en capa fina cumarinas 45
Tabla 19. Presencia de principios amargos en cromatografía en capa fina 46
Tabla 20. Presencia de taninos 46
Tabla 21. Extractos metanólicos 47
Tabla 22. Extractos diclorometánicos 47
i
ABREVIATURAS
% por ciento
µL microlitro
ATP adenosin trifosfato
BHA butil-hidroxianisol
BHT butilhidroxitolueno
C carbono
CCF cromatografía de capa fina
CE50 concentración eficiente
CG cromatografía de gases
CG-EM cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas
CG-IRTF cromatografia de gases acoplada a espectroscopía de infrarrojo com
transformada de Fourier
CI50 concentración inhibitoria
CIM concentración inhibitoria mínima
d.i. diámetro interno
DMAPP γ,γ-dimetilalilpirofosfato
DMSO dimetilsulfóxido
DPPH difenil picrilhidrazina
EM espectrometría de masas
ERN especies reactivas del nitrógeno
ERO especies reactivas del oxígeno
FAB bombardeo con átomos rápidos
FPP farnesil difosfato
g gramo
GGPP geranilgeranilo difosfato
GP galato de propilo
GPP geranil difosfato
h hora
IE impacto electrónico
IPP isopentenilpirofosfato
IQ ionización química
m/z masa/carga
Mg miligramo
mg/mL miligramos por mililitro
min minuto
mL mililitro
mm milímetro
msnm metros sobre el nivel del mar
N normal
nm nanómetro
ºC grado celsius
p/v peso volumen
Rf factor de retención
ii
RMN Resonancia Magnética Nuclear
TBHQ terc-butil-hidroxiquinona
THBP trihidroxibutilfenona
UV ultravioleta
VIS visible
w/d.w. peso sobre peso seco
iii
RESUMEN:
Las plantas estudiadas pertenecen al género Lantana, de la (Verbenaceae). Esta familia se
caracteriza por contar con varios géneros que presentan rendimientos interesantes de
aceite esencial, como el caso del género Lippia, que ha sido estudiado en Guatemala. Se
evaluaron los metabolitos secundarios y el rendimiento y composición de aceite esencial
de tres especies del género Lantana, Lantana camara L., Lantana hispida HBK y
Lantana trifolia L., las cuales se colectaron en siete localidades de Guatemala de forma
bimensual entre mayo 2008 y mayo 2009. Las localidades fueron: Escuintla, Retalhuleu,
Quetzaltenango, El Progreso, Zacapa, Alta Verapaz e Izabal. Estas plantas son nativas y
son utilizadas en la medicina popular. Actualmente existe información obtenida en otros
países, sobre la composición química de una de las plantas propuestas (L. camara), sin
embargo, dicha información no puede considerarse válida para Guatemala, en vista que las
variaciones en el clima generan diferenciación en los metabolitos secundarios producidos.
Los aceites esenciales fueron extraídos a partir de material vegetal seco por medio de
hidrodestilación, utilizando un aparato tipo Clevenger, obteniéndose rendimientos entre
0.03 y 0.65% (w/d.w.). La especie que presentó el mayor rendimiento de aceite esencial
fue L. hispida (0.38%). Los rendimientos para las otras dos plantas fueron 0.18% para L.
camara y 0.17% para L. trifolia. La composición de los aceites fue analizada por
cromatografía de gases, encontrándose compuestos comunes a los aceites esenciales de
plantas de la Familia Verbenaceae, como -cariofileno y germacreno D. El aceite esencial
de L. trifolia presentó entres los componentes principales metileugenol, lo cual sugiere
una mayor factibilidad de aplicación económica. La finalidad de la investigación consistía
en evaluar la actividad biocida y antioxidante de los aceites esenciales aislados de los
especímenes colectados. Ninguno de los aceites presentó actividad biológica frente a las
bacterias Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella typhi ATCC 14028 y Staphylococcus
aureus ATCC 25923, mientras que los aceites de L. camara y L. hispida no presentaron
actividad antioxidante significativa por el método del DPPH. Se realizó el tamizaje
fitoquímico por medio de pruebas a nivel macro y en cromatografía en capa fina, de siete
familias de metabolitos secundarios confirmándose la presencia de flavonoides, saponinas
y alcaloides en todas las muestras pero no de cumarinas, principios amargos,
antraquinonas y taninos. La recomendación más importante al considerar los resultados de
la investigación es la de realizar experimentos de domesticación de L. hispida y L.
trifolia., para evaluar rendimientos y composición de los aceites esenciales en condiciones
controladas. También se considera de utilidad caracterizar los alcaloides presentes en las
tres plantas al igual que hacer pruebas biológicas con Bacillus subtilis, Pseudomona
aeruginosa, Sarcina lutea, Candida albicans y los hongos Aspergillus Níger y A.
fumigatus.
iv
SUMMARY (ABSTRACT)
The plants that were studied are found in the Lantana genus (Verbenaceae). This family is
characteristic for having various genus with interesting yields of essential oils, such as in
the case of the Lippia genus, which has been studied in Guatemala. The yield and
composition of the essential oils as well as the presence of secondary metabolites were
analyzed in three species of the Lantana genus: Lantana camara L, Lantana hispida HBK
and Lantana trifolia L. The samples were collected every two months in seven different
locations between May 2008 and May 2009. The locations were: Escuintla, Retalhuleu,
Quetzaltenango, El Progreso, Zacapa, Alta Verapaz and Izabal. These are native plants
and are used in traditional medicine. There is some information regarding the chemical
composition of one of these plants (L. camara). Nevertheless, such information cannot be
generalized to include those found in Guatemala since different environments cause
different productions of secondary metabolites. Hydrodistillation was used to extract the
essential oils with a Clevenger type apparatus. The yields obtained ranged between 0.03
and 0.65% (w/d.w.). The species with the highest yields was L. hispida (0.38%). The
yields of the other two plants were 0.18% for L. camara and 0.17% for L. trifolia. The
composition of the oils was determined using gas chromatography. The compounds found
are common to the Verbenaceae family such as -caryophellene and germacrene D. The
essential oil of L. trifolia showed a significant presence of methyleugenol, which suggest
the plausibility of economical significance. Ultimately, the investigation sought to
establish the biological and antioxidant activity of the essential oils isolated from the
plants. None of the essential oils showed any biological activity on the microorganisms
used for the bioassays: Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella typhi ATCC 14028 and
Staphylococcus aureus ATCC 25923. The essential oils of L. camara and L. hispida did
not show any significant antioxidant activity (DPPH method). Phytochemical screening
was performed in order to establish the presence or absence of 7 families of secondary
metabolites; TLC assays were also used. Flavonoids, saponines and alkaloids were found
in all three species, but no presence of coumarins, bitter principles, antraquinones or
tannins was detected. The most important recommendation that should be considered
according to the results obtained is to perform domestication experiments of L. hispida
and L. trifolia. That would allow to measure yields and chemical compositions of the
essential oils of plants raised in a controlled environment. It would also be
recommendable to characterize the alkaloids detected in the three plants and to perform
bioassays with Bacillus subtilis, Pseudomona aeruginosa, Sarcina lutea, Candida
albicans and the fungi Aspergillus Níger and A. fumigatus.
1
PARTE I
I.1 INTRODUCCIÓN
Las especies del género Lantana estudiadas, Lantana camara L., Lantana hispida
HBK y Lantana trifolia L., son plantas nativas de importancia apícola y ornamental, que
se utilizan en medicina popular en afecciones gastrointestinales, dérmicas y reumáticas
(Stevens, W. 2001; Márquez, et al., 1999). L. camara se encuentra desde el nivel del mar
hasta los 2200 msnm, en los departamentos de Alta Verapaz, Baja Verapaz,
Chimaltenango, Escuintla, Guatemala, Huehuetenango, Izabal, Jalapa, Petén,
Quetzaltenango, Retalhuleu, Sacatepéquez, San Marcos, Santa Rosa, Sololá y Zacapa.
L. hispida presenta dos formas más diversas, una con hojas oblongas-lanceoladas,
escabrosas a hispidulosas, que se encuentra entre 1300 y 2700 msnm y otra que presenta
hojas ovales anchas, siempre velutinosas-tomentulosas y que crece entre 600 y 1900
msnm. L. trifolia se encuentra normalmente en matorrales húmedos y en bosques de pino,
desde el nivel del mar hasta los 1200 msnm, en Alta Verapaz, Guatemala, Izabal (tipo Los
Amates), Petén, El Quiché (Standley, P. Steyermark, 1970).
Previamente se había obtenido información sobre la composición química de una
de las plantas estudiadas, L. camara (Ross, 1999), sin embargo, dicha información no
puede considerarse válida para Guatemala, en vista que las variaciones climáticas,
edáficas, latitudinales y ontológicas generan diferenciación en los metabolitos secundarios
producidos. En Guatemala se ha determinado únicamente la actividad biocida de L.
camara y L. hispida, a nivel de extractos (Cáceres et al., 1990), en cambio de L. trifolia,
no se encontró información en la revisión de literatura efectuada. En cuanto al contenido
de aceites esenciales, en estudios previos se ha encontrado que las diferencias climáticas y
edáficas, pueden causar polimorfismo químico intraespecífico (Pereira et al, 2000; Pereira
et al., 2003), por lo que en este estudio se colectaron individuos de la misma especies en
diferentes localidades. Anteriormente no se había realizado ningún estudio a nivel
químico de estas tres especies en Guatemala, y es debido a ello que se realizó esta
investigación de los aceites esenciales y metabolitos secundarios más importantes
presentes en estas plantas con el objetivo de generar información que permita validar el
conocimiento popular de la flora nativa. Esta información servirá para el desarrollo de
investigaciones futuras con un grado de especificidad mayor acerca de otros componentes
de las plantas; y a la vez se espera que contribuya a propiciar el desarrollo económico de
diferentes regiones en Guatemala, a partir del aprovechamiento de las plantas de estudio,
que podría generar mayores oportunidades de trabajo y a su vez llegar a mejorar la
calidad de vida de sus habitantes.
Sin lugar a dudas, L. camara es la especie que se encuentra presente sobre una
mayor extensión del territorio nacional. Sin embargo, las poblaciones ubicadas en el
occidente del país, sobre todo en el área de Quetzaltenango, cuentan con los especímenes
de mayor tamaño y por lo tanto mayor biomasa. Esto las provee de especial interés y
utilidad industrial en el caso de determinarse alguna utilidad para esta especie. Por su
parte, L. hispida y L. trifolia se encuentran distribuidos sobre una extensión mucho menor
de terreno y han presentado menor capacidad de adaptabilidad al estrés de origen
antropogénico por lo que varias de las poblaciones reportadas por Standley y Steyermark
2
(1970) ya no existen. La determinación de utilidades específicas para ambas especies
puede contribuir a su conservación al existir un valor económico por su supervivencia.
La composición de los aceites esenciales para las tres especies estudiadas indicó
presencia de compuestos químicos característicos de la Familia Verbenaceae. Un aspecto
importante en cuanto al contenido de aceite esencial de las plantas de estudio, es que se
encontró que los rendimientos de extracción a partir de las muestras de L. camara y L.
trifolia fueron menores a los de L. hispida. Aún así, es L. trifolia la que presenta mayor
potencial para su aprovechamiento, ya que cuenta con una alta concentración de
metileugenol.
Otros datos obtenidos de los análisis químicos de las plantas estudiadas indican
que las tres contienen alcaloides, flavonoides y saponinas. Los flavonoides son de
particular interés debido a su aplicabilidad como antioxidantes en la industria cosmética y
de alimentos. Por su parte, las saponinas presentes en las plantas podrían ocasionar
dificultades para la extracción del aceite esencial utilizando la técnica de hidrodestilación.
Este problema no se observó en las diferentes extracciones realizadas a las muestras por lo
que su concentración podría ser lo suficientemente baja para no ocasionar dicha dificultad,
al menos a escala de laboratorio. No se encontró presencia de cumarinas, principios
amargos, antraquinonas y taninos en las hojas de las tres especies.
No se encontró actividad biocida a partir de los extractos analizados. Estos
resultados deben ser interpretados de acuerdo a las metodologías utilizadas. La ausencia
de actividad biocida es específica para Escherichia coli, Salmonella typhi y
Staphylococcus aureus (todas ATCC), por lo que cabe la posibilidad que los extractos
presenten actividad ante otros microorganismos patógenos. De igual manera, la actividad
antioxidante determinada por el método del DPPH, resultó negativa. La misma prueba de
actividad pero con otras metodologías podría arrojar resultados diferentes.
3
I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
I.2.1 Antecedentes en Guatemala
I.2.1.1 Plantas a estudiar:
Las plantas estudiadas pertenecen al género Lantana, de la Familia Verbenaceae. La
Familia Verbenaceae se caracteriza por contar con varios géneros que presentan
rendimientos interesantes de aceite esencial, como el caso del género Lippia, que ha sido
estudiado en Guatemala. A continuación, se describen las plantas estudiadas en el
presente trabajo, de las cuales no se contaba con información fitoquímica básica en
Guatemala.
I.2.1.2 Lantana camara
Conocida también como cinco negritos. Arbusto de 1 a 3 m de altura, de tallo
espinoso, flores amarillas, anaranjadas o rojas en forma de pequeños manojos. Los frutos
son bayas de color azul verdoso o negro, de sabor dulce. Sus hojas pueden ser
redondeadas o alargadas, ásperas o rugosas por el haz y con pelillos por el envés. La
planta es originaria de América tropical, habita en los climas cálidos, semicálido,
semiseco, desde el nivel del mar hasta los 1000 m y de los 2300 a los 3000 msnm.
Presenta diferentes usos etnomédicos, siendo usado en El Salvador como antipirético, a
partir de la cocción de flores y hojas con agua. Los frutos son tóxicos por contener
lantadeno, un sesquiterpenoide. En Colombia, se usa la planta entera en forma de cocción
para facilitar el parto y como emenagogo. En Guatemala se le atribuyen propiedades
curativas de heridas, úlceras y contusiones e infecciones de la piel. Se reporta también su
uso en afecciones respiratorias como catarro y tos ferina, se usan solo las ramas en
cocimiento. En Guatemala se encuentra desde nivel del mar hasta los 2,200 metros sobre
el nivel del mar. Se reporta en Alta Verapaz, BajaVerapaz, Chimaltenango, Escuintla,
Guatemala, Huehuetenango, Izabal, Jalapa, Petén, Quetzaltenango, Retalhuleu,
Sacatepéquez, San Marcos, Santa Rosa, Sololá, Zacapa (Standley, P. Steyermark, 1970)
En cuanto a su composición química, se ha reportado el triterpenoide lantadeno A
como principio tóxico, asimismo se ha reportado la presencia de a-amarina, lantamarona,
lantadeno B, C, y D; ácidos lantanílico, lantanólico y lantoico, oleanólico, verbascósido,
ácidos botulínicos y butulónico, -sitosterol, furanonaftaquinonas. Presenta aceite esencial, especialmente en las flores.
Se ha encontrado actividad antibiótica por las hojas y el aceite esencial sobre
Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Pseudomona aeruginosa, Sarcina lutea,
Salmonella typhi y los hongos Aspergillus Níger y A. fumigatus. El extracto etanólico de
las ramas de la planta presentó efecto antibióticos contra Staphylococcus aureus, Bacillus
subtilis, y Streptococcus faecalis, habiendo resistencia en cuanto a Eschericchia coli y
Candida albicans.
Es planta tóxica para el ganado. Se ha reportado actividad antimicrobiana de los
extractos brutos de sus hojas (Cáceres et al., 1990). Se ha reportado también hojas
4
presentan usos etnobotánicos para enfermedades gastrointestinales, del tracto respiratorio
y enfermedades de piel y mucosas (Cáceres et al., 1990 a)
I.2.1.3 Lantana hispida HBK
Arbustos erectos, de 1-2 m de altura con ramas puberulentas a hispidas, hojas
usualmente opuestas, raramente verticiladas, raramente subsésiles ovales u oblongas
lanceoladas, de 1-9 cm de longitud (principalmente de 2-5 cm) brácteas lanceovaladas,
corola blanca, crema, púrpura, o levemente rosadas. Frutos púrpura-negros, jugosos.
La planta crece en bosques de roble, pino-roble, o de pino, ocasionalmente en
colinas secas y rocosas, entre los 300 y los 2700 msnm. Las dos formas más diversas de
esta especie compleja son las plantas con hojas, oblongas-lanceoladas, escabrosas a
hispidulosas (1300-2700 msnm) y las que presentan hojas ovales anchas, siempre
velutinosas-tormentulosas (600-1900msnm). (Standley, P. Steyermark, 1970). Cáceres
reporta que los extractos brutos presentan actividad contra levaduras (Cáceres et al., 1990)
y que sus hojas presentan usos etnobotánicos para enfermedades gastrointestinales, y
enfermedades de piel y mucosas (Cáceres et al., 1990 a)
I.2.1.4 Lantana trifolia L.
Se le encuentra normalmente en matorrales húmedos, en bosques de pino, raramente
en terrenos claros. Crece desde el nivel del mar hasta los 1200 msnm, en Alta Verapaz,
Guatemala, Izabal (tipo Los Amates), Petén, El Quiché. Son arbustos erectos de hasta tres
metros de altura, trocos pilosos, hojas usualmente con pecíolo corto, lanceoladas u
oblongo-lanceoladas, agudas o atenuadas en la base. Las inflorescencias de 5 cm de largo,
densamente floreadas, pedunculadas, brácteas verdes, corola usualmente rosa, lila o
púrpura, raramente blanca. Es una planta común en muchos lugares de América Central,
a menudo en bosques secundarios (Standley, P. Steyermark, 1970). No se encontró
información en la literatura sobre estudios realizados acerca de esta planta.
I.2.1.5 Estudios de polimormismo de aceites esenciales de diferentes plantas
El polimorfismo químico ha sido estudiado en especies de diferentes regiones
geográficas. La composición química de los aceites esenciales de Lippia alba de 15
diferentes regiones de Colombia fue analizada por CG-EM y por Análisis de
Componentes Principales (ACP). Se encontraron tres quimiotipos, siendo estos: a)
carvona (41 %), b) citral (55 %); c) híbrido (carvona: 25 %; limoneno: 22 % y citral: 21
%). Más del 60 % de la variación fue representada en los dos primeros componentes
principales (Durán et al., 2007).
Poli et al. (1997) realizaron un estudio comparativo de los aceites esenciales de
Santolina insularis y Santolina corsica. Las dos especies se encuentran en Sardeña, Italia,
siendo utilizadas indistintamente por la medicina tradicional en la isla. El análisis de los
aceites esenciales por CG-EM mostró diferencias cualitativas y cuantitativas siendo
algunos componentes identificados en ambas especies, mientras que otros fueron
característicos de una sola especie, como felandreno, -3-careno y -terpineno para S.
5
insularis.
La composición del aceite esencial de 11 poblaciones de Thymus carnosus y su
variabilidad fue estudiada por CG, CG-EM y RMN-13
C, y análisis multivariado de
conglomerados. Tres muestras de Extremadura (España) fueron caracterizadas por su alto
contenido de linalol (9.5-25.5 %). Los primeros tres componentes principales explicaron
83.8 % de la variancia total. Se obtuvo tres conglomerados. I: alto contenido de borneol,
hidrato de cis-sabineno y terpinen-4-ol (54.2 % de las muestras); II: linalol, borneol e
hidrato de trans-sabineno (9.6 %); III: borneol y canfeno (36.2 %) (Salgueiro et al., 1995).
En un estudio del polimorfismo químico en aceites esenciales de Thymus
caespetitius de las Islas Corvo, Flores, São Miguel y Terceira (Açores), en Portugal, se
analizó la composición de los aceites esenciales de 24 poblaciones analizada por CG y
CG-EM. Se encontraron tres conglomerados principales: carvacrol (41-65%), timol (35-
51 %) y -terpineol (33-37 %). Según los autores, el polimorfismo químico puede deberse
a la variabilidad genética o a la influencia de factores edáficos (Santos et al., 2005).
Pereira et al. (2000) investigaron el polimorfismo químico de los aceites esenciales
de Thymus caespetitius en la isla San Jorge (Açores). En el estudio, los autores extrajeron
el aceite esencial por hidrodestilación utilizando un aparato Clevenger para determinar el
rendimiento del aceite y por extracción-destilación con aparato Likens-Nickerson, para
determinar la composición del aceite esencial por CG-EM. Así, se analizaron los aceites
esenciales de diez poblaciones de Thymus caespetitius habiéndose encontrado que la
relación enantiomérica de sabineno y -terpineol varía con la localidad de colecta (Pereira et al., 2000).
En otro estudio se investigó la influencia de los factores ambientales sobre el
polimorfismo químico de los aceites esenciales de Lychnophora ericoides en dos
poblaciones de la planta en el Cerrado brasileño. Se colectaron hojas de la planta en
intervalos de 2 meses durante un año y estas fueron analizadas por CG-EM y ACP. Dos
grupos de aceites esenciales fueron distinguidos en relación con el local de colecta y
composición, siendo estos: Conglomerado I: correspondientes a la localalidad Vianópolis,
con alto porcentaje de -bisabolol (45-76 %) y -cadinol (11-24 %). Conglomerado II:
correspondiente a la localidad Cristalina, con alto contenido de (E)-nerolidol (31-47 %) y
ar-dihidro-turmerona (5-15 %). La quimiovariación encontrada parece deberse a factores
ambientales y a características del suelo (Curado et al., 2006).
I.2.1.6 Estudios de atividad antimicrobiana de aceites esenciales de plantas en
América Latina
Diferentes estudios de actividad antimicrobiana han sido realizados en aceites
esenciales de plantas de América Latina, especialmente del género Lippia, Familia
Verbenaceae. En un estudio en Brasil, el aceite de L. origanoides tipo carvacrol presentó
mayor actividad que el antibiótico Amphotericina B contra los hongos Candida albicans
Serotipo B ATCC 36802, Candida albicans, Candida guilliermondii, Candida
parapsilosis, y mayor actividad que el antibiótico Vancomicina contra las bacterias
6
Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus aureus MRSA (BMB9393),
Lactobacillus casei ATTC 4646 y Streptococcus mutans ATCC 25175 (Oliveira et al.,
2007).
El aceite esencial de L. graveolens de dos poblaciones de Guatemala fue evaluado
contra diferentes microorganismos. Los aceites, tipo carvacrol y timol, presentaron
actividad contra varios microorganismos, entre ellos Escherichia coli, Staphylococcus
aureus, Staphylococcus epidermis, Streptococcus faecalis, Proteus vulgaris, Candida
albicans, Clodosporium cladosporioides, Apergillus niger, encontrándose que el tipo
carvacrol presentó la mayor actividad (Salgueiro et al., 2003).
En otro estudio, L. alba f. Intermedia y L. alba presentaron actividad antimicrobiana
contra diferentes bacterias y hongos por el método de difusión en agar (Oliveira et al.,
2006). El aceite de L. alba f. Intermedia presentó mayor actividad que la anfotericina
contra los hongos Candida albicans Serotipo B ATCC 36802, Candida guilliermondii,
Trichophytum rubrum T544, y que vancomicina contra las bacterias Staphylococcus
aureus MRSA (BMB9393), Lactobacillus casei ATTC 4646 y Streptococcus mutans
ATCC 25175. El aceite de L. alba presentó mayor actividad que los antibióticos contra
los hongos Candida albicans Serotipo B ATCC 36802, Candida albicans, Candida
guilliermondii, Trichophytum rubrum T544, y que vancomicina contra las bacterias
Staphylococcus aureus ATCC 25923, Lactobacillus casei ATTC 4646 y Streptococcus
mutans ATCC 25175. Otro quimiotipo de L. alba había presentado previamente,
actividad contra C. albicans, con una CIM de 0.6 mg/mL, siendo un aceite que presentó
un rendimiento de 0.1 % y linalol como componente principal (76.3 %) seguido por cineol
(2.34 %) (Duarte et al., 2005).
En un estudio reciente, el aceite esencial de Lippia sidoides presentó timol (56.67 %)
y carvacrol (16.73 %) como componentes principales, seguidos por p-cimeno (7.13 %),
timol metil éter (5.06 %) y aromadendreno (2.79 %). El método de difusión del disco fue
utilizado para evaluar la actividad antimicrobiana, mostrando 10 L de una solución de
217.5 mg/L, inhibición del crecimiento para Streptococus mutans (d.i. 18.7 mm contra
20.0 mm de vancomicina), Streptococcus mitis (d.i. 10.0 mm contra 17.0 mm de
vancomicina), Streptococcus salivarius (d.i. 8.5 mm contra 22.7 mm de vancomicina),
Streptococcus sanguis (d.i. 12 mm contra 16 mm de vancomicina) y Candida albicans (34
mm contra 27.2 mm de cetoconazol) (Botelho et al., 2007a). La actividad contra estos
microorganismos orales fue confirmada por la prevención del gel de L. sidoides (0.5%
volumen/masa) contra la absorción del hueso alveolar en periodontitis experimental en
ratones (Botelho et al., 2007b). Es interesante mencionar que una muestra del aceite
esencial de L. sidoides con timol (59.65 %) y (E)-cariofileno (10.60 %) como
componentes principales también presentó actividad antihelmíntica contra el nematoide
Haemochus contortus en ensayos con ratones (Camurça-Vasconcelos et al., 2007). El
aceite esencial de L. sidoides de Ceará también ha presentado actividad larvicida contra
Aedes aegypti (Carvalho et al., 2003).
7
I.2.2 Justificación del trabajo de investigación
Las plantas estudiadas en la presente investigación pertenecen a la familia
Verbenaceae, género Lantana, siendo las especies Lantana camara L., Lantana hispida
HBK y Lantana trifolia L. Estas plantas son nativas de Guatemala y son utilizadas en la
medicina popular. Actualmente existe información obtenida en otros países, sobre la
composición química de una de las plantas propuestas (L. camara), sin embargo, dicha
información no puede considerarse válida para Guatemala, en vista que las variaciones en
el clima generan diferenciación en los metabolitos secundarios producidos. En Guatemala
se ha determinado únicamente la actividad biocida de dos de las plantas a estudiar (L.
camara y L. hispida), a nivel de extractos, por lo cual no se tiene conocimiento sobre que
metabolito o grupo de metabolitos son los responsables de esa actividad, lo cual no
permite la generación de valor agregado para estas plantas. De la tercera planta, L.
trifolia, no se encontró información en la literatura sobre estudios sobre su composición
química.
Es debido a ello que se justificó la realización de esta investigación; el contar con
información química respecto a los aceites esenciales y los grupos de metabolitos
secundarios más importantes presentes en estas plantas, servirá para el desarrollo de
investigaciones futuras con un grado de especificidad mayor acerca de otros componentes
de las plantas. Así mismo, se espera que contribuya al desarrollo económico de diferentes
regiones en Guatemala, a partir del aprovechamiento económico de las plantas de estudio,
que podría generar mayores oportunidades de mejoramiento del ingreso económico y a su
vez contribuir al mejoramiento de la calidad de vida de sus habitantes. Por otra parte,
también se contribuye a los objetivos de la Escuela de Química y del Laboratorio de
Investigación de Productos Naturales –LIPRONAT- en la obtención de información útil
en relación con L.camara L., L.hispida HBK y L.trifolia L., siendo esta última investigada
por primera vez en Guatemala a nivel químico.
8
I.3 OBJETIVOS E HIPOTESIS
I.3.1 Objetivos
I.3.1.1 General
Evaluar la actividad biocida y antioxidante de los aceites esenciales y metabolitos
secundarios aislados de Lantana camara L., Lantana hispida HBK y Lantana trifolia L.,
de la Familia Verbenaceae, de diferentes regiones de Guatemala.
I.3.1.2 Específicos
I.3.1.2.1 Determinar la composición química de los aceites esenciales de Lantana camara
L., Lantana hispida HBK y Lantana trifolia L.
I.3.1.2.2 Determinar las variaciones estacionales en el rendimiento de extracción de
aceites esenciales de las plantas nativas estudiadas.
I.3.1.2.3 Determinar las diferencias en el rendimiento y la composición química de los
aceites esenciales obtenidos por los métodos de hidrodestilación con aparato tipo
Clevenger y por extracción-destilación con aparato Likens-Nickerson.
I.3.1.2.4 Establecer los posibles usos del aceite esencial de las plantas nativas estudiadas,
con base en su composición química.
I.3.1.2.5 Determinar la actividad biocida de los aceites esenciales y metabolitos
secundarios aislados de Lantana camara L., Lantana hispida HBK y Lantana trifolia L.,
usando la metodología de bioautografía.
I.3.1.2.6 Determinar la actividad antioxidante de los aceites esenciales y metabolitos
secundarios aislados de Lantana camara L., Lantana hispida HBK y Lantana trifolia L.
I.3.1.2.7 Establecer las procedencias de Lantana camara L., Lantana hispida HBK y
Lantana trifolia L. con mejores rendimientos cualitativos.
I.3.1.2.8 Desarrollar metodología de aislamiento y análisis que permita la determinación
rápida y confiable de los componentes de aceites esenciales y metabolitos secundarios.
I.3.1.2.9 Evaluar los métodos de extracción de metabolitos secundarios por maceración en
etanol y por extracción por ultrasonido.
1.3.1.2.10 Caracterizar los aceites esenciales de Lantana camara L., Lantana hispida
HBK y Lantana trifolia L. por su índice de refracción.
9
I.3.2 Hipótesis
Las tres plantas sujetas a estudio, Lantana camara L., Lantana hispida HBK y Lantana
trifolia L., presentan aceites esenciales y metabolitos secundarios con actividad biocida y
antioxidante.
I.4 METODOLOGIA (Descripción detallada de la Metodología)
I.4.1 Localización
El área de colecta de las plantas se localiza en los departamentos de Escuintla,
Retalhuleu, Quetzaltenango, El Progreso, Zacapa, Alta Verapaz e Izabal (Tabla 1), en los
cuales se realizó una búsqueda de acuerdo con la información provista por la Flora de
Guatemala y de acuerdo al cuadro siguiente, en cuanto a la localización de las plantas en
el país.
Tabla 1. Ubicación geográfica de los sitios de colecta de muestras.
Nombre Científico Lugar Coordenadas
Geográficas
Altitud
(msnm)
Lantana hispida L. San Vicente Pacaya,
Escuintla
N 14º 23. 452´
WO 90º 35. 897´
2,290
Lantana hispida L.
San Cristóbal
Acasuaguastlán, El Progreso
N 14º 55.305´
WO 89º 56.413´
278
Lantana hispida L. San Cristóbal
Acasuaguastlán, El Progreso
N 14º 55.341´
WO 89º 56. 480´
296
Lantana hispida L. San José, Teculután, Zacapa N 14º 59.043´
WO 89º 41.677´
248
Lantana hispida L. San José, Teculután, Zacapa N 14º 59.002´
WO 89º 41. 704´
232
Lantana hispida L. El Chico, Usumatlán, Zacapa
N 15º 01.141´
WO 89º 50. 528´
999
Lantana hispida L.
Chorjalé, Cabricán,
Quetzaltenango
N 15º 05.646´
WO 91º 40.838´
2,472
Lantana hispida L.
La Grandeza, Cabricán,
Quetzaltenango
N 15º 06.184´
WO 91º 41.296´
2,462
Lantana camara L. Zunil, Quetzaltenango N 14º 46.748´
WO 91º 29.791´
2,085
Lantana camara L. Zunil, Quetzaltenango N 14º 46.393´
WO 91º 30.098´
1,989
Lantana camara L.
La Calera, Zunil,
Quetzaltenango
N 14º 46.472´
WO 91º 30.096´
2,010
Lantana camara L.
La Calera, Zunil,
Quetzaltenango
N 14º 46.480´
WO 91º 30.091´
2,010
10
Lantana camara L. San Felipe, Retalhuleu
N 14º 37.373´
WO 91º 35.771´
620
Lantana trifolia L. Santa Inés, Los Amates,
Izabal
N 15º 13.788´
WO 89º 07.575´
103
Lantana trifolia L. Santa Inés, Los Amates,
Izabal
N 15º 13.759´
WO 89º 07.623´
103
Lantana trifolia L. Santa Inés, Los Amates,
Izabal
N 15º 13.018´
WO 89º 09.253´
93
Lantana trifolia L. Santa Inés, Los Amates,
Izabal
N 15º 13.144´
WO 89º 08.941´
100
Lantana trifolia L. Santa Inés, Los Amates,
Izabal
N 15º 13.323´
WO 89º 08.570´
105
Lantana trifolia L. Santa Inés, Los Amates,
Izabal
N 15º 13.144´
WO 89º 08.941´
100
Lantana trifolia L. Lachuá, Alta Verapaz N 15º 56.038´
WO 89º 30.601´
165
Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007
I.4.2 Las Variables
I.4.2.1 Variables dependientes
Rendimiento de los aceites esenciales (% p/p) y porcentaje de los componentes de los
aceites esenciales de las plantas de estudio (% área cromatográfica).
Metabolitos secundarios de las plantas de estudio (cualitativo).
I.4.2.2 Variables independientes
Especies de estudio (Lantana camara, Lantana hispida y Lantana trifolia)
Localidades de colecta de las plantas de estudio.
I.4.3 Indicadores
Los indicadores fisicoquímicos que permiten evaluar los objetivos de la presente
investigación son los siguientes:
1.4.3.1 Aceites esenciales
Porcentajes de rendimiento de extracción de aceites esenciales.
Porcentajes de componentes de aceites esenciales analizados por cromatografía de gases.
1.4.3.2 Metabolitos secundarios
Presencia de metabolitos secundarios analizados por tamizaje fitioquímico:
flavonoides, cumarinas, alcaloides, saponinas, antocianinas, antraquinonas, princípios
amargos y taninos.
11
I.4.4 Estrategia Metodológica
I.4.4.1 Población y Muestra
La población está constituida por las poblaciones de las plantas L. camara, L.
hispida y L. trifolia en los departamentos de Escuintla, Retalhuleu, Quetzaltenango, El
Progreso, Zacapa, Alta Verapaz e Izabal. La muestra corresponde a los especimenes
colectados en las poblaciones localizadas, de acuerdo con la información que se presenta
en la Tabla 1 en la sección de Resultados.
I.4.5 El Método
I.4.5.1 Muestreo
Con base en la información de la Flora Guatemalteca, se realizaron viajes de campo
para la localización de las especies a estudiar. En la Tabla 1 se presentan los lugares en
que se localizó y colectó material vegetal correspondiente a las tres especies de estudio.
Se colectaron dos ejemplares de cada especie para herborizar, depositándose una en el
herbario de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia. A cada muestra le fue asignado
un código, con ocho letras abreviando el nombre científico de la especies, seguido de
punto y cuatro letras abreviando el lugar de colecta, seguido del número asignado a la
población de colecta en el lugar seguido de punto y dos cifras correspondientes al
ejemplar. Las coordenadas geográficas de los lugares de colecta se registraron utilizando
un sistema de posicionamiento geográfico (GPS) para referenciar el lugar.
En vista que en varias localidades el material era muy escaso, el tamaño de la
muestra varió entre 100 g y 1000 g de material húmedo. El material vegetal colectado fue
transportado a la ciudad de Guatemala para su procesamiento, en el Laboratorio de
Investigación de Productos Naturales (LIPRONAT) de la Facultad de Ciencias Químicas y
Farmacia.
I.4.5.2 Preparación de la muestra
Las hojas y los troncos suaves del material vegetal fueron separados, descartándose
el material sobrante. El material vegetal fue mezclado y secado a temperatura ambiente,
dejando una fracción de 25.0 g para determinaciones de humedad. Dos ejemplares de
cada especie fueron herborizados para depositar en herbario. Cada muestra fue dividida en
tres submuestras de masa aproximadamente igual masa. A partir de cada submuestra se
realizaron las determinaciones que se describen en las siguientes secciones.
I.4.5.3. Determinación de humedad
10.0 g de material vegetal recién cortado (submuestra 1) fueron pesados, colocados
en una cápsula de porcelana e introducidos en el horno de convección y a 95ºC por 20 h.
Luego de transcurridas las 20 h, la muestra fue pesada en balanza analítica, determinando
el contenido de humedad por diferencia con el peso original.
12
I.4.5.4 Determinación de contenido de cenizas
4.0 g de material vegetal húmedo fueron pesados con exactitud en un crisol de
porcelana. Luego, la muestra fue calcinada en una mufla a 550 oC por 14 h, o hasta
obtener cenizas blancas. El crisol conteniendo las cenizas fue pesado en balanza analítica
luego de la calcinación El contenido de cenizas fue calculado por la diferencia de peso del
crisol con material vegetal y con las cenizas.
I.4.5.5. Extracción de aceites esenciales por hidrodestilación con aparato tipo Clevenger
Se pesaron entre 10.0 y 25.0 g de material vegetal en un balón de 250 mL, 24/40,
agregándose agua hasta sobrepasar levemente el nivel de la mitad del balón.
Luego el balón fue acoplado con el aparato de extracción, y fue encendida la estufa y
la circulación del agua a través del refrigerante del aparato de destilación. El aceite
esencial fue destilado por 3 horas, contadas a partir de la hora en que se inició la
destilación.
Luego de apagar el aparato de destilación, el aceite fue colectado en n-pentano y
concentrado en rotavapor. Luego se midió la masa del aceite destilado y se almacenó en
vial de 2 mL en refrigeración, para su posterior análisis cromatográfico.
I.4.5.6. Extracción de metabolitos secundarios por maceración con diclorometano y metanol
Se colocaron 50.0 g de material seco, en un percolador de 1 L. Se agregó
diclorometano al percolador, hasta cubrir completamente la muestra. Luego se dejó
reposar la muestra por 48 horas. La muestra fue filtrada y se colectó la solución
diclorometánica en un recipiente de vidrio. A continuación se agregó una nueva cantidad
de diclorometano al material vegetal restante en el percolador, dejándose reposar la
muestra por 24 horas.
La muestra fue nuevamente filtrada y se colectó la solución diclorometánica. En los
casos en que la solución aún presentaba coloración, se repitieron los dos pasos anteriores,
hasta obtener soluciones sin coloración o con coloración muy débil. El mismo
procedimiento se llevó a cabo con metanol utilizando el mismo material, obteniendo así
dos extractos de la misma muestra: diclorometánico (con una mayor concentración de
compuestos apolares) y metanólico (con una mayor concentración de compuestos polares).
I.4.5.7. Análisis cromatográfico de los aceites esenciales
Se realizaron de acuerdo con la metodología de Adams (2002), inyectando 0.1 µL de
una solución con aproximadamente 5 µL de aceite esencial en 0.2 mL de cloroformo, en
un cromatógrafo de gases equipado con una columna capilar HP5 de 60 m y programa de
temperatura con rampa de 60 ºC a 220 ºC, a 3 ºC/min.
13
La identificación de los componentes de los aceites esenciales se realizó por medio
de los índices de retención de los componentes presentes, calculados a partir de la
inyección de una mezcla de hidrocarburos de cadena lineal de serie homóloga desde el
octano al eicosano y por la comparación de tiempos de retención de los picos
cromatográficos con los de estándares puros. El análisis cuantitativo se realizó por medio
del cálculo del porcentaje de área total de los picos cromatográficos.
I.4.5.8. Tamizaje fitoquímico
Se realizaron pruebas de tamizaje fitoquímico para determinar la presencia de los
siguientes compuestos en el material vegetal seco que son considerados como principios
activos: alcaloides, taninos, flavonoides, principios amargos, antraquinonas, cumarinas y
saponinas. Las pruebas se realizaron siguiendo los procedimientos del Laboratorio de
Investigación de Productos Naturales y del Departamento de Farmacognosia de la
Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de la Universidad de San Carlos (Medinilla,
1996), que se describen a continuación:
I.4.5.8.1 Investigación de alcaloides
Ensayos macro y semimicro: Pesar 1 g de material vegetal. Agregar 2 gotas de
solución de hidróxido de amonio al 10 por ciento (p/v), luego añadir 25 mL de metanol a
60C. Filtrar con papel filtro Whatman 1 y acidificar el filtrado con ácido clorhídrico 2 N. La solución resultante dividirla en 4 tubos y evaluar de la siguiente manera:
Tubo 1: agregar 5 gotas del reactivo de Mayer’s. (Color blanco a crema).
Tubo 2: agregar 5 gotas del reactivo de Dragendorff. (Color rojo a naranja).
Tubo 3: agregar 5 gotas del reactivo de Wagner. (Color marrón).
Tubo 4: testigo.
Usar como estándar soluciones al 1 por ciento de atropina y papaverina. Observar
durante 2 horas la existencia de precipitados, turbidez o precipitación de complejos en los
tubos.
Preparación de Reactivos:
Mayer’s (yoduro de mercurio y potasio)
a. 1.36 g de HgCl2 /60 mL H2O
b. 5 g KI / 10 mL H2O
c. Mezclar y diluir a 100 mL.
Dragendorff (yoduro de bismuto y potasio)
a. 8 g Bi(NO3)3 5 H2O / 20 mL HNO3
7. 27.2 g KI / 50 mL H2O
8. Mezclar, reposar, decantar supernadante. Diluir a 100 mL.
Wagner (yodo-yoduro de potasio)
a. 1.27 g I2 + 2 g KI / 5 mL H2O
b. Diluir a 100 mL.
14
Cromatografía en capa fina: Pesar 1 g de material vegetal seco y molido, agregar 1 mL de
hidróxido de amonio al 10 por ciento (p/v) y extraer con 5 mL de metanol. Colocar en
baño maría a 60 C durante 5 minutos. Filtrar y concentrar. Aplicar en una placa de silica
gel 60 F254, utilizando como estándar una solución de atropina y papaverina al 1 por
ciento en metanol (10 μL).
Fase móvil: tolueno-acetato de etilo-dietilamina (70:20:10); acetato de etilo-metanol-agua
(100:13.5:10), cloroformo- dietilamina (90:10); acetona-agua-amonio concentrado
(90:7:3)
Detección:
Sin tratamiento químico: UV 254nm fluorescencia, UV 365 nm algunos fluorescen azul o
amarillo.
Reactivo de Dragendorff: zonas cafés o naranjas en región visible, los colores no son
estables.
I.4.5.8.2 Investigación de flavonoides y antocianinas
Ensayos macro y semimicro: Extraer 3 g de material vegetal pulverizado con 10 mL
de etanol o metanol al 80 por ciento, filtrar y concentrar. Enfriar a temperatura ambiente y
triturar el residuo con 15 mL de éter de petróleo hasta que la extracción sea incolora.
Disolver el residuo en 30 mL de metanol al 80 por ciento, filtrar y dividir en 5 tubos:
Tubo 1: agregar 0.5 mL de ácido sulfúrico concentrado.
Tubo 2: agregar 3 a 5 gotas de cloruro férrico al 10 por ciento (p/v).
Tubo 3: agregar 0.5 mL de ácido clorhídrico concentrado y calentar en baño de maría por
5 minutos (prueba para leucoantocianinas).
Tubo 4: agregar magnesio metálico y 0.5 mL de ácido clorhídrico concentrado.
Tubo 5: agregar un álcali a un extracto acuoso.
Tubo 6: agregar solución de ácido bórico en anhídrido acético.
Tubo 7: testigo.
Evaluar las reacciones, cambios de color y/o formación de precipitado comparados con el
testigo.
Desarrollo inmediato de color flavonas y flavonoles (amarillo a rojo), flavanonoles
(rojo a magenta), flavanonas (rojo, magenta, violeta, azul), isoflavonas (amarillo);
isoflavononas, chalconas y auronas no dan coloración.
Cromatografía en capa fina: Extraer 1 g de material vegetal seco pulverizado con 10 mL
de metanol por 5 minutos en baño de maría a 60C. Filtrar la solución y aplicar sobre las cromatoplacas de silicagel 60 F254. Como estándar emplear solución de flavonoides al
0.05 por ciento en metanol (10 μL). (Quercetina, rutina, ácido clorogénico, hiperósido).
Fase móvil: acetato de etilo-ácido fórmico-ácido acético glacial-agua (100:11:11:27), n-
butanol-ácido acético-agua (40:10:50); acetato de etilo-ácido fórmico-ácido acético
glacial-etilmetilcetona-agua (50:7:3:30:10)
15
Detección:
Sin tratamiento químico: UV 254 nm fluorescencia, zonas azules o amarillas. UV 365 nm,
dependiendo la estructura fluorescen de color amarillo, azul o verde.
Reactivo de Productos Naturales (NP/PEG). Fluorescencia intensa en UV-365 nm.
Solución 1: solución metanólica al 1 por ciento de difenilboriloxietilamina (NP).
Solución 2: solución etanólica al 5 por ciento de polietilenglicol 4000 (PEG).
Aplicar a la placa vapores de amoniaco para intensificar el color de las manchas.
I.4.5.8.3 Investigación de antraquinonas
Prueba de Bornträger: Extraer 3.0 g de material vegetal pulverizado con 10 mL de
etanol al 80 %, filtrar y concentrar en baño de maría (60C). Disolver el residuo con 30
mL de agua destilada y filtrar. Extraer con 10 mL de benceno. A la fase bencénica añadir
5 mL de solución de test de amonio y agitar. Observar cambios de color en la fase
alcalina (color rojo, rosado: positivo).
Prueba de Bortränger modificada: Calentar 0.3 g de material vegetal pulverizado con
10 mL de hidróxido de potasio alcohólico 0.5 N y 1 mL de peróxido de hidrógeno al 3 por
ciento y calentar 10 min en baño de maría a 60C. Añadir 10 gotas de ácido acético glacial para acidificar. Extraer con 10 mL de benceno. A la capa bencénica adicionar 5
mL de solución de prueba de amonio y agitar. Observar cambios de color en fase alcalina
(color rojo, rosado: positivo).
Cromatografía en capa fina: Extraer 0.5 g de material vegetal seco pulverizado con
5 mL de metanol en baño maría (60C) por 5 minutos. Filtrar y aplicar 10 μL en la
cromatoplaca de silicagel 60 F254.
Estándar: solución al 0.1 % en metanol de antraquinonas (10 μL). (Aloína,
flangulina A/B, glucofrangulina A/B y sus agliconas, reina, aloe-emodina, extracto de sen)
Fase móvil: acetato de etilo-metanol-agua (100:17:13), acetato de etilo-metanol-agua
(100:13.5:10).
Detección:
Sin tratamiento químico: UV 254 nm fluorescencia, UV 365 nm fluorescencia amarilla o
rojo-café.
Solución etanólica de hidróxido de potasio al 5 o 10 %.
Antraquinonas: zonas rojas en visible y fluorescencia roja en UV-365 nm.
Antronas y antranolas: zona amarillas en visible y fluorescencia amarilla en UV-365 nm.
I.4.5.8.4 Investigación de cumarinas
Ensayos macro y semimicro: Medir 5 mL de extracto vegetal metanólico. Agregar 1 mL
de agua destilada hirviendo. Con un capilar aplicar 2 manchas en papel filtro. A una
16
mancha agregar 1 gota de hidróxido de potasio 0.5N. Observar bajo luz ultravioleta de
365 nm (fluorescencia azul o verde: positivo).
Cromatografía en capa fina: A 1.0 g de material vegetal adicionar 10 mL de metanol y
calentar 30 minutos en baño de maría. Filtrar y evaporar hasta 1 mL. Aplicar 20 μL en
una cromatoplaca de sílica gel 60 F254. Utilizar como estándar canela en metanol al 1 por
ciento, umbeliferona, ácido p-cumárico, cumarina.).
Fase móvil: tolueno-acetato de etilo (93:7); tolueno-éter (1:1 saturado con 10 % de ácido
acético, 50 mL de tolueno y 50 mL de éter son mezclados durante 5 min con 50 mL de
ácido acético al 10 %, se filtra y se descarta la fase de abajo, y la mezcla de tolueno-éter
es usada).
Detección:
Sin tratamiento químico UV 254nm fluorescencia. UV 365 nm todas las cumarinas
muestras una intensa fluorescencia azul o verde- azul.
Solución etanólica de KOH al 5 o 10 por ciento. UV-365 nm fluorescencia azul o verde.
I.4.5.8.5 Investigación de saponinas
Prueba de espuma:
Tubo 1: 100 mg de material vegetal pulverizado y seco.
Tubo 2: 2 mL de control de saponinas (0.5 %).
Tubo 3: 2 mL de agua.
A cada tubo se le adiciona 10 mL de agua destilada. Calentar en baño de maría
(60C) durante 30 minutos. Enfriar, tapar los tubos, agitar vigorosamente 30 a 40
segundos. Dejar reposar los tubos durante 30 minutos, observar la formación de capa de
espuma. Si una capa de espuma mayor de 3 cm persiste en la superficie líquida después de
30 minutos se presume la presencia de saponinas.
Cromatografía en capa fina: 2 g de material vegetal seco, se extraen con 10 mL de
etanol al 70 por ciento con reflujo por 10 minutos. Evaporar a 5 mL y proceder a aplicar
25-40 μL en una cromatoplaca de silicagel 60 F254. Estándar de saponinas al 0.1 por
ciento en metanol (10 μL).
Fase móvil: cloroformo-metanol-agua (64:50:10), n-butanol-ácido acético-agua (50:10:40).
Detección:
Reactivo de sangre, zonas hemolíticas blancas en fondo rojo.
Reactivo de Liebermann-Burchard: UV-365 o VIS zonas azules y verdes de saponinas
esteroidales, rojas y violetas de triterpenoides. Reactivo de Komarowsky: zonas azules,
17
amarillas y rojas. Vainillina-ácido sulfúrico y anisaldehído-ácido sulfúrico: zonas azules,
violetas, amarillentas.
I.4.5.8.6 Investigación de principios amargos
Cromatografía en capa fina: Calentar 1 g de material vegetal con 10 mL de metanol
en baño de maría a 60C por 10 minutos. Evaporar y filtrar a 2 mL. Aplicar en la
cromatoplaca. Estándar: artemisina al 1 por ciento en metanol (20 μL).
Fase móvil: acetato de etilo-metanol-agua (77:15:8) y cloroformo-metanol (95:5).
Detección: vainillina-ácido sulfúrico, anisaldehído-ácido sulfúrico. Zonas rojas-violetas,
cafés-rojas, azules-verdes.
(Reactivo de Liebermann-Buchard: UV-365 nm: gris, café; VIS: café oscuro, gris).
I.4.5.8.7 Investigación de taninos
Ensayos macro y semimicro: Extraer 10.0 g de material vegetal pulverizado con 30
mL de etanol o metanol al 80 %, filtrar y evaporar a sequedad. Añadir 25 mL de agua
caliente al residuo y agitar con varilla y dejar enfriar. Agregar 1 mL de solución de
cloruro de sodio al 10 por ciento y filtrar. Adicionar 3 mL del filtrado a 4 tubos de
ensayo:
Tubo 1: testigo.
Tubo 2: agregar 4 a 5 gotas de solución de gelatina al 1 % (p/v).
Tubo 3: agregar 4 a 5 gotas de gelatina-sal (1 por ciento de gelatina y cloruro de sodio al
10 por ciento).
Tubo 4: agregar 3 a 4 gotas de solución de cloruro férrico al 10 % (p/v).
Observar la formación de precipitado y/o cambio de coloración.
Con cloruro férrico: grisáceo-negro: catecol; negro-azulado: pirogalol)
I.4.5.9 Actividad biocida de metabolitos secundarios aislados y aceites esenciales
Los aceites esenciales de dos especimenes de cada especie, fueron utilizados para
realizar ensayos de actividad biocida por inoculado en caja de Petri y por bioautografía
colocando los cromatogramas de capa fina obtenidos cromatoplacas de sílica gel sobre
medio inoculado. Los ensayos realizados correspondieron a la bacteria grampositiva,
Staphylococcus aureus, y a las bacterias gramnegativas Salmonella typhi y Escherichia
coli.
I.4.5.10 Indice de refracción de aceites esenciales
El índice de refracción de los aceites esenciales fue obtenido utilizando un
Refractómetro tipo Abbe. Este parámetro es de utilidad para la evaluación de de
diferencias entre los aceites esenciales.
I.4.6 La técnica estadística
Para la interpretación de los resultados se utilizó estadística descriptiva. Se obtuvo la
18
media del rendimiento de la extracción de aceites esenciales de tres o más repeticiones, así
como de la integración de las áreas de los picos cromatográficos correspondientes a los
componentes de los aceites esenciales analizados en las plantas de estudio.
Para su identificación, las muestras colectadas en cada muestreo fueron codificadas,
consignándose en una hoja de registro las características principales del lugar de muestreo,
ubicación y de la planta, además de registrarse la información en cuaderno de campo.
Se considera que una planta presenta potencial económico para su extracción de
aceite esencial si su contenido de aceite es mayor que 0.5 % y presenta componentes
mayoritarios de valor económico (Aragao, 1981).
I.4.7 Los instrumentos utilizados
Los principales instrumentos utilizados en esta investigación fueron:
Cromatógrafo de gases con detector de llama
Cromatógrafo de gases con detector de masas
Espectrofotómetro UV-VIS
Aparato de hidrodestilación tipo Clevenger
Refractómetro tipo Abbe
Rotavapor
19
PARTE II
MARCO TEÓRICO (CONCEPTUAL)
II.1 Aceites esenciales
Los aceites esenciales son productos volátiles de origen vegetal obtenidos por
proceso físico y puede presentarse aisladamento en mezclados entre sí, rectificados,
desterpenados o concentrados (Yunes y Cechinel, 2009). Los aceites esenciales son usados
en muchas industrias para proporcionar aromas y olores especiales a productos como
perfumes, cosméticos, jabones, condimentos, dulces, etc. Otros usos consisten en
enmascarar olores desagradables en ambientes de trabajo e instalaciones sanitarias, así
como su uso como solventes y como insumos en productos de las industrias de plásticos,
tintas, caucho, insecticidas y otras.
Algunas especies vegetales que contienen aceites volátiles, como canela, clavo de
la India, nuez moscada y jenjibre, fueron extensamente consumidas en Europa a partir de
la época de las cruzadas, debido a que poseían aroma y/o sabor acentuados. Especies
elaboradas con flores, frutos, semillas, cáscaras y raices de una gran variedad de plantas
provenientes de regiones tropicales, alcanzaron un elevado valor comercial. Esto motivó la
creación de nuevas rutas comerciales entre occidente y oriente. Las esepcies fueron
utilizadas tanto en la culinaria, con con fines de condimentación y conservación de los
alimentos, enla preparación de aceites, ungüentos, cosméticos y medicamentos (Yunes y
Cechinel, 2009).
La utilización de los aceites esenciales requiere de una cuidadosa caracterización
química y evaluación de posibles modificaciones de su composición quíica, deibdas a los
diferentes orígenes geográficos y condiciones climáticas y a variaciones genéticas
poblacioneas que pueden provocar la formación de diferentes quimiotipos. Además, la
comosiciòn química de una misma especie fegetal puede variar de acuerdo con la parte de
la planta utilizada.
En la actualidad, muchos aceites esenciales constituyen compuestos de partida para
síntesis de otras sustancias útiles en las industrias química y farmacéutica. Otros
componentes tienen propiedades farmacológicas y son usados como antibacterianos,
analgésicos, sedantes, expectorantes, estimulantes y estomáquicos en la composición de
medicamentos.
La introducción de un aceite esencial nuevo en el mercado internacional, presenta
diferentes niveles de dificultad, según la industria para la que se destine, así por ejemplo,
para su aceptación en la industria de aromas debe cumplir con patrones complejos y
rígidos, exigiendo una calidad uniforme. Por esta razón, generalmente existe un gran
interés en esta industria por la investigación de nuevas fuentes de aceites esenciales. En
el caso de la industria química, en la cual los aceites esenciales son utilizados como
solventes, o bien, como insumos, las restricciones son menores.
20
Aragão et al. (1981), seleccionaron varias plantas con posibilidades económicas en
cuanto a su cultivo, basándose en los siguientes criterios:
a) abundancia de la planta en la región
b) rendimiento de aceite esencial elevado, igual o mayor que 0.5%
c) un componente principal económicamente importante en concentración superior a
30%
d) un componente secundario de alto valor económico
En dicho estudio, Aragão obtuvo resultados de análisis químico de 82 Aceites
esenciales de plantas del Noreste de Brasil, de 14 familias botánicas diferentes. Los
resultados más importantes de dicho estudio fueron los cromatogramas correspondientes a
cada aceite y la relación de los constituyentes químicos identificados, así como sus fuentes
alternativas. Previo a su análisis, los aceites estudiados fueron obtenidos extracción por
arrastre con vapor de agua, a partir de materiales colectados en el campo y transportados
al laboratorio en vehículo, manteniéndolas a baja temperatura. Existen otras técnicas de
extracción antiguas, como la extracción con grasa fría o grasa caliente, que no serán
utilizadas en el proyecto, al ser de bajo rendimiento (Guenther, 1948). Como aporte final,
el autor presentó once monografías de los aceites esenciales seleccionados por la
importancia de sus posibilidades económicas, en las cuales se hicieron sugerencias sobre
la necesidad de investigación agronómica para su aprovechamiento agroindustrial en el
noreste de Brasil.
En cuanto a las técnicas de extracción, los aceites esenciales son obtenidos por
diferentes procesos, dependiendo de su localización en el vegetal, de la cantidad y de las
características requeridas para el producto final. Las técnicas más conocidas son el arrastre
con vapor de agua, la hidrodestilación y la extracción con solventes. Para propósitos
analíticos la hidrodestilación con aparato tipo clevenger es la más utilizada (Pereira, et al.,
2000), sin embargo, esta técnica provoca reacciones de oxidación en varios componentes
del aceite, debido a la presencia de agua y la alta temperatura, por lo que la composición
del aceite se altera antes del análisis. Por esto, se ha utilizado recientemente la destilación
extracción por tres horas, utilizando el aparato de Likens-Nickerson, para la extracción del
aceite con fines puramente analíticos (Pereira et al., 2003), que es la técnica que se
propone en el presente estudio. Además, recientemente se ha utilizado la técnica de
Microextracción en Fase Sólida, que permite la extracción del aceite esencial a partir de
material fresco y su inyección inmediata en el cromatógrafo de gases, lo cual evita el uso
de solventes y permite un análisis más inmediato de la composición del aceite esencial
estudiado.
Otras técnicas de extracción utilizadas son la expreción, la enfloración la extracción
con solventes orgánicos o grasas, y con fluidos supercríticos. Los solventes de baja
polaridad o el dióxido de carbono supercrítico, permiten obtener aceites esenciales en
mezcla con compuestos lipofílicos no volátiles. Por otro lado, la ausencia de
calentamiento evita la producción de artefactos, como los de la serie de derivados del
sabineno (terpinen-4-ol, -terpineno, -terpineno y terpinoleno). En algunos casos el
calentamiento es necesario para formarción de compuestos de interés, como el
camazuleno en la camomila (Yunes y Cechinel, 2009).
21
II.1.1 Biosíntesis
Los terpenos y terpenoides son producidos en la naturaleza por dos rutas
biosintéticas, siendo estas la del mevalonato a través del ácido mevalónico y la ruta no
mevalónica, descubierta más recientemente, a través del intermediario de cinco átomos de
carbono 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato (Dubey et al., 2003). Los fenilpropanoides son
sintetizados a partir de la fenilalanina producida vía el ácido shiquímico.
II.1.1.2 Terpenos
El ácido mevalónico, formado a partir de dos moléculas de acetilcoenzima A, es el
precursor de las dos unidades básicas de los terpenos, el isopentenilpirofosfato (IPP) y el
,-dimetilalilpirofosfato (DMAPP). La ruta del ácido mevalónico se presenta en la
Figura 1. El ácido mevalónico es pirofosfatado por dos unidades de ATP originando el
mevalonil-pirofosfato, el cual se descarboxila con la participación de otra molécula de
ATP, originando al isopentenilpirofosfato (IPP). El DMAPP es formado por isomerización
del enlace doble del IPP. La condensación de moléculas de IPP y DMAPP origina a los
precursores inmediatos de los diferentes terpenoides como el geranil difosfato (GPP),
farnesil difosfato (FPP) y geranilgeranilo difosfato (GGPP) (Yang y Orihara, 2002;
Dewick, 2001).
Figura 1. Ruta del ácido mevalónico en la biosíntesis de terpenos.
Fuente: Dewick, 2001.
22
En la ruta del 1-desoxi-D-xilulose-5-fosfato (Figura 2) la descarboxilación del
piruvato mediada por tiamina difosfato produce un acetaldehído enlazado en la forma de
una enamina la cual reacciona como nucleófilo en una reación de adición con el
gliceraldehido-3-fosfato (Dubey et al., 2003; Rochdich et al., 2001; Fellermeier et al.,
2001). La liberación de la tiamina difosfato genera aL 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato que
sufre un rearreglo tipo pinacol y una reducción siendo transformado en 2-C-metil-D-
eritrol-4-fosfato (Duvold et al., 1997; Sagner et al., 1998). La reacción de esta molécula
con citidina trifosfato produce un derivado difosforado de citidina el cual es fosforilado
vía ATP, resultando en un derivado 2-fosfato que es convertido en un fosfoanhidrido
cíclico con pérdida de citidina fosfato. El ciclofosfato es transformado por reacciones
todavía no esclarecidas en IPP que relaciona la síntesis de la desoxixilulosa con la del
mevalonato. El DMAPP podría ser derivado del IPP o producido independientemente, lo
cual no ha sido elucidado (Dewick, 2001).
La gran variedad diversidad estructural de los monoterpenos se deriva de las
reacciones de cilización enzimáticamente catalizadas, en especial por las monoterpeno
ciclasas y las isomerasas. De forma general, estas enzimas presentan propiedades
semejantes y la mayoría es capaz de sintetizar no solo uno, sino una serie de productos,
normalmente con la misma configuración espacial (Lu et al., 2002).
II.1.1.3 Fenilpropanoides
Los fenilpropanoides no son constituyentes muy comunes de los aceites esenciales,
aunque existen especies que producen estas sustancias en cantidades importantes. Los
fenilpropanoides son sintetizados a partir de la ruta del ácido shikímico (Dewick, 2001).
Los fenilpropanoides de aceites esenciales son derivados de la fenilalanina y en menor
grado de la tirosina (Sangwan et al., 2001). En la ruta biosintética, la fenilalanina es
convertida en ácido trans-cinámico; el ácido trans-cinámico es convertido en p-cumarato
(Schmid y Amrhein, 1995). Entre los fenilpropanoides comunes en aceites esenciales, se
encuentran el eugenol, el metileugenol, la miristicina, el chavicol, el metilchavicol, el
estragol y el anetol, entre otros.
II.1.1.4 Extracción de los aceites esenciales
En el laboratorio los aceites esenciales son extraídos generalmente por
hidrodestilación con aparato tipo Clevenger (Pereira, et al, 2000), siendo esta la técnica
más utilizada para la determinación del contenido del aceite esencial y para la extracción
del aceite esencial utilizado para el análisis cromatográfico. Esta técnica provoca
reacciones de oxidación en varios componentes del aceite esencial por la presencia de
agua y la temperatura elevada de operación, por lo cual la composición del aceite puede
ser alterada antes del análisis cromatográfico (Richter y Schellenberg, 2007). Por esa
razón recientemente se ha utilizado la técnica de extracción-destilación simultáneas con
aparato Likens-Nickerson para extraer el aceite con fines puramente analíticos (Pereira et
al., 2003). Existen otras técnicas de extracción antiguas, como el arraste con vapor de
agua, la extracción con disolventes y la extracción con cera fría o caliente (Guenther,
1948).
23
Figura 2. Ruta de la 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato en la biosíntesis de terpenos.
Fuente: Dewick, 2001.
II.1.2 Polimorfismo químico
Diferentes estudios de plantas ricas en aceite esencial han demostrado en los últimos
años, la existencia de polimorfismo químico entre plantas de la misma especie, es decir,
existen plantas de una misma especia que producen aceites esenciales con composiciones
diferentes, debido principalmente a la diferencia en condiciones climáticas donde crecen.
Estas plantas pueden agruparse de acuerdo a orígenes comunes de acuerdo a quimiotipos
(Pereira et al., 2003), de manera que puede seleccionarse la procedencia que producirá los
mejores resultados en cuanto a composición y a rendimiento.
24
Algunas poblaciones de plantas poseen principalmente un quimiotipo simple, pero se
ha observado que muchas poblaciones presentan dos o tres, o más quimiotipos, como
ocurre en el caso de Thymus vulgaris, planta que posee seis quimiotipos (Thompson et al.,
2003). Em el caso de polimorfismo en plantas de Guatemala del género Lippia, se ha
encontrado que L. graveolens presenta tres quimiotipos (Fischer et al, 1997) y L. alba dos
quimiotipos (Fischer et al., 2004). II.1.3 Actividad antioxidante
Las especies reactivas de oxígeno son reconocidas como responsables por un gran
número de enfermedades, así como por el proceso de envejecimiento. Los radicales libres
constituyen un blanco interesante para el desarrollo de nuevos medicamentos, en este
contexto los antioxidantes de origen natural merecen atención especial, pues las plantas
sintetizan un gran número de metabolitos capaces de captar los radicales libres (Potterat,
1997). Los mecanismos de acción de estos compuestos son diversos, incluyéndose la captura
de oxígeno, la desactivación de radicales por reacción de adición covalente, la reducción de
radicales peróxidos y la complejación de metales de transición (Larson, 1995).
La reducción del radical DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazilo) permite determinar la
actividad antioxidante. La prueba es bastante simple: los extractos, fracciones o productos
puros a evaluar son depositados en una placa de cromatografía de capa fina (sílica gel) y se
realiza la separación adecuada con un sistema de solventes apropiado, que es optimizado por
medio de pruebas de separación de los aceites esenciales. Después de secarse, la placa es
vaporizada con una solución metabólica de 2 mg/mL de DPPH. Las actividades anti-
radicalares aparecen en la forma de manchas amarillas sobre fondo violeta. La
determinación de actividad antioxidante en solución también es posible (Hostettmann et al.,
2003).
II.1.4 Actividad antioxidante de aceites esenciales
Algunos aceites esenciales son conocidos por sus propiedades antioxidantes, las
cuales presentan amplia paliación den la industria farmacéutica, de cosméticos y
pricipalmente en la industria alimenticia (Sacchetti et al., 2005). La actividad antioxidante
es de utilidad enla conservación de alimentos y también en cualquier tipo de producto que
contenga en su composición un sustrato lipídico (Hirasa y Takemasa, 1998).
Los antioxidantes son sustancias que, presentes en bajas concentraciones,
comparadas con el sustrato oxidable, retardan significativamente o inhiben la oxidación
del sustrato. Los radicales formados a partir de antioxidantes no son reactivos para
propagar la reacción en cadena, siendo neutralizados por la reacción con otro radical,
formando productos estables o pueden ser reciclados por otro antioxidante (Sousa et al.,
2007). Los principales mecanismos de acción de las sustancias antioxidantes incluyen
captadores de radicales y supresores de estados excitados, sistemas catalíticos que neutralizan o eliminan las especies reactivas de oxígeno (ERO) y especies reactivas de
nitrógeno (ERN), y el enlace de iones metálicos a proteínas, haciéndolos indisponibles
para producir especies oxidantes.
25
En la industria alimenticia la oxidación lipídica es inhibida por secuestradores de
radicales libres. Las sustancias más utilizadas para esa función son: butil-hidroxianisol
(BHA), butilhidroxitolueno (BHT), terc-butil-hidroxiquinona (TBHQ),
trihidroxibutilfenona (THBP) y galato de propilo (GP). Estudios recientes han sugerido la
posibilidad de que estas sustancias presenten efectos tóxicos (Soares, 2002).
Varios métodos son utilizados para determinar la actividad antioxidante de extractos
y sustancias aisladas, encontrándose entre ellos el método de oxidación térmica (Almeida-
Doria y D’Arce, 2000), el del -caroteno y el del DPPH, que permiten la evaluaciòn de las
etapas primarias y secundarias de la oxidación en sistemas liposolubles (Sacchetti et al.,
2005); uno de los métodos más utilizados es la evaluación de la actividad secuestradora
del radical libre 2,2-difenil-picril-hidrazil (DPPH) de color púrpura que absorbe radiación
electromagnética a 515 nm (Sousa, 2005). Por acción de un antioxidante (AH) o de una
especie radical (R.), el DPPH
. es reducido generando difenil-picril-hidrazina, de color
amarillo con disminución proporcional de la absorbancia. A partir de las medidas de
absorbancia obtenidas puede determinarse la actividad antioxidante o secuestradora de
radicales libres como porcentaje de DPPH. remanente en el medio reactivo (Sánchez-
Moreno, 1998). El porcentaje de actividad antioxidante (% AA) corresponde a la cantidad
de DPPH consumida por el antioxidante, mientras que la cantidad de antioxidante
necesaria para disminuir la concentración inicial de DPPH en 50 % es denominada
concentración eficiente (CE50) también llamada como concentración inhibitoria (CI50).
Cuanto mayor el consumo de DPPH por una muestra, menor será la CE50 de la sustancia y
mayor su actividad antioxidante.
Sacchetti et al (2005), evaluaron la actividad antioxidante, antiradical y biocida de
once aceites esenciales, usando los métodos del -caroteno, DPPH y luminol-quimioluminiscencia para determinar la actividad antioxidante obteniendo resultados
consistentes entre los métodos usados. El método del DPPH fue usado también en la
evaluación de la actividad antioxidante del aceite esencial Lippia berlandieri (Rocha-
Guzmán et al., 2007) y de Ocotea quixos (Lam.) (Laureaceae) del Ecuador (Bruni et al.,
2004). Besco et al. (2007), determinaron la capacidad antioxidante integral (IAC) de
productos de baobab por fotoquimioluminiscencia.
II.1.5 Actividad biológica de aceites esenciales
La actividad biológica puede ser definida como la capacidad de una sustancia o
mezcla de sustancias para alterar una o más funciones químicas o fisiológicas de una
célula. Esa capacidad está relacionada con la naturaleza física de la sustancia, la
composición química y concentración, y con la duración de la exposición de la célula a la
sustancia. Existen varios ensayos para evaluar la actividad biológica dependiendo del
objetivo. Los organismos utilizados como blancos para ensayos de actividad biológica,
pueden clasificarse en 6 grupos principales (Hosttettman et al., 2003):
a) organismos inferiores: microorganismos (bacterias, hongos)
b) invertebrados: insectos, crustáceos, moluscos.
c) sistemas sub-celulares: enzimas, receptores.
26
d) culturas de células de origen vegetal o animal
e) órganos aislados: humanos
f) animales vivos
En el caso de los aceites esenciales, las actividades antibacteriana y antifúngica son
estudiadas en la búsqueda de sustancias que puedan ser utilizadas como desinfectantes y
en la industria de alimentos. El esquema de trabajo es relativamente simple. El extracto o
sustancia es colocado en contacto con el agente patógeno y después de un período de
incubación se observa la inhibición del crecimiento o muerte de esporas en el caso de
hongos (Hosttettman et al., 2003). En las últimas décadas, se ha estudiado
exhaustivamente la actividad antimicrobiana de una gran variedad de aceites esenciales
(Oumzil et al., 2002; Burt et al., 2004; Cheng et al., 2006). La mayor parte de estos
estudios se realizó con lso aceites esenciales sin fraccionamiento, y en algunos casos, sin
la identificación de los componentes químicos. En lagunos casos la actividad fue atribuida
a alguno de los componentes del aceite, con base en estudios realizados con las sustancias
aisladas.
Es importante que los resultados de actividad antimicrobiana sean confrontados con
la sensibilidad variable de las diferentes cepas de microorganismos utilizadas en los
experimentos. Los métodos más empleados para la detección de actividad antimicrobiana
son ensayos in vitro realizados por difusión, dilución o bioautografía, siendo posible en
este último, relacionar los efectos bacteriostáticos o bactericidas y fungistáticos o
fungicidas con los componentes de la mezcla. En algunos casos, el aceite de una planta
puede presentar un constituyente mayoritario, como el de la canela que contiene más de 85
% de cinamaldehido, lo que evidencia la correlación entre la química y la actividad. Sin
embargo, las sustancias presentes en menor cantidad pueden contribuir, por lo menos en
parte, a la actividad, posiblemente por sinergismo entre sus componentes (Yunes y
Cechinel, 2009). .
II.1.6. Métodos de análisis de actividad antimicrobiana
Los métodos para análisis de actividad antimicrobiana son clasificados en tres tipos
(Valgas et al., 2007):
II.1.6.1 Métodos de difusión en agar
En estos métodos el inóculo bacteriano es colocado en agar y el aceite esencial es
colocado en el agar en pozos o en discos de papel filtro que son puestos en contacto con el
inóculo. Después de la incubación los resultados son obtenidos como diámetros de los
halos de inhibición.
II.1.6.2 Métodos bioautográficos
Existen dos métodos, el directo y el indirecto, en los cuales el aceite esencial es
corrido en una cromatografía en capa fina (CCF) y después la placa es colocada sobre el
inóculo. Con esta metodología se determina el halo de inhibición que corresponde a las
sustancias separadas en la CCF.
27
II.1.6.3 Métodos de dilución
En este método se determina la Concentración Inhibitoria Mínima (CIM), usando
diferentes diluciones del aceite esencial en DMSO que son distribuidas en placas de 96
pozos, siendo cada pozo utilizado, inoculado con la suspensión bacteriana a evaluar.
Después de la inoculación, se determina la menor concentración del aceite que inhibe el
crecimiento bacteriano, correspondiendo a la CIM, siendo esta expresada en mg/mL
(Valgas et al., 2007).
II.1.7 Bioautografía directa
Esquema bastante simple para actividades antifúngica y antibacteriana. En un primer
ensayo debe colocarse el extracto o sustancia en contacto con un agente patógeno, y puede
observarse con relativa facilidad la inhibición del crecimiento o muerte de esporas, en el
caso de los hongos. (Hostettmann et al., 2003).
Actualmente muchas investigaciones son realizadas para desarrollar nuevos agentes
antimicóticos, pues un número de casos ligados al SIDA, de micosis sistémicas, están en
plena expansión. La bioautografía directa, combina la cromatografía en capa fina y el ensayo
biológico in situ, es un excelente método porque puede conseguir la fácil localización de los
compuestos activos en una matriz compleja. Algunos métodos de cromatografía directa que
utilizan Aspergillum, Penicillium y Cladosporium sp. han sido publicados en la literatura
(Van der Sluis et al., 1981)
Las placas de capa fina son asperjadas con una suspensión de esporas y en seguida,
incubadas por dos o tres días en atmósfera húmeda. Las zonas de inhibición son directamente
visibles, pues durante el período de incubación, el hongo produce un pigmento colorido. La
técnica también puede ser usada para Candida albicans.
II.1.8 Análisis de los aceites esenciales
El desenvolvimiento de técnicas instrumentales de análisis y el acoplamiento con
sistemas computadorizados ha facilitado el análisis de los aceites esenciales.
Antiguamente el análisis era un proceso muy largo ya que se necesitaba aislar y purificar
cada componente de los aceites esenciales para determinar la estructura por métodos
químicos tradicionales (Bandoni, 2003). En la actualidad, las técnicas usadas en el
análisis de los aceites esenciales son los siguientes:
a) Técnicas cromatográficas de alta resolución, como cromatografia de gases con columna
capilar.
b) Técnicas espectroscópicas, como espectrometría de masas (EM), espectroscopía
infrarroja (IR) y espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear (RMN).
c) Sistemas cromatográficos acoplados a técnicas espectroscópicas, como cromatografía
de gases acoplada a espectrometría de masas (CG-EM) y cromatografia de gases acoplada
a espectroscopía de infrarrojo con transformada de Fourier (CG-IRTF).
28
Las principales técnicas analíticas utilizadas en el análisis de aceites esenciales se
basan en las caracteristicas fisicoquímicas de los aceites y sus componentes.
II.1.8.1 Cromatografía de gases (CG)
Por tratarse de una mezcla de constituyentes volátiles, los aceites esenciales brutos
pueden analizarse directamente por cromatografía de gases, sin tratamiento previo de la
muestra, además de una simple dilución, permitiendo no solamente el análisis cuantitativo
de sus constituyentes, sino también cualitativo, ya sea por el uso de tiempos o índices de
retención, o por el acoplamiento del cromatógrafo con un espectrómetro de masas. Sin
embargo, cuando los aceites se encuentran como componentes en formas farmacéuticas,
alimentos u otros tipos de formulaciones, su análisis es posible solamente mediante una o
varias etapas de extracción.
La técnica más usada en los laboratorios para el análisis cualitativo y cuantitativo de
aceites esenciales es la cromatografía de gases con detector de ionización de llama
(Bandoni, 2003). El análisis de aceites esenciales se basa en la identificación de las
sustancias presentes en el aceite por el tiempo de retención de estas comparado con los
tiempos de retención de sustancias puras o por medio de índices de retención obtenidos a
partir de la inyección de hidrocarburos de serie homóloga y su comparación con los
índices de estándares de sustancias comunes en los aceites esenciales (Marriot et al.,
2001). Existen bases de datos de los índices de retención para un número grande de
sustancias encontradas en aceites esenciales (Adams, 2001). El análisis cuantitativo es
realizado por medio de la integración de las áreas de los picos pertenecientes al aceite
esencial y el cálculo del porcentaje del área de cada pico dentro del área total de los picos
correspondientes al aceite (Bandoni, 2003). En la actualidad son utilizadas columnas
capilares de 25 a 60 m de largo por 0.25 mm de diámetro, que proporcionan alta
resolución cromatográfica. Columnas de polidimetilsiloxano y polietilenglicol son
utilizadas normalmente en el análisis de aceites esenciales (Bandoni, 2003).
Desde 1952, cuando fue desarrollada la cromatografía de gases, existe interés en
mejorar la velocidad de separación. Recientemente se han desarrollado alternativas para
disminuir el tiempo de análisis en casos en que el número de platos teóricos de una
columna capilar es demasiado alto para un problema de separación específico presentando
solutos muy bien separados (R>>2) pero tiempos de retención muy largos. Estos métodos
incluyen el uso de columnas multicanales y cromatografía de gases “Flash” (David et al.,
1999). El incremento de la velocidad de separación sin disminuir la resolución obtenida
para una mezcla compleja sobre una determinada fase estacionaria, puede realizarse por la
reducción del diámetro interno de la columna capilar. Así, una columna de 10m x 0,1 mm
D.I., proporciona la misma resolución que una columna de 25 m x 0.25 mm D.I.. Como la
columna es 2,5 veces más corta, el tiempo de análisis es reducido drásticamente, pudiendo
ser usadas también mayores velocidades de flujo para el gas portador ya que la velocidad
óptima del gas es mayor y las gráficas de H versus u (curvas de Van Deemter) son más
planas para columnas finas (Cramers y Leclercq, 1999). Con el uso de programas de
computadora de conversión de métodos, un procedimiento de operación existente para una
columna capilar normal puede ser convertido en un procedimiento de operación para una
columna fina, resultando en un análisis más rápido con la misma resolución. Ambos datos
29
cualitativos y cuantitativos permanecen sin alteraciones. La técnica de cromatografía de
gases ultra rápida (CG-UR) ha sido probada en el análisis de aceites esenciales de
diferente complejidad, mostrando buena reproducibilidad en la separación e identificación
de sustancias confiable (Bicchi et al., 2004).
II.1.8.2 Espectrometría de masas (EM)
El objetivo de la EM es determinar la masa molecular del analito y generar
información sobre su estructura. La masa molecular es determinada por medio de la
ionización de la molécula utilizando diferentes técnicas como Impacto Electrónico (IE),
Ionización Química (IQ), Bombardeo con Átomos Rápidos (conocida por FAB en inglés),
entre otras. Los iones generados en la cámara de ionización son acelerados
eletrostáticamente y separados en el analizador en función de su relación masa/carga
(m/z), y son colectados en el detector donde es registrada la señal producida. Las señales
son digitalizadas y procesadas en un sistema computarizado donde son comparadas con
espectros de bibliotecas de sustancias patrón. Esta técnica se utiliza pocas veces en forma
aislada en el análisis de aceites esenciales, para el cual su utilidad principal es en forma
acoplada como sistema de detección con CG.
II.1.8.3 Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (CG-EM)
La cromatografía de gases con detector de masas (CG-EM) presenta una gran
utilidad para el análisis de sustancias volátiles y estables a temperaturas altas. En la
literatura existen bases de datos y bibliotecas de espectros (Adams, 2001) que son usadas
para identificar los componentes de los aceites esenciales por medio de la comparación de
los espectros. La espectrometría de masas no presenta espectros únicos para componentes
de aceites esenciales en muchos casos, en vista del gran número de isómeros con la misma
fórmula molecular y diferente estructura que presentan espectros muy similares. El
acoplamiento con CG permite la separación de las sustancias de los aceites esenciales en
la columna cromatográfica y la obtención de los espectros de masas de cada una de las
sustancias eluidas. Así, el uso combinado de la información proporcionada por los tiempos
de retención en la cromatografía y los espectros de masas es de gran utilidad para la
identificación de los componentes de los aceites (Marriot et al., 2001). En la actualidad
casi todas las publicaciones sobre identificación de los componentes de aceites esenciales
son basadas en estas dos técnicas acopladas.
II.2 Flavonoides
Entre los grupos de metabolitos secundarios que se encontraron en las plantas de
estudio que presentan mayor potencial para la investigación de posibles aplicaciones en
las industrias de alimentos y farmacéutica, se encuentran los flavonoides. Los flavonoides
constituyen una clase de compuestos polifenólicos de amplia distribución en el reino
vegetal. Se encuentran principalmente en plantas en la forma de glucósidos, siendo los
pigmentos amarillos, naranja, azules y rojos de las flores, responsables también por el
color amarillo de las horas en el otoño. Son importantes para el crecimiento normal,
desarrollo y defensa de las plantas, Actúan como atractivos visuales favoreciendo la
polinización, como mecanismo de defensa contra el ataque de insectos y microorganismos
30
y como protectores contra la radiación ultatvioleta, por sus propiedades antioxidantes
(Yunes y Cechinel, 2009).
Los flavonoides son importantes constituyentes de la dieta humana, a pesar de no ser
considerados nutrientes. Se encuentran en una gran variedad de vegetales, bebidas como té
o vino tinto, y en frutas, especialmente las cítricas. Se ha calculado que la ingestión diaria
de flavonoides aportados por la dieta se encuentra entre 50-800 mg/día (Yunes y Cechinel,
2009), existiendo estimaciones de que la ingestión podría ser de hasta 1 g (Kandaswami et
al., 2005). Una taza de té verde o de un vaso de vino tinto pueden proporcinar hasta 200
mg de flavonoides totales; una cebolla, 40 mg/100 g; una manzana, 6-10 mg, un durazno,
1-2 mg y una naranja, 10 mg (Yunes y Cechinel, 2005). El hecho de que los flavonoides
estén presentes en la dieta y de que se les atribuya una gran variedad de actividades
biológicas, hace suponer que estos polifenoles podrían cumplir una función protectoa
contra enfermedades cardiovasculares y contra ciertas forams de cáncer.
Las plantas sintetizan centenas de compuestos fenólicos y polifenólicos, que poseen
variadas estructuras y funciones (Figura 3). Entre estos compuestos, los más estudiados
como antioxidantes son los flavonoides que tienen en común las estructura C6-C3-C6,
consistiendo de dos anillos aromáticos enlazados por un heterociclo oxigenado. Dentro de
los aproximadamente 4000 flavonoides descritos, las mayores clases son los flavonoles,
catequinas o flavonas, antocianidinas e isoflavonas. En estas clases hay grandes
variaciones estructurales, dependiendo del nivel de hidrogenación, hidroxilación,
metilación y sulfonación de las moléculas.
Figura 3. Estructuras de las principales clases de flavonoides.
Fuente: Bruneton, 1993.
Los flavonoides constituyen los ingredientes nutracéuticos más activos en las
plantas. Corresponden a un grupo de moléculas orgánicas distribuidas en las plantas
31
vasculares. Como compuestos fenólicos típicos, pueden actuar como potente antioxidantes
y quelantes metálicos.
II.2.1 Funciones de los flavonoides
Los flavonoides cumplen una amplia variedad de funciones ecológicas y fisiológicas
en las plantas. Es bien conocido el rol de los pigmentos de antocianina como señales
visuales en angiospermas para atraer polinizadores y agentes de dispersión de frutas, pero
estas funciones se adquirieron tarde en la diversificación evolutiva de los flavonoides.
Funciones menos conocidas y probablemente más antiguas de los flavonoides incluyen la
protección contra los efectos nocivos de la radiación UV, la mediación de las
interacciones entre el polen y el estigma, defensa contra bacterias, hongos patógenos y
herbívoros, mediación de interacciones entre plantas y hongos micorrízicos mutualistas, y
como reguladores de la actividad hormonal (Shirley, 1996).
La ruta biosintética de los flavonoides ha sido útil como sistema modelo para el
entendimiento de la regulación de los genes en las plantas. En forma similar, los genes de
la ruta de los flavonoides, estructurales y reguladores, han sido útiles como sistema
modelo para el entendimiento de una gran variedad de procesos evolutivos, incluyendo el
rol de la duplicación de genes en la facilitación de la evolución de caracteres nuevos y la
importancia relativa de los genes estructurales y reguladores en la evolución de caracteres
ecológicamente importantes.
La ruta de los flavonoides es un ejemplo clásico de las rutas que se han ido
extendiendo gradualmente, conforme nuevos productos y nuevas funciones van surgiendo.
A pesar que muchos detalles de su construcción evolutiva aún son desconocidos, es
posible reconstruir los principales eventos evolutivos con confianza. La duplicación de
genes ha proveído la materia prima para la construcción de la ruta. Hay una simetría
satisfactoria en esto, ya que una vez que la ruta de los flavonoides se completó, la
duplicación y la divergencia de los genes de la ruta han permitido la aparición de nuevas
clases de compuestos. A través de la duplicación de los genes, las rutas no solo nacen, sino
también se expanden en rutas sintéticas adicionales (Lin y Weng, 2008).
II.2.2 Actividad antioxidante de los flavonoides
Las dietas ricas en flavonoides, frutas y vegetales, son protectoras contra una
variedad de enfermedades, particularmente enfermedades cardiovasculares y algunos tipos
de cáncer (Ness y Powles, 1997). Los antioxidantes y la fibra dietética son los nutrientes
responsables por estos efectos protectores. Las Especies Reactivas de Oxígeno (ERO) son
formadas in vivo durante el metabolismo aeróbico normal y pueden causar daño al ADN,
proteínas y lípidos, no obstante el sistema de defensa antioxidante natural de todos los
organismos (Lin y Weng, 2008). Las ERO contribuyen al envejecimiento celular
(Kawanishi et al., 2001) y enfermedades coronarias (Khan y Baseer, 2000), posiblemente
a través de la desestabilización de membranas (Takabe et al, 2001), daño del ADN, y
oxidación de las lipoproteínas de baja densidad (LDL) (Meyer et al., 1998).
32
Los efectos protectores de los flavonoides en los sistemas biológicos se deben a su
capacidad para transferir electrones de radicales libres, la quelación de catalizadores
metálicos (Ferrari et al., 1997), la activación de enzimas antioxidantes, la reducción de
radicales de -tocoferol (Hirano et al., 2001) y la inhibición de oxidasas (Cos et al.,
1998). Velioglu et al. (1998), analizaron la actividad antioxidante y fenoles totales en
frutas, vegetales y granos. Ellos encontraron correlación estadísticamente significativa
entre la actividad antioxidante y el contenido de fenoles totales.
Algunos flavonoides como la quercetina, presentan mayor velocidad de reacción con
radicales libres in vitro que el -tocoferol. Se ha sugerido que esto es debido a la conjugación más extendida de sus estructuras, que lleva a radicales libres más
estabilizados. La presencia de dos o más grupos OH reactivos y menor impedimento
estérico en el sitio de abstracción también deben influir.
Los polifenoles son capaces de captar radicales alcoxilo (RO.), alquilperoxilo
(ROO.), superóxido (O2
.-) radical hidroxilo (HP
.), óxido nítrico (NO
.), además del oxidante
peroxinitrito (ONOO./ONOOH). La eficacia antioxidante de polifenoles in vivo todavía
necesita de ser evaluada, pues se conoce poco sobre su biodisponibilidad.
II.2.3 Anti-carcinogénesis:
Numerosos estudios in vitro indican que los flavonoides encontrados en plantas
pueden participar efectivamente en procesos que pueden tener efectos anticarcinogénicos
y anti-anterogénicos. Estos estudios han demostrado que los flavonoides inhiben la
carcinogénesis in vitro y evidencia sustancial indica que también lo hacen así in vivo
(Caltagirone et al., 2000; Miyagi et al., 2000). Los flavonoides pueden inhibir la
carcinogénesis afectando los eventos moleculares en las etapas de iniciación, promoción y
progresión. Los estudios en animales usando diferentes modelos celulares sugieren que
ciertos flavonoides podrían inhibir la iniciación de tumores así como el crecimiento de los
mismos (Makita et al., 1996; Tanaka et al., 1997, 1999).
Entre los procesos que previenen estas enfermedades, el más evidente es la
capacidad antioxidante de estos compuestos atribuida al poder reductor del grupo
hidroxilo aromático, que reduce radicales libres reactivos, produce el radical libre
fenoxilo estabilizado por resonancia. La capacidad antioxidante de los polifenoles es
influida por el número y posición de los grupos OH, así como por las posiciones de
glicosilación. Al contrario del ácido ascórbico y el -tocoferol, que actúan en medio
acuoso y en la cámara fosfolipídica celular, respectivamente, los flavonoides pueden
localizare en las dos fases.
En cuanto a la actividad anticancerígena de los flavonoides, Soleas et al. (2006)
compararon las actividades antitumorales de un fenol de cada uno de cuatro diferentes
clases: flavanoles [(+)-catequina], estilbenos (trans-resveratrol), flavonoles (quercetina) y
ácidos hidroxibenzoicos (ácido gálico). Para eso, fue utilizado un modelo de cáncer de
piel de ratón CD-1 en dos etapas, con el 9,10-dimetil-1,2-benzantraceno (DMBA) como
iniciador. Los ratones fueron tratados con polifenoles específicos en dosis entre 0 y 25
33
moles (disueltos en 200 L de acetona), dos veces por semana hasta dieciocho semanas.
La solución fue aplicada tópicamente en la región dorsal afeitada de cada animal Los
autores comparan las potencias relativas de los polifenoles, por la evaluación de la
inhibición de la formación de tumores en individuos y por el número de ratones que
desarrollaron uno o más tumores con los diferentes programas de dosis. La quercetina fue
la más efectiva (ED50< 1 mol) y el ácido gálico el menos efectivo (ED50 5-10 moles),
(+)-catequina y trans-resveratrol fueron intermedios, con ED50 entre 5 y 6 mol,
respectivamente. Los autores concluyeron que el trans-resveratrol podría ser el polifenol
anticancerígeno más efectivo de los presentes en el vino tinto en la forma como es
consumido por humanos saludables, ya que el trans-resveratrol es absorbido mucho más
eficientemente que la (+)-catequina y la quercetina en humanos después de la ingestión.
II.2.4 Evolución de la producción de flavonoides por las plantas.
Los flavonoides juegan un papel muy importante para la quimiosistemática, como
marcadores de la evolución de las plantas. Es aceptada la teoría de que las plantas
terrestres se derivaron de organismos como las algas verdes, sin embargo, no se han
encontrado flavonoides en las algas. Además, a pesar que los genomas de algunas algas se
han secuenciado, ninguno contiene marcos de lectura abiertos que muestren homología
con las secuencias de codificación de las enzimas conocidas en la biosíntesis de los
flavonoides. Así, la evolución inicial de la ruta de los flavonoides probablemente se
desarrolló después de la colonización del suelo. El grupo parafilético (briofitas),
representa las primeras plantas que colonizaron la tierra. Corresponde también a las
plantas que produjeron los primeros flavonoides, estando entre los tipos producidos por
estas plantas, las charconas, los flavonoles y las flaconas, que son derivadas de las
primeras tres enzimas de la ruta de los flavonoides (Lin y Weng, 2008).
Dos hipótesis han sido planteadas en relación a las funciones que pudieron dar
origen a la biosíntesis de flavonoides por las primeras plantas que colonizaron la tierra. La
primera hipótesis sugiere que los flavonoides se originaron como pantalla efectiva contra
la radiación UV cuando las plantas iniciaron la colonización de la tierra (Shirley, 1996).
Entre los hechos que dan soporte a esta hipótesis se encuentran las observaciones de que
aún los flavonoides simples, como chalconas, auronas y flavanonas, absorben fuertemente
longitudes de radiación UV, y que mutantes que no presentan estos compuestos son
extremamente susceptibles a daños por la radiación UV. En contraste, Stafford planteó en
1991 la hipótesis de que la primera función de los flavonoides fue regular las hormonas de
las plantas. Según Stafford, esta hipótesis es más probable, en vista que la de la
protección contra radiación UV ya que presumiblemente las primeras enzimas de los
flavonoides no eran tan eficientes como las enzimas actuales, y de esta forma los
flavonoides no podían acumularse en cantidades suficientes para proteger a las plantas.
Además de esto, ha sido demostrado que los flavonoides contribuyen a la regulación del
transporte de auxina en las angiospermas (Peer et al., 2004).
La última etapa evolutiva de los flavonoides corresponde a las gimnospermas y
angiospermas. En estos dos grupos fue donde hicieron su aparición las antocianinas. La
adición clave a la ruta de los flavonoides involucrada en esta etapa fue la enzima
34
antocianidina sintasa (ANS), posiblemente como resultado de la duplicación de genes de
la familia de las oxigenasas de pendientes del 2-oxo-glutarato. Esta enzima cataliza la
producción de las antocianinas coloreadas a partir de las leucoantocianidinas incoloras.
No esta claro, sin embargo, si fue la producción de color per se la que constituyó la
función original de las antocianinas. A pesar de la función señalizadota del color,
especialmente para los polinizadores y los agentes dispersores de frutas, es claramente la
función primaria de las antocianinas en las angiospermas, dicha señalización es rara sino
ausente en las gimnospermas de las cuales se desarrollaron las angiospermas (Lin y Weng,
2008). Se ha estimado que existe más de un millón de polifenoles naturales, en frutas y
vegetales, ya que los polifenoles se encuentran generalmente como glucósidos, existiendo
una gran variedad de especies de azúcares y las formas de enlace con la aglicona
(Herrmann, 1976; Wollenweber et al., 1981).
35
PARTE III
III.1 RESULTADOS
III.1.1 Colecta de plantas.
La Tabla 2 presenta los códigos y los sitios de colecta de los especimenes de las
plantas de estudio, en los departamentos de Escuintla, El Progreso, Zacapa,
Quetzaltenango, Retalhuleu, Izabal y Alta Verapaz.
Tabla 2. Códigos, localización geográfica y datos de rendimiento de aceite esencial
de las muestras de las plantas de estudio colectadas.
Código Nombre
científico Fecha Lugar
Altitud
(msnm)
Masa
(g)
Rend
(%)
LH.PACA.01.01 L. hispida L. 01-may-08 Volcán Pacaya, Escuintla 2.290 9.8 0.09
LH.PACA.02.01 L. hispida L. 08-nov-08 Volcán Pacaya, Escuintla 2.290
LH.KM93.01.01 L. hispida L. 30-jun-08 San Cristóbal Acasuaguastlán, El Progreso
278
LH.KM93.01.02A L. hispida L. 30-jun-08 San Cristóbal Acasuaguastlán, El Progreso
296 30 0.60
LH.KM93.01.02B L. hispida L. 30-jun-08 San Cristóbal Acasuaguastlán, El Progreso
296 27.3 0.65
LH.KM93.01.02C L. hispida L. 30-jun-08 San Cristóbal Acasuaguastlán, El Progreso
296 30 0.46
LH.KM93.01.POOL L. hispida L. 30-jun-08 San Cristóbal Acasuaguastlán, El Progreso
0.57
LH.SNJO.01.01A L. hispida L. 30-jun-08 Aldea San José, Teculután, Zacapa
248 29.2 0.33
LH.SNJO.01.01B L. hispida L. 30-jun-08 Aldea San José, Teculután, Zacapa
249 30.2 0.35
LH.SNJO.01.01C L. hispida L. 30-jun-08 Aldea San José, Teculután, Zacapa
250 31.4 0.24
LH.SNJO.01.01D L. hispida L. 30-jun-08 Aldea San José, Teculután,
Zacapa 251 30 0.29
LH.SNJO.01.03 L. hispida L. 30-jun-08 San Cristóbal Acasuaguastlán,
El Progreso 0.33
LH.CHOR.02.01A L. hispida L. 11-ene-09 Aldea Chorjalé, Cabricán,
Quetzaltenango 2.472 0.11
LH.CHOR.02.01B L. hispida L. 11-ene-09 Aldea Chorjalé, Cabricán,
Quetzaltenango 2.472 0.23
LH.CHOR.02.01C L. hispida L. 11-ene-09 Aldea Chorjalé, Cabricán,
Quetzaltenango 2.472 0.17
LH.LGRA.02.01 L. hispida L. 11-ene-09 Aldea La Grandeza, Cabricán,
Quetzaltenango 2.462
LH.KM93.02.01 L. hispida L. 11-ene-09 San Cristóbal Acasuaguastlán,
El Progreso 278 0.72
LH.SNJO.02.01A L. hispida L. 11-ene-09 Aldea San José, Teculután,
Zacapa 248 0.30
LH.SNJO.02.01B L. hispida L. 11-ene-09 Aldea San José, Teculután,
Zacapa 249 0.35
LH.KM93.03.01 L. hispida L. 10-may-09 San Cristóbal Acasuaguastlán,
El Progreso 278
LH.SNJO.03.01 L. hispida L. 10-may-09 Aldea San José, Teculután,
Zacapa 232
LH.CHIC.03.01 L. hispida L. 10-may-09 Aldea El Chico, Usumatlán,
Zacapa 999
LC.ZUNI.01.01A L. camara L. 06-jul-08 Carretera a Zunil, 2.085 25 0.09
36
Quetzaltenango
LC.ZUNI.01.01B L. camara L. 06-jul-08 Carretera a Zunil,
Quetzaltenango 2.086 20 0.09
LC.ZUNI.01.02 L. camara L. 06-jul-08 Aldea La Calera, Zunil,
Quetzaltenango 2.010
LC.ZUNI.01.03 L. camara L. 06-jul-08 Carretera a Zunil,
Quetzaltenango 1.989
LC.ZUNI.01.04 L. camara L. 06-jul-08 Aldea La Calera, Zunil,
Quetzaltenango 2.010
LC.SNFE.01.01 L. camara L. 06-jul-08 San Felipe, Retalhuleu 620 30 0.09
LC.ZUNI.02.01 L. camara L. 11-ene-09 Carretera a Zunil,
Quetzaltenango 2.085 14.1 0.22
LC.ZUNI.02.02A L. camara L. 11-ene-09 Aldea La Calera, Zunil,
Quetzaltenango 2.010 23.4 0.34
LC.ZUNI.02.02B L. camara L. 11-ene-09 Aldea La Calera, Zunil,
Quetzaltenango 2.010 20 0.11
LC.ZUNI.02.03A L. camara L. 11-ene-09 Carretera a Zunil,
Quetzaltenango 1.989 25 0.12
LC.ZUNI.02.03B L. camara L. 11-ene-09 Carretera a Zunil,
Quetzaltenango 1.989 20 0.17
LC.ZUNI.02.03C L. camara L. 11-ene-09 Carretera a Zunil,
Quetzaltenango 1.989 25 0.46
LC.ZUNI.02.04 L. camara L. 11-ene-09 Aldea La Calera, Zunil,
Quetzaltenango 2.010 20 0.39
LC.SNFE.02.01 L. camara L. 11-ene-09 San Felipe, Retalhuleu 620
LC.ZUNI.03.01A L. camara L. 26-abr-09 Carretera a Zunil, Quetzaltenango
2.085 26.3 0.07
LC.ZUNI.03.02 L. camara L. 26-abr-09 Aldea La Calera, Zunil, Quetzaltenango
2.010 20 0.17
LC.ZUNI.03.01B L. camara L. 26-abr-09 Carretera a Zunil, Quetzaltenango
2.085 25 0.13
LC.ZUNI.03.03A L. camara L. 26-abr-09 Carretera a Zunil, Quetzaltenango
1.989 19 0.10
LC.ZUNI.03.03B L. camara L. 26-abr-09 Carretera a Zunil, Quetzaltenango
1.989 19 0.16
LC.ZUNI.03.04 L. camara L. 26-abr-09 Aldea La Calera, Zunil, Quetzaltenango
2.010 25 0.13
LT.LAMA.01.01A L. trifolia L. 31-ago-08 Carretera a Aldea Santa Inés, Los Amates, Izabal
103 25 0.03
LT.LAMA.01.01B L. trifolia L. 31-ago-08 Carretera a Aldea Santa Inés, Los Amates, Izabal
103 25 0.51
LT.LAMA.01.02A L. trifolia L. 31-ago-08 Carretera a aldea Santa Inés, Los Amates, Izabal
103 25 0.09
LT.LAMA.01.02B L. trifolia L. 31-ago-08 Carretera a aldea Santa Inés, Los Amates, Izabal
103 19.5 0.13
LT.LAMA.01.02C L. trifolia L. 31-ago-08 Carretera a aldea Santa Inés, Los Amates, Izabal
103 25 0.01
LT.LAMA.01.03 L. trifolia L. 31-ago-08 Carretera a aldea Santa Inés, Los Amates, Izabal
93 0.13
LT.LAMA.02.01A L. trifolia L. 07-dic-08 Carretera a aldea Santa Inés, Los Amates, Izabal
103 25 0.25
LT.LAMA.02.01B L. trifolia L. 07-dic-08 Carretera a aldea Santa Inés, Los Amates, Izabal
103 25 0.32
LT.LAMA.02.01C L. trifolia L. 07-dic-08 Carretera a aldea Santa Inés, Los Amates, Izabal
103 25 0.36
LT.LAMA.02.03A L. trifolia L. 07-dic-08 Carretera a aldea Santa Inés, Los Amates, Izabal
93 28 0.18
LT.LAMA.02.03B L. trifolia L. 07-dic-08 Carretera a aldea Santa Inés, Los Amates, Izabal
93 27 0.27
LT.LAMA.02.03C L. trifolia L. 07-dic-08 Carretera a aldea Santa Inés, Los Amates, Izabal
93 20 0.17
37
LT.LAMA.02.03D L. trifolia L. 07-dic-08 Carretera a aldea Santa Inés,
Los Amates, Izabal 93 25 0.10
LT.LAMA.02.03E L. trifolia L. 07-dic-08 Carretera a aldea Santa Inés,
Los Amates, Izabal 93 30 0.05
LT.LAMA.02.04 L. trifolia L. 07-dic-08
Carretera de aldea Santa Inés a
aldea Gayuser, Los Amates,
Izabal
100
LT.LAMA.02.05 L. trifolia L. 07-dic-08
Carretera de aldea Santa Inés a
aldea Gayuser Los Amates,
Izabal
105
LT.LAMA.03.06ª L. trifolia L. 07-abr-09 Carretera a aldea Santa Inés,
Los Amates, Izabal 100 30 0.03
LT.LAMA.03.06ª L. trifolia L. 07-abr-09 Carretera a aldea Santa Inés,
Los Amates, Izabal 100 30 0.02
LT.LAMA.03.07 L. trifolia L. 02-may-09
Carretera de terracería de
Rubelsanto a Parque Nacional Laguna Lachúa, Alta Verepaz
165
Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007.
III.1.2 Determinación del porcentaje de humedad
En la tabla 3 se observan los porcentajes de humedad obtenidos de las muestras en
que se determinó humedad, obteniéndose como resultados porcentajes desde 13.08 %
hasta 14.80 %.
Tabla 3. Porcentaje de humedad
No. muestra Muestra Peso (g) Porcentaje de Humedad
1 LC.ZUNI.01.01 0.5 14.55
2 LC.ZUNI.01.04 0.5 13.80
3 LT.LAMA.01.01 0.5 14.75
4 LH.SNFE.01.01 0.5 14.01
5 LT.LAMA.01.03 0.5 13.08
6 LH.KM93.01.01 0.5 14.80
Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007. Balanza de humedad utilizada: HB35 Halogen.
III.1.3 Aceites esenciales
La tabla 4 presenta los resultados de rendimiento de extracción de los aceites
esenciales de las plantas de estudio, mientras que las tablas 5, 6 y 7 presentan los
resultados de los análisis cromatográficos de los aceites.
III.1.3.1 Rendimiento
La Tabla 4 presenta los resultados del rendimiento de extracción por hidrodestilación
del aceite esencial de las plantas de estudio, utilizando un aparato tipo Clevenger. La
planta que presentó el rendimiento más elevado fue L. hispida con 0.38 %, mientras que L.
camara y L. trifolia presentaron un rendimiento bajo (0.18 y 0.17 %, respectivamente). No
fue posible obtener los rendimientos por la técnica de destilación-extracción, ya que los
bajos contenidos de aceite esencial de las especies de estudio no permiten la evaluación de
los mismos por esta técnica.
38
Tabla 4. Rendimiento de Extracción de aceite esencial por especie.
Especie n % de rendimiento
Lantana hispida 16 0.38
Lantana camara 17 0.18
Lantana trifolia 17 0.17
n = número de especimenes extraídos.
Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007.
III.1.3.2 Composición del aceite esencial de Lantana hispida
El aceite esencial de L. hispida presentó como componentes mayoritarios, sabineno
(6.59-13.91 %; no se encontró sabineno en especimenes colectados en San José, Zacapa, y
Cabricán, Quetzaltenango), limoneno (2.9-24.34 %), -cariofileno (16.44-30.61 %) y germacreno D (9.05-18.5 %) (Tabla 5).
Tabla 5. Resultados del análisis de muestras de Lantana hispida por Cromatografía de
gases, expresados en porcentajes de área. En los códigos de muestras se han omitido las
siglas LH, correspondientes a las iniciales de la especie. IK teórico Sustancia KM93.01.01 KM93.01.02 KM93.01.04 SNJO.01.01D CHOR.02.01B
ND NI 0.81
930 -thujeno 0.74 0.91 16.43
939 -pineno 2.4 2.62 4.68 4.42 2.54
975 Sabineno 13.91 13.17 6.59
979 -pineno 1.02 11.51
ND NI 0.7
991 -mirceno 1.55 1.51 4.35
1003 -felandreno 4.73 4.16
1017 -terpineno 2.49 3.55
1025 p-cimeno 3.05 2.74 1.72
1029 Limoneno 10.97 10.42 2.9 24.34
1031 1,8-cineol 7.35 6.43 4.97
1037 Ocimeno 0.74
1060 -terpineno 1.07 1.48
1097 -linalol 1.06 1.17
1177 1-terpinen-4-ol 1.06 1.48
ND NI 0.57
1189 -terpineol 0.62
1290 Timol 1.48 1.15 3.77
1375 -copaeno 5.85 1.57 4.71
1388 -bourboneno 0.67
1391 -elemeno 0.64 1.07 2.88 0.65
1404 Metileugenol 2.51
1419 -cariofileno 16.44 21.75 30.61 23 15.62
1455 -cariofileno 1.32 1.58 1.76
1460 Aloaromadendreno 1.05
1485 germacreno D 9.05 10.62 18.5 17.66 14.33
1498 -selineno 3.42 3.78 5.15
ND NI 1.08
ND NI 0.58
1506 (E,E)--farneseno 0.68 0.88
1514 -cadineno 0.63 10.92
1523 -cadineno 3.81
39
1561 Germacreno B 1.28 1.33
1578 Espatulenol 3.32 2.61 2.86 3.76
ND NI 0.83
1583 óxido de cariofileno 3.41 2.25 3.53 5.76
1640 Epi--cadinol 0.57
1654 -Cadinol 1.27
ND NI 5.99 7.96
ND NI 1.54 3.45
ND NI 0.37
ND NI 1.27
ND NI 0.66
1658 -oxido de bisabolol B 3.23
1672 Epi--Bisabolol 4.87
1686 -bisabolol 3.75 3.35
ND NI 0.34
SUMA 99.42 100.0 100.0 100.0 99.98
NI = No identificado.
Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007.
III.1.3.3 Composición del aceite esencial de Lantana camara
El aceite esencial de L. camara presentó como componentes mayoritarios, -
cariofileno (4.45-32.97 %) y germacreno D (29.5-50.36 %), presentes en todas las
muestras, las cuales presentaron más del 70 % de compuestos correspondientes a
sesquiterpenoides (Tabla 6).
Tabla 6. Resultados del análisis de muestras de Lantana camara por Cromatografía de
gases, expresados en porcentajes de área. En los códigos de muestras se han omitido las
siglas LC, correspondientes a las iniciales de la especie.
IK teórico Sustancia ZUNI.01.01 ZUNI.02.02 ZUNI.03.03 ZUNI.02.04 ZUNI.02.01 LACH.04.01
930 -thujeno 1.59 2.55 4.71
939 -pineno
975 Sabineno 1.09 0.32 7.67
979 -pineno 2.09
1025 p-cimeno
1029 Limoneno 2.61 5.78 16.26 3.11
1031 1,8-cineol 0.87 2.51 2.99
1037 Ocimeno 1.32
1060 -terpineno
1097 -linalol 2.02 7.34 0.59 10.12
1238 Neral 0.53 0.93 7.77
1267 Geranial 0.66
1290 Timol 3.62
ND NI
1338 -elemeno 0.46
1351 -Cubeneno
1369 NI
1375 -copaeno 0.45
1388 -bourboneno 0.62 0.58 0.96 1.95
1391 -elemeno 5.83 3.46 2.13 1.72 3.09
1419 -cariofileno 32.97 29.83 21.74 22.13 28.73 4.45
1432 -copaeno
40
1455 -cariofileno 1.88 1.57 2.37
1460 Aloaromadendreno 1.37 1.17 1.06 1.55 5.56 2.15
1480 -muuroleno 0.57 0.58 2.00 1.30
1485 germacreno D 29.54 29.6 29.5 50.36
1493 -selineno 39.26 18.47 2.12
1498 -selineno 10.85 15.28 5.69 1.92
ND NI 9.97 16.91
ND NI 4.56
1506 (E,E)--farneseno 3.24 1.37 2.12 0.54 2.34
1514 -cadineno 0.65 1.20 12.89
1523 -cadineno 0.75 0.57
1550 Elemol
1561 Germacreno B 0.99
1563 E-nerolidol 4.18
1568 NI
1578 Espatulenol 0.93 1.7 1.04 4.44
1583 óxido de cariofileno 1.02 2.52 1.08
ND NI 2.68
ND NI 2.72
ND NI 1.14
1604 NI 1.30
1608
Epóxido de humuleno
II
ND NI 0.76
1640 Epi--cadinol 0.79
ND NI
1646 -muurolol
1654 -cadinol 2.71 1.81
1658 -oxido de bisabolol B 1.25
1672 Epi--Bisabolol
1686 -bisabolol
1691 NI 1.06
SUMA 99.99 98.91 100.0 99.98 100.0 98.17
NI: No identificado. Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007.
III.1.3.4 Composición del aceite esencial de Lantana trifolia
El aceite esencial de L. trifolia presentó como componentes mayoritarios, α-copaeno
(3.67-12.48 %, presente en tres de las cuatro muestras analizadas), metileugenol (21.06-
40.01 %, presente en todas las muestras analizadas), y muuroleno (17.8-22.09 %) por lo
que su composición es diferente del aceite de las otras dos plantas estudiadas (tabla 7).
Tabla 7. Resultados del análisis de muestras de Lantana trifolia por Cromatografía de
gases, expresados en porcentajes de área. En los códigos de muestras se han omitido las
siglas LT, correspondientes a las iniciales de la especie. IK teórico Sustancia LAMA.01.01 LAMA.02.03 LAMA.01.03 LACH.04.02
975 Sabineno 2.16 0.69 3.51
1025 p-cimeno 1.26
1029 Limoneno 0.68
1031 1,8-cineol 2.05
ND NI 1.57
1097 -linalol 2.83 0.84
ND NI 0.88
ND NI 0.98
1238 Neral 4.09
41
1257 Acetato de Linalilo 0.73
1290 Timol 5.36 0.99 1.29 3.51
1338 -elemeno
1351 -Cubeneno 1.27 0.91
1369 NI 3.99
1375 -copaeno 10.39 12.48 3.67
1391 -elemeno 3.55 3.48 1.44 1.69
1404 Metileugenol 40.01 3.3.32 21.63 21.06
1432 -copaeno 5.19
1435 trans-bergamoteno 7.3 3.45 4.7 8.35
1455 -cariofileno 1.82 7.48
1460 Aloaromadendreno 1.72 1.21 1.39
1480 -muuroleno 22.09 17.8 18.79
1485 germacreno D 0.73 7.31
ND NI 0.68
1493 -selineno 1.4 1.56
1498 -selineno 2.41 2.68 3.78 1.54
ND NI 1.89
ND NI 4.77
ND NI 0.33
1506 (E,E)--farneseno 1.91
1507 Z--bisaboleno 1.1 2.01
1514 -cadineno 3.8 4.15 1.9 2.79
1550 Elemol 3.03
1561 Germacreno B 2.84 9.01
1568 NI 0.69 2.58
1578 Espatulenol 5.06 2.6 2.2 6.09
1583 óxido de cariofileno 1.33 1.32
1608
Epóxido de humuleno
II 1.55
1632 -eudesmol 1.81
1654 -Cadinol 1.38 6.89 1.38
ND NI 1.72
ND NI 2.65
SUMA 99.97 98.93 98.93 96.64
NI: No identificado
Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007.
III.1.3.5 Evaluación de la actividad biológica, antioxidante e índice de refracción de
los aceites esenciales de las plantas de estudio
Como puede apreciarse en la Tabla 8, ninguno de los aceites esenciales de las plantas
estudiadas presentó actividad antioxidante por el método del DPPH, ni contra los
microorganismos S. aureus, S. typhi y E. coli, lo cual puede deberse a que los aceites no
presentan compuestos fenólicos o con funciones alcohólicas en porcentajes elevados.
Tabla 8. Actividad biológica, antioxidante e índice de refracción de los aceites
esenciales
Especie S. aureus S. typhi E. coli Antioxidante IR
Lantana camara Negativo Negativo negativo negativo ND
Lantana hispida Negativo Negativo negativo negativo 1.4960
Lantana trifolia Negativo Negativo negativo ND ND
NM: no determinado. Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007.
42
III.1.3.6 Actividad biocida y antioxidante de extractos con solvente de las plantas de
estudio.
La Tabla 9 presenta los resultados de actividad biocida de los extractos metanólicos de las
tres plantas del género Lantana estudiadas. Ningúno de los extractos presentó actividad
contra los microrganismos evaluados.
Tabla 9. Actividad biocida de extractos etanólicos de las especies de Lantana a una
concentración de 1 mg de extracto/mL
Procedencia Parte Escherichia coli
ATCC 25922
Salmonella typhi
ATCC 14028
Staphylococcus aureus
ATCC25923 L. hispida Hoja Negativo negativo negativo L. cámara Rizoma Negativo negativo negativo L. trifolia Hoja Negativo negativo negativo
Fuente: FODECYT 011-2007
La Tabla 10 presenta los resultados de actividad antioxidante de los extractos de las tres
plantas del género Lantana estudiadas, determinada por el método de la extinción del
radical libre DPPH. Para las plantas L. hispida y L. trifolia se evaluaron los extractos
etanólicos obtenidos directamente del material vegetal y del material vegetal previamente
extraído con diclorometano. En el caso de L. camara, se evaluó la actividad antioxidante
del extracto metanólico correspondiente. Los extractos diclorometánicos de las tres plantas
de estudio, no presentaron actividad antioxidante.
Tabla 10. Actividad antioxidante de extractos de las especies de Lantana estudiadas y
del antioxidante artificial BHT, expresada como IC50 (concentración de extracto que
inhibe la concentración del DPPH al 50 %).
No. Muestra IC50 (g/mL)
1 L. hispida CH2Cl2/etanol 95% 50.24
2 L. trifolia CH2Cl2/etanol 95% 28.29
3 L. hispida etanol 95% 74.34
4 L. trifolia etanol 95% 29.15
5 L. hispida CH2Cl2 ND
6 L. trifolia CH2Cl2 ND
7 L. camara CH2Cl2 ND
8 L. camara metanólico 29.32
9 BHT etanol 95% 34.22
ND: No detectado.
Fuente: FODECYT 011-2007
43
III.1.4 Tamizaje fitoquímico
En las tablas 11 a 15 se presentan los resultados obtenidos mediante pruebas macro y
semimicro y cromatografía en capa fina (CCF) de los metabolitos evaluados, habiéndose
detectado la presencia de alcaloides, flavonoides y saponinas en CCF.
III.1.4.1 Alcaloides
Tabla 11. Presencia de alcaloides en las plantas Lantana camara L., Lantana hispida
HBK y Lantana Trifolia L.
No.
Muestra
Muestra Reactivo
Mayer’s
Reactivo
Dragendorff
Reactivo
Wagner
1 LC.ZUNI.01.01 - - + Marrón
2 LC.ZUNI.01.04 - - -
3 LT.LAMA.01.01 - - + Marrón
4 LH.SNFE.01.01 - - + Marrón
5 LT.LAMA.01.03 - + (naranja) + Marrón
6 LH.KM93.01.01 - + (naranja) + Marrón
Reactivo Mayer’s cambio de color blanco a crema (+)
Reactivo Dragendorff cambio de color rojo a naranja (+)
Reactivo Wagner cambio de color marrón (+).
Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007.
Tabla 12. Detección de Alcaloides por CCF
No. Mx Muestra No.
Bandas
Rf Color de la banda
1 LC.ZUNI.01.01
2 0.50
0.68
Naranja, naranja
2 LC.ZUNI.01.04
2 0.38
0.55
Naranja, naranja
3 LT.LAMA.01.01
2 0.33
0.38
Naranja, naranja
4
LH.SNFE.01.01
3 0.23
0.30
0.37
Naranja, naranja,
naranja
5
LT.LAMA.01.03
3 0.23
0.32
0.42
Naranja, naranja,
naranja
6 LH.KM93.01.01
2 0.28
0.42
Naranja, naranja
Estándar
Papaverina
1 0.28 Naranja
Atropina 1 0.08 Naranja
Reserpina 1 0.22 Naranja
Fase móvil: tolueno, acetato de etilo, dietilamina (70:20:10).
Revelador utilizado: Reactivo de Dragendorff.
Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007.
44
III.1.4.2 Flavonoides y antocianinas
Tabla 13. Detección de flavonoides y antocianinas por CCF
No. Mx Muestra No.
Bandas
Rf Color de la banda
1 LC.ZUNI.01.01 2 0.50, 0.68 Naranja, naranja
2 LC.ZUNI.01.04 2 0.38, 0.55 Naranja, naranja
3 LT.LAMA.01.01 2 0.33, 0.38 Naranja, naranja
4 LH.SNFE.01.01
3 0.23, 0.30, 0.37 Naranja, naranja,
naranja
5 LT.LAMA.01.03
3 0.23, 0.32, 0.42 Naranja, naranja,
naranja
6 LH.KM93.01.01 2 0.28, 0.42 Naranja, naranja
Estándar de Flavonoides 3 0.09, 0.22, 0.28 Naranja
Fase móvil: n-butanol-ácido acético-agua (40:10:50)
Reactivo Revelador: Productos naturales (NP/PEG).
Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007.
III.1.4.3 Saponinas
Tabla 14. Detección de saponinas mediante la prueba de espuma
No. Mx Muestra Reactivo
(KOH)
Observación
1 LC.ZUNI.01.01 + Se observó
formación de espuma. Si
una capa de espuma mayor
de 3 cm persiste en la
superficie líquida pués de 30
minutos se presume la
presencia de saponinas.
2 LC.ZUNI.01.04 +
3 LT.LAMA.01.01 +
4 LH.SNFE.01.01 +
5 LT.LAMA.01.03 +
6 LH.KM93.01.01 +
Estándar de saponinas +++
+ poca formación de espuma
+++ abundante formación de espuma
Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007.
Tabla 15. Detección de Saponinas por CCF
No. Muestra No. Bandas Rf Color de la banda
1 LC.ZUNI.01.01 1 0.97 Violeta
2 LC.ZUNI.01.04 1 0.94 Violeta
3 LT.LAMA.01.01 1 0.94 Violeta
4 LH.SNFE.01.01 1 0.96 Violeta
5 LT.LAMA.01.03 1 0.96 Amarillenta
6 LH.KM93.01.01 1 0.96 Amarillenta
Estándar de Saponinas 1 0.69 Violeta
Fase móvil: n-butanol-ácido acético-agua (50:10:40)
Revelador: vainillina-ácido sulfúrico.
Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007.
45
III.1.4.4 Antraquinonas, cumarinas, principios amargos y taninos:
Las tablas 16, 17, 18, 19 y 20 presentan los resultados de tamizaje fotoquímico
correspondiente a los metabolitos secundarios antraquinonas, cumarinas, principios
amargos y taninos. No fue detectada la presencia de compuestos correspondientes a estas
familias en ninguna de las seis muestras de las plantas de estudio.
Tabla 16. Presencia de Antraquinonas
No.
Muestra
Muestra Bornträger Bornträger
modificado
1 LC.ZUNI.01.01 - -
2 LC.ZUNI.01.04 - -
3 LT.LAMA.01.01 - -
4 LH.SNFE.01.01 - -
5 LT.LAMA.01.03 - -
6 LH.KM93.01.01 - -
Prueba de Bornträger cambios de color en la fase alcalina (color rojo, rosado: +).
Prueba de Bornträger modificado cambios de color en fase alcalina (color rojo, rosado: +).
Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007.
Tabla 17. Presencia de Cumarinas
No.
Muestra
Muestra Reactivo
(KOH)
Observación
1 LC.ZUNI.01.01 - No se observó
fluorescencia
azul o verde,
bajo luz UV de
365 nm
2 LC.ZUNI.01.04 -
3 LT.LAMA.01.01 - 4 LH.SNFE.01.01 -
5 LT.LAMA.01.03 - 6 LH.KM93.01.01 -
Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007.
Tabla 18. Cromatografía en capa fina Cumarinas
No. Muestra Muestra No. De
bandas
Rf Color de la
banda
1 LC.ZUNI.01.01 0 0
2 LC.ZUNI.01.04 0 0
3 LT.LAMA.01.01 0 0
4 LH.SNFE.01.01 0 0
5 LT.LAMA.01.03 0 0
6 LH.KM93.01.01 0 0
Ácido p-cumarico 1 0.07 Verde
Umbelliferona 1 0.07 Verde
Cumarinas 1 0.34 Verde
Fase móvil: tolueno-acetato de etilo (93:7)
Revelador: solución etanólica de hidróxido de potasio al 5%.
Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007.
46
Tabla 19. Presencia de Principios Amargos en Cromatografía en Capa Fina
No.
Muestra
Muestra No. de
bandas
Rf Color de la
banda
1 LC.ZUNI.01.01 0 0
2 LC.ZUNI.01.04 0 0
3 LT.LAMA.01.01 0 0
4 LH.SNFE.01.01 0 0
5 LT.LAMA.01.03 0 0
6 LH.KM93.01.01 0 0
Neuroloena
lobata
1 0.17 Amarillenta
Fase móvil: acetato de etilo-metanol-agua (97:15:8)
Revelador: vainillina-ácido sulfúrico. Las seis muestras dieron resultados negativos.
Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007.
Tabla 20. Presencia de Taninos
No.
Muestra
Muestra Gelatina
al 1%
Gelatina-
sal
Cloruro férrico
al 10%
1 LC.ZUNI.01.01 - - -
2 LC.ZUNI.01.04 - - -
3 LT.LAMA.01.01 - - -
4 LH.SNFE.01.01 - - -
5 LT.LAMA.01.03 - - -
6 LH.KM93.01.01 - - -
Observación de formación de precipitados y/o cambio de coloración es positivo (+). Las
seis muestras dieron resultados negativos (-).
Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007.
47
III.1.5 Extracción de metabolitos secundarios por maceración con diclorometano y metanol
En las tablas 21 y 22 se presentan los resultados de rendimento de los extractos
metabólicos y diclorometánicos, respectivamente, observándose mayores rendimientos en
los extractos metanólicos que en los extractos diclorometánicos para las tres plantas. Esto
puede estar relacionado a un alto contenido de compuestos fenólicos como los flavonoides
y bajo contenido de compuestos poco polares como los presentes en los aceites esenciales.
Tabla 21. Extractos metanólicos
Muestra
Material
Vegetal (g)
Extracto
(g)
Rendimiento
% Propiedades Organolépticas
LT.LACH.04.01 50.03 21.5566 43.09
Consistencia muy dura, color
pardo a negro, olor muy débil e
indescriptible
LC.GUA.04.01 50.05 6.2761 12.54
Consistencia muy dura, color
pardo a negro, olor muy débil e
indescriptible
LH.CHIC.03.01 51.86 9.9636 19.21
Consistencia muy dura, color
pardo a negro, olor muy débil e
indescriptible
Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007.
Tabla 22. Extractos diclorometánicos
Especie
Material
Vegetal (g)
Extracto
(g)
Rendimiento
% Propiedades Organolépticas
LT.LACH.04.01 50.03 1.5987 3.20
Consistencia suave, color pardo
a negro, olor ligeramente dulce
LC.GUA.04.01 50.05 3.3591 6.71
Consistencia dura, color pardo a
negro y olor muy dulce
LH.CHIC.03.01 51.86 3.1305 6.04
Consistencia suave, color pardo
a negro, olor muy débil e
indescriptible
Fuente: Proyecto FODECYT 011-2007.
48
III.2 Discusión de Resultados
III.2.1 Rendimiento de extracción de aceites esenciales
El aceite esencial de una planta es una fracción líquida volátil, para la cual existen
diversas técnicas de extracción. En la presente investigación se utilizó la técnica de
hidrodestilación con aparato tipo Clevenger, la cual es una técnica reproducible y que
presenta alto rendimiento de extracción.
En el presente trabajo, fueron utilizados entre 10.0 y 30.0 g de material vegetal seco
para realizar la extracción del aceite esencial por hidrodestilación. En los casos en que se
usaron menos de 20.0 g para la extracción, se debió a que la planta era escasa en algunos
sitios de muestreo. Los sitios de muestreo se presentan en la Tabla 1 en Resultados, donde
se presentan los códigos de las muestras, el lugar de colecta, la altitud y el rendimiento de
extracción. En la revisión de literatura, no se encontró información sobre el rendimiento
de aceite esencial en este género; pero por estudios previos se tiene conocimiento que
distintos géneros de la Familia Verbenaceae tienen buenos rendimientos de aceites
esenciales (Pérez, 2008).
Casi todas las muestras y submuestras presentaron porcentajes de rendimiento bajos
por debajo del 0.5 %, el cual se sugiere como aceptable para la producción de aceites
esenciales (Aragão et al., 1981; Pérez, 2008); la excepción fueron las muestras:
LH.KM93.01.02 A y B, y LT.LAMA.01.03 C que presentaron porcentajes de
rendimientos de aceites esenciales superiores a 0.5%. También se puede observar en la
Tabla 4 que el rendimiento promedio de extracción del aceite esencial de L. hispida fue el
más alto (0.38 %), mientras que para L. camara y L. trifolia, fue de 0.18 y 0.17 %,
respectivamente. Estos últimos dos rendimientos son bajos, pero considerando que las
tres especies estudiadas, por lo que en vista de los resutados de composición obtenidos, en
que L. hispida presenta alto porcentaje de metileugenol, esta planta presentaría el mayor
potencial para la extracción del aceite esencial.
Por otra parte, no se observaron diferencias en las colectas realizadas en meses
diferentes, por ejemplo en el caso de L. hispida, que fue colectada en San Cristóbal
Acasaguastlán, El Progreso y en San José, Zacapa, en los meses de junio de 2008 y enero
de 2009, los rendimientos fueron similares en ambos meses. En el caso de L. hispida, si se
observaron diferencias en el rendimiento de extracción entre los dos municipios
mencionados, con mayores rendimientos en las muestras colectadas en San Cristóbal
Acasaguastlán (0.46-0.72 %) que en las colectadas en San José (0.24-0.35 %), por lo que
en el caso de esta especie si influye la situación geográfica. En el caso de L. camara y L.
trifolia, no se observaron diferencias marcadas en los rendimientos entre diferentes sitios
de colecta ni entre diferentes meses.
III.2.2 Composición de los aceites esenciales de las plantas de estudio:
Las tablas 5, 6 y 7 presentan los resultados de los análisis cromatográficos de los
aceites esenciales de L. hispida, L. camara y L. trifolia, obtenidos por hidrodestilación con
aparato tipo Clevenger. El aceite esencial de L. hispida presentó principalmente sabineno,
49
-cariofileno y germacreno D, todos en porcentajes promedio superiores a 10 % (tabla 5),
siendo el primero de ellos un monoterpeno y los segundos, sesquiterpenos, que resultaron
ser los compuestos dominantes en la composición del aceite esencial. No se observaron
diferencias marcadas en la composición de los aceites esencial de L. hispida de diferentes
localidades, con excepción del aceite esencial de San José, Zacapa, que presentó mayor
diversidad (29 compuestos), entre ellos 9 compuestos menores no identificados. El -cariofileno y el germacreno D son compuestos que pueden ser utilizados como base para
la síntesis de otros compuestos que podrían presentar actividad biológica, por lo que la
producción de aceite esencial de esta planta podría ser orientada para la obtención de estos
compuestos como materia prima. El aceite esencial de L. hispida no presentó actividad
biológica contra los microorganismos investigados. Al ser L. hispida la planta que
presentó mayor rendimiento de aceite esencial (0.46-0.72 %), se considera que de las
plantas estudiadas es la que presentaría mayor potencial económico para producción del
aceite esencial.
El aceite esencial de L. camara presentó -cariofileno (4.45-32.97 %) y germacreno
D (29.5-50.36 %) como componentes mayoritarios, presentando los aceites de esta planta
más del 70 % correspondiente a compuestos sesquiterpenoides (Tabla 6). En vista del
bajo rendimiento de extracción (0.18 %), la falta de actividad biológica del aceite y la
presencia de los mismos compuestos mayoritarios que el aceite de L. hispida, el aceite
esencial de L. camara presenta menor potencial económico que el de L. hispida. No se
observaron diferencias marcadas en la composición del aceite esencial correspondiente a
diferentes localidades de colecta.
El aceite esencial de L. trifolia presentó -copaeno (3.67-12.48 %), metileugenol
(21.06-40.01 %), y muuroleno (17.8-22.09 %), como principales componentes (tabla 7).
Estos compuestos no presentan porcentajes elevados en las otras dos especies estudiadas,
por lo que sería un factor de diferenciación para la producción del aceite esencial. El
metileugenol puede ser un precursor en la síntesis de compuestos con actividad biológica.,
por lo que la producción del aceite esencial de L. trifolia, a pesar del bajo rendimiento de
extracción (0.17 %) podría orientarse a la obtención de este compuesto. No se observaron
diferencias marcadas en la composición del aceite esencial en las dos localidades ni en
meses diferentes.
III.2.3 Tamizaje fitoquímico y extractos diclorometánicos y metanólicos
El tamizaje fitoquímico se realizó en seis muestras; dos de cada especie de la familia
Lantana: L. camara, L. hispida y L. trifolia provenientes de distintos lugares. El tamizaje
fitoquímico se realizó con el fin de determinar cualitativamente los siete grupos
principales de constituyentes químicos presentes en planta, ya que en Guatemala no se le
ha realizado ningún estudio previo; tales como alcaloides, taninos, flavonoides (fenoles),
principios amargos, antraquinonas, cumarinas y saponinas. Se realizaron extracciones con
metanol a partir de material vegetal seco, tanto con maceración como con ultrasonido, no
habiéndose observado diferencias en los grupos de metabolitos secundarios extraidos con
los dos métodos, analizados por pruebas colorimétricas (ensayo macro) cualitativas y un
análisis por cromatografía en capa fina.
50
Se puede observar en la Tabla 3, que el porcentaje de humedad en todos los casos
fue superior al 10 %, Esto no es relevante ya que la finalidad de reducir el porcentaje de
humedad del material vegetal al 10 % es de poder almacenarlo sin que pierda su integridad
por un período de dos años aproximadamente, y esa no fue la finalidad de este estudio.
Un grupo de metabolitos secundarios de gran importancia es el conformado por los
alcaloides. Esto se debe a que presentan actividad contra una gran cantidad de herbívoros
provenientes de diferentes familias. Los resultados de las pruebas realizadas a las seis
muestras se presentan en la Tabla 11; se puede observar que se realizaron tres pruebas
colorimétricas (ensayo macro) para indicar la presencia de alcaloides. Para que se pueda
tomar como significativa la presencia de alcaloides, tienen que ser positivas por lo menos
dos de las tres pruebas realizadas, de lo contrario no son significativas. Las muestras No.
5 (L. trifolia) y 6 (L. hispida), (LT.LAMA.01.03 y LH.KM93.01.01 respectivamente)
dieron positivas en las pruebas con el reactivo de Dragendorff y Wagner (Trease y Evans,
1991). La desventaja de este tipo de pruebas es que en muchas ocasiones se pueden
obtener resultados ambiguos, es decir, falsos positivos; es por eso que se realizó la
cromatografía en capa fina, solamente para saber de una forma muy general si hay
presencia o no de alcaloides. Se puede observar en la Tabla 12, que en la cromatografía de
capa fina, las seis muestras presentaron cualquier tipo de alcaloide. Se utilizaron tres
estándares de alcaloides específicos (Papaverina, Atropina y Reserpina), estos se
utilizaron con el fin de tener una referencia de comparación en el color de las bandas
siempre dependiendo del reactivo revelador (bandas naranjas o cafés), y también a su vez
se pudo realizar una comparación entre los factores de retención (Rf) teóricos versus los
obtenidos experimentalmente de las seis muestras. Con la realización de este experimento
se determinó que en la muestra No. 6, de L. hispida, LH.KM93.01.01, hay presencia del
alcaloide papaverina ya que el Rf teórico es igual a uno de los obtenidos
experimentalmente en esa muestra; lo cual se puede decir de una forma general que hay
presencia de alcaloides.
Los flavonoides y antocianinas son de suma importancia ya que poseen la propiedad
de actuar como agentes antioxidantes, aunque frecuentemente presentan más actividades
(Bruneton, 1993). Se clasifican en isoflavonas, antocianidinas, flavanos, flavonoles,
flavonas y flavanonas. Se realizaron las pruebas a nivel macro pero en ninguna de las seis
muestras hubo presencia de alguna de ellas; pero en cambio en la cromatografía en capa
fina se puede observar en la Tabla 13 que en las seis muestras hay presencia de
flavonoides y antocianinas, debido a que se obtuvieron varias bandas de color naranja
similar al de los obtenidos en el estándar; específicamente en la muestra No. 6, de L.
hispida, LH.KM93.01.01.
Las saponinas son compuestos que presentan propiedades tensoactivas. Estas
mismas propiedades tensoactivas no son deseables durante la hidrodestilación de aceites
esenciales al hacer uso del aparato tipo Clevenger o cualquier sistema similar debido a que
provocan proyecciones del material vegetal. En la Tabla 14, se observa en que las seis
muestras hay presencia de saponinas ya que al realizar la prueba macro se observó la
formación de una capa de espuma de aproximadamente 3 cm la cual persistió por más de
30 min. Esto se corroboró con la cromatografía en capa fina, ya que según la Tabla 15, se
obtuvieron resultados positivos para la presencia de saponinas, ya que al utilizar el
51
revelador de vainillina-ácido sulfúrico se presentaron bandas de color azul, violetas o
amarillas. No se detectó presencia de antraquinonas, cumarinas, principios amargos y
taninos en ninguna de las seis muestras a las que se realizó el tamizaje fotoquímico
(Tablas 16, 17, 18, 19 y 20).
Las Tablas 21 y 22 presentan respectivamente los rendimientos de los extractos
metanólicos y diclorometánicos. Se observa un mayor rendimiento en el extracto
metanólico que en el diclorometánico para las tres especies estudiadas. En el caso de L.
trifolia, el rendimiento del extracto metanólico es superior al 40 %, trece veces mayor que
el rendimiento del extracto diclorometánico. La reducida presencia de aceite esencial en
las tres especies y presencia de compuestos fenólicos tales como los flavonoides se
correlacionan perfectamente con este tipo de resultados.
III.2.4 Actividad biológica, antioxidante e índice de refracción de los aceites
esenciales de las plantas de estudio
Los ensayos de actividad biológica se realizaron con dos muestras de aceite esencial
de Lantana camara L., Lantana hispida HBK y Lantana trifolia L. No se encontró que los
aceites presenten actividad biológica frente a los microorganismos Escherichia coli,
Salmonella typhi y Staphylococcus aureus (Tabla 8). Esto puede deberse a que los aceites
esenciales estudiados no presentan grupos funcionales con alta reactividad (grupos
hidroxilo o fenólicos), que puedan atacar a los microorganismos utilizados.
Los mismos aceites esenciales, con excepción del aceite esencial de L. trifolia
(debido a la escasez con que se obtuvo este aceite, se priorizaron los análisis
cromatográficos y de actividad biológica), fueron utilizados para evaluar la actividad
antioxidante por el método del DPPH (Tabla 8). Ninguna de las cuatro muestras de aceite
esencial evaluadas (dos correspondientes a L. camara y dos a L. hispida), presentaron
actividad antioxidante, considerándose, al igual que con los resultados negativos de
actividad biológica, que la ausencia de actividad antioxidante, en este caso, secuestro del
radical libre DPPH, se debió a que estos aceites no presentaron componentes con grupos
reactivos, por ejemplo fenólicos. De igual manera, únicamente fue posible determinar el
índice de refracción de L. hispida, que fue de 1.4960.
III.2.5 Actividad biológica y antioxidante de extractos de las plantas de estudio
obtenidos con solventes.
En las tablas 9 y 10 se presentan los resultados de la evaluación de la actividad
antimicrobiana y actividad antioxidante de extractos de las plantas de estudio, obtenidos
por maceración con solvente.
Los ensayos de actividad biológica se realizaron con muestras de extractos
etanólicos de hojas Lantana hispida HBK y Lantana trifolia L. y de rizomas de Lantana
camara L. Ninguno de los extractos de las plantas de estudio presentó actividad biológica
frente a los microorganismos Escherichia coli, Salmonella typhi y Staphylococcus aureus
(Tabla 9). Es posible que el grado de dilución de los extractos etanólicos de la
52
metodología estándar utilizada no sea el adecuado para que la concentración de los
metabolitos secundarios encontrados, entre ellos, flavonoides, muestre actividad biológica.
La actividad antioxidante de los extractos de las plantas de estudio fue evaluada
utilizando el método del radical libre DPPH (Tabla 10). Extractos etanólicos obtenidos
directamente del material vegetal de L. hispida y L. trifolia, y de material de estas plantas
previamente extraido por diclorometano fueron utilizados para esta determinación. En el
caso de L. camara fueron utilizados extractos metanólicos. Los extractos diclorometánicos
de las tres plantas de estudio, no presentaron actividad antioxidante detectable. El extracto
etanólico de L. hispida presentó la mayor actividad antioxidante (IC50 de 74.34 g/mL)
superior inclusive a la actividad presentada por BHT (IC50 de 34.22 g/mL). La menor actividad antioxidante fue observada para el extracto diclorometánico de L. trifolia (IC50
de 28.29 g/mL), mientras que el extracto metanólico de L. camara presentó una actividad
antioxidante ligeramente menor a la del BHT (IC50 de 29.32 g/mL). Las diferencias pueden observarse en la Figura 4, que presenta la gráfia del IC50 de los extractos
analizados. La actividad antioxidante observada en las especies del género Lantana
estudiadas, podría ser causada por la presencia de flavonoides encontrada en las mismas, y
que podría presentar potencial para su evaluación para la obtención de antioxidantes
naturales para su uso en la industria alimenticia.
Figura 4. Actividad antioxidante de extractos de plantas del género Lantana.
Actividad antioxidante de extractos
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Lanta
na hisp
ida C
H2Cl2/e
tanol 9
5%
Lanta
na trifo
lia C
H2Cl2/e
tanol 9
5%
Lanta
na hisp
ida e
tanol 9
5%
Lanta
na trifo
lia e
tanol 9
5%
Lanta
na cam
ara m
etanólic
o
BHT eta
nol 95%
muestra
I C5
0 [
µg/
ml]
Fuente: FODECYT 011-2007.
53
PARTE IV.
IV.1 CONCLUSIONES
IV.1.1 El aceite esencial de las plantas Lantana camara L., Lantana hispida HBK y
Lantana trifolia L., presenta una composición química característica de la Familia
Verbenaceae, siendo el aceite de L. trifolia el que presenta mayor potencial para su
aprovechamiento en procesos agroindustriales al presentar metileugenol entre sus
componentes mayoritarios.
IV.1.2 La planta Lantana hispida presentó el mayor rendimiento de extracción (0.38 %)
en comparación con Lantana camara (0.18 %) y Lantana trifolia (0.17 %), no habiéndose
encontrado que exista relación entre el rendimiento de extracción de los aceites esenciales
de las plantas de estudio con la estación del año en que se realiza la colecta.
IV.1.3 No fue posible determinar las diferencias en los rendimientos de extracción de los
aceites esenciales por las técnicas de hidrodestilación y extracción-destilación, ya que por
el bajo contenido de aceite esencial de las plantas de estudio, la técnica de extracción-
destilación no resultó útil para la extracción de los aceites esenciales para las especies del
género Lantana evaluadas.
IV.1.4 Con base en su composición química, los aceites esenciales de las plantas de
estudio presenta potencial para su uso como materia prima para la síntesis de moléculas
modificadas para la investigación de actividad biológica, por el elevado porcentaje de
sesquiterpenos, para la obtención de metileugenol en el caso de L. trifolia, y en la industria
cosmética para el caso de las tres plantas de estudio.
IV.1.5 Los aceites esenciales y metabolitos secundarios presentes en los extractos de
Lantana camara L., Lantana hispida HBK y Lantana trifolia L., no presentaron actividad
biológica frente a los microorganismos Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella typhi
ATCC 14028 y Staphylococcus aureus ATCC25923.
.
IV.1.6 Los aceites esenciales de Lantana camara L., Lantana hispida HBK no presentaron
actividad antioxidante por el método del DPPH. La actividad antioxidante del aceite
esencial de Lantana trifolia L. no pudo determinarse por la escasez con que se obtuvo
dicho aceite. En el caso de los extractos con solvente de las plantas de estudio, todos
presentaron actividad antioxidante similar o mayor a la del antioxidante artificial BHT
(IC50 de 34.33 g/mL), destacando la actividad antioxidante (IC50 de 74.34 g/mL) del
extracto etanólico de Lantana hispida. Esta actividad antioxidante de lo extractos puede
estar relacionada a la presencia de flavonoides encontrada en los mismos extractos.
IV.1.7 El aceite esencial de Lantana hispida proveniente de San Cristóbal Acasaguastlán
presenta mejor rendimiento de extracción que el procedente de la Aldea San José,
Teculután, Zacapa, por lo que puede considerarse como con mayor potencial para la
selección de plantas con el propósito de producción del aceite esencial. Para las otras dos
plantas estudiadas, Lantana camara y Lantana trifolia, no se encontraron diferencias en el
54
rendimiento ni en la composición del aceite esencial que le otorguen mayor potencial a las
plantas procedentes de las diferentes localidades de colecta.
IV.1.8 Se optimizó el método de extracción y análisis por cromatografía de gases, que
permite la determinación rápida y confiable de los componentes de aceites esenciales y
metabolitos secundarios de las plantas Lantana camara L., Lantana hispida HBK y
Lantana trifolia L.
IV.1.9 No hubo diferencia en la extracción de los grupos de metabolitos secundarios
identificados en las plantas de estudio, al utilizar las técnicas de maceración en etanol y de
extracción en etanol por ultrasonido, al obtenerse los mismos metabolitos secundarios.
IV.1.10 No fue posible realizar la clasificación de los aceites esenciales de las plantas de
estudio con base en su índice de refracción, debido a que los rendimientos de extracción
fueron muy bajos, siendo todos menores a 0.4 %, por lo que no se contó con material
suficiente para la determinación de este parámetro.
IV.1.11 Las plantas Lantana camara L., Lantana hispida HBK y Lantana trifolia L.
presentaron Alcaloides, Flavonoides y Saponinas, que deben investigarse, ya que podrían
presentar potencial en las industrias cosmética, de alimentos y como posibles moléculas
con actividad biológica.
IV.1.12 Las plantas Lantana camara L., Lantana hispida HBK y Lantana trifolia L. no
presentaron Cumarinas, Principios Amargos, Antraquinonas y Taninos.
IV.1.13 Los extractos metanólicos de las plantas Lantana camara L., Lantana hispida
HBK y Lantana trifolia L. presentan un rendimiento de 12.54, 19.21 y 43.09 %
respectivamente; los cuales son superiores a los rendimientos de los extractos
diclorometánicos para estas mismas plantas; 6.71, 6.04 y 3.20 % respectivamente.
55
IV.2 RECOMENDACIONES
IV.2.1 Realizar experimentos de domesticación de Lantana hispida HBK y Lantana
trifolia L., para evaluar rendimientos y composición de los aceites esenciales en
condiciones controladas, para evaluar el potencial de producción.
IV.2.2 Realizar estudios de aislamiento, identificación y cuantificación de alcaloides y
flavonoides en las plantas Lantana camara L., Lantana hispida HBK y Lantana trifolia L.,
para determinar las moléculas que puedan ser investigadas por su actividad biológica y
antioxidante, para posibles usos en las industrias de alimentos y farmacéutica.
IV.2.3 Realizar ensayos de actividad biocida con los aceites esenciales y extractos de las
plantas del género Lantana, frente a los microorganismos: Bacillus subtilis, Pseudomona
aeruginosa, Sarcina lutea, Candida albicans y los hongos Aspergillus Níger y A.
fumigatus. Así mismo, se recomienda evaluar la actividad biocida frente a Escherichia
coli, Salmonella typhi y Staphylococcus aureus modificando el método, para utilizar una
mayor concentración de extractos.
56
IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Almeida-Doria, R.F., Regitano-Dárcey, A.B. (2000) Antioxidant of Rosemary and
oregano ethanol extracts in soybean oil under thermal oxidation. Cienc. Tecnol.
Aliment., Campinas 20: 197-203.
Aragão, A. (1981) Oleos Essenciais de Plantas do Nordeste. Ediçoes UFC. Fortaleza,
Brasil, 1981.
Bandoni, A. (2003) Los Recursos Vegetales Aromáticos en Latinoamérica. Su
aprovechamiento industrial para la producción de aromas y sabores. Buenos Aires,
CYTED. pp31.
Besco, E., Baccioli, E., Vertuani, S., Ziosi, P., Brazzo, F., Bruni, R., Sacchetti, G.,
Manfredini, S. (2007) The use of photochemiluminescence for the measurement of
the integral antioxidant capacity of baobab products. Food Chem. 102: 1352-1356.
Bicchi, C., Cordero, Ch., Liberto, E., Rubiolo, P., Sgorbini, B. (2004) Automated
headspace solid-phase dynamic extraction to analyse the volatile fraction of food
matrices. J. Chromatogr. A, 1024: 217-226.
Botelho, M.A., Nogueira, N.A.P., Bastos, G.M., Fonseca, S.G.C., Lemos, T.L.G.,
Matos, F.J.A., Montenegro, D., Heukelbach, J., Rao, V.S., Brito, G.A.C. (2007a)
Antimicrobial activity of the essential oil from Lippia sidoides, carvacrol and thymol
against oral pathogens. Braz. J. of Med. Biol. Res. 40: 349-356.
Botelho, M.A., Rao, V.S., Carvalho, C.B.M., Bezerra-Filho, J.G., Fonseca, S.G.C.,
Vale, M.L., Montenegro, D., Cunha, F., Ribeiro, R.A., Brito, G.A. (2007b)
Lippia sidoides and Myracrodruon urundeuva gel prevents alveolar bone resorption
in experimental periodontitis in rats. J. Ethnopharmacol. 113: 471-478
Bruneton, J. (1993) Farmacognosia. Fotoquímica. Plantas Medicinales. Segunda edición.
Editorial Acribia, S.A. Zaragoza, España. Pp 123-124, 183-184, 261-263, 305-306,
366-367, 405-407, 467 y 775.
Bruni, R., Medici, A., Andreotti, E., Fantin, C., Muzzoli, M., Dehesa, M., Romagnoli,
C., Sacchetti, G. (2004) Chemical composition and biological activities of Ishpingo
essential oil, a traditional Ecuadorian spice from Ocotea quixos (Lam.) Diosterm.
(lauraceae) flower calices. Food Chem. 85:415-421.
Burt, S. (2004) Essential oils: their antibacterial properties and potential applications in
foods –a review. Int. J. Food Microbiol. 94:223.
Cáceres A. (1998) Plantas de Uso Medicinal en Guatemala. Colección Monografías, Vol.
1 Editorial Universitaria, Guatemala.
57
Cáceres A.; Samayoa, B, Logemann, H. (1990) Plantas de Uso Medicinal en
Guatemala: Tamizaje de la actividad antimicrobiana (2ª parte) Revista de la
Universidad de San Carlos, No. 10, marzo, 1990.
Cáceres A, Girón L, Freire V. (1990) Plantas de uso medicinal en Guatemala.
Detección etnobotánica y bibliográfica. Revista de la Universidad de San Carlos,
No. 10, junio, 1990.
Caltagirone, S., Rossi, C., Poggi, A., Ranelletti, F.O., Natali, P.G., Brunetti, M.,
Aiello, F.B., Piantelli, M. (2000) Flavonoids apigenin and quercetin inhibit
melanoma growth and metastatic potencial, Int J. Cancer, 87: 595-600.
Camurça-Vasconcelos, A.L.F., Bevilaqua, C.M.L., Morais, S.M., Maciel, M.V.,
Costa, C.T.C., Macedo, I.T.F., Oliveira, L.M.B., Braga, R.R., Silva, R.A.,
Vieira, L.S. (2007) Antihelmintic activity of Croton zehntneri and Lippia sidoides
essential oils. Vet. Parasitol. 148: 288-294
Carvalho, A.F.U., Melo, V.M.M., Craveiro, A.A., Machado, M.I.L., Bantim, M.B.,
Rabelo, E.F. (2003) Larvicidal activity of the essential oil from Lippia sidoides
Cham. Against Aedes Aegypti Linn. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 98: 569-571.
Cheng, S.S., Liu, J., Hsui, Y.R., Chang, S.T. (2006) Chemical polymorphism and
antifungal activity of essential oils from leaves from different provenances of
indigenous cinnamon (Cinnamomum osmophloeum). Bioresource Technology. 97:
306.
Cos, P., Ying, L., Calomme, M., Hu, J.P., Cimanga, K., Van Poel, V., Pieters, L.,
Vlietinck, A.J., Vanden Berghe, D. (1998) Structure-activity relationship and
classification of flavonoids as inhibitors of xanthine oxidase and superoxide
scavengers. J. Nat. Prod. 61: 71-76.
Cramers, C.A., Leclercq, P.A. (1999). Strategies for speed optimization in gas
chromatography: an overview. J. of Chromat. A 842:3-13.
Curado, M.A., Oliveira, C.B.A., Jesus, J.G., Santos, S.C., Seraphin, J.C., Ferri, P.H. (2006) Environmental factors influence on chemical polymorphism of the essential
oils of Lychnophora ericoides. Phytochemistry 67:2363-2369.
Dewick, P.M. (2001) Medicinal Natural Products. A Biosynthetic Approach. West
Soussex, John Wiley and Sons. 2nd
Ed. 507 pp.
Duarte, M.C.T., Figueira, G.M., Sartoratto, A., Rehder, V.L.G., Delarmelina, C. (2005) Anti-Candida activity of Brazilian medicinal plants. J. Ethnopharmacol.
97:305-311.
Dubey, V.S., Bhalla, R., Luthra, R. (2003) An overview of the non-mevalonate pathway
for terpenoid biosynthesis in plants. J. Biosci. 28: 637-646.
58
Durán, D.C., Monsalve, L.A., Martínez, J.R., Stashenko, E.E. (2007) Estudio
comparativo de las composición química de aceites esenciales de diferentes regiones
de Colombia, y efecto del tiempo de destilación sobre la composición del aceite.
Scient. Et Tech. 33:435-438.
Duvold, T., Bravo, J., Pale-Grosdemange, C., Rohmer, M. (1997) Biosynthesis of 2-C-
Methyl-D-erytrhiotol, a putative C5 intermediate in the mevalonate independent
pathway for isoprenoid biosynthesis. Thetraed. Lett. 38: 4769-4772.
Fellermeier, M., Raschke, M., Sagner, S., Wungsintaweekul, J., Schuhr, Ch., Hecht,
S., Kis, K., Radykewicz, T., Adam, P., Rohdich, F., Eisenreich, W., Bacher, A.,
Arigoni, D., Zenk, M. (2001) Studies on the nonmevalonate pathway of terpene
biosuynthesis. Eur. J. Biochem. 268: 6302-6310.
Ferrari, M., Signorini, C., Caciotti, B., Sugherini, L., Ciccoli, L., Giachetti, D.,
Comproti, M. (1997) Protection against oxidative damage of erythrocyte membrane
by the flavonoid quercetine and its relation to iron chelating activity, FEBS Lett,
416:123-129.
Fischer, U., Franz, Ch., López, R., Pöll, E. (1997) Variability of the Essential Oils of
Lippia graveolens HBK from Guatemala. Proceedings of 27th International
Symposium on Essential Oils. Edits., Ch. Franz, A. Mathé and G. Buchbauer, pp.
266-269. Allured Publ. Corp., Carol Stream, IL.
Fischer, U., López, R., Pöll, E., Vetter, S., Novak, J., Franz, Ch. (2004) Two
chemotypes within Lippia alba populations in Guatemala. Flav. Frag. J., 19, 333-
335.
Guenther, E. (1948) The Essential Oils. Van Nostrand Company, New York. Vol. 1.
P.189-200.
Hermann, K. (1976) Flavonols and flavones in food plants: a review. J. Food Technol.
11: 433-448.
Hirano, R., Sasamoto, W., Matsumoto, A., Itakura, H., Igarashi, O., Kondo, K. (2001) Antioxidant ability of various flavonoids against DPPH radicals and LDL
oxidation, J. Nutr. Sci. Vitaminol (Tokyo), 47:357-362.
Hirasa, K., Takemasa, M. (1998) Spice Science and Technology. CRS Press: Nueva
York. 232 pp.
Hostettmann, K; Queiroz, E.; Vieira, P. (2003) Princípios Ativos de Plantas
Superiores. Edufscar, San Carlos, Brasil.
Kanadaswami, C., Lee, L.T., Lee, P.P., Hwang, J.J., Ke, F.C., Huang, Y.T., Lee, M.T.
(2005) The antitumor activities of flavonoides. In vivo, 19: 895.
59
Kaneda, J. P. (1992) J. Nat. Prods. 55 (8): 1136-1141
Kawanishi, S., Hiraku, Y., Oikawa, S. (2001) Mechanism of guanine-specific DNA
damage by oxidative stress and its role in carcinogenesis and aging. Mutat. Res. 488:
65-76.
Khan, M.A., Baseer, A. (2000) Increased malondialdehyde levels in coronary heart
disease, J. Pak. Med. Assoc. 50:261-264.
Larson, R A (1995) Antioxidant mechanisms of secondary natural products. In: Oxidative
stress and antioxidant defense in biology. Ed. Ahmad, London.
Lin, L., Mukhopadhyay, S., Robbins, R.J., Harnly, J.M. (2007) Identification and
quantification of flavonoids of Mexican oregano (Lippia graveolens) by LC-DAD-
ESI/MS analysis. J. Food Comp. Anal. 20: 361-369.
Lu, S., Xu, R., Jia, J.W., Pang, J., Matsuda, S.T.P., Chen, X.Y. (2002) Cloning and
functional characterization of a -pinene synthase from Artemisia annua L. that
shows a circadian pattern of expression. Plant Physiol. 130: 477.
Marriot, P.J., Shellie, R., Cornwell, Ch. (2001) Gas chromatographic technologies for
the analysis of essential oils. J. Chromatogr. A. 936:1-22.
Medinilla, B. (1996) Manual de Laboratorio de Farmacognosia. USAC, Guatemala.
Meyer, A.S., Heinonen, M., Frankel, E.N. (1998) Antioxidant interactons of catechin,
cyanidin, caffeic acid, quercetin, and ellagic acid on human LDL oxidation. Food
Chem. 61: 71-75.
Ness, A.R., Powles, J.W. (1997) Fruit and vegetables, and cardiovascular disease: a
review, Int. J. Epidemiol, 26: 335-341.
Oliveira, D.R., Leitão, G.G., Santos, S.S., Bizzo, H.R., Lopes, D., Alviano, C.S.,
Alviano, D.S., Leitão, S.G. (2006) Ethnopharmacological study of two Lippia
species from Oriximiná, Brazil. J. Ethnopharmacol. 108: 103-108.
Oumzil, H., Ghoulami, S., Thajaoui, M., Hidrissi, A., Fkih-Tetouani, S., Faid, M.,
Bejouad, A. (2002) Antibacterial and antifungal activity of essential oils of Mentha
suaveolens. Phytother. Res. 16: 727
Peer, W.A., Bandyopadhyay, A., Blakeslee, J.J.U., Makam, S.N., Chen, R.J., Masson,
P.H., Murphy, A.S. (2004) Variation in expression and protein localization of the
PIN family of auxin efflux facilitator proteins in flavonoid mutants with altered
auxin transport in Arabidopsis thaliana, Plant Cell, 16: 1898-1911.
60
Pereira, S.I., Santos, P.A.G., Barroso, J.G., Figueiredo, A.C., Pedro, L.G., Salguero,
L.R., Deans, S.G., Scheffer, J.J.C. (2003) Chemical Polymorphism of the Essential
Oils from Populations of Thymus caespiitius Grown on the Islands Pico, Faial and
Graciosa (Azores). Pthytochemical Analysis, 14, 228-231.
Pereira, S.I., Santos, P.A.G., Barroso, J.G., Figueiredo, A.C., Pedro, L.G., Salgueiro,
L.R., Deans, S.G., Scheffer, J.J.C. (2000) Chemical Polymorphism of the Esencial
Oils from Populations of Thymus caespititius Grown on the island S. Jorge (Azores).
Phytochemistry, 55, 241-246.
Pérez, J.F. (2008) Investigação Química de Óleos Essencials de Plantas da Guatemala.
Tesis doctoral. Río de Janeiro. UFRJ. BR. 281 p.
Poli, F., Bonsignore, L., Loy, G., Sacchetti, G., Ballero, M. (1997) Comparison between
the essential oils of Santolina insularis (Genn. Ex Fiori) Arrigoni and Santolina
corsica Jord. Et Fourr. From the island of Sardinia (Italy) J. Of Ethnopharma.
56:201-208.
Potterat, O. (1997) Antioxidants and free radical scavengers of natural origin. Current
Organic Chemistry, 1, 415.
Richter, J. e Schellenberg, I. (2007) Comparison of different extraction methods for the
determination of essential oils and related compounds from aromatic plants and
optimization of solid-phase microextraction/gas chromatography. Anal. Bional.
Chem. 387: 2207-2217.
Rocha-Guzmán, N.E., Gallegos-Infante, J.A., González-Laredo, R.F., Ramos-Gómez,
M., Rodríguez-Muñoz, M.E., Reynosos-Camacho, Rocha-Uribe, A., Roque-
Rosales, M.R. (2007) Antioxidant effect of orégano (Lippia berliandieri v. Shauer)
essential oil and mother liquors. Food Chem. 102: 330-335.
Rochdich, F., Kis, K., Bacher, A., Eisenreich, W. (2001) The non-mevalonate pathway
of isoprenoids: genes, enzymes and intermediates. Curr. Opin. Chem. Biol. 5: 535-
540.
Ross, I.A. (1999) Medicinal Plants of the World. Totowa: Humana Press. Vol. 1. pp 179-
187.
Sacchetti, G., Maietti, S., Muzzoli, M., Scaglianti, M., Manfredini, S., Radice, M.,
Bruni, R. (2005) Comparative evaluation of 11 essential oils of different origin as
functional antioxidants, antiradicals and antimicrobials in foods. Food chemistry,
91:621-632.
Sagner, S., Eisenreich, W., Fellermeier, M., Latzel, Ch., Bacher, A., Zenk, M. (1998)
Biosynthesis of 2-C-methyl-D-erytrhiol in plants by rearrangement of the terpenoid
precursor, 1-Deoxy-D-xylulose 5 –phosphate. Tetrahed. Lett. 39: 2091-2094.
61
Salgueiro, L.R., Cavaleiro, C., Goncalves, M.J., Proença da Cunha, A. (2003)
Antimicrobial Activity and Chemical Composition of the Essential Oil of Lippia
graveolens from Guatemala. Planta Medica, 69, 80-83.
Salgueiro, L., Vila, R., Tommas, X., Tomi, F., Cañigueral, S., Casanova, J., Proença,
A., Adzet, T. (1995) Chemical Polymorphism of the essential oil of Thymus
carnosus from Portugal. Phytochemistry. 38:391-396.
Sánchez-Moreno, C. Larrauri, J.A. Saura-Calixto, F. (1998) A procedure to measure
the antiradical efficiency of polyphenols. J. Sci. Food Agric. 76: 270.
Sangwan, N.S.; Farooqi, A.H.A.; Shabih, F.; Sangwan, R.S. (2001) Regulation of
essential oil productin in plants. Plant Growth Regulation 34: 3-21.
Santos, P.A.G., Barroso, J.G., Figueiredo, A.C., Pedro, L.G., Salgueiro, L.R.,
Fontinha, S.S., Deans, S.G., Scheffer, J.C. (2005) Chemical polymorphism of
populations of Thymus caespititius grown on the islands Corvo, Flores, Sao Miguel
and Terceira (Azores) ande on Madeira, assessed by analysis of their essential oils.
Plant Science. 169:1112-1117.
Schmid, J. y Amrhein, N. (1995) Molecular organization of the shikimate pathway in
higher plants. 39: 737-749.
Senatore, L., Rigano, F. (2001) Essential oil of two Lippia spp. (verbenaceae) growing
wild in Guatemala. Flav. Fragr. J. 16: 169-171
Shirley, B.W. (1996) Flavonoid biosynthesis: “new” functions for an “old” pathway,
Trend Plant Sci. 1:377-382
Soares, S. E. (2002) Ácidos fenólicos como antioxidantes. Rev. Nutr. 15:71
Soleas, G.J., Grass, L., Josephy, P.D., Goldberg, D.M., Diamandis, E. (2006) A
comparison of the anticarcinogenic properties of four red wine polyphenols.
Clinical Biochem (39) 492-497.
Sousa, C.M.M., Silva, H.S., Vieira-Jr, G.M., Ayres, M.C.C., Costa,C.L.S., Araújo,
D.S., Cavalcante, L.C.D., Barros, E.D.S., Araújo, P.B.M., Brandão, M.S.,
Chaves, M.H. (2007) Fenóis totais e atividade antioxidante de cinco plantas
medicinais. Quím. Nova 30:2
Souto-Bachiller, F.A., De Jesús Echeverría, M., Cárdenas González, O.E., Acuña-
Rodríguez, M.F., Meléndez, P.A., Romero-Ramsey, L. (1997) Terpenoid
composition of Lippia dulcis. Phytochemistry. 44 (6): 1077-1086
Standley, P. Steyermark, (1970) Flora de Guatemala, part IX. Fieldiana: Botany, USA.
1970, vol. 24. 209-211.
62
Stevens, W. D., C. Ulloa U., A. Pool y O. M. Montiel (eds.), (2001) Flora de Nicaragua.
Vol. 85, tomos I, II y III. Missouri Botanical Garden Press. St. Louis Missouri.
Tanaka, T., Kawabata, K., Kakumoto, M., Makita, H., Ushida, J., Honjo, S., Hara,
A., Tsuda, H., Mori, H. (1999) Modifying effects of a flavonoid morin on
azoxymethane-induced large bowel tomorigenesis in rats. Carcinogenesis, 20:1477-
1484.
Thompson, J.D., Chalchat, J., Michet, A., Linhart, Y., Ehlers, B. (2003) Qualitative
and Quantitative variation in monoterpene co-occurrence and composition in the
essential oils of Thymus vulgaris chemotypes. J. Chem. Ecol. 29: 859-880.
Valgas, C., Souza, S.M., Smânia, E.F.A., Smânia Jr., A. (2007) Screening methods to
determine antibacterial activity of Natural Products. Braz. J. Microbiol. 38: 369-
380.
Yunes, R.A., Cechinel Filho, V. (2009) Química de Produtos Naturais, Novos Fármacos
e a Moderna Farmacognosia. 2 Ed. UNIVALI, Itajaí, Brasil. 319 pp.
Van der Sluis, WT; Van Arkel J, Fischer FC, Labadie R, (1981) Thin Layer
chromatography assay of photoactive compounds (furanocoumarins) using the
fungus Penicillium-expansum as test organism. J. of Chrom., 214, 349.
Velioglu, Y.S., Mazza, G., Gao, L., Oomah, B.D. (1998) Antioxidant Activity and Total
Phenolics in Selected Fruits, Vegetables, and Grain Products. J. Agric. Food Chem.
46: 4113-4117.
Vila, R., Iglesias, J., Cañigueral, S., Ciccio, J.F. (2004) J. Ess. Oil Res. 16: 177-179
Windholz, M. (1983) The Index Merck. Merck & Co. 10 ed. New Jersey, USA.
Wollenweber, E., Dietz, V.H. (1981) Occurrence and distribution of free flavonoid
aglycones in plants. Phytochemistry 20: 869-932.
Yang, J.W., Orihara, Y. (2002) biosynthesis of abietane diterpenoids in cultured cells of
Torreya nucifera var. radicans: bioisynthetic inequality of the FPP part and the
terminal IPP. Tetrahedron 58: 1265-1270.
63
IV.4 ANEXOS
64
IV.4.1 ANEXO 1 CROMATOGRAMAS
Figura 5. Cromatograma del aceite esencial de Lantana camara, muestra 1. Colectada en Zunil,
Quetzaltenango el 6 de julio de 2008; obtenido en cromatógrafo de gases con detector de ionización de
llama.
Fuente: FODECYT 011-2007.
Figura 6. Cromatograma del aceite esencial de Lantana camara, muestra 2. Colectada en Zunil,
Quetzaltenango el 11 de enero de 2009; obtenido en cromatógrafo de gases con detector de ionización de
llama.
Fuente: FODECYT 011-2007.
-Cariofileno
Germacreno-D
-Selineno
-Elemeno
-Cariofileno Germacreno-D
-Elemeno
-Selineno
65
Figura 7. Cromatograma del aceite esencial de Lantana camara, muestra 3. Colectada en Zunil,
Quetzaltenango el 26 de abril de 2009; obtenido en cromatógrafo de gases con detector de ionización de
llama.
Fuente: FODECYT 011-2007.
Figura 8. Cromatograma del aceite esencial de Lantana hispida, muestra 1. Colectada en San Cristóbal
Acasaguastlán, El Progreso, el 30 de junio de 2008; obtenido en cromatógrafo de gases con detector de
ionización de llama.
Fuente: FODECYT 011-2007.
-Cariofileno
Germacreno-D
-Selineno
Limoneno
Limoneno
1,8-cineol
-Cariofileno
Germacreno-D
66
Figura 9. Cromatograma del aceite esencial de Lantana hispida, muestra 2. Colectada en San Cristóbal
Acasaguastlán, El Progreso, el 30 de junio de 2008; obtenido en cromatógrafo de gases con detector de
ionización de llama.
Fuente: FODECYT 011-2007.
Figura 10. Cromatograma del aceite esencial de Lantana trifolia, muestra 1. Colectada en Los Amates,
Izabal, el 31 de agosto de 2008; obtenido en cromatógrafo de gases con detector de ionización de llama.
Fuente: FODECYT 011-2007.
Limoneno
1,8-cineol
-Cariofileno
Germacreno-D
Metileugenol
-Muuroleno
-Copaeno
Timol
trans-Bergamoteno
67
Figura 11. Cromatograma del aceite esencial de Lantana trifolia, muestra 2. Colectada en Los Amates,
Izabal, el 7 de diciembre de 2008; obtenido en cromatógrafo de gases con detector de ionización de llama.
Fuente: FODECYT 011-2007.
-Copaeno
-Muuroleno
Metileugenol
68
IV.4.2 ANEXO 2. APARIENCIAS DE LOS EXTRACTOS
Figura 12. Apariencia del extracto metanólico de Lantana camara, colectada en la ciudad
de Guatemala, Guatemala el 22/12/09 (extracto seco).
Fuente: FODECYT 011-2007.
Figura 13. Apariencia del extracto metanólico de Lantana hispida, colectada en El Chico,
Zacapa (extracto seco), el 10/05/09.
Fuente: FODECYT 011-2007.
69
Figura 14. Apariencia del extracto metanólico de Lantana trifolia, colectada en Lachuá,
Alta Verapaz (extracto seco), el 29/11/09.
Fuente: FODECYT 011-2007.
Figura 15. Apariencia del extracto diclorometánico de Lantana camara, colectada en la
ciudad de Guatemala, Guatemala (extracto seco), el 22/12/09.
Fuente: FODECYT 011-2007.
70
Figura 16. Apariencia del extracto diclorometánico de Lantana hispida, colectada en El
Chico, Zacapa (extracto seco), el 10/05/09.
Fuente: FODECYT 011-2007.
Figura 17. Apariencia del extracto diclorometánico de Lantana trifolia, colectada en
Lachuá, Alta Verapaz (extracto seco), el 29/11/09.
Fuente: FODECYT 011-2007.
71
IV.4.3 ANEXO 3. Determinación de actividad antioxidante de los extractos de las
plantas de estudio.
Figura 18. Fotografía de la determinación de la actividad antioxidante del extracto
etanólico del residuo de la extracción con diclorometano de Lantana hispida.
Fuente: FODECYT 011-2007.
Figura 19. Fotografía de la determinación de la actividad antioxidante del extracto
diclorometánico de Lantana hispida.
Fuente: FODECYT 011-2007.
72
Figura 20. Fotografía de la determinación de la actividad antioxidante de la solución
etanólica de BHT.
73
PARTE V
V.1 INFORME FINANCIERO