Reporte de práctica de laboratorio

Práctica No. 3: “Cromatografía en Columna”

Análisis Cromatográfico y de Masas

Docente: Dra. Laura Paloma Correa Cuevas

Equipo No. 2

IntegrantesMarcos Abdiel Flores Nungaray

Carlos Alexis Ibal RodríguezChristian Ulises Gutiérrez Rojas

Moisés Alejandro Román DávalosConnie Rubí Páez Rodríguez

Dalia Itzel Ramos JaraDalia Getzabeth Cuevas Ayón María Esther Zamora GalvánGabriela Martínez Márquez

Grupo: 6° C

Turno Vespertino26 de mayo de 2015

Universidad Autónoma de Nayarit

Unidad Académica de Ciencias Químico Biológicas y Farmacéuticas

Práctica 3 “Cromatografía en columna”1. Introducción

La cromatografía es un método físico de separación para la caracterización de mezclas complejas, la cual tiene aplicación en todas las ramas de la ciencia. Las técnicas de la cromatografía están basadas en el principio de retención selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes. La cromatografía en columna es quizás el método más general, utilizado para la separación, a la vez que para la purificación, de diferentes compuestos orgánicos.

En este tipo de cromatografía, la fase estacionaria utilizada, es decir, el adsorbente, se coloca en el interior de la columna de vidrio, la cual finaliza con una llave para controlar el paso de sustancias al exterior de la columna. La fase estacionaria se impregna con el eluyente o fase móvil. Seguidamente la mezcla orgánica que se interesa separar se deposita por la parte superior de la fase estacionaria, y así la fase móvil podrá ir atravesando el sistema. la separación se consigue haciendo fluir la mezcla a través de una columna de adsorbente. Emergiendo los compuestos en la columna a tiempos diferentes, y recogiéndolos en fracciones separadas.

El tiempo que se necesita para hacer fluir un compuesto por la columna, se conoce con el nombre de tiempo de retención. Este tiempo varía, siendo característico de cada compuesto en una condiciones cromatográficas determinadas, que varían según el absorbente usado, el disolvente, la presión, el diámetro que tenga la columna utilizada, etc.

El absorbente mayormente utilizado para las cromatografías en columna, es el gel de sílice. A veces, en sustitución del gel de sílice, cuando éste es incompatible con la mezcla a separar, se utilizan la alúmina o el florisil (silicato magnésico). La cromatografía en columna puede realizarse por gravedad o a media presión. Cuando se realiza a media presión, se conecta la cabeza de la columna a un compresor o a una línea de aire comprimido. La medida de las partículas de gel de sílice para realizar las cromatografías a media presión debe ser más pequeñas que en el caso de la cromatografía por gravedad. Si en la cromatografía por gravedad se utilizara un gel de sílice con un tamaño de partículas más pequeñas, no se produciría elución, pues se impediría el flujo del disolvente. Pero en cambio, si se aplica presión, entonces debido a la fuerza si se produciría la elución por el disolvente. A causa de la disminución del tamaño de las partículas del absorbente, se produce una separación más eficaz. Generalmente la cromatografía a media presión, produce mejores resultados que la cromatografía por gravedad, y además, al ser más rápida, es la más utilizada.

Cuando se va a realizar una cromatografía en columna, lo primero que se debe hacer es elegir un disolvente adaptado para el caso, para así optimizar la

separación de los componentes de la mezcla. Dicha operación se produce a través de cromatografía analítica en capa fina. La variante más influyente en la eficacia de la separación de la cromatografía a media presión usando gel de sílice es el diámetro de la columna, así como la cantidad de gel utilizado.

Para elegir el disolvente, primero se lleva a cabo una cromatografía en capa fina de la muestra a analizar. El disolvente debe producir una buena separación de los componentes de la mezcla en la placa, colocando el componente menos polar a un Rf cercano a 0.3. En el caso de columnas pequeñas, lo ideal es usar un eluyente menos polar que el conseguido en el resultado de la cromatografía en placa.

A veces se utilizan mezclas de disolventes y se hace una elución en gradiente. Para esto, la cromatografía se inicia con una mezcla de disolventes de polaridad adecuada para poder separar el componente que posea mayor Rf, y así, una vez recogido, se aumentará poco a poco la polaridad para poder ir separando los componentes más polares. Si cuando se empieza la cromatografía se usa un disolvente excesivamente polar, los componentes de la mezcla eluirán conjuntamente, lo que llevaría a que la separación no tenga lugar.

En cuanto a la muestra de interés de esta práctica tenemos la lecitina. Su nombre procede del griego “Lekigos” que significa “yema de huevo” debido a que fue por primera vez aislada de la yema del huevo. Su descubridor fueMaurice Gobley en el año 1850. Es un grupo de sustancias l de color amarillo marrón. Su composición está formada principalmente por colina, glicerol ácidos grasos, y fosfolípidos.Las lecitinas obtenidas de semillas oleaginosas como soja y recientemente girasol son empleadas como aditivos en la manufactura de productos alimenticios, cosméticos y farmacéuticos debido a suspropiedades emulsionantes.

2. Metodología

Objetivo: Aprenderás a realizar la cromatografía en columna, sus limitaciones, aplicaciones, la fase de preparación de la muestra y revelación de cromatoplaca.

Reactivos y materiales (Por equipo)

Sesión 1

1 Probeta de 100mL

2 vasos de precipitados de 100mL

1 embudo de filtración

1 embudo de separación

1 Papel filtro

1 Coladera

Agua destilada

Yema de huevo

50 mL de acetona

Vial con tapa con septa de politetrafluoroetileno (PTFE)

Espátula

50 mL de etanol 95% 5 mL de éter de petróleo

Sesión 2

Por grupo:

Cromatografía en columna (CC)

Fibra de vidrio (10g aprox)

10 mL de cloroformo

1 columna cromatografica

Soporte y dos pinzas con nuez para la columna

12.5 g de óxido de aluminio

2 Pipetas Pasteur de tallo corto

Probeta de 50mL

Pipeta graduada de 1mL

12 mL de cloroformo – metanol 9:0.5

50 mL de cloroformo – metanol 9:1

10 Tubos de ensayo de 15X100 (y gradilla) o 10 frascos “Gerber” (y una caja para transportarlos)

1 Probeta de 5mL

Cromatografía de capa fina (TLC) cromatoplacas de silicagel 60F254 10X20 en soporte de aluminio.

Lápiz HB con punta fina (traer sacapuntas, no usar portaminas) y regla de acero de 30 cm (una por equipo). Exacto, Capilares o micro jeringas.

Sesión 3:.

138mL de fase móvil: Cloroformo: metanol: Ác acético: agua::75:45:12:6

Secadora (de preferencia con aire frio)

Ácido anilinonaftalensulfunico (ANS) preferentemente uno por cada 3 equipos).

Plancha de calentamiento.

Jeringa Hamilton de 100 o 200 micro litros.

Mechero con gas

Lámpara UV de onda larga y corta.

Método:

Sesión 1: Preparación de la muestra:

Por grupo (por equipo hacer la cuarta parte):

1.- Tomar 4 yemas de huevo (aproximadamente 50g) se lavan cuidadosamente con agua, se pasan con una coladora para eliminar membranas.

2.- Se mezclan con 100 mL de acetona a 25 ºC con un agitador hasta homogeneización. Se deja reposar por veinte minutos para precipitar fosfolípidos crudos y proteínas, después se filtra.

3.- El extracto se descarta y el sedimento se lava 3 veces con 20mL de acetona previamente enfriada a 15ºC y se homogeneiza en 100mL de etanol 95%

4.- Se dejó reposar veinte minutos y se filtra. La extracción se lava dos veces con 50 mL de etanol al 95%.

5.- El sólido se filtra y se disuelve en 20 mL de éter de petróleo. (si es posible se hacen lavados por extracción liquido-liquido con 100mL de acetona dos veces).

Sesión 2, cromatografía en columna

Colocar una pequeña porción de fibra de vidrio. Pesar 12.5g de óxido de aluminio, agregar 10 mL de cloroformo, agitar con una varilla de vidrio y vaciar de una sola vez en la columna para que se empaque uniformemente y en una sola pieza.

Agregar 20mL de cloroformo para lavar la columna.

Cuando el cloroformo haya terminado de pasar y solo quede 3mm sobre el óxido de aluminio, se agrega el extracto de éter de petróleo de la lecitina (25 uL deben agregarse a una cromatoplaca, ver abajo). Se agrega con una pipeta Pasteur cuidadosamente, tratando de que se empaque en un mínimo de volumen. Se enjuagan las paredes con pequeñas cantidades de cloroformo. Iniciar el agregado de 30mL de cloroformo para arrastrar todas las impurezas posibles de la lecitina.

Agregar 12.5 mL de cloroformo-metanol 9:0.5 y descartar el eluido.

Agregar 50 mL de solución de cloroformo-metanol 9:1. Tomar fracciones de 5 mL. A medida que van saliendo las fracciones, agitar y homogeneizar cada fracción. Dejar las fracciones semitapadas para permitir la evaporación del solvente; en cuanto se evapore, tapar y guardar en refrigeración las fracciones.

Preparar la cromatoplaca para monitorear el fraccionamiento. Colocar 25uL de cada fracción (de la 1 a la 8) y monitorearlos en capa fina. Tomar un punto para correr la muestra del extracto completo. La cromatoplaca se guarda hasta la siguiente sesión.

Sesión 3;

Saturar la cámara cromatográfica con la fase móvil al menos media hora antes de usarla. Si fue posible preparar la cromatoplaca con anterioridad eluír la

cromatoplaca una vez saturada. De lo contrario, prepararla (ver sesión anterior).

Una vez eluida, secar con aire; si usa caliente, no ponerlo demasiado cerca para evitar accidentes. Aplicar en aerosol el ANS al 0.1%. Secar con el aire caliente y evaluar la cromatoplaca a UV de onda larga. Las fracciones de lecitina cromatográficamente pura se reúnen en un solo frasco gerber y el resto se descartan. Se puede evaluar la concentración por mineralización de la muestra y por la técnica fiske-Subbarow.

Normas de seguridad:

Dado que se trabaja con solventes explosivo y tóxico se debe tener la precaución de trabajar con áreas ventiladas y usar mascarilla.

3. Resultados y Discusiones3.1. Extracción y preparación de la muestra

Al inicio de esta práctica, se quebraron dos huevos de gallina y se les extrajeron cuidadosamente las yemas en su interior. Estas yemas fueron sometidas a un lavado con agua, de manera cuidadosa, con el fin de eliminar el contenido de la membrana (clara de huevo) sobrante, ya que este líquido contiene altas cantidades de material proteínico principalmente ovoalbúmina en un 54%, ovomucina en un 11% (las cuales responsables de la consistencia de la membrana), y la lisozima (3,4%), las cuales pueden interferir en los métodos cromatográficos siguientes debido a su alto peso molecular. Después de su lavado, las yemas fueron depositadas en un vaso de precipitado, para posteriormente añadirles 50ml de acetona a 25°C, para enseguida homogenizarla. Luego de este proceso, la mezcla yema-acetona (con aspecto coloidal y de color amarillo) se dejó reposar por 20 minutos. Esta primera parte se realizó con el fin de precipitar los compuestos no polares contenidos en la yema con ayuda de la acetona, la cual es un disolvente apolar, siendo que este fenómeno obedece al principio químico de “semejante disuelve a semejante”, solubilizando principalmente proteínas que pudiesen estar retenidas en la misma (el contenido de proteínas en la yema es más bajo que en la membrana) y ciertos lípidos que pudieran intervenir por su peso molecular en los siguientes pasos (p. ej. los fosfolípidos). Luego, se filtró el contenido anterior mencionado, con el fin de dejar solo los componentes lipídicos necesarios (que se mencionarán más adelante). Después se lavó el sedimento sobrantes 3 veces con 10 ml de acetona a 15°C, para disminuir la reacción la velocidad de la reacción anterior mencionada, con la finalidad de hacer la separación más eficientede los compuestos apolares.

Im. Izq: Formación de muestra semicoloidal, Im. Cent.: Filtración de los residuos apolares. Im. Der.: Acumulación de los residuos de acetona (los cuales contienen los lípidos de la yema).

La muestra obtenida se fue homogenizada nuevamente, ahora con 50 ml etanol al 95%, con el fin de desnaturalizar el contenido proteico (en este paso puede quedar en menor proporción) que pudiese quedar presente en la mezcla, rompiendo sus enlaces y alterando su estructura molecular, para después precipitar estos residuos. Pero además, provoca la deshidratacón de la yema, es decir, el agua que pudiera contener la misma sale de esta conformación y en su lugar entra el alcohol, provocando un efecto detergente al lograr disolver los lípidos contenidos dentro de la muestra. Después de agregar el alcohol, se dejó reposar la muestra por 20 minutos. Durante este lapso de tiempo, se observó una separación inmiscible de dos mezclas dentro del vaso. Esto es debido a la precipitación del contenido lipídico y la solubilización de restos proteínicos de la

yema.La separación de los componentes provocó la formación de un disolución semiopaca en el fondo de este recipiente (la cual contenía los lípidos de la yema), disueltas en alcohol etílico, mientras que en la parte superior se encontraba restos proteínicos desnaturalizadosde menor peso molecular solubilizados en la acetona presente, ésta última tornó con una consistencia menos viscosa y más transparente que la anterior. Su separación se debe a la densidad de los disolventes, predominando la del etanol (0.798 gr/ml), haciendo que este líquido se estanqué hacia el fondo del vaso, dejando los residuos de acetona(0.791 gr/ml) en la parte superior. Esta extracción se realizó dos veces más, ahora con 25 ml de este compuesto alcohólico, permitiendo la generación del fenómeno anterior dicho, con la finalidad de separar por filtración los componentes retenidos en el líquido con mayor densidad, siendo en este caso los lípidos solubilizados en el alcohol etílico.

La fase de etanol extraída (la cual tuvo una consistencia sólida) se colocó en un nuevo vaso de precipitado, para enseguida disolverla en 10 ml de éter de petróleo. En este caso, el éter de petróleo actúo como disolvente por apolaridad al solubilizar la fosfatidilcolina o lecitina, el componente lipídico de interés de ésta práctica. Tras la solubilización, en el vaso de precipitado, ocurrió de nueva cuenta una separación inmiscible, en la cual el éter de petróleo fue el líquido (semitrasparente de color amarillo) con menor densidad (0.6 gr/ml), posicionándose arriba de los residuos de alcohol etílico, los cuales contenían restos lípidicos variados (p. ej. colesterol, lipoproteínas), siendo éste último descartado, debido a que éstos no son los componentes de interés de nuestra práctica.

Después de esta primera sesión, se guardaron los residuos de éter durante una semana en un frasco de vidrio por el lapso de una semana.

3.2. Cromatografía en columna

Im. Izq. : Separación por densidad de disolventes. La parte superior se conforma por éter de petróleo y lecitina, mientras que la parte inferior por etanol y lípidos. Im.Der.: Recolección de éter de petróleo filtrado.

Im. Izq.: Homogenización con etanol. Im. Der. : Separación por densidad de disolventes. Parte superior se conforma por acetona y proteínas, mientras que la parte inferior por etanol y lípidos.

Transcurrido los 8 días posteriores a la realización de las extracciones, se retomó la misma en una segunda sesión, en la cual se realizó la Cromatografía en columna. Como discusión breve, esta cromatografía tiene como principio basarse en las velocidades de los compuestos conforme bajan la columna. Al añadir la muestra y la fase móvil (ya sea isocrática o por gradiente) a la columna, por efecto de la gravedad, se promueve un movimiento de la muestra a través de la columna, estableciendo un equilibrio entre el soluto adsorbido en la fase estacionaria y la fase móvil que fluye por este recipiente. Debido a que cada uno de los componentes de una mezcla establecerá interacciones diferentes con la fase estacionaria y la móvil, estos serán transportados en diferentes velocidades, promoviendo una mejor separación. De esta manera, las diferencias en las velocidades de desplazamiento a través de la fase estacionaria corresponden a las diferencias en los tiempos de elución de los distintos componentes de la muestra, los cuales se recogerán en fracciones diferentes.

Al contar con la muestra necesaria (la lecitina) dentro del extracto de éter de petróleo, es importante considerar que en el mismo se encuentran otros componentes lipídicos (p. ej. fosfatidilcolina) que hayan sido disueltos por este componente. Para separar la lecitina de estos componentes, se recurre a la utilización de la cromatografía de columna. Debido a la falta del material necesario para realizar por equipo esta práctica, se procedió a recolectar en un frasco todos los residuos de éter de petróleo de toda el aula, para que éste sea valorado de manera individual en los siguientes pasos.

De manera previa, se colocó dentro de la una columna de vidrio, un soporte de fibra de vidrio con poros muy estrechos, con la finalidad de retener la fase estacionaría que se agregaría más adelante. Después se agregó a la columna la fase estacionaria de naturaleza polar, la cual se conformaba por 12.5 grs de óxido de aluminio, disueltos en 10 ml de cloroformo (el cual le permite a la FE tener una mejor moldeabilidad y compactibilidad dentro de la columna). Posteriormente, se realizaron procesos de lavado con 20 ml de cloroformo, para compactar más la fase estacionaria. Tras compactar la fase estacionaria, se dejaron 3 mm de cloroformo sobre la misma, para permitir el flujo de flujo de la muestra y las fases móviles que se utilizaron posteriormente.

Al contar con nuestra columna preparada con la fase estacionaria correspondiente, se añade a este recipiente el residuo de éter de petróleo con los residuos lipídicos (en el cual se recuerda que se encuentra la lecitina) con ayuda de una pipeta Pasteur. Después de añadir la muestra de éter de petróleo, se realiza dentro de la columna un lavado con 30 ml de cloroformo, con la finalidad de solubilizar las impurezas apolares que pudiese contener este extracto (p. ej. contenido proteínico no extraídos), reteniendo en la fase estacionaria la lecitina y eluyendo el contenido impuro de la muestra.

Tras el lavado con cloroformo, se procedió a realizar la separación cromatográfica(la cual actúa por elución por gradiente) con dos mezclas de soluciones que actuaron como fase móvil de esta parte. La primera fase móvil se conformaba por una mezcla de cloroformo-metanol, en proporción 9:0.5, respectivamente. De esta primera fase móvil, se añadieron 12.5 ml dentro de la columna cromatográfica. En

Recolección de residuos impuros con cloroformo

Preparación de la columna con la fase estacionaria

este caso, al usar una mayor cantidad de cloroformo (solvente mediamente apolar) junto con metanol (solvente polar), al interaccionar con el extracto de la lecitina, hubo una competencia más eficiente entre el disolvente apolar junto con las moléculas apolares de la muestra por los lugares apolares que se encontraban diversos en la fase estacionaria (esto se debe a que previamente el óxido de aluminio se sometió a lavados de cloroformo), provocando el desplazamiento de los componentes apolares por ejemplo de gravedad hasta salir por debajo de la columna. En este caso, aquellos compuestos no necesarios (p. ej. los fosfolípidos) fueron descartados en un eluido semitransparente amarillo, mientras que al igual que en el lavado anterior, se retuvo la muestra de interés en la fase estacionaria. La proporción 9:0.5 de la fase móvil ayuda a evitar el escape de la lecitina de la columna, alterando en parte la polaridad del cloroformo, haciendo que no sea tan afín al compuesto de interés y sea retenido en las partes apolares del óxido de aluminio.

Después de esta primera separación, se procedió a añadir la segunda fase móvil, conformada de igual manera de cloroformo-metanol, pero en proporción 9:1, respectivamente. De esta segunda fase móvil, se añadieron 50 ml dentro de la columna cromatográfica. Al igual que en la primera fase móvil utilizada, ésta actuó como solvente de compuestos apolares presentes en la muestra, sin embargo, se aumentó la proporción del metanol para incrementar la afinidad hacia el compuesto de interés, es decir, solubilizar la lecitina contenida en el óxido de aluminio y poder eluirla fuera de la columna.Sin embargo, no se pudo observar el progreso de la separación debido a que los compuestos son incoloros, y por tanto se debieron aislar los compuestos conforme fueron extraídos. Dado a esto, se recolectaron (de forma descendente a asciende de la columna) 8 fracciones provenientes de la elución con la fase móvilde la muestra, cada una de 5 ml. Tras la recolección de las fracciones, se dejaron por el lapso de una semana los frascos contenedores semidestapados, con la finalidad de permitir la evaporación de la fase móvil sobrante en temperatura ambiente, para que éstos no interfirieran en los siguientes pasos.

3.3. Aplicación de la cromatografía de capa fina

Trascurrido los 8 días de la segunda sesión, se retomó la última parte de la práctica, en la cual se realizó una segunda separación de muestra por el método de cromatografía de capa fina. En este caso, se eligió como fase estacionaria a la cromatoplaca de gel 60 F254 (12x10 cm aproximadamente) en soporte de aluminio. Esta cromatoplaca se conforma de sílice (también llamado silica gel o ácido sílico), un agente adsorbente de naturaleza polar que tiene la capacidad de retener aquellos compuestos que posean una polaridad similar en su estructura a partir de las acción de las fuerzas electrostáticas que se generen entre ambos. El soporte de aluminio complementa a la fase estacionaria, ya que este agente le confiere mayor polaridad, de tal forma que retendrá con mayor avidez a los componentes polares durante la separación.Al escoger la fase estacionaria, se trazó con un lápiz HB en ella (en la parte del sílice) las líneas “origen” (al igual que 11 puntos por cada 0.6 cm de longitud de esta línea) y “frente”, se procede a calentarla a 60°C por 20 minutos, con el fin de evaporar y/o evitar la adsorción aquellos agentes extraños que contenga en su estructura, que pudieran afectar la separación cromatográfica.

Recolección de fracciones de lecitina

Por otro lado, los docentes encargados realizaron la elaboración de la fase móvil a partir de los eluyentes disponibles, siendo en este caso Cloroformo, Metanol, Ácido Acético y Agua, en proporción 75:45:12:6, respectivamente Tras realizar la fase móvil, este solvente se añadió a una cámara cromatográfica de vidrio hasta una altura de 0.5 cm por arriba del fondo de la misma, para después taparse por un tiempo aproximado de media hora.

Al contar con nuestra fase estacionaria, fase móvil y los instrumentos necesarios (jeringa Hamilton de 200 μl), se procedió a realizar la separación de las muestras problemas por capilaridad. Primero, se colocó en la cromatoplaca las muestras que quieren separarse, siendo en este caso el residuo de éter del grupo y las 8 fracciones obtenidas de la separación por columna cromatográfica. Estas muestras fueron añadidas a partir del punto 1 y hasta el punto 9 marcados en la cromatoplaca (los puntos 0 y 10 no fueron utilizados debido a su cercanía con los bordes de la cromatoplaca, ya que al momento del corrimiento puede perderse muestra problema). Entre los puntos del 1 al 8 agregaron de manera ascendente 25 μl de las 8 fracciones obtenidas, es decir, la fracción 1 en el punto 2, la fracción 2 en el punto entre, y así sucesivamente, mientras que en el punto 9 se añadió 25 μl del residuo de éter del grupo.Al terminar de añadir las muestras problema a la cromatoplaca, se procedió dejar a secar las mismas sobre una plancha a 60°C, con el fin de evaporar el exceso de que pudiese interferir con las otras durante el corrimiento.

Después de dejar secar la cromatoplaca con las muestras, la fase estacionaria se introdujo con la parte del sílice hacia el frente (para visualizar las muestras) en la cámara cromatográfica ya estabilizada con la fase móvil, con el fin de iniciar el proceso de separación por capilar. Después de añadirla, la cámara se cerró y empezó el corrimiento de las muestras. A continuación se obtuvieron los siguientes resultados.

3.3.1. Corrimiento de las muestras problema

Inmediatamente, la fase móvil al entrar en contacto con la cromatoplaca, ascendió rápidamente por capilaridad, provocando el corrimiento de las muestras también de manera ascendente. En este caso, eluyente Cloroformo-Metanol-Ácido Acético-Agua 75:45:12:6, al contar con un mayor volumen del primer compuesto, la carga neta entre otros compuestos es igual y por tanto pueden vencerse fácilmente las fuerzas intermoleculares de los compuestos con los que entra en contacto. Al predominar el cloroformo, podemos decir que esta fase móvil posee un alto carácter apolar, que a su vez, obedece un principio químico que dice que “semejante disuelve a semejante”, es decir, al agregar este eluyente apolar, el adsorbente arrastrará los compuestos con él, de esta manera, ciertos componentes de las muestras que son polares se adsorben en la fase estacionaria en el lugar de origen, y a medida que se produce la elución, van siendo desplazados y solubilizados los componentes apolares junto el disolvente de la fase

Cromatoplaca con las muestras dentro de la cámara cromatográfica.

móvil, provocando así la separación. En el caso de los eluyentes restantes (principalmente el ácido acético), al realizar el diseño de la fase móvil, se hizo con el propósito de evitar la ionización de los ácidos grasos presentes en las muestra, ya que esto es causa de la formación de malos arrastres o largas manchas asimétricas en la fase estacionaria. Al adicionarse ácido acético en pequeñas cantidades, éste mantiene cualquier ácido graso (especialmente los que conforma la estructura de la lecitina) en la forma RCOOH, en vez de una forma ionizada como RCOO-. Por otro lado, el metanol y el agua, al ser compuestos de naturaleza polar, efectúan su efecto de atracción por ciertos compuestos polares, facilitando la retención de los mismos en la cromatoplaca, para que estos no interfieran en el corrimiento de las apolares.

En el caso del metanol de la fase móvil, al estar en menor proporción, el carácter polar del solvente se ve desfavorecido, sin embargo, este puede efectuar su efecto de atracción con ciertos compuestos, facilitando la retención de compuestos polares en la cromatoplaca para que éstos no interfieran en el corrimiento de los apolares.

Las muestras experimentaron corrimientos provocados por la fase móvil, pero este fenómeno no se presentó de la misma forma en todas, esto se debe a que cada una presenta una afinidad distinta con respecto con la fase móvil. Al estar sometidas en distintos solventes, cada muestra es un vehículo de naturaleza líquida que transporta diversos tipos de componentes y por tanto, la afinidad de los mismos por otros compuestos es muy variada. Tras el procedimiento de corrimiento, se dejó secar la cromatoplacacon ayuda de una secadora de aire caliente, para evaporar el exceso de fase móvil que pudiese alterar los resultados. Después, se aplicó en forma de aerosol una solución reveladora de ANS (ácido anilinonaftalénsulfónico) al 0.1% en agua, la cual forma complejos fluorescentes, es decir, son capaces de absorber energía en forma de radiaciones electromagnéticas, emitiendo parte de la misma en forma de radiación en una longitud de onda determinada.

Para visualizar el corrimiento de las muestras, la cromatoplaca se sometió a un espectro UV de onda larga (400 – 315 nm) y con la ayuda de un lápiz HB se marcaron las manchas obtenidas y sus medidas. En la siguiente tabla se muestran las manchas obtenidas y sus medidas correspondientes.

Tabla 1: Medidas obtenidas

Fracción.Manchas por

fracción.Distancia de la muestra (cm)

Distancia del eluyente (cm)

Ancho de mancha

(cm)

11 2.0

6.30.5

2 4.4 0.63 5.5 1.0

2 1 5.6 6.2 1.13 1 5.8 6.3 0.54 1 6.2 6.3 0.25 1 6.2 6.3 0.2

Cromatoplaca (previamente rociada con ANS al 0.1%) sometida a radiación UV de onda larga

6 1 5.5 6.2 1.17 1 5.7 6.1 0.78 0 0 6.1 0

Muestra 1 5.5 6.2 1.0*: Los números de mancha por muestra están enumerados con base en el orden de aparición en la placa cromatográfica, de abajo hacia arriba; el numero 1 corresponde a la primer mancha de la muestra correspondiente, y así sucesivamente en orden ascendente.

Como se observa en la Tabla 1, la mayoría de las muestras experimentaron una separación cromatográfica eficiente. Esto se debe a que la lecitina contenida en las muestras, al ser un componente con largas cadenas carbonadas (conformada por ácidos grasos insaturados), lo hace altamente apolar y afín a compuestos de esta naturaleza, es decir, la conformación apolar de la fase móvil provocó el desplazamiento por capilaridad de las manchas en la cromatoplaca. A simple vista, puede comprobarse que las manchas más cercanas al frente puede contener lecitina, debido a que los desplazamiento obtenidos son bastante similares, los cuales rondan entre 5.5 hasta 6.2 cm (esto pudo verse favorecido a que las muestras fueron agregadas cuantitativamente por medio de una jeringa Hamilton).

Sin embargo, existen casos particulares en esta separación. Con respecto a la fracción 1, fue la única que presentó más de 3 manchas, esto se debe a que además de lecitina, en esta muestra puede estar la posibilidad de que se presenten otros compuestos con mayor polaridad que la muestra de interés. Debemos considerar que al ser la primera extracción de la columna, esta muestra puede contener residuos de compuestos intermediamente polares que no fueron extraídos en los procesos previos a la cromatografía de columna, arrojando los resultados vistos en la cromatoplaca. En el caso de la fracción 8, no hubo presencia de manchas, esto pudo deberse a que a partir de esta muestra ya no se encontraba presente la lecitina (la cual pudo eluirse hasta la fracción 7), arrojando un resultado nulo.

3.3.2. Parámetros para determinar la separación cromatográfica

Una vez realizado el proceso de separación y de marcado con ANS, se dejó secar la cromatoplaca, para después obtener las medidas mencionadas anteriormente con el fin de calcular los parámetros que se muestran a continuación.

1) Tiempo de respuesta (Rf)Una vez obtenida las medidas, podemos encontrar el factor de retención o el tiempo de respuesta (Rf) el cual se define como “la relación entre la velocidad de desplazamiento del soluto y la del disolvente medidas ambas por el avance hacia un frente” (BurrielMartí, Lucena conde, Arribas Jimeno, & Hernández Méndez, 1998)1. A partir de este parámetro podemos definir la competencia que se establece entre las muestras que se separaron y la fase móvil al retenerse a la fase estacionaria. Cabe destacar que tanto la distancia recorrida del disolvente y de la fase móvil fueron tomados a partir de la línea de origen. Estos fueron los resultados:

Muestra no.1:

Rf1 = 2 cm / 6.3 cm = 0.3174

Rf2= 4.4 cm / 6.3 cm = 0.0.6984

Rf3 = 5.5 cm / 6.3 cm = 0.8730

Muestra no.2:

Rf= 5.6 cm / 6.2 cm = 0.9032

Muestra no.3:

Rf= 5.8 cm / 6.3 cm = 0.9206

Muestra no.4:

Rf= 6.2 cm / 6.3 cm = 0.9841

Muestra no.5:

Rf= 6.2 cm / 6.3 cm = 0.9841

Muestra no.9:

Rf= 5.5 cm / 6.2 cm = 0.8870

Muestra no.7:

Rf= 5.7 cm / 6.1 cm = 0.9344

Muestra no.4:

Rf= 6.2 cm / 6.3 cm = 0.9841

Al calcular estos parámetros, podemos verificar que hay un mejor tiempo de respuesta entre más alto sea el Rf. En casi todos los compuestos (excepto la fracción 8). presentaron mayor corrimiento tuvieron, arrojando un Rf más alto debido naturaleza apolar de la lecitina, permitiendo que reaccionarán de manera inmediata con el disolvente, logrando así un desplazamiento más rápido de manera ascendente hacia el frente de la cromatoplaca, indicando que éstos son separados más rápido gracias a la afinidad que tuvieron con la fase móvil. Con esta base podemos verificar que la lecitina si se encuentra en la muestra y fue separada satisfactoriamente, ya que presenta Rf muy parecidos, dando a entender que este compuesto está en todas las fracciones y en la muestra original.

En el caso de la fracción 1, a pesar de que cuenta con lecitina (con un Rf similar al de las otras fracciones), arrojó dos manchas más. Como se mencionó con anterioridad, estas manchas pueden contener compuestos procedentes de la yema (p. ej. proteínas, otros fosfolípidos) con polaridad intermedia, que corren a una menor velocidad debido a que poseen una mayor afinidad por la fase estacionaria. Estos nos da a entender que la fracción 1 contiene componentes diversos, los cuales fueron extraídos, permitiendo que fueran eluidos para solo arrojar en las siguientes fracciones el componente de interés, como se mencionó anteriormente. En el caso de la fracción 8, además de verificar que no hay corrimiento debido a la falta de lecitina, no se puede descartar la presencia de otros componentes, pero debe considerarse que estos sean de naturaleza altamente polar y sean retenidos en la fase estacionaria (esto puede ocurrir de igual manera con las otras fracciones).

Si vemos la separación en base al instrumento utilizado, podría decirse que la utilización de jeringa Halmiton favoreció al tiempo de respuesta, debido a que se arrojaron cantidades controladas de las muestras, aumentando las posibilidades de añadir el compuesto de interés, el cual presenta una mejor afinidad con la fase móvil, promoviendo una separación más eficiente.

2) SelectividadLa selectividad se define como el grado de preferencia de la fase móvil por un compuesto con respecto a la distancia de la primera mancha más cercana al origen. En este caso, la mancha 1 de la muestra 1 (Extracto de árbol de té añadido con capilar), fue la más cercana al origen, dando una distancia de 2.0 cm. A partir de este dato, podemos obtener el grado de preferencia de las manchas obtenidas. Estos fueron los resultados:

Muestra no.1: S 2= 2 cm / 4.4 cm = 0.4545

S 3= 2 cm / 5.5 cm = 0.3636

Muestra no.2:

S= 2 cm / 5.6 cm = 0.3571

Muestra no.3:

S= 2 cm / 5.8 cm = 0.3448

Muestra no.4:

S= 2 cm / 6.2 cm = 0.3225

Muestra no.5:

S= 2 cm / 6.2 cm = 0.3225

Muestra no.6:

S= 2 cm / 5.5 cm = 0.3636

Muestra no.7:

S= 2 cm / 5.7 cm = 0.3508

Muestra no.9:

S= 2 cm / 5.5 cm = 0.3636

Las 8 muestras de extractos presentan parámetros regulares muy parecidos en cuanto a la selectividad de la fase móvil, los cuales varían desde 0.3225 hasta 0.4545. Con esto podemos demostrar que la separación no presentó anomalías, la fase móvil utilizada actuó de la manera esperada y que los compuestos presentaron un corrimiento apto a la polaridad que poseen, principalmente la lecitina.

3) Eficiencia

En este caso, la eficiencia mide en base a la proporción del plato teórico (en este caso su mancha) como avanza con respecto al disolvente en un determinado lapso de tiempo. A continuación estos fueron los resultados

Eficiencia = (16) (Distancia de la muestra / Ancho de la mancha / 2)

Muestra No.1:

Eficiencia mancha 1: (16) (2 cm /(0.5 cm / 2)) = 128

Eficiencia mancha 2: (16) (4.4 cm /(0.6 cm / 2)) = 234.66

Eficiencia mancha 3: (16) (5.5 cm /(1.0 cm / 2)) = 176

Muestra No.2:

Eficiencia: (16) (5.6 cm /(1.1 cm / 2)) = 162.90

Muestra No.3:

Eficiencia: (16) (5.8 cm /(0.5 cm / 2)) = 371.2

Muestra No.4:

Eficiencia: (16) (6.2 cm /(0.5 cm / 2)) = 992

Muestra No.5:

Eficiencia: (16) (6.2 cm /(0.5 cm / 2)) = 992

Muestra No.6:

Eficiencia: (16) (5.5 cm /(1.1 cm / 2)) = 160

Muestra No.7:

Eficiencia: (16) (5.7 cm /(0.7 cm / 2)) = 260.57

Muestra Original:

Eficiencia: (16) (5.5 cm /(1.0 cm / 2)) = 176

Al contar con eficiencias mayores a 100, se puede decir que la fase móvil actuó de la manera correcta en el tiempo necesario, permitiendo la migración de cada una, generando una buena separación cromatográfica.

4) Resolución

La resolución se define como el grado de separación entre las manchas de una muestra ante la fase móvil.

Resolución = Distancia de la muestra 2 – Distancia de la muestra 1 / Promedio de anchos de las manchas

Muestra No.1:

Resolución entre mancha 1 y 2: (4.4 cm – 2.0 cm / ((0.6 cm +0.5 cm)/ 2) = 4.3636

Resolución entre mancha 2 y 3: (5.5 cm – 4.4 cm / ((1.0 cm +0.6 cm)/ 2) = 5.5

A pesar de la buena migración de las muestras, en la primera no ocurre de la misma forma, Esto puede deberse a las grandes cantidades de componentes polares, haciendo el corrimiento más lento y menos a fin a los componentes que contiene la misma.

4. Conclusión

La cromatografía por columna se emplea para la separación de mezclas o purificación desustancias, reteniendo en su fase estacionaria (en este caso la alúmina) a algunos compuestos por su propiedad de adsorción, por la que a través de ella se hará pasar una corriente de disolventes o mezcla de disolventes (fase móvil:eluyente) que arrastrará a los compuestos constituyentes de la mezcla, haciéndoles avanzar a través de la columna. Este tipo de cromatografía se utiliza para saber en qué recipientes se encuentra un componente buscado y para determinar la cantidad de este cuantitativamente, esta cromatografía corresponde a una cromatografía liquida en fase normal, ya que la fase solida (silica) es más polar que la móvil (etanol).los enlaces de la fase estacionaria presentan momentos dipolares mayores que los del disolvente.La polaridad del disolvente es la que define la velocidad de elución ya que los solutos tienden a moverse más rápido con disolventes muy polares y asíeluyen mas rápido.

Este se debe esencialmente a que los disolventes mas polares compiten mejor por el soluto que los menos polares y las sustancias tienen a solubilizarse en solventes con polaridad parecida.

Al usar la sílice se producen uniones silicio –oxigeno-carbono o simplemente se unen compuestos de carbonos mediante uniones covalentes (fases ligadas).

Al realizar la esta cromatografía podemos rescatar los siguientes puntos:

1. La cromatografía en columna permite el análisis de cada componente de una mezcla por separado y la cromatografía en capa fina permite estudiar una mezcla de compuestos en un solo paso.

2. La cromatografía en columna requiere cuidados para la construcción y el mantenimiento de la columna.

3. Se debe elegir correctamente bien los solventes para la cromatografía de columna debido a que una mala elección puede influir en la velocidad de flujo y puede hasta permitir la obtención de la mezcla, sin obtener sus componentes por separado.

4. Se debe tener cuidado con el material que empaqueta la columna ya que la presión debe permitir el flujo de las sustancias:eluyente y componente extraído pero no debe ser mínima porque permitiría el paso exagerado de las sustancias y por lo tanto una extracción erróneo.

5. Cuestionario

1. ¿En los dos sistemas que se trabajan cual es la fase móvil y cuál la estacionaria?

Cromatografía en columna

Fase móvil: Dilución de Cloroformo:metanol en diluciones 9:05 y 9:1.

Fase estacionaria: Óxido de aluminio (sometido con cloroformo) y Fibra de vidrio como soporte.

Cromatografía en capa fina

Fase móvil: Di lución de Cloroformo-Metanol-Ácido Acético-Agua 75:45:12:6

Fase estacionaria: cromatoplaca de silicagel 60 F254 en soporte de aluminio.

2. ¿Cuál fue la función de la cromatografía en columna?

R= La cromatografía en si tiene como objetivo separar los distintos componentes de una mezcla permitiendo su identificación y determinación a través de una columna, que nos permite separar físicamente con ayuda de una fase móvil los distintos componentes de una solución por la adsorción de una fase estacionaria selectiva de los constituyentes de una mezcla.

3. ¿Por qué no es necesario medir con pipeta volumétrica la fase móvil?

R= Porque al utilizar la pipeta volumétrica se puede empacar un menor volumen, sin embargo podemos hacer este procedimiento con sumo cuidado usando otro instrumento (en nuestra práctica fue un vaso de precipitado) obteniendo los mismos resultados.

4. ¿La separación por CC fue isocrática, por gradientes y por cambios de concentración?

R= La separación fue isocrática, ya que en primer lugar se agregaron 12.5 mL de cloroformo-metanol 9:0.5 y después se agregaron 50 mL de cloroformo-metanol 9:1, es decir las concentraciones de los disolventes variaron.

5. ¿Cuál paso de la CC se refiere a la cromatografía de retención y cual al de separación?

R = Retención: Se agrega el extracto de éter de petróleo. Se agrega con una pipeta Pasteur cuidadosamente, tratando de que se empaque en un mínimo de volumen.

Separación: Agregar 50 mL de cloroformo-metanol 9:1. Tomar fracciones de 5mL.

6. ¿Cuál fue la función de la TLC en esta práctica?

R= Separar los componentes en las 8 diferentes fracciones obtenidas en la CC.

7. ¿Cuál es el fundamento del ANS como revelador?

R= El ácido anilinonaftalénsulfónico (ANS) produce fluorescencia dependiendo de la polaridad del ambiente, incrementándose conforme la polaridad disminuye.

8. ¿Por qué el fraccionamiento en CC puede considerarse purificación y no aislamiento?

R= porque solo permite obtener un solo tipo de analito en especial que se encuentra dentro de una muestra compleja.

9. ¿Cuáles razones habría para eluir o no las fracciones 9 y 10 en la TLC?

R= son fracciones las cuales contienen muy poca lecitina debido a que la

lecitina tiene una alta solubilidad en cloroformo y sale en las primeras

fracciones por lo tanto en la 9 y 10 se obtiene muy poca lecitina junto con

otros compuestos, por lo tanto no es necesario el obtener estas fracciones.

10.¿Cuál es la necesidad del vial con septa de PTFE?

R= El vial es necesario para contener las muestras dentro de el y evitar que la muestra se contamine con cualquier otra impureza que pueda provocar en el análisis resultados desfavorables.

11.Explica brevemente cual es el fundamento de cada uno de los pasos en la preparación de la muestra.

R= El agua es para eliminar exceso de clara en la yema y poder extraer la lecitina que se encuentra en la yema de huevo.

La acetona provoca la precipitación de los fosfolípidos, en tanto que las grasas y el colesterol permanecen disueltos, por tanto, éste lavado es para eliminación de grasas y colesterol.

Se lava con etanol para solubilizar y eliminar impurezas en el sedimento, manteniendo solamente precipitadas a las proteínas y los fosfolípidos

La lecitina es más soluble en el alcohol frío, por lo tanto en el papel filtro queda únicamente la cefalina.

El éter de petróleo reduce la proporción de agua y consecuentemente también las sustancias no grasas solubles. Recuperando el filtrado que contiene solamente los fosfolípidos.

6. Glosario

1. Cromatografía de retención

El comportamiento de retención refleja la distribución del soluto entre la fase Móvil y estacionaria.

2. Cromatografía para separación

Las distintas técnicas cromatográficas se pueden dividir según cómo esté dispuesta la fase estacionaria:

Cromatografía plana. La fase estacionaria se sitúa sobre una placa plana o sobre un papel. Las principales técnicas son:

a. Cromatografía en papelb. Cromatografía en capa fina

Cromatografía en columna. La fase estacionaria se sitúa dentro de una columna. Según el fluido empleado como fase móvil se distinguen:

c. Cromatografía de líquidosd. Cromatografía de gasese. Cromatografía de fluidos supercríticos

La cromatografía de gases incluye a numerosos compuestos orgánicos. En el caso de compuestos no volátiles se recurre a procesos denominados de "derivación", a fin de convertirlos en otros compuestos que se volatilicen en las condiciones de análisis. Dentro de la cromatografía líquida destaca la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, del inglés High Performance LiquidChromatography), que es la técnica cromatográfica más empleada en la actualidad, normalmente en su modalidad de fase reversa, en la que la fase estacionaria tiene carácter no polar, y la fase móvil posee carácter polar (generalmente agua o mezclas con elevada proporción de la misma, o de otros disolvente polares, como por ejemplo metanol). El nombre de "reversa" viene dado porque tradicionalmente la fase estacionaria estaba compuesta de sílice o alúmina, de carácter polar, y por tanto la fase móvil era un disolvente orgánico poco polar. Una serie eluotrópica es un rango de sustancias de diferentes polaridades que actúan como fase móvil y que permiten observar un mejor desplazamiento sobre una fase estacionaria

3. Silica gel

El gel de sílice es una forma granular y porosa de dióxido de silicio fabricado sintéticamente a partir de silicato sódico. A pesar del nombre, el gel de sílice es sólido.

4. ANS

Cromatografía de lípidos; Solución de anilinonaftalénsulfónico (ANS)

5. Revelado

Una vez que el eluyente sobre la placa se ha secado se ha de proceder a la visualización del cromatograma. En determinados casos, si los compuestos son coloreados esto puede realizarse de forma directa. Sin embargo, para compuestos incoloros es necesario utilizar diferentes técnicas de revelado. Diferentes reactivos orgánicos permiten el revelado permanente de la placa, obteniéndose manchas coloreadas en ella. De entre los métodos más comunes puede destacarse la utilización del Iodo. Para ello la placa se introduce en una cubeta que contiene cristales con Iodo y se deja estar en ella durante unos minutos. Los vapores de iodo se disuelven en las manchas de los compuestos orgánicos tiñéndolas de color marrón.

6. Oxido de aluminio

Es un compuesto químico de aluminio y oxígeno con la fórmula química Al2O3. Es el que ocurre más frecuentemente de varios óxidos de aluminio, y específicamente identificado como óxido de aluminio. Es comúnmente llamado alúmina, y también puede ser llamado aloxide, aloxite, o alundo dependiendo de las formas o aplicaciones particulares. Se produce con frecuencia en su fase cristalina polimórfica a-Al2O3, en la que consta el mineral corindón.

7. PTFE

El politetrafluoretileno es un material plástico de alta resistencia química, auto lubricante y resistente a altas temperaturas. Es de gran aplicación en la industria alimenticia por su estabilidad sanitaria La elaboración de productos de PTFE puede ser de material virgen según las necesidades del producto.

8. Éter de petróleo

El éter de petróleo, también conocido como bencina, nafta VM & P, nafta de petróleo, nafta ASTM o ligroína, es una mezcla líquida de diversos compuestos volátiles, muy inflamables, de la serie homóloga de los hidrocarburos saturados o alcanos, y no a la serie de los éteres como erróneamente indica su nombre. Se emplea principalmente como disolvente no polar.

9. Lecitina

Lecitina es un término genérico para designar a un amplio grupo de lípidos saponificables y con función de emulgente que se producen de manera natural en tejidos animales y vegetales. Engloba a cualquier grupo de sustancia grasa (de color amarillo-marronáceas) compuesta de ácido fosfórico, colina, ácidos grasos, glicerol, glicolípidos, triglicéridos y fosfolípidos.

7. Bibliografía1. Burriel Martí, F., Lucena conde, F., Arribas Jimeno, S., & Hernández Méndez, J.

Química analítica cualitativa. Madrid: Paraninfo.1998. Autor anónimo. Cromatografía en capa fina. Textos científicos.com. 17 de enero

de 2007. De: http://www.textoscientificos.com/quimica/cromatografia/capa-fina Campra Madrid, P. .Tesis doctoral: “Ácido gamma-linolénico (18:3n6), distribución

y purificación a partir de nuevas fuentes vegetales. Universidad de Almería: España. 2003. Pp. 59.60.

Gennaro, A.R. Remington: Farmacia. 20ª. edición. Volumen 1. México: Editorial Médica Panamericana. 2003.