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Cromatografia em Camada Delgada
Discentes: Daniely de Godoy Silva
Germano Blaquez Junior
Gislaine Ap. da Cunha
Docentes: Profº. Drº José Eduardo de Oliveira
Profª Amanda Coelho Danuello
Histórico da Cromatografia em Camada Delgada
BEYERINCK em 1889 usou sólidos em camada delgada sobre vidro, para o desenvolvimento circular de misturas de sais inorgânicos.
Em 1938 IZMAILOV e SCHRAIBER reintroduziram a Cromatografia em Camada Delgada, para análise de produtos farmacêuticos, mas não foi muito usada até o desenvolvimento, por KIRCHNER do método de aderir os sólidos ao suporte.
Em 1956 atingiu grande desenvolvimento, pelo método de preparar as placas com reprodutibilidade por STAHL.
Cromatografia :Método físico-químico de separação dos componentes de uma mistura, realizada através da distribuição destes componentes entre duas fases, que estão em contato íntimo.Uma das fases permanece estacionária enquanto a outra move-se através dela.
Durante a passagem da fase móvel sobre a fase estacionária, os componentes da mistura são distribuídos entre as duas fases, de tal forma que cada um dos componentes é seletivamente retido pela fase estacionária, resultando em migrações diferenciais destes componentes.
Cromatografia
Planar Coluna
Líquido LíquidoGás
Líquido Fase ligada
Sólido Líquido LíquidoSólido Fase ligada
CP CCD CCD CGL CGS CGFL CLL
Sólido
CLS CE
Fase ligada
CLFLCTI CB
Critério de classificação
Técnica
Fase Móvel
Fase Estacionária
Tipo de cromatografia
Cromatografia GasosaCromatografia Gasosa (CG): (aplicada a compostos orgânicos voláteis).
•A fase móvel é um gás
•A fase estacionária é frequentemente um líquidode alto p.e. sobre um suporte sólido ou um adsorvente sólido
Métodos cromatográficos
Cromatografia Líquida em Coluna Clássica
Cromatografia Líquida em coluna clássica (CCC) (utilizada para separar analitos em solução, incluindoíons) metálicos e compostos orgânicos).
•A fase móvel é um solvente
•A fase estacionária é um líquido sobre um suportesólido, um sólido ou uma resina de troca iônica, etc.
Algodão
Disco de papel filtro
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Cromatografia Líquida de Alta EficiênciaCLAE)
(uma variação da cromatografia líquida queutiliza bombas de alta pressão para aumentar
a eficiência das separações) . SOLVENTES
BOMBA
INJETOR COLUNA
DETETOR COLETOR
DESCARTE
Outra Classificação
Fase Normal
Polaridade: FE > FM
FE utilizada : Sílica G
Fase Reversa
Polaridade: FE < FM
FE utilizada: Sílica C18
CromatografiaCromatografia emem CamadaCamadaDelgadaDelgada
Consiste na separação de uma mistura atravésda migração de seus componentes sobre umacamada delgada de adsorvente (faseestacionária) retido sobre uma superfície plana, geralmente placas de vidro. Isso acontece devidoa processos de adsorção. Após ocorrido o processo, a placa passa a se chamarcromatograma.
Fase Estacionária (FE): Contém o adsorvente
Fase Móvel (FM): Contém o solvente
MecanismosAdsorção Partição Exclusão
Líquido/gás sólido
Líquido sólido
+
+
+ -
-
Líquido/gás líquido Líquido/gás gel/sólido
INTERAÇÕES INTERMOLECULARESIônicasPonte de Hidrogêniovan der Waals Keeson (dipolo/dipolo)
Debye (dipolo/dipolo induzido)London (dipolo induzido/dipolo
induzido)
Troca Iônica
Aplicações:
Identificação de compostos orgânicos com pontos de fusão próximos;
Estudos preliminares da complexidade dos componentes de um extrato orgânico;
Investigação de: Casos de envenenamento; ingestão de estimulantes por atletas;
Estudos de reações : presença de intermediários estáveis;
Análise da pureza de compostos;
Análise da eficiência de: destilação e cristalização
Vantagens da Cromatografia em Camada Delgada
a. Maior rapidez;
b. Menor trajeto da fase móvel ;
c. Boa resolução;
d. Alta sensibilidade;
e. Manchas em geral menos difusas;
f. Possibilidade, quase sempre, de emprego de reagentes de detecção corrosivos;
g. Baixo custo;
h. Facilidade de raspar a camada, com espátula fina ou com uma lâmina para microscopia, para recuperar, por eluição o conteúdo de uma mancha ou de uma banda;
ADSORVENTES UTILIZADOS EM CCD
Adsorvente: termo geral para Fase EstacionáriaAtividade dos adsorventes varia em função da quantidade de água presentes no mesmos. Quanto menor o teor de água, maior será a sua atividade, isto é, maior sua afinidade para com as substâncias a separar. A atividade depende, pois, da temperatura e do tempo de aquecimento a que é submetido o adsorvente.
Na prática, as cromatoplacas, após sua ativação, devem ser utilizadas logo a seguir, ou então conservadas em dessecadores de dimensões apropriadas, para que não tenham seu grau de atividade diminuído, por adsorção de água do ambiente.
Exemplos de adsorventes:
Sílica-Gel ou àcido Silícico;
Óxido de alumínio ou alumina;
Celulose;
Kieselgur;
Poliamida;
Sílica gel ou Ácido silícico
Mecanismo de adsorção:-Si-OH: Interações polares por ponte de hidrogênio, como doador ou aceptor de H.-Si-OH e –Si-O-Si-: dipolo/dipolo ou dipolo/dipolo induzido
SiO O Si
O
O O
O
OH
Mais usada na CCD
Substância porosa e amorfa.
Apresenta caráter ácido.
Possui característica polar, devido à presença de grupos hidroxilas denominados silanóis. Deve apresentar número de hidroxilas razoável para ser seletivo na separação de substâncias de diferentes polaridades
Tratamento térmico → eliminação de água ( temperatura recomendada para a sua ativação de 105 a 110ºC)
Caracterização do tipo básico de sílica gel :G: adição de sulfato de cálcio, gipsita, (aglutinante);H: indica ausência de aglutinante;F: indica adição de substâncias fluorescentes;P: indica adsorvente para uso preparativo;R: indica adsorvente de alto grau de pureza;
Preparação: 30g de sílica com 60-70 mLde água = 5 placas de 20x20cm com espessura de 0,3 mm
CUIDADO! A aspiração da sílica causa silicose, um tipo de inflamação pulmonar crônica!
Alumina ou Óxido de AlumínioSegundo adsorvente mais empregado em CCD;
Há três grupos deste adsorvente:
A ativação da alumina faz-se,após secagem ao ar durante cerca de 2 h, pelo aquecimento em estufa a 120ºC por 60 min.
A alumina é caracterizada pelo diâmetro dos poros dos grânulos.
Tipo E: apresenta superfície específica de 120 – 180 m2. g-1.
Tipo T: apresenta superfície específica de 60 – 90 m2. g-1.
Preparação: 5 placas de 20x20 cm e espessura de 0,3 mm, recomenda-se a utilização de uma suspensão de 30 g de alumina em 40 mL de água destilada.
O Al
AlO
ClAlCH3
Cl
CH3
Cl
ÁCIDApH 4,0
O Al
AlO
ONaAlCH3
ONa
CH3
ONa
BÁSICApH 9,0
O Al2+
AlO
AlCH3 O NEUTRApH 7,0
Mecanismo de adsorção:Al3+: campo positivo favorece interação com moléculas polarizáveis ( sistemas conjugados)O2-: sítios básicos favorecem a interação com doadores de H+
CeluloseExistem dois tipos de celulose empregadas em CCD: a nativa ( celulose fibrosa) e a celulose microcristalina.
Existem ainda as celuloses quimicamente tratadas aplicadas na CCD:
Tipos:
CM-celulose ( carboximetilcelulose) → trocador iônico fraco;
DEAE-celulose (dietilaminoetilcelulose) → trocador aniônico básico forte;
ECTEOLA-celulose (mistura alcalina, trietanolamina e epicloridrina → trocador aniônico básico fraco;
PEI-celulose (polietilenimina) → trocador iônico básico forte;
Celulose fosforilada → trocador catiônico forte;
Celulose microcristalina constitui-se em excelente material para separação de substâncias orgânicas hidrofílicas.
Mecanismo: Partição ou troca iônica.
Preparação: 5 placas de 20 x 20 cm, mistura-se 25 g de celulose com 90 mL de água destilada, agitando-se por 2 min, antes de colocar na placa de vidro.
Kieselgur ou terra de diatomáceas
É um tipo de ácido silícico oriundo de carapaças de diatomáceas fósseis.
Comparado a sílica e alumina é menos adsorvente e com menor poder de resolução.
Pode ser adicionado à sílica para diminuir seu poder adsorvente.
Apresenta baixa atividade
Tipos:
Com aglutinantes;
Sem aglutinantes;
Mecanismo: Partição
Preparação: 30g do adsorvente com 60-70 mLde água = 5 placas de 20x20cm com espessura de 0,3 mm
PoliamidaSeparação de fenóis e ácidos carboxílicos
A separação depende da intesindade das forças decorrentes das ligações de hidrogênio com o analito.
Baixa aderência ao vidro: dificuldade de preparação da placas
Tipos:
11 – ácido poliaminoundecanóico (Nylon 11)
6 – aminopolicaprolactama (Perlon)
6.6 – poli-hexametildiaminamonoadipato
Poliamida acetilada
Preparação:
15g em 60 mL de metanol = 5 placas (20 x 20 x 0,03 cm)
Técnica GeralEscolha da fase estacionária;
Preparação das placas cromatográficas;
Ativação das placas cromatográficas;
Seleção da fase móvel;
Aplicação das amostras nas cromatoplacas;
Preparação da cuba cromatográfica e desenvolvimento do cromatograma;
Revelação dos cromatogramas;
Documentação;
Calculo do fator de retenção Rf;
Escolha da fase estacionária
Liofilicidade e liofobicidadeInteração com os componentes (polaridade)
Necessidade de aditivos AglutinantesSubstâncias fluorescentes
Capacidade adsorvedora
Preparação da placasAs placas devem ser: resistentes, inertes aos reagentes e solventes, resistentes àtemperatura e uniformes.
Procedimentos para a preparação das placas
Limpeza da placa de vidro → detergente e água corrente (eliminação de gordura);
Secagem → em estufa
Preparação das camadas finas dos adsorventes:
Utilização de espalhadores ( mais empregada);
Submersão, aspersão ou vertendo-se sobre as placas suspensão do adsorvente apropriado.
Dificuldades: Obtenção de solução com viscosidade adequada.
Placas pré fabricadas: Dispensam a fase de preparação; são mais uniformes e homogêneas, melhorando a separação e tornando os valores de Rf mais reprodutíveis.
Riscar as placas, determinando a altura
de ínicio e fim da cromatografia
Ativação das placas
Objetivo: retirar substâncias interferentes e eliminar água
Metodologia : Varia de uma adsorvente para outro.Exemplo : Sílica e alumina ⇒ estufa 105 – 110 ºC por 30 –60 min;
Celulose ⇒ estufa 105ºC por 10 min;
Seleção da fase móvel Depende: natureza química das substâncias a serem separadas e polaridade da fase móvel.
Seleção da fase móvel em um sistema cromatográfico por adsorção: levar em conta a natureza da fase móvel, da fase estacionária e do soluto. Assim, para solutos muito polares deve-se utilizar um adsorvente de baixa atividade e uma fase móvel de grande poder eluente.Seleção da fase móvel em um sistema cromatográfico por partição: Realizada com os adsorventes celulose microcristalina e kieselgur, constitui um processo de separação que depende das diferenças de solubilidade dos componentes das amostras, nas fases estacionária e móvel e na imiscibilidade dessas fases.
Aplicação das amostras
A amostra A amostra éé aplicada na forma de soluaplicada na forma de soluçção 0,1 ão 0,1 –– 1%,dependendo 1%,dependendo da sensibilidade do revelador, usando solventes mais volda sensibilidade do revelador, usando solventes mais volááteis teis posspossííveis.veis.
AplicaAplica--se a amostra com micropipetas, microsseringas ou tubos se a amostra com micropipetas, microsseringas ou tubos capilares.capilares.
As amostras devem estar a mais ou menos 2,0 cm da parte As amostras devem estar a mais ou menos 2,0 cm da parte inferior da placa, afim de que essas não entrem em contato diretinferior da placa, afim de que essas não entrem em contato direto o com o solvente durante o desenvolvimento do com o solvente durante o desenvolvimento do cromatogramacromatograma..Alinhamento horizontal uniforme.Alinhamento horizontal uniforme.
Preparação da cuba A placa deve ser colocada, rapidamente ( para evitar A placa deve ser colocada, rapidamente ( para evitar
evaporaevaporaçção) e verticalmente, apão) e verticalmente, apóós aplicadas as amostras, numa s aplicadas as amostras, numa cuba de vidro contendo a fase mcuba de vidro contendo a fase móóvel desejada. A cuba deve estar vel desejada. A cuba deve estar saturada com vapor de fase msaturada com vapor de fase móóvel para que o cromatograma se vel para que o cromatograma se desenvolva regularmente. Para isso, colocadesenvolva regularmente. Para isso, coloca--se papel de filtro na se papel de filtro na cuba, que ajuda na evaporacuba, que ajuda na evaporaçção e na conseqão e na conseqüüente saturaente saturaçção. A ão. A cuba deve ser dotada tampa esmeriladas de forma a vedcuba deve ser dotada tampa esmeriladas de forma a vedáá--la la hermeticamente, garantindo uma boa saturahermeticamente, garantindo uma boa saturaçção da atmosfera ão da atmosfera interna.interna.
Desenvolvimento de um cromatograma numa cuba
Procedimentos químicos, físicos, ou biológicosaplicados ao cromatograma para tornar visível as manchasdas substâncias separadas por cromatografia. AA-- ProcedimentosProcedimentos FFíísicossicos: Luz ultravioleta (aromáticos oudupla ligação conjugada).CC-- ProcedimentosProcedimentos BiolBiolóógicosgicos e e EnzimEnzimááticosticos: Antibióticos, Enzimas e Substratos. DD-- ProcedimentosProcedimentos QuQuíímicosmicos: Aplicação de um reativoquímico para formar um derivado colorido ou fluorescente.
Revelação dos cromatogramas
Reveladores Físicos
RadiaRadiaçção ultravioleta para compostos fluorescentes.ão ultravioleta para compostos fluorescentes.Ex: clorofila.Ex: clorofila.
Reveladores QuímicosConsiste em utilizar reveladores quConsiste em utilizar reveladores quíímicos que, em contato com micos que, em contato com
as substâncias da amostra, as tornam coloridas e visas substâncias da amostra, as tornam coloridas e visííveis.veis.
Tipos de reveladores quTipos de reveladores quíímicos micos AlcalAlcalóóides:ides: DragendorffDragendorff, , iodoplatinatoiodoplatinatoFlavonFlavonóóidesides:: NPNP--PEGPEGAnti-oxidantes: ββ--carotenocarotenoSaponinasSaponinas, terpenos e , terpenos e esteresteróóidesides:: anisaldeanisaldeíídodo sulfsulfúúricoricoAntraquinonasAntraquinonas e e cumarinascumarinas:: vapor de amôniavapor de amôniaFenFenóólicos, licos, saponinassaponinas e e terpenterpenóóidesides:: vapor de iodo e soluvapor de iodo e soluçção de ão de CeSOCeSO44
Compostos fenCompostos fenóólicos:licos: FeClFeCl33
Reveladores BiológicosUtilizaUtiliza--se rease reaçções enzimões enzimááticas ou bacterianas para ticas ou bacterianas para tornar a mancha vistornar a mancha visíível.vel.Ex.: para testar se uma amostra contEx.: para testar se uma amostra contéém substância m substância antianti--ffúúngicangica, revela, revela--se o se o cromatogramacromatograma com esporos de com esporos de fungos. Os fungos não crescerão onde houver essas fungos. Os fungos não crescerão onde houver essas substâncias.substâncias.
Fator de Retenção Rf (Relation front ou Rate factor)
Rf = distância percorrida pela substância / distância percorrida pela fase móvel.
Os valores Rf variam entre 0 e 1 e são dados com dois algarismos após a vírgula.
dr1
dm
dr2
Ws1
Linha de chegada da FM
Profundidade da FMPonto de partida da amostra
Ws2
•• FartorFartor de de RetenRetenççãoão ((RRff):):•
• Rf = dr / dm
••• ResoluResoluççãoão ((RRss):):
•• Rs = 2(dr1 – dr2) / (Ws1 + Ws2) ••• EficiênciaEficiência::
•• n = 16 (dr – Ws)2
ParâmetrosParâmetros UtilizadosUtilizados nana CromatografiaCromatografia PlanarPlanar
Desvantagens da CCD
DifDifíícil reprodutibilidade:cil reprodutibilidade:quantidade de amostra aplicada quantidade de amostra aplicada obtenobtençção de ão de cromatoplacascromatoplacas com caractercom caracteríísticas idênticas.sticas idênticas.
Baixa sensibilidade:Baixa sensibilidade:detecdetecçção ão difusão da amostradifusão da amostra
DifDifíícil determinacil determinaçção exata do ão exata do RfRf..
Constantes Físicas
Bibliografia
••COLLINS, Carol H. COLLINS, Carol H. etet al, introdual, introduçção a mão a méétodos cromatogrtodos cromatográáficos, 6ficos, 6ªª eded, ed. , ed. Unicamp,Campinas,1995.Unicamp,Campinas,1995.
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