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Copyright©2009 Maria Antonia Malajovich

Biotecnologia na vida cotidiana / Lava-roupas biológicos

Manual de atividades práticas de Biotecnologia

Texto, fotografias e desenhos da autora

Edições BIBLIOTECA MAX FEFFER

do INSTITUTO DE TECNOLOGIA ORT do Rio de Janeiro

Rua Dona Mariana 213 Rio de Janeiro, 22280-020 RJ-Brasil

Tel.:(5521) 2539-1842; FAX: (5521) 2286-9174

Maria Antonia Malajovich – Biotecnologia na vida cotidiana - Vinagres - www.bteduc.bio.br

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SUMÁRIO

Tema Página

VINAGRES 3

O VINAGRE 3

A ACETIFICAÇÃO 3

TRADIÇÃO E MODERNIDADE

O PROCESSO RÁPIDO DE FABRICAÇÃO (SCHUETZENBACH OU ALEMÃO)

PROCESSOS DE FABRICAÇÃO COM CULTIVOS SUBMERGIDOS

4

OS USOS DO VINAGRE 5

BIBLIOGRAFIA

5

GUIA DO PROFESSOR 6

VINAGRES, POR QUÊ?

6

INICIANDO A PRODUÇÃO DE VINAGRES 6

O ACOMPANHAMENTO DA ACETIFICAÇÃO COMO PRÉ-REQUISITO

O PROCEDIMENTO LABORATORIAL

POR QUE CNaOH = 0,66%?

A ELABORAÇÃO DOS DADOS

PREPARAÇÃO DAS SOLUÇÕES

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A OBTENÇÃO DO INÓCULO 8

O PROCESSO LENTO DE PRODUÇÃO DE VINAGRES

MONTAGEM DO FERMENTADOR

O FERMENTADOR EM FUNCIONAMENTO

A COMPOSIÇÃO INICIAL DO CALDO

A MÃE DO VINAGRE

CONDUZINDO A FERMENTAÇÃO

PRODUÇÃO, RENDIMENTO E PRODUTIVIDADE

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O PROCESSO RÁPIDO DE PRODUÇÃO DE VINAGRES



O ACONDICIONAMENTO DO VINAGRE COMO PRODUTO FINAL

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AS ALTERAÇÕES DO VINAGRE

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GUIAS DO ALUNO 16

A1. COMO PREPARAR VINAGRE ARTESANALMENTE 17

A2. COMO MEDIR A ACIDEZ DO VINAGRE 19

A3. COMO INICIAR A PRODUÇÃO DE VINAGRE 21

A4. A PRODUÇÃO DE VINAGRE – PROCESSO LENTO 23

A5. CONSTRUINDO UM FERMENTADOR - PROCESSO RÁPIDO 25

A6. A PRODUÇÃO DE VINAGRE - PROCESSO RÁPIDO

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VINAGRES

O VINAGRE

O vinagre (do francês, vin aigre ‘vinho ácido’) se origina por fermentação espontânea do vinho de uvas e da cerveja. Por isso, não surpreende que tenha sido conhecido no Egito e Mesopotâmia. Os gregos e os romanos o utilizavam para temperar alimentos e bebiam água com vinagre para se proteger dos germes.

Na Idade Média, o vinagre era valorizado como uma especiaria. Em 1394, criou-se em Orléans (França) a primeira corporação monopolizadora da fabricação e comercialização do vinagre. A estrutura corporativa manteve o método francês de produção de vinagre nos mesmos padrões por vários séculos. Só em 1832, Schuetzenbach introduziu na Alemanha algumas modificações técnicas para acelerar a acetificação.

A passagem da produção artesanal à era industrial só foi possível a partir dos trabalhos de Pasteur sobre a fermentação acética, já na segunda metade do século XIX. Estes culminam em 1868 com a publicação dos Études sur le vinaigre que, além de explicar cientificamente o processo de fabricação do vinagre, orientam os produtores sobre os procedimentos que asseguram uma qualidade constante.

Atualmente, o método francês (Orléans) e o método alemão (Schuetzenbach) coexistem com outros métodos tecnologicamente mais avançados (Frings), de alta produtividade.

A ACETIFICAÇÃO

O vinagre é uma bebida que contém ácido acético em uma concentração de 5-6% e resulta de uma fermentação alcoólica seguida de uma fermentação acética durante a qual o etanol é oxidado e transformado em ácido acético por um agente biológico, em uma reação exotérmica.

As principais etapas que levam à formação do ácido acético estão indicadas no seguinte esquema:

MATÉRIA-PRIMA

Frutas (uva, maçã) Sustâncias açucaradas (açúcar, mel) Grãos amiláceos (cevada)

FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA

C6H12O6 → 2 CH3 CH2OH + 2 CO2 Glicose Etanol Dióxido de carbono

FERMENTAÇÃO ACÉTICA

CH3CH2OH + O2 → CH3COOH + H2O Etanol Oxigênio Ácido acético Água (etanoico)

Durante muito tempo, se considerou que o agente biológico responsável pela acetificação era um fungo (Mycoderma aceti), mas hoje se sabe que a acetificação se deve a diversas espécies de bactérias do gênero Acetobacter.

Na fabricação de vinagre não são utilizadas cepas puras, porque as próprias condições do processo (etanol, acidez alta) selecionam as cepas mais produtivas. Portanto, não há necessidade de manter condições assépticas.

As condições básicas necessárias para conduzir a acetificação são: matéria-prima de boa qualidade, aeração, temperatura entre 25 e 300 C, adequadas acidez e concentração de álcool, penumbra e vigilância de eventuais contaminações. Não são muito complicadas.

O oxigênio é um fator limitante na produção de vinagre. A solução técnica encontrada para assegurar o fornecimento do oxigênio para a acetificação varia em cada um dos métodos de produção. Dessa solução dependem o rendimento e a produtividade.

O envelhecimento do vinagre, através de numerosas reações de esterificação, melhora notavelmente as propriedades organolépticas (brilho, odor, cor, sabor). Atualmente, alguns vinagres de excelente qualidade têm alcançado a denominação de origem: vinagres de Xerez e do condado de Huelva na Espanha, aceto balsâmico ou vinagre de Modena (Itália). Este último chega a passar 12 anos em uma série de tonéis de madeiras diferentes.


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TRADIÇÃO E MODERNIDADE

Os processos de fabricação de vinagre se realizam seja de maneira descontinua, seja de maneira semicontínua. No primeiro caso, ao alcançar as características de acidez desejadas, se retira todo o vinagre produzido e se começa de novo. No segundo, ao chegar a uma determinada acidez, se retira parte do produto e se adiciona uma quantidade equivalente de matéria-prima.

O PROCESSO LENTO DE FABRICAÇÃO (FRANCÊS OU DE ORLÉANS)

É o método mais antigo. Em um barril de carvalho de 200 litros se coloca o vinho até ocupar três quartos de sua capacidade. Na superfície, em contato simultâneo com o ar e o vinho, se forma uma película gelatinosa de Acetobacter, que é a chamada de mãe do vinagre. Um suporte quadriculado de madeira a impede de afundar no líquido (Figura 1).

Figura 1: O método lento de produção de vinagre

A acetificação ocorre na superfície, com aeração natural. O processo é lento, exige espaço e tem uma produtividade muito baixa. No entanto, proporciona os melhores vinagres.

O PROCESSO RÁPIDO DE FABRICAÇÃO (SCHUETZENBACH OU ALEMÃO)

O gerador ou fermentador é um recipiente de 100 a 100.000 litros de capacidade preenchidos com serragem ou outro material que tenha uma superfície de contato grande e sobre a qual se fixam as bactérias acéticas.

O vinho circula repetidas vezes no gerador enquanto se injeta ar no sentido contrário. O calor não se espalha tão facilmente como no método tradicional, e é necessário, então, um método de esfriamento, estabelecendo um gradiente de temperatura que impulsiona a circulação do ar (Figura 2).

Em relação ao processo lento, a produtividade é maior, mas a qualidade do vinagre é inferior.

Figura 2: O método rápido de produção de vinagre


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PROCESSOS DE FABRICAÇÃO COM CULTIVOS SUBMERGIDOS

A partir de 1950 se desenvolveram sistemas de produção nos quais as bactérias estão submersas em uma mistura hidroalcoólica, dentro de enormes cubas de aço inoxidável. Estes acetificadores modernos contam com agitação, oxigenação e controles de temperatura. Desenhados e patenteados pela empresa alemã Heinrich Frings, os geradores ou Acetators são utilizados em mais de 50 países. Produzem 920 a 960 litros de vinagre com 10% de acidez a partir de 100 litros de álcool absoluto e funcionam em turnos de 24 horas. Devido a sua eficiência, também são utilizados na produção de ácido acético para outras finalidades.

OS USOS DO VINAGRE

O vinagre cumpre um papel importante na culinária como condimento, conservante e modificador da textura dos alimentos. Também é usado como agente de limpeza, desodorizante, tira-manchas, mordente, solvente, cosmético e antisséptico com poder germicida, inseticida e espermicida.

Apesar de haver poucos dados atualizados sobre o mercado mundial de vinagre, os especialistas reconhecem que o mercado de vinagres de qualidade tende a aumentar.

BIBLIOGRAFIA AQUARONE E. et al. Alimentos e bebidas produzidos por fermentação. Biotecnologia, Vol. 5. São Paulo, Editora Edgar Blucher Ltda., 1983 AQUARONE E. et al. (Coord). Biotecnologia Industrial. Biotecnologia na produção de alimentos, Vol. 4. São Paulo, Editora Edgar Blucher Ltda., 2001. FUNDACIÓN EROSKI http://www.consumaseguridad.com HEINRICH FRINGS http://www.frings.com MALAJOVICH M.A.M. Fazer vinagre não é deixar o vinho azedar. Rio de Janeiro, ORT Brasil, 1989. MALAJOVICH M.A. Biotecnologia. Rio de Janeiro, Axcell Books do Brasil, 2004 MALAJOVICH M.A.M. Biotecnología. Bernal, Editora de la Universidad Nacional de Quilmes, 2007 SAGYPA Análisis de la cadena de vinagres Disponível em http:// www.alimentosargentinos.gov.ar/0-3/especias/01_Cadenas/Vinagre/Vinagre.htm THE VINEGAR INSTITUTE http://www.versatilevinegar.org/index.html ZANCANARO Jr. O. “Vinagres”. In: Biotecnologia Industrial, Vol. 4. São Paulo, Editora Edgar Blucher Ltda., 2001.


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GUIA DO PROFESSOR

VINAGRES, POR QUÊ?

Do ponto de vista histórico, os estudos sobre as fermentações representam um marco conceptual que derruba a Teoria da Geração Espontânea. Sua relevância não passou despercebida aos produtores de bebidas fermentadas, que enfrentavam enormes dificuldades para manter a qualidade e a conservação de seus produtos. Ao encontrar uma aplicação imediata na fabricação de vinhos, vinagres, cervejas e laticínios, estes trabalhos foram fundamentais para a economia europeia da segunda metade do século XIX.

É difícil encontrar um tema tão rico como este para a educação em Biotecnologia. Diferente da fermentação alcoólica ou da fermentação láctica, a fermentação acética ocorre em aerobiose. As bactérias acéticas crescem em condições tão estritas de acidez e nutrientes (etanol) que os riscos de contaminação são poucos. Elaborado em condições adequadas, o vinagre adquire odor, cor e sabor característicos. Sua acidez elevada lhe confere propriedades antissépticas, sendo utilizado como condimento sem perigo para a saúde do consumidor.

Além de serem interessantes tanto do ponto de vista ecológico como do microbiológico, os estudos sobre a acetificação permitem simular condições industriais, abrindo a possibilidade de elaborar projetos, construir fermentadores e discutir tópicos como rendimento, produtividade e, eventualmente, custos. É uma maneira de introduzir alguns aspectos básicos de Biotecnologia Industrial.

Alguns dos pontos mais importantes relacionados com o tema são: crescimento de populações microbianas, fatores limitantes, sucessão ecológica, metabolismo microbiano, fermentação alcoólica, fermentação acética, titulação ácido-base (volumetria), separação de misturas heterogêneas, construção de fermentadores, processos fermentativos descontínuos e semicontínuos.

A tecnologia de vinhos é de uma complexidade extraordinária, de modo que nem todas as fantasias se cumprem e os vinhos de frutas costumam ser bastante ruins. No entanto, os vinagres podem resultar excepcionais. Ainda que a indústria gere produtos mais baratos, estes são de qualidade inferior aos obtidos com as técnicas deste fascículo.

No momento de planificar as atividades deve-se contar com uma boa quantidade de vinagre com bactérias acéticas vivas e de alta concentração de ácido acético (vinagre forte). Quanto ao resto, só se precisa de um ambiente na penumbra, uma temperatura preferentemente entre 25-280 C, limpeza e muita paciência.

O início é lento, mas o esforço é compensador, e os resultados podem ser extraordinários, além de criativos. Vale a pena experimentar.

INICIANDO A PRODUÇÃO DE VINAGRES

Os vinagres podem ser elaborados a partir de vinhos comerciais, econômicos e honestos, mas não de vinhos ruins. Os vinhos tintos costumam dar melhores resultados que os brancos. Também se elaboram vinagres a partir de vinhos de diversas frutas, como se indica na Atividade 1 (Como preparar vinagre artesanalmente). A maçã, a ameixa e o caqui costumam dar bons vinagres.

Dependendo da matéria-prima escolhida, maçã ou ameixa, por exemplo, o produto obtido será denominado vinagre de maçã ou vinagre de ameixa, em contraposição a um vinagre de vinho tinto ou vinagre de vinho branco. Se o vinagre for elaborado a partir de uma mistura de vinho tinto e vinho de banana, será chamado de vinagre de vinho tinto com aroma de banana.


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O ACOMPANHAMENTO DA ACETIFICAÇÃO COMO PRÉ-REQUISITO

O PROCEDIMENTO LABORATORIAL

Estima-se periodicamente a concentração de ácido acético presente no vinagre por titulação ácido-base (volumetria), com fenolftaleína como indicador.

Nos laboratórios de Química, a titulação se realiza com material especializado, tal como pipetas, buretas e soluções-padrão. Tais materiais dificilmente se encontram nos laboratórios escolares, por isso, simplificamos o procedimento, como se descreve na Atividade 2 (Como medir a acidez do vinagre).

Além de utilizar uma solução de NaOH sem padronizar, substituímos as pipetas por seringas de 1 ml, as buretas, por seringas de 10 ml e os frascos de Erlenmeyer, por copos plásticos de café. Cada grupo de alunos recebe seu material, tornando-se responsáveis pela limpeza e conservação do mesmo. As seringas não precisam de agulha; ao terminar o trabalho, o material deve desmontado, limpo e guardado.

Acompanhamos a evolução da acidez ao longo de todo o trabalho com uma única solução de NaOH (0,66%). Apesar de as medidas resultarem menos exatas que as obtidas com soluções-padrão, o método é econômico e simples. Também apresenta repetibilidade (um operador obtém resultados muito parecidos ou idênticos quando titula a mesma amostra várias vezes) e reprodutibilidade (dois operadores obtêm resultados muito parecidos ou idênticos titulando a mesma amostra).

A um volume conhecido de vinagre (V = 1 ml) se adiciona uma gota de fenolftaleína, um indicador de pH, incolor em meio ácido e rosa fúcsia em meio básico. A seguir, se deixa cair lentamente, gota a gota, uma solução de hidróxido de sódio (NaOH) de concentração conhecida CNaOH = 0,66%.

Chegará um momento em que todo o ácido acético (CH3COOH) do vinagre terá sido neutralizado pelo NaOH da solução. Esse momento se identifica facilmente. Ao adicionarmos uma gota a mais da solução de NaOH, o pH varia bruscamente e o indicador muda de cor. Isto é visível mesmo em vinagres do tipo tinto.

O volume V’ da solução de NaOH necessário para chegar ao ponto de equivalência é igual à concentração de ácido acético na amostra de vinagre. Por exemplo, se precisamos deixar cair 4 ml de uma solução de NaOH 0,66% para chegar ao ponto de equivalência, isso significa que a concentração de ácido acético no vinagre é de 4%.

POR QUE CNaOH = 0,66%?

No ponto de equivalência, o número de moles de NaOH é igual ao número de moles de CH3COOH. Sabendo que a massa de 1 mol de CH3COOH é de 60 g e que a de 1 mol de NaOH é de 40 g, podemos calcular o número de moles de cada sustância:

Número de moles de CH3COOH → MassaCH3COOH /60 = VolumeCH3COOH x ConcentraçãoCH3COOH / 60

Número de moles de NaOH → MassaNaOH /40 = VolumeNaOH x ConcentraçãoNaOH / 40

No ponto de equivalência, como ambos os valores são iguais, escrevemos que:

VolumeCH3COOH x ConcentraçãoCH3COOH / 60 = VolumeNaOH x ConcentraçãoNaOH / 40

Como VolumeCH3COOH = 1 ml, então:

ConcentraçãoCH3COOH / 60 = VolumeNaOH x ConcentraçãoNaOH / 40

ConcentraçãoCH3COOH x 0, 66 = VolumeNaOH x ConcentraçãoNaOH

Se o valor da ConcentraçãoNaOH for 0,66%, então

ConcentraçãoCH3COOH = VolumeNaOH

Por conseguinte, basta medir o VolumeNaOH necessário para atingir o ponto de equivalência para estabelecer o valor da ConcentraçãoCH3COOH %


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A ELABORAÇÃO DOS DADOS

Na Atividade 2, as medições devem ser repetidas três vezes para considerar a média.

Dependendo do nível dos alunos, pode-se aprofundar um pouco mais e ampliar a análise dos dados com medidas de dispersão como a variância ou desvio padrão.

Outro parâmetro interessante é o

Quanto menor for a dispersão dos dados, menor será o valor do coeficiente de variação. Até 10% considera-se o resultado ótimo, de 11% a 20%, bom, de 21 a 30%, regular.

PREPARAÇÃO DAS SOLUÇÕES

Solução de hidróxido de sódio 0,66%

Pesar 6,6 g de hidróxido de sódio (seco); dissolvê-lo em água e avolumar a solução a 1 litro. Convém preparar com antecedência uma boa quantidade de solução de hidróxido de sódio, pois como ele é higroscópico, poderá haver variações entre duas soluções preparadas em diferentes momentos.

Solução de fenolftaleína

Dissolver 1 g de fenolftaleína em 50 ml de etanol e adicionar 50 ml de água. É preferível, mas não indispensável, utilizar água destilada.

A OBTENÇÃO DO INÓCULO

Na produção de vinagre se utilizam, em vez de espécies puras, misturas de diferentes variedades ou espécies de gênero Acetobacter. Existem três maneiras de obter o inóculo:

- A primeira é a partir de uma garrafa de vinho com a metade de seu conteúdo e mal fechada. Com o passar do tempo, o vinho terá se transformado em vinagre. Demora, porém funciona.

- A segunda é pedir um pouco de vinagre forte a algum colega ou a um produtor de vinagre. Trata-se de um pouco de vinagre sem pasteurizar no qual pode haver algum fragmento gelatinoso do vinagre-mãe. Prepara-se o caldo de fermentação misturando quantidades iguais de vinho e vinagre forte e se aguarda o crescimento de uma capa ou película gelatinosa na superfície do líquido (caldo).

- A terceira é mais elaborada. Trata-se de recorrer aos conhecimentos biológicos sobre flora microbiana e sucessão ecológica na superfície da uva. À medida que a fruta amadurece, as leveduras fermentam, transformando o açúcar da fruta no álcool; este é o substrato utilizado pelas bactérias acéticas para obter energia e manter sua atividade metabólica.

Separam-se do ramo algumas uvas muito maduras, dessas que ninguém come. Não importa que estejam um pouco passadas, mas não deve haver crescimento visível de fungos. Colocam-se as uvas em um recipiente que contenha um caldo com iguais quantidades de vinagre comercial e vinho (tinto, branco ou de frutas). Fecha-se o recipiente para impedir a entrada de ar, mas deixando bastante ar lá dentro. Depois de algumas semanas, se observará na superfície uma película ou camada gelatinosa, a denominada mãe do vinagre (Figura 3).

O inóculo pode ser obtido, em quantidade adequada, seguindo o procedimento descrito na Atividade 3 (Como iniciar a produção de vinagre). Independentemente do caminho escolhido, a partir do momento em que a mãe do vinagre aparece se amplifica lentamente o cultivo, adicionando-lhe vinho e monitorando a acidez.


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Figura 3: O vinagre-mãe (zoogleia)

A: vista lateral do caldo e a zoogleia; B B: zoogleia presa na balsa; C e D: a zoogleia já liberada da balsa parece uma massa gelatinosa.

A

C

D

O PROCESSO LENTO DE PRODUÇÃO DE VINAGRES


Qualquer recipiente de plástico ou vidro pode servir. Trabalhamos com caixas de diversos tamanhos, vasos de 500 ml e garrafas de água mineral ou refrigerante, todos de plástico.

O fermentador deve estar fechado para evitar a entrada de moscas, de modo que, para manter o vinagre em contato com o ar e a matéria-prima, o recipiente terá que ter uma capacidade bem maior que o volume máximo de vinagre. O oxigênio é um fator limitante da fermentação acética.

Para impedir a entrada de moscas, fechamos os recipientes com um pano de algodão muito espesso ou uma película de PVC ajustada com elásticos ou um cordão. O PVC permite a circulação de ar, mas deve-se ter o cuidado de não encher muito o recipiente, pois a aeração insuficiente produz vácuo. Furando a caixa ou sua tampa e cobrindo a abertura com um band aid grande também se impede a entrada de moscas, deixando passar o ar.

As tentativas de colocar torneiras não deram bons resultados, seja porque não conseguimos selar bem a união entre a caixa e a torneira, seja porque entupiram com a massa viscosa da mãe do vinagre.


A COMPOSIÇÃO INICIAL DO CALDO

O caldo se compõe de vinho e vinagre forte, que é vinagre com bactérias vivas. Se a quantidade de vinagre forte for pouca, pode-se complementar com um pouco de vinagre comercial. No caldo inicial as proporções podem-se modificar em função dos teores de álcool e de ácido acético e, também, da quantidade de inóculo disponível.


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No entanto, e independentemente de seu volume, o caldo deve ter 5-8% de teor alcoólico e 2-3% de acidez. Concentrações mais altas de etanol são tóxicas para a flora bacteriana que ainda não está adaptada ao meio, e concentrações baixas de acidez favorecem as contaminações. Nem sempre é fácil manter esta regra com os vinhos de frutas.

Exemplo 1: Acompanhamento da acetificação de alguns vinhos de frutas

Apesar do grau de acidez inicial ser baixo, nesta oportunidade conseguimos alguns vinagres interessantes, como os de abacaxi e caqui. Obviamente, nem sempre se alcança o sucesso.

Gráfico 1: Acompanhamento da acidez durante a acetificação de alguns vinhos de frutas (abacaxi, caqui, tangerina).

A MÃE DO VINAGRE

Com o passar do tempo, aparece na superfície do caldo uma película translúcida que cresce até transformar-se em uma espessa camada gelatinosa, a mãe do vinagre. Trata-se de um polímero de celulose produzido pelas bactérias acéticas e que as mantém na superfície do líquido, em contato com o ar e o substrato alcoólico. Embora tradicionalmente considerada uma zoogleia, desde o ponto de vista microbiológico a mãe do vinagre deve ser vista como um biofilme.

À medida que o tempo passa, a mãe do vinagre se espessa cada vez mais, até, finalmente, afundar no líquido. Em pouco tempo, forma-se na superfície uma camada nova.

As camadas velhas precisam ser retiradas para evitar sua decomposição, o que daria ao vinagre um odor e um sabor desagradáveis. Evita-se o problema colocando uma jangada ou balsa de sustentação na superfície do líquido.

Uma das montagens mais simples utiliza metades de bolinhas de isopor e palitos. Também pode se fazer um quadro de isopor e tecer uma rede com fio de náilon (Figura 5).

Figura 5: Formas simples de construir uma balsa

A e B: Balsas de bolinhas de isopor cortadas pela metade e palitos. C: Balsa construída com uma moldura de isopor e fio de náilon grosso; no detalhe, o entrecruzamento dos fios.

0

2

4

6

8

Semanas

Acide

z (%

)

Abacax i 1,4 1,6 2,7 7,4 7

Caqui 2,1 2,1 2,1 2,7 4,5 5,3 5,6 5,5 6 6,7

Tangerina 2,1 1,9 6,5 6,5 5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10


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CONDUZINDO A FERMENTAÇÃO

O início do processo lento está descrito na Atividade 4 (Produzir vinagre – Processo lento). A quantidade de vinho inicial depende da quantidade de vinagre forte disponível. Acompanha-se semanalmente o processo até a estabilização da acidez, quando todo ou quase todo o etanol tiver sido transformado em ácido acético.

Nesse momento, se abrem três caminhos:

- Adicionar vinho no fermentador, visando o aumento da produção.

- Processar, engarrafar e pasteurizar o vinagre formado no fermentador, visando representar um sistema de produção descontínua, em bateladas.

- Retirar parte do vinagre (não mais de 10%) e adicionar no fermentador uma quantidade equivalente de vinho, visando representar um processo de produção semicontínuo. Chega um momento em que a zoogleia, espessa demais, precisa ser retirada (Figura 6)

Figura 6: O processo lento da produção de vinagre

À esquerda se mostra o fermentador com uma balsa dupla. À direita, o mesmo fermentador depois da troca da balsa.

Exemplo 2: Acompanhamento da acetificação em um fermentador (processo lento)

Colocamos no fermentador 1 litro de vinagre forte e 1 litro de vinho a 10,70 GL, isto é, com um teor alcoólico de 10,7 ml de etanol em 100 ml de vinho. Medimos semanalmente a acidez, sendo que, na sexta semana, constam os valores medidos antes e depois de retirar 250 ml de vinagre e colocar 250 ml de vinho. A partir desse momento, o fermentador entrou em ritmo de produção.

Gráfico 2: Acidez do vinagre ao longo da acetificação (processo lento)

4

5

6

7

8

9

Semana

Acidez (%

)

Acidez (% ) 4,1 4,3 5,5 6,6 8,3 8,5 8,4

1 2 3 4 5 6 7

7,7


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PROBLEMAS POSSÍVEIS

Às vezes, a acidez dos vinagres de frutas não aumenta por falta de etanol. Existem algumas soluções muito pouco ortodoxas. A primeira consiste em adicionar alguns mililitros de vodca, aumentando o teor alcoólico em 1 ou 2%. Os exageros são perigosos, porque a vodca tem 38 a 400 GL de etanol, e muito etanol é tóxico para as bactérias acéticas. A segunda é congelar o vinagre, separando duas fases, uma sólida em cima e outra líquida embaixo, com maior concentração de ácido acético.

Outras vezes, a acidez diminui depois de atingir seu valor máximo e se estabilizar. Isto ocorre porque, ao desaparecer o etanol do meio, algumas bactérias acéticas (Gluconobacter) passam a utilizar o ácido acético como nutriente. Tanto o processamento do vinagre como as adições periódicas de vinho resolvem o problema.

Excesso de nutrientes e pouca acidez favorecem o crescimento de Acetobacter xylinum, uma espécie que produz grandes quantidades da mãe do vinagre, chegando a obstruir os dutos do fermentador rápido.

Também pode haver crescimento da população de bactérias lácticas, que dão ao vinagre um odor estranho e bastante desagradável. Não tem solução; joga-se tudo no lixo e começa-se novamente.

PRODUÇÃO, RENDIMENTO E PRODUTIVIDADE

O processo lento permite obter vinagres de acidez elevada (8-10%). A vantagem é que, retirando semanalmente 200 ml de vinagre com 10% de acidez e diluindo-o convenientemente, obteremos 400 ml de vinagre com 5% de acidez. Em outras palavras, a produção deste fermentador é de 400 ml por semana.

O rendimento esperado da fermentação acética pode ser calculado a partir da relação estequiométrica segundo a qual 40 g de etanol podem ser transformados em 60 g de ácido acético, ou seja, 1 g de etanol gera 1,304 g de ácido acético.

C2H5OH + O2 → CH3COOH + H2O 40 g 60 g

Na indústria, se considera aceitável a transformação de 1 g de etanol em 1 g de ácido acético, correspondendo a um rendimento de 76,7%, valor que expressa a percentagem entre o ácido acético formado e o ácido acético que poderia ter sido formado.

Na prática, o rendimento R se calcula mediante a fórmula:

R = 100 (Af – Ai) / Ei x 1,304 (1)

Onde Ai = Acidez inicial % (v/v), Af = Acidez final % (v/v), Ei = Etanol inicial % (v/v)

Exemplo 3: Como calcular o rendimento

Colocamos no fermentador 750 ml de vinho e 750 ml de uma mistura de vinagre e vinagre forte, obtendo uma acidez inicial de 3%. Se o teor alcoólico do vinho for de 120 GL, podemos dizer que introduzimos 12 x 750 /100 = 90 ml de etanol. Dado que a massa específica do etanol é de 0,78 g/ml, esse volume corresponde a 70,2 g de etanol.

Sendo o volume total do fermentador igual a 1.500 ml, calculamos o etanol % (m/v) inicial segundo a fórmula:

Ei % = 70,2g x 100 ml / 1.500 ml

Ei % = 4,7%

Cinco semanas depois, ao medir novamente a acidez, encontramos o valor Af = 7%

Calculamos o rendimento, aplicando a fórmula (1)

R = 100 (7 - 3) / 4,7 x 1,304

R = 65,3%


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Exemplo 4: Como calcular a produtividade

A produtividade se expressa como a quantidade de ácido acético formado, em gramas / litro x hora

No exemplo anterior, a diferença entre Af e Ai é de 4%, ou seja, em 100 ml de caldo se formaram 4 g de ácido acético. Considerando o volume total de caldo, a quantidade de ácido acético formado é de 4g x 1.500 ml / 100 ml = 60,

que correspondem a uma produção de 60 g / 1,5 l = 40 g/l

Por conseguinte, a produtividade do fermentador ao longo de 5 semanas, ou 840 horas, foi de 0,0476 g/l.h

O PROCESSO RÁPIDO DE PRODUÇÃO DE VINAGRES


Contando com um volume razoável de vinagre forte, o desafio consiste em construir um fermentador que permita simular as condições características do processo rápido de produção de vinagre.

Montamos um sistema simples no qual o vinho circula repetidas vezes sobre um suporte onde as bactérias acéticas estão aderidas. Na literatura, encontramos referências a diversos materiais: isopor, bagaço de cana-de-açúcar, de uva ou de maçã, cerâmica, pedras etc. Entretanto, não realizamos os testes correspondentes. Utilizamos aparas de madeira como suporte.

Lavamos e fervemos as aparas, por razões higiênicas e, também, para eliminar o olor e o sabor característicos da madeira. Submergimos as aparas em uma mistura de vinagre forte e vinho na proporção 3:1. Uma parte do vinagre forte pode ser substituída por vinagre comercial.

Depois de 2 a 4 semanas, observamos uma película fina e brilhante sobre a madeira, indicando a fixação das bactérias no suporte. É o momento de montar o fermentador, como descrito na Atividade 5 (Como construir um fermentador).

Qualquer tipo de garrafa serve, porém, convém evitar aquelas com desenhos ou relevos porque possuem buracos por onde entram as moscas. Uma bomba de aquário injeta ar na mangueira que conecta a parte inferior à parte superior do fermentador, garantindo o fornecimento de oxigênio e impulsionando a circulação do líquido.

A conexão para injetar ar é delicada. A cabeça da agulha encaixa na mangueira de aquário proveniente da bomba. Para facilitar a tarefa, pode-se recortar a cabeça da agulha, abrandar a mangueira com a chama de um fósforo ou conectar ambas as partes (cabeça da agulha e mangueira de aquário) com um pedaçinho de mangueira de látex. A ponta da agulha é inserida então no pedaço de mangueira de látex (Figura 7).

Figura 7: Montagem de um sistema para impulsionar o líquido por injeção de ar


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Dois problemas se observam com certa frequência. Um deles surge quando a bomba de aquário é colocada a uma altura menor que a do líquido presente na parte inferior do fermentador. Em caso de corte de energia, o líquido entra na bomba, inutilizando-a. O segundo é o refluxo de ar rumo ao fermentador, porque o líquido deixa de circular e a falta de nutrientes é prejudicial para as bactérias acéticas que estão nas aparas, no compartimento superior.

Evita-se o refluxo deixando um pedaço de mangueira bastante comprido entre a saída do fermentador e a agulha de injeção. Porém, se houver refluxo, deve-se restabelecer rapidamente a circulação. Um método simples de fazê-lo consiste em apertar a mangueira de látex antes do lugar onde está inserida a agulha até a chegada do líquido e soltar.


Antes de partir para a Atividade 6 (Produção de vinagre – Processo Rápido), é fundamental verificar com água o funcionamento do fermentador. Também é indispensável ter uma boa quantidade de aparas já inoculadas.

Desmonta-se o fermentador para colocar as aparas inoculadas no compartimento superior, e o caldo (vinagre forte e vinho em proporção 3:1) no compartimento inferior. Monta-se novamente o fermentador e, depois de verificar a inserção da agulha, se liga a bomba de aquário. O líquido começa a circular.

Depois de 48 a 72 horas o fermentador começa a embaçar devido ao aumento da temperatura no interior. É um bom sinal de atividade metabólica bacteriana, já que a acetificação é uma reação exotérmica. Acrescenta-se um pouco de vinho e se monitora a fermentação titulando o teor de ácido acético a cada dois dias.

Uma vez estabilizada a acidez no fermentador, se extrai parte do vinagre e se acrescenta uma quantidade equivalente de vinho. Deve-se estar sempre alerta para que a acidez não seja inferior a 4%.

O fermentador passa a funcionar como um sistema semicontínuo (Figura 8). Apesar de ser de qualidade inferior, a produção de vinagre com o processo rápido chega a ser 10 vezes maior que com o processo lento.

Figura 8: Processo rápido de produção de vinagre

Observam-se o fermentador em funcionamento e, ao lado, os recipientes onde se desenvolve o processo lento.

Exemplo 5: Monitoramento da acetificação (Processo rápido)

A acidez diminui quando se retira vinagre e se acrescenta vinho. Os valores registrados nos dias 5, 8, 11 e 15 correspondem às medidas tomadas antes e depois de retirar 500 ml de vinagre e colocar 500 ml de vinho.


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4,9 3,5 3,2

3

4

5

6

7

8

9

10

Días

Acidez(%)

Acidez (%) 4,4 7,5 7,5 4 6,8 8,7 9,5 6,1 8 8,5 8,8

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

4,3

Dias

Gráfico 5: Acidez do vinagre ao longo da acetificação (Processo rápido)

PASSAGEM DE UM SISTEMA SEMICONTÍNUO A UM SISTEMA CONTÍNUO DE PRODUÇÃO

Pode-se transformar o fermentador anterior de modo a alcançar um sistema contínuo de produção de vinagre. O vinho goteja lentamente a uma velocidade regulada por um dispositivo semelhante aos utilizados na clínica médica nas bolsas de soro para hidratação de pacientes. A transformação é interessante, mas cara.

O ACONDICIONAMENTO DO VINAGRE COMO PRODUTO FINAL

Seja qual for o processo utilizado, rápido ou lento, o vinagre obtido passa pelas seguintes etapas:

- Filtração.

- Diluição, para obter um produto com 5 a 6% de acidez. É preferível uma porcentagem superior à exigida comercialmente para compensar o erro experimental causado pelo uso de uma solução não estandardizada de NaOH para a medição da acidez.

- Engarrafamento.

- Pasteurização: esquentar a 650 C durante 5 minutos.

- Etiquetagem. Na etiqueta constam o produto, sua origem, a marca de fantasia, a firma responsável, a forma de obtenção (fermentação acética), a acidez, a composição do produto, o volume e, eventualmente, o preço. Vale a pena consultar nas gôndolas dos supermercados qual a informação exigida pelas autoridades locais. Em geral, o vinagre não traz data de validade.

AS ALTERAÇÕES DO VINAGRE

O vinagre pode sofrer diversos tipos de alterações. Algumas são de origem química, provocadas por metais; outras se devem às contaminações microbianas.

Comentamos anteriormente que alguns vinagres adquirem odor e sabor desagradável quando a acidez é inferior a determinado patamar, uma condição que favorece o crescimento de bactérias lácticas. Alguns organismos, como o verme nematódeo Anguillula aceti e o ácaro ou piolho do vinagre, são citados na literatura como fonte de alterações da qualidade do produto.

Mas, sem dúvida, a entrada de moscas (Drosophila) é a pior das tragédias, porque, depois de algumas horas, suas larvas passeiam pela zoogleia. Por menosprezar este perigo, excelentes vinagres acabaram no lixo.


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GUIAS DO ALUNO

Todos os protocolos que figuram a seguir podem ser adaptados a um número variável de alunos e demandam recursos materiais relativamente simples e baratos. Como utilizá-los? Qual a melhor sequência? A resposta depende do tempo disponível, dos objetivos e do espaço que ocuparão no planejamento do docente.

A Atividade 1 (Como preparar vinagre artesanalmente) é independente das restantes. Mostra a maneira mais simples de preparar vinagre sem necessidade de conhecimento de química.

A Atividade 2 (Como medir a acidez do vinagre) é indispensável para o desenvolvimento das atividades seguintes. Apesar de utilizar conceitos de volumetria, pode ser aplicada sem aprofundamento da parte química.

A Atividade 3 (Como iniciar a produção de vinagre) é básica para o início da produção de vinagre, seja pelo processo lento, seja pelo processo rápido.

A Atividade 4 (Produção de vinagre – Processo lento) mostra como obter uma boa quantidade de vinagre forte, que pode ser acondicionado como produto final ou utilizado para inocular as aparas.

A Atividade 5 (Como construir um fermentador – Processo Rápido) e a Atividade 6 (Produção de vinagre - Processo rápido) representam as duas etapas inseparáveis do processo rápido de produção de vinagre.

Por conseguinte, as atividades podem se desenvolver seguindo quatro sequências:

A1; A2 → A3 ; A2→A3→A4 ; A2→A3→A4→A5→A6


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A1. COMO PREPARAR VINAGRE ARTESANALMENTE

O vinagre é o produto de uma fermentação alcoólica seguida de uma fermentação acética. Na primeira, as leveduras transformam o açúcar da fruta em etanol; na segunda, as bactérias acéticas convertem o etanol em ácido acético.

Nesta atividade vamos preparar artesanalmente o vinagre a partir de uvas ou de outras frutas, por dupla fermentação (alcoólica e acética). O processo exige paciência, mas o resultado vale a pena.

MATERIAL

Para cada grupo: 1-2 kg de uvas, 200-250 g de açúcar, água, 1 limão, 2 garrafas plásticas, 1 balão, 1 elástico, liquidificador, tábua, faca, funil, 1 pedaço de pano de algodão ou 1 coador de pano, papel pH.

PROCEDIMENTO

PRIMEIRA ETAPA – PREPARAÇÃO PRÉVIA DE UM BOM VINHO DE FRUTAS

(Ver Atividade 2, de Vinhos)

SEGUNDA ETAPA – A TRANSFORMAÇÃO DE VINHO EM VINAGRE

RESULTADOS

1. Qual o aspecto da mãe do vinagre?

2. Descrever as características organolépticas do vinagre: cor, odor e sabor.


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DISCUSSÃO

1. O processo acaba quando o vinagre fica muito ácido. Uma vez filtrado e engarrafado, o vinagre é pasteurizado (650 C durante 5 minutos). Quais as vantagens e desvantagens desse tratamento?

2. Qual o interesse, para uma comunidade rural, em produzir vinagre artesanalmente?


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A2. COMO MEDIR A ACIDEZ DO VINAGRE?

Em muitos países, a legislação determina que um produto só pode ser chamado de vinagre quando resulta de uma fermentação e apresenta uma concentração de ácido acético superior a 4% Nesta atividade, mediremos a concentração de ácido acético do vinagre utilizando um método simplificado de titulação volumétrica.

MATERIAL

Para cada grupo: Vinagre comercial, solução de fenolftaleína (1%), solução de hidróxido de sódio NaOH (0,66%), 3 copinhos pequenos de plástico (50 ml), 1 seringa de 1 ml, 1 seringa de 10 ml (ambas sem agulhas).

PROCEDIMENTO


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RESULTADOS

1. Anotar os valores obtidos na tabela e calcular a média aplicando a fórmula

Tabela: Concentração de ácido acético do vinagre

Ensaio 1 2 3 Média

Ácido acético (%)

3. Há muita diferença entre os valores obtidos por uma única pessoa (Repetibilidade)?

4. Há muita diferença entre os valores obtidos por pessoas diferentes (Reprodutibilidade)?

5. Uma das qualidades de um bom método de medição é que se obtenham valores iguais ou muito parecidos quando é repetido por um operador (Repetibilidade) ou por vários operadores (Reprodutibilidade). Como qualificaria o método de titulação aplicado nesta atividade?


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A3. COMO INICIAR A PRODUÇÃO DE VINAGRE

A produção de vinagre pode ser considerada um cultivo em meio líquido de bactérias acéticas, em média ou grande escala. Para se obter a cultura inicial ou starter convém recorrer a frutas bem maduras, porque sua flora microbiana inclui leveduras e bactérias acéticas.

As bactérias acéticas se multiplicam em presença de etanol e em condições aeróbicas; suportam bem a acidez do ambiente, que aumentam ao transformar o etanol em ácido acético. Por conseguinte, a multiplicação das bactérias acéticas será favorecida em um meio ácido que contenha etanol e se encontre em contato com o ar.

Nesta atividade, seguiremos esse raciocínio para obter uma cultura rica em bactérias acéticas, que amplificaremos até conseguir uma quantidade adequada às nossas necessidades.

MATERIAL

PRIMEIRA ETAPA - CONSEGUIR VINAGRE FORTE. Para cada grupo: 2 recipientes plásticos de 500 ml, filme de PVC, elásticos, 4-6 uvas bem maduras, 100 ml de vinho tinto, 100 ml de vinho branco, 200 ml de vinagre comercial, material para a titulação (Atividade 2)

SEGUNDA ETAPA - AUMENTAR A QUANTIDADE DE VINAGRE FORTE. Para cada grupo: recipientes com maior capacidade, filme de PVC, elásticos, vinho tinto, vinho branco, material para a titulação (Atividade 2), isopor e palitos para construir uma jangada.

PROCEDIMENTO

PRIMERA ETAPA – CONSEGUIR VINAGRE FORTE


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SEGUNDA ETAPA - AUMENTAR A QUANTIDADE DE VINAGRE FORTE

RESULTADOS

Quanto vinagre forte se obteve?

DISCUSSÃO

Como poderíamos manter indefinidamente este cultivo de bactérias acéticas?


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A4. A PRODUÇÃO DE VINAGRE – PROCESSO LENTO

Nesta atividade, produziremos vinagre pelo processo lento. Em um recipiente, colocaremos vinho e vinagre forte, ocupando três quartos de sua capacidade. As bactérias acéticas (Acetobacter) fermentam e se multiplicam, formando uma película gelatinosa na superfície do líquido, um lugar onde estão simultaneamente em contato com o oxigênio do ar e o etanol do vinho.

MATERIAL Uma caixa de plástico, 1 jangada, filme de PVC, barbante, material para a titulação (Atividade 2), vinho (12 a 140 GL) e vinagre forte (7 a 8%) em quantidade tal que possam ocupar três quartos da capacidade do recipiente.

PROCEDIMENTO

PRIMEIRA ETAPA – INÍCIO DA PRODUÇÃO


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ANÁLISE DOS DADOS

1. Qual o volume de etanol em 100 ml de caldo, no início da produção?

2. A massa específica do etanol é de 0,78 g/ml. Quantos gramas de etanol (Ei) havia em 100 ml de caldo, no início da produção?

3. Calcula-se que 1 g de etanol pode originar 1,304 g de ácido acético. Justifique esta afirmação, sabendo que a equação da fermentação acética é:

CH3CH2OH + O2 → CH3COOH + H2O

4. O rendimento expressa a relação entre a quantidade de ácido acético obtido e a quantidade de ácido acético esperado. Seu valor se calcula mediante a fórmula

R% = 100 (Af – Ai) / (Ei x 1,304).

Qual o rendimento do processo? Como podemos melhorá-lo?

SEGUNDA ETAPA – ENTRANDO EM RITMO DE PRODUÇÃO

ANÁLISE DOS DADOS

1. Calcule a produtividade do fermentador em gramas / litro x hora.

2. Quanto vinagre a 4% poderia se obter semanalmente?

DISCUSSÃO

Ao se estabilizar a acidez, na primeira etapa desta atividade, poderíamos ter dado fim ao processo, extraído o produto, limpado o fermentador e começado tudo de novo. Este procedimento teria caracterizado o sistema de produção como descontínuo.

No entanto, na segunda etapa, ao extrair parte do produto e acrescentar mais matéria-prima, transformamos o sistema de produção em semicontínuo.

Quais as vantagens e desvantagens de cada sistema de produção?


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A5. CONSTRUINDO UM FERMENTADOR - PROCESSO RÁPIDO

Trata-se de construir um fermentador que permita simular as condições características do processo rápido de produção de vinagre: o agente biológico está fixo em um material inerte e a oxigenação é abundante devido à rápida circulação do líquido.

Nesta atividade, construiremos um fermentador com um compartimento onde colocaremos o material inerte com as bactérias imobilizadas e um sistema de propulsão do líquido que assegure a oxigenação.

MATERIAL PARA AMBAS AS ETAPAS: PREPARAÇÃO DO MATERIAL E MONTAGEM DO FERMENTADOR

Garrafas plásticas, algodão, tesouras para cortar as garrafas, um prego para furá-las, mangueira de aquário, mangueira de látex, bomba de aquário, agulha de injeção, fósforos.

PROCEDIMENTO

PRIMEIRA ETAPA – PREPARAÇÃO DO MATERIAL


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SEGUNDA ETAPA – MONTAGEM DO FERMENTADOR

RESULTADOS

1. Os problemas mais frequentes costumam ser a perda de líquido nas conexões e o refluxo da circulação. Como se solucionaram estes problemas?

2. Fecha-se a garrafa 2 com uma rolha de algodão enrolada ao redor da mangueira. Porém, entre as duas garrafas, pode ter ficado algum buraco que permitiria a entrada de moscas. Qual a solução proposta para selar esse espaço?


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A6. A PRODUÇÃO DE VINAGRE - PROCESSO RÁPIDO

Nesta atividade, produziremos vinagre mediante um processo rápido. O vinho circulará repetidas vezes sobre um material no qual teremos fixado previamente as bactérias acéticas (aparas de madeira, por exemplo).

MATERIAL PRIMEIRA ETAPA – PREPARAÇÃO PRÉVIA

Inoculação das aparas: vinagre forte, vinagre comercial, aparas lavadas e fervidas.

Montagem do fermentador (Verificação do sistema de circulação e aeração, Atividade5).


Fermentador, aparas previamente inoculadas com bactérias acéticas, vinho, vinagre forte, material para a titulação (Atividade 2)

PROCEDIMENTO

PRIMERA ETAPA - PREPARAÇÃO PRÉVIA


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RESULTADOS

1. Representar graficamente a evolução da acidez no fermentador.

2. Quanto vinagre a 4% se consegue a partir do volume de vinagre forte retirado por semana?

3. Qual a produtividade do fermentador (gramas / litro x hora)?

DISCUSSÃO

Este tipo de produção é contínuo ou semicontínuo? Como se poderia montar um sistema contínuo de produção?

www.ort.org.br

As atividades práticas deste manual foram desenvolvidas e testadas nos laboratórios de Biotecnologia do Instituto de Tecnologia ORT do Rio de Janeiro, com a participação de seus professores, técnicos e alunos.

O Instituto de Tecnologia ORT é um Colégio de Ciência e Tecnologia com cursos de Ensino Fundamental II (do 6º ao 9º ano) e de Ensino Médio Técnico (em três anos) com especialização em Biotecnologia, Comunicação Social, Eletrônica e Informática.

ORT - ORGANIZAÇÃO, RECONSTRUÇÃO E TRABALHO é uma instituição educacional de origem judaica que se dedica ao ensino e treinamento tecnológico. Atua hoje em mais de 50 países; suas escolas são frequentadas por cerca de 300.000 alunos.

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