SLOVENSKÁ POĽNOHOSPODÁRSKA UNIVERZITA

V NITRE

FAKULTA BIOTECHNOLÓGIE A POTRAVINÁRSTVA1130970

NÁZOV FAKULTYNÁZOV VYSOKEJ ŠKOLY

PRODUKCIA FARMACEUTÍK RASTLINAMI

2011 Marek Soboň

SLOVENSKÁ POĽNOHOSPODÁRSKA UNIVERZITA

V NITRE

ERROR: REFERENCE SOURCE NOT FOUNDFAKULTA

BIOTECHNOLÓGIE A POTRAVINÁRSTVA

PRODUKCIA FARMACEUTÍK RASTLINAMI

Bakalárska práca

Študijný program: Aplikovaná biológia

Študijný odbor: 1536700 biológia

Školiace pracovisko:Katedra biochémie a biotechnológieError:

Reference source not found

Školiteľ: Chňapek Milan Ing., PhD.

Nitra 2011 Marek Soboň

w

w

Čestné vyhlásenie

Podpísaný Marek Soboň vyhlasujem, že som záverečnú prácu na tému

„Produkcia farmaceutík rastlinami“ vypracoval samostatne s použitím uvedenej

literatúry.

Som si vedomý zákonných dôsledkov v prípade, ak hore uvedené údaje nie sú

pravdivé.

V Nitre, 19. mája 2011

Marek Soboň

w

Poďakovanie

Na tomto mieste by som chcel poďakovať vedúcemu bakalárskej práce

Ing. Milanovi Chňapekovi PhD., za pomoc pri preklade, usmernenie a odbornú pomoc

pri vypracovaní mojej bakalárskej práce.

w

Abstrakt

Už viac ako dvadsať rokov, produkcia farmaceuticky významných bielkovín z

rastlín je skutočnosťou. Biofarmaceutiká predstavujú najrýchlejšie sa rozvíjajúci sektor

vo farmaceutickom priemysle. A preto produkcia farmaceutík rastlinami naberá na

dôležitosti. Výhody rastlinných bioreaktorov sú v nízkej produkčnej cene a možnosti

zvyšovania výnosov. Rôzne rastlinné druhy majú odlišné vlastnosti, čo znamená že

každý druh má svoje výhody a nevýhody ako expresný systém. Do dnes sa podarilo

získať množstvo rekombinantných proteínov z rastlín, jedná sa hlavne o vakcíny a

protilátky. Pre tvorbu transgénnych organizmov bolo vyvinutých niekoľko metód, pri

rastlinách sú k dispozícií niektoré jedinečné metódy transformácie. Práca okrem metód

transformácie, získaných produktov a hostiteľských rastlinných druhov porovnávaná

rastlinnú produkciu rekombinantných farmaceutík s ďalšími konkurenčnými

platformami. V Spojených štátoch a na Kube sú farmaceutiká získané z rastlín

dostupné na trhu.

Kľúčové slová: rekombinantné bielkoviny, transgénne rastliny, produkcia farmaceutík

w

Abstrakt

For more than twenty years, the production of pharmaceutically important

proteins from plants is a reality. Biopharmaceuticals represent the fastest growing sector

in the pharmaceutical industry. Therefore, production of biopharmaceuticals in plant systems takes on importance. Benefits of

plant bioreactors are in their low production costs and increase yields opportunities.

Various plant species have different characteristics, which means that each type has its

advantages and disadvantages as an expression system. Until today, managed to get

many recombinant proteins from plants, is mainly about vaccines and antibodies. For

the creation of transgenic organisms has been developed several methods for plants are

available some unique method of transformation. Work in addition to methods of

transformation, derived products and host plant species compared plant production of

recombinant pharmaceuticals with other competing platforms. In the United States and

Cuba are pharmaceuticals derived from plants on the market.

Key words: recombinant proteins, transgenic plants, production of pharmaceuticals

w

Obsah

Obsah ................................................................................................................................ 7

Zoznam skratiek a značiek ............................................................................................ 9

Úvod ................................................................................................................................ 10

1. Cieľ práce ....................................................................................................................... 11

2. Metodika práce .............................................................................................................. 12

3. Prehľad o súčasnom stave riešenej problematiky ....................................................... 133.1 Rekombinantné bielkoviny ....................................................................................... 133.2 Produkcia farmaceutík ............................................................................................... 15

3.2.1 Liečba rakoviny a prevencia HIV ...................................................................... 193.2.2 Výrobné

náklady ................................................................................................ 213.2.3 Vysoká cena spracovateľských procesov ........................................................... 22

3.3 Transformačné metódy .............................................................................................. 233.3.1 Agrobacteriom sprostredkovaná transformácia ................................................. 243.3.2 Binárne vektory .................................................................................................. 253.3.3 Biolistická transformácia .................................................................................... 263.3.4 Protoplastová a somatická hybridizácia ............................................................. 263.3.5 Chloroplastové manipulácie ............................................................................... 27

3.4 Produkčné rastliny ....................................................................................................... 283.4.1 Tabak .................................................................................................................. 283.4.2 Obilniny .............................................................................................................. 29

3.4.2.1 Kukurica ............................................................................................. 293.4.2.2 Ryža .................................................................................................... 303.4.2.3 Jačmeň ................................................................................................ 31

3.4.3 Strukoviny .......................................................................................................... 313.4.3.1 Sója ...................................................................................................... 313.4.3.2 Hrach ................................................................................................... 323.4.4 Repka ...................................................................................................... 323.4.5 Ovocie a zelenina ................................................................................... 32

3.5 Ďalšie produkčné platformy ......................................................................................... 343.5.1 Escherichia coli .................................................................................................. 353.5.2 Kvasinky ............................................................................................................. 353.5.3 Huby ................................................................................................................... 363.5.4 Transgénne živočíchy ......................................................................................... 37

7

3.5.5 Hmyzie kultúry ................................................................................................... 38 3.6 Biologická bezpečnosť ................................................................................................. 39Záver ...................................................................................................................................... 41Zoznam použitej literatúry .................................................................................................. 42

8

Zoznam skratiek a značiek

TSP – Total Solutable Protein – celkový rozpustný proteín

TIP – Total Intracellular Protein – celkový intracelulárny proteín

DNA - Deoxyribonucleic acid - deoxyribonukleová kyselina

T-DNA - transfer-deoxyribonucleic acid – transferová- deoxyribonukleová kyselina

bp - base pair – bázový pár

IgA - Immunoglobulin A – Imunoglobulín A

IgE - Immunoglobulin E – Imunoglobulín E

USDA – U.S. Department of Agriculture - Ministerstvo poľnohospodárstva U.S.A.

HSV - Herpes Simplex Virus – herpes simplex vírus

LDL - Low Density Lipoproteins - lipoproteíny s nízkou hustotou

HIV - Human Immunodeficiency Virus - ľudský vírus imunitnej nedostatočnosti.

HPV - Human Papilloma Virus – ľudský papiloma vírus

9

Úvod

Rastliny sú už od úplných prvopočiatkov ľudstva zdrojom cenných látok pre život.

Súčasný stav poznania a dostupná technológia nám umožnuje produkovať v rastlinách látky

ktoré sa v nich prirodzene nevyskytujú.

Tvorba ne-prirodzene sa vyskytujúcich bielkovín sa označuje ako hetorológna

expresia. V septembri roku 1989 De Zoeten et al., dokázal ziskom ľudského interferónu

v repe, funkčnosť konceptu využívania rastlín ako bioreaktorov. O dva mesiace neskôr toho

roku sa objavila prvá správa o produkcií protilátok v rastlinách, konkrétne išlo o myší

imunoglobulín z tabaku (Hiatt et al., 1989). Haq et al., (1995) produkciou tepelne labilného

enterotoxínu E. coli v zemiakoch ponúkli dôkaz prvej jedlej vakcíny – potrvdenie koncepcie

jedlej vakcinácie.

Z kukurice získaní kurací avidín (Haq et al., 1995) a bovínny trypsín (Woodard et al.,

2003) sa stal prvým komercionalizovaním proteínom resp., prvým proteínom uvedeným na

trh, z rastlín.

Myšlienka že farmaceutiká by bolo možno získavať poľnohospodáskou činnostou

namiesto zložitých chemických syntéz je veľmi lákavá. Najmä ak si uvedomíme potenciál

rastlín pri liečbe rakoviny alebo pri prevencií HIV. Hlavnou výhodou rastlinej produkcie je jej

nízka cena, pretože rastliny vyžadujú zákadné živiny, svetlo a vodu.

Keď ministerstvo poľnohospodárstva U.S.A v roku 2006 schválilo spoločnosťi Dow

AgroSciences™ vakcínu pre hydinu proti NDV (Newcastle Disease Virus) bol to úspech na

poli akceptácie z rastlín získaných farmaceutík regulačnými orgánmi. Podobným úspechom

bola komercinalizácia prvej protilátky, išlo o hepatitis B povrchový antigén

produkovaní tabaku, na kube (Pujol et al., 2005).

Prekážky pre rastlinú produkciu sú takisto zrejmé. Okrem technických problémov pri

transformácií a obáv o biologickú bezpečnosť, je každá rastlina jedinečná a vykazuje rôzne

pre a proti.

Avšak žiadne farmaceutikum vyrobené z rastlín nebolo schválené ako ľudské liečivo,

niekoľko je v neskorej fáze vývoja a niektoré už obdržali súhlas regulačných orgánov ( Spök

et al., 2008; Kaiser, 2008).

10

1. Cieľ práce

Cieľom predloženej práce je na základe spracovania odbornej literatúry zhodnotiť

súčasný stav farmaceutík produkovaných rastlinami.

Práca predstavuje v súčasnosti najvyužívanejšie spôsoby transformácie rastlín,  druhy

produkčných rastlín a získané liečivá. Práca sa snaží predstaviť čitateľovi koncept tvorby

rekominantných bielkovín v rastlinách v porovnaní s ďalšími produkčnými platformami.

11

2. Metodika práce

Pri vypracovávaní bakalárskej práce bola zvolená nasledovná metodika práce:

o zhromažďovanie odbornej literatúry. Pri získavaní potrebných materiálov a informácii bola

využitá zahraničná literatúra, odborné časopisy a knižné zdroje,

o štúdium odbornej literatúry a oboznámenie sa s problematikou. Po preštudovaní

dostupného materiálu sa získal prehľad o súčasnom stave riešenej problematiky,

o spracovanie získaných materiálov a informácií. Nadobudnuté poznatky a vedomosti boli

spracované formou kompilačnej práce do súčasnej podoby.

12

3. Prehľad o súčasnom stave riešenej problematiky

3.1 Rekombinantné bielkoviny

Metódy génového inžinierstva umožňujú tvorbu DNA v ktorej sú zabudované gény z

jedného alebo viacerých zdrojov. Takáto DNA sa nazýva rekombinantná DNA a je možné ju

vložiť do rôznych organizmov, v ktorých sa bude následne produkovať rekombinantná

bielkovina.

Prvou rekombinantnou bielkovinou získanou z transgénnych rastlín bolo ľudské

sérum albumín (Sijmons et al., 2003) pre ktorý je ročný dopyt viac ako 500 ton

a chloramfenikol acetyltransferáza (Hogue et al., 1990). V súčasnosti je hlásených viac ako

300 terapeutických bielkovín, ktoré sú založené na rastlinnej produkcii napr. protilátky,

jednoreťazcové variabilné fragmenty (scFv), antigény, vakcíny, hormóny, rastové faktory,

cytokiníny,  ľudské krvné bielkoviny a signálne molekuly, množstvo ďalších je v štádiu

výskumu a vývoja (Fox, 2006).

Rastlinná genetická transformácia sa zdokonalila vďaka prudkému rozvoju

molekulárnej biológie. Tvárou v tvár rastúcej požiadavke na diagnostické a terapeutické

bielkoviny, sa použitie transgénnych rastlín vo farmaceutickom priemysle stalo dôležitým

odvetvím biofarmácie s ekonomickým potenciálom.

Zisk rekombinantných bielkovín získaných z transgénnych rastlín je v porovnaní

s hostiteľským systémom cicavcov a mikroorganizmov menší. Vo všeobecnosti sú tieto

bielkoviny produkované na nízkej úrovni, typicky menej než 0,1 % celkového rozpustného

proteínu. A tak zlepšenie výnosov a kvality rekombinantných bielkovín predstavuje dôležitý

cieľ vo vývoji rastlinných expresných systémov. Ako napríklad, pri použití chloroplastového

systému tabaku na expresiu ľudských proteínov kde ľudský rastový hormón bol produkovaný

v tabakových listoch na úrovni presahujúcich 7 % TSP (Staub, 2006) a ľudský albumín bol

produkovaný na úrovni väčšej ako 11 % TSP (Fernandez et. al., 2003)

13

Rastlinné bioreaktory majú mnoho potenciálnych výhod pre produkciu

rekombinantných bielkovín, v porovnaní s mikrobiálnymi a živočíšnymi bunkovými

systémami:

- náklady z poľnohospodárskeho hľadiska na produkciu surového materiálu sú nízke a je

ľahké zvýšiť množstvo surového materiálu,

- hromadenie rekombinantnej bielkoviny v semenách, hľuzách a plodoch môže byť prospešné

pre skladovanie. Hlavne rastlinné vakcíny pre ústne podanie, nepotrebujú žiadne špeciálne

podmienky skladovania (Korban et al., 2002; Mason et al., 2002; Stoger et al., 2000),

- hlavná nevýhoda bakteriálnej expresie je absencia posttranslačných modifikačných

procesov,

- rastlín odvodené bielkoviny sú relatívne bezpečné pretože nehrozí kontaminácia zvieracími

patogénmi (Commandeur et al., 2003),

- proces vedúci k bielkovine je relatívne konzervatívny. Rastliny majú schopnosť správne

vykonávať posttranslačné úpravy ako je glykozylácia, fosforylácia a amidácia. Tak

imunogenicita a biologická aktivita rekombinantných bielkovín je podobná vyšším

živočíšnym bunkám (Daniell et al., 2001),

- metódy a techniky zberu sú dostupné a dobre zavedené.

Avšak existuje niekoľko potenciálnych nevýhod, ktoré sú spojené s rastlinným expresným

systémom zahŕňajúc:

- občas nestála a nízka produkcia,

- potenciálny výskyt posttranslačného tlmenia génov,

- spôsob glykozylácie sa výrazne líši od glykozylácie ľudských bielkovín,

- výskyt biologicky aktívnych rastlinných metabolitov (napr. alkaloidov) ktoré kontaminujú

surový produkt,

- obavy verejnosti o potenciálny únik geneticky zmenených rastlín,

- sezóna, geografická povaha rastlín.

Ideálna transgénna rastlinná kultúra pre produkciu rekombinantných bielkovín by mala

mať: vysokú rýchlosť rastu, ľahkú genetickú transformáciu, vysokú produkčnú schopnosť

bielkovín, slabú endogénnu proteolytickú aktivitu, nízku produkciu sekundárnych metabolitov

14

(napr. fenoly a o-chinóny ktoré môžu reagovať s aminokyselinami rekombinantného proteínu,

cez oxidáciu pôsobiac zmeny vo fyzikálno-chemickej štruktúre a komplikujú proces čistenia

(Jervis, 1989; Rawel et. al., 2007)), posttranslačnú modifikačnú schopnosť, správny a rovnaký

spôsob glykozylácie a správne skladanie bielkovín, dlhodobo geneticky stabilnú bunkovú

líniu, malé agregáty a homogénnu disperziu v bioreaktore.

Metóda použitá pre rastlinnú transformáciu záleží na druhu hostiteľskej rastliny

Sharma et al. 2005; Hansen 1999). Najstabilnejšia metóda génovej transformácie, zahŕňa

jadrovú transformáciu akou je Agrobacteriom sprostredkovaná transformácia, (Horsch et al.,

1985; Shrawat 2006) časticové bombardovanie (Klein et al., 1988) alebo elektorporácia

protoplastov (Sharma et al. 2005).

Na druhú stranu, však genetická nestabilita nediferencovaných buniek spôsobujúca

somaklonálnu variabilitu, môže byť potenciálne limitujúcim faktorom vo vývoji rastlinných

kultúru určených pre produkciu rekombinantných bielkovín (Offringa et al., 1990).

Boli hlásené významné redukcie výnosov produktu pripisované genetickej nestabilite

ďalej sú známe transgénne straty, zmeny v raste, alebo nežiaduce genetické zmeny pri

transgénnych rastlinách keď neboli udržiavané subkultúry (Klein et al., 1988). Tak bola

študovaná kryo-konzervácia línií transgénnych rastlinných kultúr pre dlhotrvajúce zachovanie

stabilných produkčných systémov (Cho et al., 2007).

3.2 Produkcia farmaceutík

Rozmanité rekombinantné proteíny ako diagnostické bielkoviny, priemyselné enzýmy,

vakcíny, antigény, protilátky a ďalšie liečivé proteíny boli úspešne produkované v rastlinách.

(Ma et al., 2003; Liénard et al., 2007; Sun, 2008; Basaran a Rodriguez-Cerezo, 2008).

Ako prvý bol vyprodukovaný avidín z vajec, v semenách kukurice (Hood et al., 1997)

pre použitie ako diagnostické činidlo. V porovnaní s bežným spôsobom extrakcie z vajec je

najmenej desať krát úspornejší na cenu vstupných materiálov. Avšak prvý produkt majúci

významný komerčný potenciál je z kukurici odvodený bovinný trypsín (Woodard et al.,

2003). Trypsín je proteáza ktorá má široké komerčné využitie pri spracovaní farmaceutík

a odhad na trhu v USA je 120 miliónov dolárov (Horn et al., 2004). Trypsín získaný z rastlín

15

môže uspokojiť požiadavky farmaceutických spoločností po činidlách ktoré neboli získané zo

zvierat.

V súčasnosti je na trhu jedenásť ne-farmaceutických produktov z rastlín (Basaran a

Rodriguez-Cerezo, 2008). Vzhľadom na nižší počet regulačných prekážok, ne-farmaceutické

proteíny z rastlín boli prvé na trhu. Zahrnujúc avidín, trypsín, peroxidázy a laktázy (Basaran a

Rodriguez-Cerezo, 2008). Avšak žiadne farmaceutikum vyrobené z rastlín nebolo schválené

ako ľudské liečivo, niekoľko je v neskorej fáze vývoja a niektoré už obdržali súhlas

regulačných orgánov ( Spök et al., 2008; Kaiser, 2008).

Niekoľko nehumánnych liečiv získaných z rastlín, obdržalo povolenie a približne

osemnásť ďalších je vo fázy klinického testovania (Basaran a Rodriguez-Cerezo, 2008;

Kaiser, 2008; Spök et al., 2008). V januári roku 2006, sa hydinová vakcína stala prvým

farmaceutickom získaným z rastlín, ktorá dostala súhlas regulačných orgánov od USDA

z centra pre veterinárnu biológiu (Dow AgroSciences, 2006). Vakcína produkovaná

v bunkách tabaku, chráni hydinu pred Newcaste chorobou. (Basaran a Rodriguez-Cerezo,

2008).

Len niekoľko substancií malo väčší pozitívny dopad na ľudské zdravie ako protilátky

a vakcíny. Tieto imonulogické prípravky sa rozšírene používajú v medicíne prevažne v liečbe

a prevencií infekčných chorôb. Prípravky polyklonálnych protilátok boli použité k vyvolaniu

pasívnej imunity proti množstvu cudzích činidiel. A vakcíny sú bezpečne použité k podpore

aktívnej imunizácie. Vývoj moderných biotechnologických metód mal významný dopad na

liečbu, použitím imunologických činidiel. Monoklonálne upravené protilátky našli mnoho

liečebných uplatnení a mnoho nových vakcín je v súčasnosti produkovaných technológiu

rekombinantnej DNA.

Podľa prognóz expertov, rastliny budú najlacnejším zdrojom protilátok.

Imunoglobulíny sú kódované dvomi génmi pre ľahký a ťažký reťazec, pričom pre určenie

antigénných regenerátov je dôležitý variabilný úsek týchto reťazcov. Kódujúce sekvencie

nemusia byť kompletné, stačí syntéza len špecifických častí a tie postačujú pre imunitnú

reakciu. Do recipientných transgénnych rastlín je potrebné preniesť obidva transgény pre

imunoglobulíny s tým, že druh imunoglobulínu bude determinovaný variabilným (aj

nekompletným) úsekom transgénnov (Toth et al., 2007).

Príkladom môže byť prenesenie transgénnov do tabaku. V takomto tabaku rastúcom

na poliach sa produkuje sekrečný IgA proti Streptococcus mutans, hlavnému pôvodcovi

zubného kazu. Protilátky sa ukázali byť efektívne pri eliminácií rekolonizácie S. mutans

16

u ľudí štyri mesiace od lokálnej ústnej aplikácií. (Ma et al., 1998). Vyvíja sa aj ICAM-1 fúzny

proteín na lokálne použitie pre prevenciu a liečbu bežnej nádchy, tento proteín je podľa

Basaran and Rodríguez-Cerezo (2008), v I. fáze klinického testovania.

Transgénne rastliny môžu produkovať proteíny, ktoré sú vlastné ľudským patogénom

vstupujúcim do ľudského tela membránami epiteliálnych buniek. Ide o baktérie a vírusy

spôsobujúce nachladnutie. Transgénne rastliny ako rastlinné vakcíny môžu byť účinné proti

takýmto infekciám tým, že stimulujú mukózny imunitný systém pre produkciu

imunoglobulínov IgA. Imunitná odpoveď vzniká v bunkách respiračného a tráviaceho epitelu.

K imunizácii dochádza konzumáciou transgénnej zeleniny – rastlinná vakcinácia.

Vplyv vitamínov a iných špecifických zlúčenín obsiahnutých v strave je veľmi

dôležitý. Vitamín E je napríklad účinný antioxidant, ktorý detoxikuje nestabilné molekuly

kyslíka, ktoré sú všeobecne považované za príčinu mnohých chorobných procesov a starnutia.

Vitamín E redukuje aj LDL cholesterol. Tento vitamín rozpustný v tukoch je nevyhnutný pre

tvorbu krvných elementov, svalov, pľúcneho a nervového tkaniva. Podporuje imunitu,

znižuje riziko srdcovocievnych ochorení a rakoviny prostaty, spomaľuje priebeh artritídy

a Alzheimerovej choroby. Vitamín E sa vyskytuje v štyroch formách. Najvyššiu biologickú

aktivitu má alfa-tokoferol, najnižšiu gama-tokoferol. V sójovom oleji je alfa-tokoferol

zastúpený v celkovom obsahu vitamínu E iba 7 %. Všeobecne semená všetkých olejnatých

rastlín sú chudobné na enzým gama-tokoferol-metyltransferázu, ktorá mení neúčinný

prekurzor na jeho účinnú formu. Tzv. g-TMT gén môže obsah alfa-tokoferolu v rastlinách

zvýšiť. Tento gén bol izolovaný zo sinice Syncechocystis a podarilo sa ho preniesť do

modelovej rastliny Arabidopsis. V transgénnych rastlinách sa zvýšila hladina alfa-tokoferolu

80-násobne, z toho 95 % sa akumulovalo v semene (Toth et al., 2007).

Vývoj vakcín získaných z rastlín závisí na organickej kombinácii technológie

rastlinného génového inžinierstva a imunologického mechanizmu organizmu. Existujú dva

prístupy pre produkciu transgénnych rastlinných vakcín.

Jednou z ciest je oddelenie čistého cudzieho proteínu od rastlinného tkaniva na

vysokej úrovni pre intravenózne použitie. Druhou je expresia proteínu v jedlej časti pre ústne

požitie. Ako bolo ukázané v pokusoch so zvieratami, rastlinné antigény po izolácií a čistení

stále zostávajú imunologicky kompetentné, to vedie k produkcií špecifických protilátok vo

zvierati. Rastlinné vakcíny pre ústne podanie môžu spôsobiť slizničné a humorálne imúnne

odpovede v čreve.

17

Jedlé vakcíny poskytujú niektoré priame výhody oproti tradičnej vakcinácii, ako sú

nízka cena, ľahko skladovateľné a jednoduché použitie, tak sa výskum zameral na genetické

inžinierstvo vakcín.

A aj keď expresia rekombinantných vakcín v rastlinách dosiahla úspechov, stále

existuje mnoho problémov k vyriešeniu pred komercializáciou. Po prvé, hostiteľské druhy pre

rastlinnú produkciu sú modely rastlín Arabidopsis thaliana a tabak ktorý možná nie je

ideálnou voľbou pre jedlé vakcíny. Produkcia vakcín v listoch tabaku je spojené s rizikom

kontaminácie nikotínom a ďalšími alkaloidmi. Po druhé ústne podávané vakcíny možno

neprežijú gastrointesticiálne podmienky bez určitej straty imunogenicity alebo degradácie.

A nakoniec nízky výnos cudzieho proteínu.

V tabuľke 1. sú uvádzané liečivá a produkty ktoré sú minimálne v druhej fáze

schvaľovania (Spök et al., 2008 a Kaiser, 2008)

Použitie Rastlinný systémĽudské liečiváCaroRx (protilátka proti Streptococcus mutans)

Prevencia zubného kazu Tabak

Gastrická lipáza Liečba cystickej fibrózy Kukurica

Hepatitis B antigén Ústna vakcína Zemiaky

Inzulín Liečba cukrovky Požlt farbiarsky

Laktoferón (alfa-interferón) Liečba hepatitis C Lemna (žaburinka)

Ďalšie produktyProtilátky proti hepatitis B Čistenie vakcín Tabak

Vakcínu pre hydinu proti NDV Hydinová vakcína Suspenzia buniek tabaku

Ľudský intristický faktor Doplnok jedla pri nedostatku vitamínu B 12

Arabidopsis

Ľudský laktoferín a lyzozýn Doplnok jedla pri nedostatku železa a akútnej hnačke

Ryža

18

3.2.1 Liečba rakoviny a prevencia HIV

Rakovina je jedným z celosvetovo najčastejšie sa vyskytujúcich ochorení, čím je

vysvetlené, prečo je na jej liečenie využitých až 35 % z celkových rekombinantných liečiv

v roku 2010. Z dôvodu vysokej spotreby liečiv proti rakovine je nevyhnutné znižovať náklady

na ich produkciu a odstraňovať problémy spojené s výrobnými technológiami

rekombinantných farmaceutík, ako sú napríklad ťažkosti s ich začlenením do kultivovaných

baktérii, kvasiniek, alebo cicavčích buniek. V poslednej dobe sa pozornosť začína upriamovať

na expresiu rekombinovaných anti-rakovinových bielkovín v rastlinách.

Každoročne pribudne 10 miliónov nových prípadov ochorení na rakovinu a 7,6

milióna úmrtí v dôsledku rakoviny (13 % zo všetkých úmrtí), čo robí rakovinu celosvetovo

najdevastujúcejším ochorením. Aj napriek rozsiahlej aplikácii zabehnutých liečebných

postupov proti rakovine ako aj novej vlne bioterapií je predpoklad nárastu stanovený na 9

miliónov ľudí, ktorý zomrú na rakovinu v roku 2015

(http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en/index.html). Vo väčšine rozvojových

krajín je rakovina jednou z popredných príčin úmrtí ľudí od 15 do 64 rokov a je hlavnou

príčinou znižovania priemerného veku obyvateľstva.

Monoklonálne protilátky boli prvými farmaceutickými molekulami exprimovanými

v rastlinách, a zostali v centre záujmu mnohých publikácii (Twyman et al., 2005), pretože

poskytujú širokú škálu uplatnenia protilátok v imunoterapii. Dokonca aj keď bolo iba 5 z 18

schválených, musíme s terapeuticky využívanými protilátkami rátať, pretože ich ročná

produkcia prekračuje 100 kg (http://www.pharmaweek.com/Exclusive_Content/2_23.asp).

Predpoveď vysokého nárastu vhodných terapeuticky využiteľných protilátok (Das, 2006) (na

základe počtu produktov vyvinutých a skúšaných a na základe celosvetového dopytu

v desiatkach tisíc kilogramov v roku 2010), v kombinácii s faktom, že protilátky sú využívané

viac a viac v liečbe chronických ochorení, poskytujú veľkú výzvu pre produkciu veľkej škály

prítomných monoklonálnych protilátok, ktoré sú takmer úplne hybridnými alebo

transgénnymi kultúrami (Hood et al., 2002).

Ako príklad môžeme uviesť 3 úspešné protilátky z Genentech

(http://www.gene.com/gene/). Avastin (bevacizumab) má v súčasnosti predpokladaný dopyt

viac ako jedna tona ročne a tiež je predpokladaná potreba 400 kg Herceptinu (trastuzumab)

a 150 kg Rituxanu (rituximab) v rovnakom období. V tejto situácii sa očakáva nárast

rastlinných expresných systémov, ktoré by dokázali pokryť tieto náklady a požiadavky na

19

tkanivá, ako aj poskytnúť bezpečnú a efektívnu produkciu. Ďalšie príklady liečiv proti

rakovine získaných z rastlín sú uvádzané v tab. 2.

Protilátky voči niektorým typom rakoviny už boli exprimované v rastlinných listoch

alebo semenách. Je preukázateľne dokázané, že tri z nich (Ko et al., 2005; Brodzik et al.,

2006; McCormick et al., 1999) vykázali protinádorovú aktivitu porovnateľnú z ich

náprotivkami produkovanými v cicavčích bunkách v pokusoch na myšacích modeloch.

Biologicky aktívny Cetuximab (erbitux) a anti-EGF-receptorová monoklonálna protilátka od

Imclone (http://www.imclone.com/ ) boli exprimované v kukurici (Ludwig et al., 2004)

a Nimotuzumab (TheraCTM) ďalšia anti-EGF-receptorová protilátka od CIMAB-YM

Biosciences (http://www.cim.sld.cu/and http://www.ymbiosciences.com/ ) bol exprimovaný

v tabaku (Rodriguez et al., 2005).

Tab. 2 Rekombinantné farmaceutiká proti rakovine z rastlín (Pujol et al., 2007)

Liečivo Hostiteľský systém Cieľ

Imunoglobulín G Tabak EpCAM kolorektálny

karcinóm

Murine 38C13, scFv Listy tabaku B - lymfón

scFv Kultúra buniek ryži Karcinoembryonální antigén

E7 proteín Listy tabaku HPV typ 16

Interleukin-2 Zemiaky Nádor obličiek a melanóm

Alkalická fosfatáza Tabak Rakovina vaječníkov

a semenníkov

Tri aspekty spravili tieto protilátky atraktívne pre rastlinnú expresiu. Po prvé, cicavčie

bunky produkujúce časti týchto dvoch protilátok sú už na trhu ako liek proti rakovine, krku

a hrubého čreva (Crobet et al., 2004; Allan, 2005). Po druhé, tieto imunoglobulíny majú

potenciálne široké uplatnenie v niektorých ďalších typoch rakoviny, a preto sa predpokladá

požiadavka na stovky ďalších kilogramov na pokrytie dopytu v budúcnosti. A po tretie, ich

protirakovinový mechanizmus súvisí hlavne s blokovaním receptorov a rastlinné látky

vykazujú vyššiu funkcionalitu ako ich glykozylované varianty.

Ako bolo poznamenané skôr, posttranslačná úprava a náklady sú najväčšími výhodami

rastlinných systémov pre produkciu farmaceutík.

20

HIV

Lokálne podanie terapeutických proteínov bolo zvážené aj pri HIV. Rekombinantné

mikrobicídy môžu byť lokálne aplikované k prevencií sexuálneho prenosu vírusu. Pravidelná

dávka 5mg poskytuje ochranu podľa štúdie na opiciach. (Shattock and Moore, 2003).

Odhaduje sa že produkcia 260 kg proteínu by bola potrebná k liečbe jedného milióna žien

ročne. (Ma et al., 2005). HIV neutralizujúca protilátka 2G12, je potenciálnom kandidátom

k lokálnej aplikácii, bol získaní z kukuričných semien v úrovni 0,1 g/kg kukuričných semien,

čistení použitím lacného extrakčného procesu. Protilátka sa ukázala byť aktívna v in vitro

testoch (Ramessar et al., 2008).

Keďže spracovateľské náklady sú hlavným faktorom pri produkcií protilátok, štúdia

Ramessar et al. (2008) ukazuje uskutočniteľnosť nie len lacnej produkcie HIV mikrobicídu,

ale aj jeho lacné čistenie.

3.2.2 Výrobné náklady

Hlavná výhoda transgénnych rastlín pre molekulárne pestovanie je v porovnaní jej

nízkej ceny a vysokého množstva produktov. Obe kapitál a náklady sú významne nižšie než

tie pri bunkových produkčných systémoch pretože tu nie je potreba školená osoba na

pestovanie.

Odhaduje sa že rekombinantné proteíny môžu byť produkované v rastlinách za 2-10%

ceny mikrobiálnych a kvasných systémov a za 0.1 % ceny kultúr z buniek cicavcov, aj keď to

záleží na výnose produktu (Giddings, 2001).

Pre proteíny ktoré sa dajú produkovať vo vysokých výnosoch je ekonomická výhoda

rastlinných produkčných systémov zrejmá. Jeden klas kukurice produkuje rekombinantný

avidín vo výške 20 % všetkých rozpustných proteínov v semene, je to rovnaký výnos ako

z jednej tony slepačích vajec, prirodzeného zdroju avidinu ale za 0.5 % ceny (Hood, 2004).

Nie veľa proteínov môže byť produkovaných na takejto úrovni. Úroveň 0,1-1,0 % TSP, je

typická pre produkciu farmaceutických proteínov, ako sú rekombinantné protilátky. To robí

rastliny konkurencie schopné s inými systémami a ekonomicky životaschopné (Hood et al.,

2002). Kde takýto výnos nie je možné dosiahnuť, produkcia v rastlinách nie je ekonomická,

najmä v prípade že produkt má nízku trhovú hodnotu.

21

Produkčná cena rekombinantných proteínov taktiež významne závisí na požadovanej

čistote pretože viac ako 85% výdavkov odráža následné spracovanie skôr než produkcia sama

o sebe. Pretože podobné metódy sú použité pre čistenie proteínu bez ohľadu na systém

z ktorého bol získaný, cena spracovania je plošne podobná ak je požadovaná vysoká čistota.

Avšak, rôzne typy rekombinantných proteínov môžu byť použité surovom alebo

čiastočne spracovanom materiáli, tým sa odstránia ďalšie spracovateľské náklady. Napríklad,

rekombinantná podjednotka vakcíny produkovaná v rastlinách môže byť podávaná v stave

surového alebo čiastočne spracovaného ovocia a zeleniny (Manson et al., 2002), a protilátky

pre pasívnu imunizáciu môžu byť podávané ako lokálne aplikované pasty vyžadujúce nízku

čistotu. Podobne, priemyselné enzýmy ako sú glukanázy (ktoré sa používajú na štiepenie

celulózy vo zvieracej potrave) a fytázy (ktoré štiepia kyselinu fytovú a uvoľňujú biologicky

využiteľný fosfor) môžu byť zavedené medzi priemyselné procesy buď ako čiastočne

spracovaný rastlinný materiál alebo priamo v rastlinách ktoré musia byť spracované

(Denbow et al., 1998; Dai et al., 2000; Ziegler et al., 2000; Zigelhoffer et al., 2001).

Pre farmaceutické proteíny ktoré treba čistiť pred použitím, bolo vyvinutých niekoľko

stratégii k zníženiu cien následných spracovaní.

Pretože náklady na spracovania sú nepriamo úmerné koncentrácií produktu

v začiatočnom materiáli, výnos proteínu na jednotku rastlinnej biomasy je kritický. To záleží

na expresnom systéme a na produkte samotnom, a treba ich hodnotiť na základe skúsenosti.

3.2.3 Vysoká cena spracovateľských procesov

V porovnaní s tradičným spôsobom výroby farmaceutík, rastlinné systémy majú

prednosť v podobe nízkych vstupných nákladov pre produkciu. Ale náklady na získanie

produktu sú vysoké. Tak by mala byť zvažovaná cena spracovateľských procesov, rozumným

prístupom je zamerať sa na redukciu ceny.

Banány sú ideálnym hostiteľským systémom pre jedlé vakcíny pretože sú stráviteľné,

vyskytujú sa počas celého roka v trópoch a subtrópoch (Kumar et al., 2004). Kumar et al.

(2005) podáva prvú správu expresie HBsAg v transgénnych banánoch.

Ďalej zacielenie na albumínové bunky jedlých semien je použiteľné k expresií

rekombinantných proteínov, týmto môžeme zvýšiť stabilitu cudzieho proteínu. Použitím tejto

22

metódy, sa proteíny stávajú uskladniteľné, transportovateľné a zjednodušuje sa proces čistenia

a spracovania. (Arcalis et al., 2004).

Rastlinné kultúry môžu byť dobrou voľbou pre produkciu malých až stredných

množstiev nákladných, vysoko čistých špeciálnych rekombinantných proteínov vďaka väčšej

kontrole nad prostredím (Kim et al., 2008).

3.3 Transformačné metódy

Rastlinná transformácia, znamenajúca stabilnú integráciu génu záujmu do rastlinného

genómu, bola pôvodne vykonaná s použitím modifikovaného kmeňa Agrobacterium

tumefaciens.

V súčasnosti je prístupných množstvo metód. Môžeme ich rozdeliť do dvoch hlavných

skupín; nepriame a priame. Nepriame metódy rastlinnej transformácie sú založené na

vkladaní plazmidov nesúcich génový konštrukt do cieľovej bunky pomocou Agrobacterium

tumefaciens alebo Agrobacterium rhizogenes. Priame metódy nevyužívajú bakteriálne bunky

ako sprostredkovateľov.

Agrobacteriom sprostredkovaná transformácia je hlavnou metódou používanou na poli

biotechnológii, kde sú najčastejšie používanými priamymi metódami protoplastové

transformácie alebo mikroprojektilové bombardovanie. Ďalšími technikami k transformácií

rastlín sú PEG metóda, elektroporácia atď..

Zásadným problémom pri použití týchto metód sa sústreďujú okolo ťažkostí

s regeneráciou rastlín z jednobunkových protoplastov. Okrem toho rastliny zhotovené

použitím týchto metód sú často sterilné a fenotypicky abnormálne. Ďalšie problémy sa týkajú

fragmentácie génov,  preskupovania génov ale aj génových duplikácii a ne-mendelovskými

zákonmi dedičnosti transgénov. (Christou, 1997; Gelvin, 2003; Rakoczy-Trojanowska, 2002,

Liu et al., 2006). Elektrické pole a chemické substancie aplikované pri dezintegrácii bunkovej

steny veľmi redukujú životaschopnosť protoplastov a ich schopnosť pri delení.

Veľa metód transformácie rastlín vyžaduje použitie in vitro kultúr aspoň v niektorých

procedurálnych krokoch. Počas in vitro regenerácie sa môžu vyskytnúť niektoré

somaklonálne zmeny. Tento fakt môže urobiť komplikovať analýzu transformantov

a limitovať jej použitie v ďalších štúdiách. Všetky skôr zmienené obmedzenia inšpirujú

23

výskumníkov k hľadaniu nových alternatívnych transformačných procedúr. Až do súčasnosti,

niekoľko takých metód bolo vyvinutých.

Z nich sú najviac využívanými:

Infiltrácia

Kremíkovo karbidovým vláknom sprostredkovaná transformácia

Elektroporácia buniek a pletív

Elektroforéza embryii

Mikroinjektáž

Transformácia pomocou tzv. pollen tube pathway

Lipozómami sprostredkovaná transformácia

(Newell, 2000; Patnaik and Khurana, 2001; Songstad et al.,1995; Vasil, 1994; Zhu et al.,

1993).

Väčšina týchto techník by mohla byť riešením pre efektívnu transformáciu ťažko

modifikovateľných druhov, ako jednoklíčnolistové rastliny alebo niektoré strukoviny.

Do dnes, zostáva rozšírenie množstva hostiteľských kultúr a požiadavka na zvýšenie

efektivity transformácie hlavnými výzvami. (Broothaerts et al., 2005

Najvyužívanejšie metódy transformácie sú popísané ďalej.

3.3.1 Agrobacteriom sprostredkovaná transformácia

Potenciál transformácie založenej na Agrorobacterium, pre expresiu cudzích bielkovín

v rastlinách bol odokrytý Arminom Braunom. Ten v roku 1947 dokázal že A. tumefaciens

zavádza do rastlín faktor ktorý trvalo mení rastlinné bunky na nádorové. Neskôr

v osemdesiatych rokoch boli vo virulentných kmeňoch Agrobacteria identifikované veľké

plazmidy.

Tieto objavy viedli k rozoznaniu skupiny plazmidov známych ako „tumor-indikujúce“

alebo Ti plazmidy. Ti plazmdy sú zodpovedné za tvorbu nádorov, keď ich časť, T-DNA je

transformovaná do rastlinných buniek a zabudovaná do ich genómu (Christou, 1997 Gelvin,

2003). Na základe týchto prác bol Ti plazmid skúmaní ako vektor pre zavádzanie cudzích

génov do rastlín. Dosiahlo sa toho pomocou dvoch prístupov. Prvý zahŕňa klonovanie génu

záujmu v Ti plazmide samotnom pri takomto spôsobe je nový gén umiestnení na cis alebo vir

24

gény v plazmide. Druhým spôsobom je klonovania cudzieho génu v T- regióne na druhom

pomocnom plazmide.

Vývoj binárnych vektorov T-DNA spôsobil revolúciu v použití Agrobacteria

k prenosu génov do rastlín. Bolo vyvinuté množstvo binárnych vektorov pre vysoko

špecifické použitie a sú bežne používané v rastlinnej biotechnológii.

Genetická transformácia rastlín pomocou Agrobacterium je len jedným z príkladov

genetických výmen v prírode. (Gelvin, 2003). Napriek tomu je náročné transformovať mnoho

poľnohospodárskych druhov použitím Agrobacteria. Efektivita rastlinnej transformácie môže

byť zvýšená v mnohých rastlinných druhoch použitím virulentnejších kmeňov Agrobacteria,

zlepšením podmienok rastlinných kultúr alebo môže byť zlepšená manipuláciou s rastlinným

genómom.

V prípade Agrobacteriom sprostredkovanej transformácie, je využiteľnosť  pri

jednoklíčno-listových rastlinách stále nedostatočná. Aj keď, v posledných rokoch sa táto

metóda stala využívanou aj pri tejto skupine plodín (Nadolska, Orczyk et al., 2000).

3.3.2 Binárne vektory

Začínajúc od binárneho vektora pBIN19, ktorý bol skonštruovaný Bevanom v roku

1984, vektory boli modifikované pre obsiahnutie čo najväčšieho rozsahu ich použiteľnosti

a na zvýšenie ich transformačnej efektivity.

Významným pokrokom je skonštruovanie super binárneho vektora pTOK233 (Heii et

al., 1994) klonovaním virB, virG a virC génov pTiBo542 v pGA472. To viedlo k úspešnej

transformácii japonskej ryže. Nasledovali transformácie indickej ryže (Aldemita a Hodges,

1996; Mohanty et al., 1999; Kumaria et al., 2001) jávskej ryže, kukurice, ciroku a cesnaku

(Doy et al., 1996; Ishida et al., 1996; Zheng et al., 2001) ktoré boli uskutočnené použitím

rovnakej stratégie.

Nová séria pPZP vektorov bola vyvinutá, pričom sa jedná o veľkosťou malé a stabilné

vektory v Agrobakteriu (Hajdukiewicz et al., 1994). Kostra pPZP vektora bola použitá na

konštrukciu pCAMBIA série vektorov. pCAMBIA vektory sú veľmi rozšírené pri použití

v transformácii ryže.

V správe (Hou et al. 2003), rastlinný expresný vektor pGU4AGBar a pGBIU4AGBar

boli použité a TeGNA gén bol transformovaný v zimnej pšenici pomocou peľovej trubice, čo

25

malo za následok pozorovanie 20 transformovaných exprimovaných proteínov. Táto stratégia

potvrdila, že všetky rastliny označené kanamycínom mali kompletnú T-DNA vrátane génov

záujmu.

3.3.3 Biolistická transformácia

Obmedzené množstvo hostiteľských systémov pri Agrobacteriom sprostredkovanej

transformácií robí infekcie jednoklíčno-listových rastlín obtiažnejšie než u dvojklíčno-

listových. Jednoklíčno-listová kukurica, napríklad je bežne transformovaná časticovým

bombardovaním, pri tejto procedúre sú vysokou rýchlosťou mikroprojektily (tvorené

wolfrámom ktorý je obalený DNA) „strelené“ stlačením héliom do rastlinného tkaniva.

Mikroprojektily preniknú do rastlinných buniek, a uvoľnia gény. Pri optimálnych

podmienkach je poškodenie bunky minimálne, a nové gény sú integrované (Christou, 1997;

Gelvin, 2003).

Najviac rozlišujúcim faktorom limitujúcim použitie génovej pušky je prítomnosť

viacnásobných kópii introdukovaného génu, čo môže viesť k rôznym nežiaducim efektom

ako napríklad, možnosť potlačenia alebo zmeny expresie. Vysoká cena príslušenstva génovej

pušky môže byť tiež zahrnutá do posudzovania.

3.3.4 Protoplastová a somatická hybridizácia

Série štúdii počas skorých 60-tych rokov Cocking (1960, 2000; Vasil, 1976; Giles, 1983)

popisovali metódy izolácie rastlinných protoplastov inkubáciou segmentov rastových

vrcholov a ďalších pletív v hrubej zmesi enzýmov hydrolyzujúcich bunkové steny. Malé

množstvo protoplastov, ktoré boli izolované boli použité hlavne na fyziologické štúdie. Dva

kľúčové objavy v 1970 a v 1971 zaznamenali potenciálne použitie protoplastov pri zvyšovaní

kvality rastlín:

1. Indukovaná fúzia protoplastov rôznych druhov (Powers et al., 1970) mienená ako

produkcia somatických hybridných buniek a nových hybridných rastlín bez ohľadu na

taxonomickú príbuznosť

2. Regenerácia rastlín z kultivovaných protoplastov (Takebe et al., 1971).

26

Jedna z najefektívnejších techník vo fazuli bola založená na „micropod“ kultúre - výskum

bol zahájený Geertsom et al. (2000, 2001) a vylepšený Schryerom et al. (2005). Hoci techniky

na izoláciu protoplastov a fúziu sú len veľmi slabo preštudované v rámci zŕn strukovín

(Ochatt et al., 2007).

V súčasnosti už môžu byť rastliny regenerované z protoplastov širokou škálou druhou.

Podobne, veľa somatických hybridov bolo získaných medzi príbuznými aj nepríbuznými

druhmi, hoci použiteľné hybridy boli vyprodukované iba v limitovanom počte druhov ako

Brasica, Citrus a Solanum. Protoplasty však môžu byť veľmi dobre použiteľné v genetických

transformáciách rastlín (Marton et al., 1979; Davey et al., 1980; Paszkowski et al., 1984),

zahrňujúc aj ekonomicky najvýznamnejšie cereálie (Vasil a Vasil, 1992). Táto metóda

transformácie má pár limitácii. Tieto limitácie zahrňujú hlavne frekvenciu protoplastových

transformácii, variabilnú tak v rámci ako aj medzi experimentami. Preto je tento systém

limitovaný hodnotami pre kvantitatívnu analýzu.

Táto metóda je vymedzená iba pre tie rastlinné druhy, ktoré vykazujú kalusovú

regeneráciu (Waldron et al., 1985)

3.3.5 Chloroplastové manipulácie

Problémy génovej expresie v jadre transformovaných rastlinách sa výrazne líšia od

rastliny k rastline. Pozície chromozómov sú čiastočne zodpovedné za tento problém pretože

vloženie transgénu do rastlinného genómu je nekontrolované. Ďalšie problémy vznikajú pri

transgénnych rastlinách s viac ako jedným cudzím génom. (Yin et al., 2004). A keďže mnohé

vlastnosti vyžadujú činnosť viacerých génov, produkcia transformantov využívajúcich

viacero génov môže byť veľmi zdĺhavý proces (Filipecki and Malepszy, 2006).

Asi najväčšie prísľuby pre rastlinnú expresiu cudzích proteínov majú základ

v úpravách chloroplastov cez plastidovú transformáciu. Úprava chromozómov zahŕňa

zavádzanie tisícok kópii cudzieho génu záujmu do bunky a následky jej produkcie cudzieho

proteínu môžu dosiahnuť úroveň 46 % TSP (Daniell, 1999; Daniell et al., 2002; Daniell a

Dhingra, 2002). Táto schopnosť dáva chloroplastovým manipuláciám ohromný potenciál pre

výrobu vakcín a biofarmaceutík.

Vektor pre plastidovú transformáciu sa skladá z dvoch cieľových sekvencií z približne

400 bp, homológnych chloroplastovému genomu s ktorým spolu tvoria cudzí gén záujmu. Rec

A-typ systém homológnej transformácie umožňuje vloženie génu záujmu na presne určené

27

miesto na chloroplastovom genóme s vysokou úrovňou účinnosti, čo vyúsťuje v rovnakú

expresiu medzi transgénnymi líniami. (Maliga, 2003)

V budúcnosti by chloroplastová expresia mohla umožniť zisk požadovaných

vlastnosti, z viacerých génov. Úroveň transgénnej expresie z rastlín transformovaných

pomocou chloroplatu je niekoľko krát vyššia v porovnaní s jadrovou transformáciou. 

Hromadenie cudzieho proteínu v chloroplastoch zabraňuje ich nepriaznivej interakcií

s cytoplazmou a chráni bunku pred hromadením potenciálne toxických bielkovín. A keďže

chloloroplasty sa nenachádzajú v peli, transgénny nemôžu byť prenesené na blízke pohlavne

zlučiteľné plodiny. Schopnosť chloroplastovej transformácie predchádzať hlavným

problémom spojených s konvenčnými jadrovými technikami vytvorila obrovské možnosti pre

rastlinnú biotechnológiu.

3.4 Produkčné rastliny

3.4.1 Tabak

Jedným z najvýhodnejších aspektov pre produkciu rekombinantných proteínov

v tabaku je dostupnosť množstva expresných stratégií, pričom každá má svoje silné stránky.

Stabilná jadrová transformácia je schopná splniť dlhodobé nároky na autentické

glykoproteíny, ako sú protilátky, alebo expresia založená na chloroplatoch môže poskytnúť

veľké množstvo proteínov ktoré vyžadujú posttranslačné úpravy.

Tabak sa potvrdzuje ako príťažlivý bioreaktor pre produkciu farmaceutických

bielkovín. Okrem ekonomických výhod tabakových bioreaktorov, má tabak schopnosť

produkovať široké spektrum farmaceutických bielkovín ako protilátky, vakcíny

a inunomodulačné molekuly ako sú cytokiníny. Navyše použitím prechodnej proteínovej

expresii, je tabak schopný v krátkom čase vyprodukovať významné množstvo proteínu, to je

nevyhnutné pre rýchlu odpoveď na vypuknutie choroby ako bola napríklad influenza A/H1N1

a pri liečbe konkrétnych prípadov rakoviny.

Tabak bol a je hlavnou platformou zeleného bioreaktoru. Napriek tradične

negatívnemu pohľadu na tabak, kôli väzbe s fajčením, má niekoľko jedinečných výhod pred

inými druhmi rastlín. Tabak je často označovaný za laboratórnu myš v rastlinnom svete, pre

28

svoju prijateľnosť modifikácii, a stal sa dôkazom opodstatnenosti konceptu produkcie

rekombinantných bielkovín. Tabak je listová rastlina, ktorá má vysoký výnos a vysokú úroveň

rozpustného proteínu. Tabak ponúka aj viac možností pri spôsoboch expresie, ako prechodný

spôsob cez agrobakterium alebo vírusovú indukciu a stabilnú jadrovú alebo chloroplastovú

expresiu.

Dostupnosť tabaku s nízkym obsahom nikotínu a alkaloidov, ako je kultivar “81V9”

spravili z tabaku rastlinu vhodnú aj pre ústne podávanie v rastlinnom materiáli alebo

v surovom rastlinnom extrakte (Menassa et al., 2001).

3.4.2 Obilniny

V súčasnosti sú obilniny zahrnujúc kukuricu, ryžu, jačmeň a pšenicu, hlavnými

platformami pre produkciu rekombinantných bielkovín založenú na zrne, pričom kukurica je

najprednejšou (Ma et al., 2003; Ramessar et al., 2008).

Vo všeobecnosti, tieto plodiny majú vysoký výnos zrna, s relatívne vysokým obsahom

bielkovín (7%-10%) a pre ryžu a kukuricu je dostupné dobre vyhynuté molekulárne náradie

na genetickú manipuláciu.

Jedna z výhod rekombinantných proteínov v semenách transgénnych obilnín je že

môžeme nahromadiť vysokú úroveň produktu v malom množstve, čo minimalizuje cenu

spojenú so spracovaním (Perrin et al., 2000; Stoger et al., 2000).

Hlavná obilná plodina pšenica, je posledná vo vývoji pokiaľ ide o PMF, hlavne kôli jej

slabej transformačnej efektivite (Stoger et al ., 2000).

3.4.2.1 Kukurica

Kukurica je hlavnou komerčnou plodinou pre produkciu rekombinantných bielkovín.

Má mnoho výhod vysoký výnos biomasy, jednoduchá transformácia, a ľahko sa zvyšuje

biomasa (Ramessar et al ., 2008b). Kôli týmto dôvodom, prvý komerčne získaný proteín,

avidín bol produkovaný v kukurici (Hood et al ., 1997).

Ďalšie bielkoviny získané z kukurici zahŕňajú aprotinín, lakázu, a trypsín (Witcher et

al., 1998; Zhong et al., 1999; Woodard et al., 2003).

Kukurica bola tiež použitá k produkcií farmaceutických bielkovín ako sú enzýmy,

vakcíny a protilátky (Daniell et al ., 2001; Hood, 2002). Pre produkciu vakcín, bol potenciál

29

a efektívnosť ústne podávaných antigénov s kukuričným zrnom demonštrovaný v niekoľkých

štúdiách (Lamphear et al., 2002; Streatfield et al., 2003; Lamphear et al., 2004; Guerrero-

Andrade et al., 2006).

Získané antigény podjednotka enterotoxínu B E. coli a hrotový proteín vírusov

spôsobujúcich gastroenteritídu. Boli testované na zvieratách, vyvolali ochrannú imunitu

priamym kŕmením so zrnom produkujúcim antigén. Obe vakcíny ktoré boli vyvinuté

spoločnosťou ProdiGene, ukončili prvú fázu schvaľovania, ďalší výskum sa zastavil po tom

ako spoločnosť skrachovala.

Hlavnou nevýhodou používania kukurice ako bioreaktoru je fakt že patrí medzi

jednodomé rôznopohlavné rastliny, a sú tu silné obavy z kontaminácie plodín jedlej kukurici.

(Spök, 2007).

3.4.2.2 Ryža

Ryža je ďalšou platformou pre rekombinantné bielkoviny. Delí sa o mnohé výhody

vyššie spomínanej kukurici. Značnou výhodou ryži nad kukuricou je že ryža je

samoopeľujúca rastlina a mala by predstavovať nižšie riziko nezamýšľaného toku génov.

Spoločnosť Ventria BioScience, vyvinula dva z ryže získané proteíny ľudský

laktoferín a lyzozým, oba obdržali schválenie regulačnými úradmi.

Súčasné štúdie na ryži ako bioreaktore, sa zamerali na jej potenciál ako na systém pre

ústne podávanie vakcín, a terapeutických peptidov a v tomto ohľade bol  dosiahnutý pokrok

(Yang et al., 2008). Množstvo antigénov vakcín bolo úspešne získaných zo semien ryže, ako

napríklad podjednotka cholera toxínu B, vírus infekčnej burzitídy (IBDV) immunogén VP2

a upravený povrchový hepatitis B antigén SS1 (Nochi et al., 2007; Wu et al., 2007; Qian et

al., 2008).

V štúdiách transgénnej ryže boli použité epitopy peľových alergénov japonského

cédru. Najmä cez ústne kŕmenie, rozvoj alergickej imúnnej odpovede v testovacích myšiach

bol oslabený a alergén špecifická produkcia IgE bola potlačená.

Ryžové semená boli použité k dodaniu liečiv pri liečbe vysokého krvného tlaku

a cukrovky v živočíšnych modeloch. Ústnym užitím ryžových semien tvoriacich potenciálny

peptid proti vysokému tlaku sa podarilo významne znížiť systolický krvný tlak v modelových

myšiach, a ryža produkujúca ľudský inzulín ako rastový faktor I (IGF-1) bola schopná znížiť

glukózu v krvi diabetickej myši cez ústne podanie. (Yang et al., 2006; Xie et al., 2008).

30

3.4.2.3 Jačmeň

V porovnaní s ďalšími obilnými plodinami, jačmeň je využívaní menej. Ale je takisto

samoopelivý, to môže byť pokladané za výhodu pretože problém kontaminácie ne-

trasngénnych rastlín je minimalizovaní. To je dôvodom prečo Islandská spoločnosť ORF

Genetics si prisvojila jačmeň ako svoju produkčnú platformu (Ramessar et al., 2008a ).

Ďalšie spoločnosti ako Ventria BioScience a Maltagen, tiež vyvíjajú jačmeň na

produkciu rekombinantných bielkovín. Transformácia jačmeňa nie je tak priamočiara ako pri

kukurici alebo ryži, no v poslednej dekáde bol učinený pokrok (Dahleen a Manoharan, 2007).

Je len niekoľko prác pri ktorých sa jačmeň využíva ako produkčná platforma, ale bol

v nich hlásený vysoký výnos proteínu. Z dvoch štúdii zameraných na expresiu glukanázy

z prvej boli hlásené výnosy 1-1,5 g /kg zrna zatiaľ čo ostatné ukazujú nahromadenie enzýmu

do 1,5 % TSP (Horvath et al., 2000; Xue et al., 2003).

Diagnostická protilátka proti HIV bola tiež získaná z jačmeňa a nahromadené

v množstve 150 μg/g zrna, to je vyššia úroveň než v listoch tabaku alebo v hľuzách zemiakov

(Schunmann et al., 2002).

3.4.3 Strukoviny

3.4.3.1 Sója

Rôzne druhy strukovín boli použité na expresiu rekombinantných proteínov, ale len

dva druhy hrach a sója boli preskúmané ako hlavný produkčný hostitelia. Výhoda sóji ako

produkčnej plodiny je v tom, že aj keď má relatívne nízke ročné výnosy zrna v porovnaní

s kukuricou a ryžou, tak obsah proteínu v semenách je veľmi vysoký.

Avšak, táto výhoda je vyrovnaná, dlhším časom potrebným na transformačné procesy. Iba dve

práce molekulárneho pestovania v sóji boli publikované (Zeitlin et al., 1998; Philip et al.,

2001).

Zeitilin (1998) popisuje produkciu ľudských protilátok proti HSV, a tie boli

produkované v rastline skôr než v semenách samotných. V druhej práci bol kazenín

produkovaný v sójových semenách s využitím lektínovej expresie (Philip et al., 2001).

Potenciálny problém sóji je vo vysokom obsahu oleja, ktorý môže ovplyvniť následné

spracovanie.

31

3.4.3.2 Hrach

Hrach má podobný ročný výnos zrna, a produkciu semenného proteínu ako sója

a preto má rovnaký potenciál z hľadiska výnosov rekombinantných proteínov na hektár.

Avšak cena produkcie je o 50% vyššia ako pri sóji .

Do dneška len jeden farmaceutický proteín bol získaný z hrachu, jednoreťazcové

protilátky. Jedna protilátka priamo proti rakovinovému antigénu bola získaná na nízkej úrovni

pod kontrolou špecifických promotorov (Perrin et al., 2000). Ďalšie protilátky získané

použitím ‘unknown seed protein’ USP promotéra, boli získané na úrovni 2 % TSP (Sallbach

et al., 2001).

3.4.4 Repka

V semenách transgénnej repky olejnej sa akumuluje proteín pijavky konskej – hirudín,

ktorý tvorí komplexy s trombínom, a tak bráni zrážaniu krvi. Farmakologicky sa používa ako

heparín.

Repka môže byť užitočný hostiteľ pre produkciu proteínov, pretože olejové telieska

môžu byť využívané pre zjednodušenie proteínovej izolácie. Napríklad, pomocou oleosin-

fúznej platforme vyvinutej v SemBioSys Genetics Inc (http://www.sembiosys.com/) (Liu et

al. 1997).

V oleosin-fúznom systeme, fúzny proteín môže byť odstránený od olejových teliesok

použitím jednoduchej extrakčnej procedúry a rekombinantný proteín je odstránený od svojho

fúzneho partnera endoproteázov zažívania ako uvádza Liu et al., (1997).

3.4.5 Ovocie a zelenina

Rozhodujúcim kladom bielkovinovej expersie v ovocí a zelenine je  jej jedlosť

v surovom, nespracovanom alebo čiastočne spracovanom stave, to ich robí ideálnymi pre

produkciu rekombinantných podjednotiek, vakcín, protilátok a látok s nutričnou hodnotou

Zemiaky sú hlavným systémom pre produkciu vakcín (Tacket et al., 1998; Tacket et al., 2000;

Richter et al., 2000).

Napríklad, produkcia proteínu kapsidu rotavírusu VP6 v transgénnych zemiakoch pre

vakcináciu proti náhlej vírusovej gastroenteritíde (Yu a Langridge, 2003). Artsaenko (1998)

32

ukázal ako zemiaky môžu byť použité pre tvorbu protilátok a tento systém bol skúmaný ako

možná platforma pre masovú produkciu protilátok (De Wilde et al., 2002). Zemiaky boli tiež

použité na výrobu glukanázy (Dai et al., 2000), diagnostických protilátok (Schumann et al.,

2002) a bielkovín materského mlieka (Chong, 2000; Chong et al., 1997).

Rajčiny sú pestovateľnejšie ako zemiaky a majú ďalšiu výhodu, vysoký výnos

biomasy a použitie skleníkov pre zvýšenie biologickej bezpečnosti. Rajčiny poli použité ako

kandidát na produkciu vakcín proti besnote, a boli tiež použité na produkciu protilátok, ale

výnosy boli nižšie než 3mg na gram čistej váhy (McGarvey et al., 1995; Stoger et al., 2002).

Banány sa najmä pre Afriku javia ako veľmi príťažlivý zdroj vakcinácie. Pre svoju

konzumovateľnosť a širokú distribúciu medzi deťmi aj dospelými. (Manson et al., 2002; Sala

et al., 2003).

Tab. 3. Porovnanie biomasy, obsahu proteínu v semenách a rozmnožovania

najvýznamnejších hostiteľských systémov

DruhPribližná

biomasa osiva (kg. ha-1 r-1)

Obsah proteínu

v semenách (%)

Rozmnožovanie

Kukurica (Zea mays) 8670 10 cudzoopelivá

Ryža (Oryza sativa) 7270 8 samoopelivá

Jačmeň (Hordeum vulgare) 3100 13 samoopelivá

Pšenica (Triticum aestivium) 2700 12 samoopelivá

Sója (Glycine max) 2600 40 samoopelivá

Hrach (Pisum sativum) 2500 40 samoopelivá

Repka (Brassica napus) 1500 22 cudzoopelivá

Svetlica (Carthamnus tictorius) 1500 25 cudzoopelivá

Ľaničník (Camelina sativa) 1100 25 cudzoopelivá

33

3.5 Ďalšie produkčné platformy

Pri výbere platformy pre produkciu rekombinantných bielkovín je nutné zvážiť

množstvo hľadísk ako napríklad, úroveň expresie, posttranslačné úpravy, biologická

bezpečnosť, náklady atď. Z tabuľky 4. (Huang a McDonald, 2009) je zrejmé že rastliny sa

líšia nielen medzi sebou, ale že existujú aj významné rozdiely medzi produkčnými systémami.

Tab. 4. Vlastnosti hostiteľských systémov pre in vitro produkciu

rekombinantných proteínov

Funkcia Expresný systém

Baktérie Kvasinky Hmyzie bunky

Bunky cicavcov Rastlinné bunky

Úroveň expresie 0, 5 – 5 g/l 0, 1 – 2 g/l 0, 1 – 2 g/l 1 – 3 g/l 0, 01 -0, 2 g/l

Sekrécia Periplazmatická Možná Možná Možná Možná

Schopnosť posttranslačných úprav

Nie je alebo je chybná

Schopné Schopné Schopné Schopné

Glykozylácia Chýba alebo je nesprávna

Nesprávna, chýba terminálna alfa-(1, 3)-manóza

Čiastočne správna

Zvyčajne podobná ľudskej

Je, ale žiadna terminálna galaktóza a kys. sialová, obsahuje xylózu,

Homogenita proteínu

Nízka Stredná Stredná Vysoká Vysoká

Stabilita bunkových línií

Vysoká Vysoká Stredná Nízka Stredná

Doba produkcie Krátka Krátka Stredná Dlhá Stredná

Riziko kontaminácie

Endotoxíny Endotoxíny Nízke riziko Vírusy, priony Veľmi nízke riziko

Terapeutické riziko

Áno Áno Áno Áno Neznáme

Vyvinutý proces Priemyselné meradlo

Priemyselné meradlo

Skúšobný Priemyselné meradlo

Skúšobný

Náklady na čistenie

Vysoké Vysoké Stredné Vysoké Nízke

Odhad výrobných nákladov

(v dolároch)

Nízke

20 -100/g

Nízke

20 – 100/g

Stredné

50- 200 /g

Vysoké

1 000-10 000/g

Nízke

50-100/g

Produkty na trhu Áno Áno Áno Áno Áno

34

3.5.1 Escherichia coli

Mnoho mikroorganizmov predstavuje potenciálne produkčné systémy pre

farmaceutiká. Pretože môžu byť obvykle kultivované vo veľkých množstvách, s nízkymi

nákladmi a v krátkom čase, bežnými metódami. Produkčné podniky môžu byť postavené

kdekoľvek a rozsah produkcie môže byť upravovaný podľa požiadaviek.

Prvé biofarmaceutikum ktoré bolo získané z geneticky upraveného mikroorganizmu

bol rekombinantný ľudský inzulín (obchodný názov „Humulin“) získaní z E. coli. Ako príklad

novšej bielkoviny získanej z E. coli je „Kepivance“, rastový faktor keratínocytov, používaný

k liečbe zápalu ústnej sliznice. Rekombinantný produkčný systém E. coli vykazuje množstvo

výhod:

- E. coli slúžila ako modelový systém pri mnohých štúdiách týkajúcich sa genetiky

prokaryontov. Jej molekulová biológia je tak dobre charakterizovaná,

- vysoká úroveň expresie heterológnych bielkovín môže byť dosiahnutá v rekombinantnej E.

coli. Moderné, promotéry môžu zaručiť že úroveň výnosu rekombinantného proteínu

dosiahne 30% celkového bunkového proteínu,

-E. coli rastie na pomerne jednoduchom a nenákladnom médiu a príslušné fermentačné

technológie sú dobre zavedené.

Tieto výhody, najmä jednoduchá genetická manipulácia umožňovali E. coli byť

hlavným produkčným systémom biofarmaceutík niekoľko rokov. Ale E. coli má aj nevýhody

pre jeho využitie ako producenta biofarmaceutík :

- heterologné bielkoviny sa hromadia intracelulárne,

- neschopnosť vykonávať posttranslačné modifikácie ( najmä glykozylácia) bielkovín,

- prítomnosť lipopolysachridov na povrchu E. coli.

3.5.2 Kvasinky

Bunky kvasiniek (najmä Saccharomyces cerevisiae) majú vlastnosti ktoré môžu byť

pri produkcií využité:

35

- ich molekulárna biológia bola do detailov študovaná to uľahčuje genetické manipulácie,

- väčšina sú vedené ako geneticky uznané ako bezpečné (GRAS), a majú dlhú históriu

priemyselného použitia (napr. pivovarníctvo a pekárstvo),

- rastú pomerne rýchlo na nenáročnom médiu, a ich vonkajšia stena ich chráni pred fyzickým

poškodením,

- k dispozícii sú priemyselné pomôcky a technológia pre fermentáciu,

- majú schopnosť vykonávať posttranslačnú modifikáciu bielkovín.

Praktický potenciál produkčných systémov založených na kvasinkách, bol potvrdený

expresiou množstva terapeutických bielkovín v takomto systéme. Spolu stým sa ukázali aj

nevýhody súvisiace s produkciou heterológnych bielkovín v kvasinkách:

- hoci sú kvasinky schopné glykozylácie heterológnych ľudských bielkovín, spôsob

glykozylácie sa líši od spôsobu pozorovaného pri natívnom glykoproteine (keď je izolovaní

z prirodzeného zdroja, alebo keď je získaný z rekombinantných zvieracích kultúr),

- vo väčšine prípadov úroveň expresie heterológnych bielkovín zostáva nižšia ako 5%

celkového bunkového proteínu. To je výrazne nižšia úroveň expresie, oproti rekombinantným

systémom E. coli.

Napriek týmto nevýhodám, niektoré rekombinantné biofarmaceutiká získané z

kvasiniek boli schválené pre lekárske použitie.

3.5.3 Huby

Huby sú ďalším potenciálnym produkčným systémom pre heterológne bielkoviny.

Mnoho húb má dlhú históriu ako producenti priemyselných enzýmov ako amyláza

a glukoamyláza. Tak isto ako pri mikroorganizmoch a kvasinkách aj pri hubách sú dostupné

technológie a metodika. Vo všeobecnosti sú huby schopné expresie proteínov na vysokej

úrovni, z ktorých mnohé sa vylučujú do extracelulárneho média.

Extracelulárna produkcia biofarmaceutík by mohla byť výhodnejšia z hľadiska

následného spracovania. Huby majú schopnosť posttranslačnej úpravy. Spôsob glykozylácie

sa líši od spôsobu glykozylácie v cicavčích bunkách. Čo môže spôsobiť zníženie životnosti

séra alebo imunologické komplikácie u ľudí.

36

Mnoho kmeňov húb taktiež produkuje významné množstvo extracelulárnych proteáz,

ktoré sú schopné degradácie rekombinantného produktu. Táto nevýhoda môže byť čiastočne

prekonaná použitím mutantných kmeňov húb ktoré sú schopné vylučovať výrazne nižšie

množstvo proteáz. Hoci sa podarilo vyprodukovať množstvo potenciálne terapeutických

bielkovín zo systémov rekombinantných húb, žiadne biofarmaceutikum vyrobené týmto

spôsobom zatiaľ nezískalo obchodné povolenie.

3.5.4 Transgénne živočíchy

V nedávnej dobe si produkcia heterológnych bielkovín v transgénnych živočíchoch si

získala značnú pozornosť. Generácia transgénnych živočíchov najčastejšie vzniká

mikroinjekciou exogénnej DNA do vaječnej bunky. V niektorých prípadoch je táto DNA

stabilne integrovaná do bunkového komplementu.

Po oplodnení vajíčka, môže byť implantované do náhradnej matky. Každá bunka

výsledného transgénneho živočícha bude obsahovať kópiu prenesenej DNA. To zahŕňa aj

zárodočné bunky a tak môže byť nová genetická informácia odovzdávaná z jednej generácie

na druhú.

Transgénne živočíchy obsahujúce gén kódujúci liečivo sa môžu stať živými

bioreaktormi produkujúce proteíny záujmu. S cieľom urobiť takýto systém praktický musí

byť rekombinantná bielkovina ľahko získaná spôsobom ktorý by nemal poškodiť zviera alebo

proteín. Jednoduchým spôsobom ako toho dosiahnuť je zamerať produkciu proteínu na

mliečnu žľazu. Potom je k zisku proteínu nutné len podojenie zvieraťa.

Mliečna expresia môže byť dosiahnutá, spojením génu záujmu s regulačnou

sekvenciou obsahujúcou promotér, génu kódujúceho špecifické mliečne bielkoviny. Kozy

a ovce sa ukázali ako schopné hostiteľské systémy pretože vykazujú zaujímavé kombinácie

vlastností, ako napr.: vysoká produkčná kapacita mlieka, ľahká manipulácia a chov, spolu so

zavedenými technikami chovu.

Produkcia biofrmaceutík z transgénnych živočíchov má aj ďalšie výhody:

- jednoduché získanie surového produktu,

- dostupnosť vyvinutých systémov na dojenie, s dôrazom kladením na hygienu získaného

mlieka,

37

- nízke kapitálové investície (t.j. relatívne nízke náklady na chov v porovnaní

s fermentačnými zariadeniami) a nízke prevádzkové náklady,

- vysoké úrovne bielkovinovej expresie sú dosiahnuteľné. V mnohých prípadoch je úroveň

prejavu 1g bielkoviny na 1l mlieka. V jednom prípade bola dosiahnutá úroveň 60g na l, ktorá

sa v priebehu laktácie stabilizovala na 35g na l. Aj pri úrovni expresie 1g na l, jedna

transgénna ovca môže vyprodukovať podobné množstvo produktu za jeden deň aké by bolo

možné získať z 50-100 l v bioreaktore,

- pokračujúce dodávky produktu sú zaručené (kŕmením),

- mlieko je biochemicky dobre popísané, a fyzikálno-chemické vlastnosti hlavných natívnych

bielkovín rôznych druhov sú známe. To pomáha pri vývoji vhodných spracovateľských

procesoch.

Navzdory príťažlivosti tohto systému zostáva množstvo otázok ktoré je treba vyriešiť

pred širokým priemyselným použitím:

- premenlivosť úrovne výnosov. Aj keď je pri množstve prípadov úroveň produkcie

heterológneho proteinu 1g na l, v niektorých prípadoch je úroveň expresie len 1 mg na l,

- dĺžka doby medzi transgénnym embryom a začatím bežnej produkcie. Táto doba sa môže

pohybovať v rozmedzí od 1 mesiaca pri králikoch do 9 mesiacoch pri kravách. Transgénne

zvieratá musia dosiahnuť pohlavnú zrelosť.

Okrem mlieka, boli rekombinantné bielkoviny získané z rôznych tkanív a tekutín

získaných z transgénnych živočíchov. Protilátky a ďalšie bielkoviny boli produkované v krvi

transgénnych prasiat a králikov. Takýto spôsob produkcie je však nepravdepodobný. Omnoho

väčší prísľub predstavujú vajcia.

3.5.5 Hmyzie kultúry

Široká škála rekombinantných bielkovín bola získaná z hmyzích kultúr. Tento prístup

všeobecne predpokladá infekciu hmyzích bunkových kultúr, upraveným bakulovírusom

nesúci gén kódujúci požadovaný proteín, pod vplyvom silného vírusového promotéra.

38

Hmyz infikovaní bakulovírusom, ako produkčný systém má výhody:

- vysoká úroveň intracelulárneho rekombinantného proteínu. Použitím vírusových promotérov

ako sú promotéry odvodené od vírusového polyhedrinu alebo P10 gény, môžu zvýšiť úroveň

expresie rekombinantných bielkovín na 30-50% TIP,

-ľudské patogény vo všeobecnosti nenapadajú hmyz.

Nevýhody:

- cielená extracelulárna produkcia rekombinantného proteínu je na veľmi nízkej úrovni,

- posttranslačná úprava a spôsob glykolyzácie môžu byť nekompletné a/alebo sa môžu veľmi

významne líšiť od natívnych glykoproteinov.

3.6 Biologická bezpečnosť

Odkedy zvažovanie rizika hrá dôležitú úlohu v mienkotvornej politike, bola vyvíjaná

snaha navrhnúť prostriedky ktorými sa identifikujú, kontrolujú a prehodnocujú riziká

poľnohospodárskej biotechnológie. Paradigma hodnotenia ekologických rizík bola prvý krát

predstavená v Spojených štátoch Petersonom a Arntzenom v roku 2004. V tomto hodnotení

rizík bol posúdení a predložený rad neistôt a predpokladov.

Posúdenie rizík, rastlín produkujúcich farmaceutika musí byť preskúmané prípad od

prípadu, pretože rastliny použité k produkcií proteínov majú odlišné riziká. Mnoho rastlín

z ktorých získavame biofarmaceutiká otestujú našu schopnosť definovať nebezpečenstvo pre

životné prostredie. (Howard and Donnelly, 2004).

Napríklad, expresia bovínnych antigénov v zemiakoch na orálne užitie vo veterinárnej

medicíne bude mať výrazne iný súbor kritérií pre hodnotenie rizík, ako expresia protilátky

získanej z kukurici k potlačeniu Campylobacter jejuni u hydiny (Peterson and Arntzen, 2004;

Kirk et al., 2005).

Prekríženie geneticky modifikovaných rastlín s divými druhmi neohrozí len

v oblastiach genetických centier vzniku príbuzných druhov a poddruhov, ale aj v regiónoch

výskumných pracovísk, ktoré sústreďujú divé druhy príslušných plodín pre vzdialenú

39

hybridizáciu. Pri cudzoopelivých plodinách vzniká teda nebezpečenstvo prekríženia geneticky

modifikovaných odrôd rastlín s klasickými odrodami, čím vzniká problém pri uznávacom

konaní, aj prípadne pre pestovateľov na výrobnej ploche.

Je nanajvýš dôležité aby vedomosti získané z analýzy rizík, boli efektívne použité na

riešenie verejnej mienky. Nedostatok spoľahlivých informácií viedol v Európe k nízkej

verejnej akceptácii poľnohospodárskych biotechnológy (Peterson, 2000).

40

4. Záver

Rekombinantné farmaceutiká z rastlín sa postupom času stávajú realitou. Je

nepravdepodobné že by sa trend postupných úspechov produkcie a akceptácie zastavil.

Naopak, ako bolo viac krát spomínané v predchádzajúcich kapitolách, rastliny by sa mali

najmä z ekonomického hľadiska využívať čoraz častejšie. Na druhú stranu je výskum

a čistenie produktu finančne náročné.

Rastlinné systémy vykazujú veľa špecifických vlastností. Jednou z nich je možnosť

jedlej vakcinácie, napríklad v podobe banánov. Pri olejninách je možné využiť jednoduchý

fúzny systém na čistenie a pri obilninách je možné dlhodobejšie skladovanie.

Druhová produkcia sa výrazne líši svojimi vlastnosťami. Tabak, zemiaky a kukurica

sú najvyužívanejšie druhy z ktorých získané vakcíny, protilátky a ďalšie liečivá sú využívané

už aj v praxi.

Liečba rakoviny je finančne aj technicky náročná, navyše so silnými vedľajšími

účinkami. A tak sa rastliny začali využívať na produkciu protilátok a liečiv zameraných na

rakovinu. V tomto smere by sa dal vidieť najväčší potenciál rastlinnej produkcie farmaceutík

vôbec. Produkciou látok k prevencií HIV, môžu rastliny dopomôcť k zníženiu počtu úmrtí

spôsobených týmto vírusom a zabrániť jeho šíreniu.

Proces vedúci od tvorby transgénnej rastliny k uvedeniu produktu na trh je nielen

technicky a finančne náročný ale aj legislatívne z obáv o biologickú bezpečnosť. Pri

rastlinách ktoré sú pestované v skleníkoch, rastlinách samoopelivých alebo rastlinách

transformovaných pomocou chloroplastových manipulácií tento problém čiastočne odpadáva.

Hlavnými kritériami pre výber rastlín určených k produkcií farmaceutík tak sú:

schopnosť transformácie (pričom najstabilnejší spôsob -Agrobacteriom sprostredkovaná

transformácia- je, možná len u dvoj-klíčnolistových druhov), úroveň výnosu proteínu (spolu

s čistotou proteínu a posttranslačnými úpravami), lokalizácia proteínu

(intracelulárne/extracelulárne, v semenách/v rastline samotnej) a biologická bezpečnosť.

5. Zoznam použitej literatúry 41

ALLAN, D.G. 2005. Nimotuzumab: evidence of clinical benefit without rash.

Oncologist 10, 760–761.

ARCALIS, E. – MARCEL, S. – ALTMANN, F. – KOLARICH, D. – DRAKAKI, G.

FISCHER, R. – CHRISTOU, P. – STOQER, E. 2004. Unexpected deposition patterns of

recombinant proteins in post-endoplasmic reticulum compartments of wheat endosperm.

Plant Physiol. 136(3): 3457-3466.

ALDEMITA, R. R. – HODGES, T. K. 1996. Agrobacterium tumefaciens-mediated

transformation of indica and japonica rice varieties. Planta ;199:612–7.

ARTSAENKO, O. et al. 1998. Potato tubers as a biofactory for recombinant

antibodies. Mol. Breed. 4, 313–319.

BASARAN, P. - RODRÍGUEZ-CEREZO, E. 2008. Plant molecular farming:

opportunities and challenges.Crit Rev Biotechnol;28:153–72.

BRODZIK, R. et al. 2006. Plant-derived anti-Lewis Y mAb exhibits biological

activities for efficient immunotherapy against human cancer cells. Proc. Natl. Acad. Sci.

U. S. A. 103, 8804–8809.

BROOTHAERTS, W. - MITCHELL, H. J. - WEIR, B. - KALNES, S. - SMITH,

L.M.A. - YANG, W. - MAYER, J.E. - ROA-RODRIGUEZ, C. - JEFFERSON, R.A.

2005. Gene transfer to plants by diverse species of bacteria. Nature 433: 629633.

COMMANDEUR, U. – TWYMAN, R. M. – FISHER, R. 2003. The biosafety of

molecular farming in plant. Agric Biotechnol Net. 5: 110-111.

42

CROMBET, T. et al. 2004. Use of the humanized anti-epidermal growth factor

receptor monoclonal antibody h-R3 in combination with radiotherapy in the treatment of

locally advanced head and neck cancer patients. J. Clin. Oncol. 22, 1646–1654.

COCKING, E.C. A method for the isolation of plant protoplasts and vacuoles.

Nature

1960;187:927–9.

CHO, J.S. - HONG, S.M. - JOO, S.Y. - YOO, J.S. - KIM, D.I. 2007

Cryopreservation of transgenic rice suspension cells producing recombinant hCTLA4Ig,

Applied Microbiology and Biotechnology 73 s. 1470–1476.

CHRISTOU, P. 1997. Rice transformation: bombardment. Plant Mol. Biol. 35:

197–203.

CHONG, D.K.X. - LANRIGE, W.H.R. 2000. Expression of fulllength bioactive

antimicrobial human lactoferrin in potato plants. Transgenic Res. 9, 71–78.

CHONG, D.K.X. et al. 1997.. Expression of the human milk protein b-casein in

transgenic potato plants. Transgenic Res. 6, 289–296.

DANIELL, H. – CHEBOLU, S. - KUMAR, S. - SINGLETON, M. – FALCONER,

R. 2005. Chloroplast-derived vaccine antigens and other therapeutic proteins. Vaccine. 23:

1779-1783.

DANIELL, H. – STREATFIELD, S. J. – WYCOFF, K. 2001. Medical molecular

farming: production of antibodies, biopharmaceuticals and edible vaccines in plants.

Trends Plant Sci. 6: 219-226.

43

DROSSARD, J. - WILLIAMS, - KEEN, D. – PERRIN, Y. – CHRISTOU, P. –

FISCHER, R. 2000. Cereal crops as viable production and storage system for

pharmaceutical scFv antibodies. Plant Mole. Biol. 42(4): 583-590.

Dow AgroSciences. Dow AgroSciences achieves world's first registration for plant-

made vaccines. 2006 Press release (http://www.dowagro.com/animalhealth/resources/

news/20060131b.htm).

DAS, R.C. 2006. Antibody Therapeutics – Product Development, Market Trends,

and Strategic Issues, Revised Edition, D&MD Publications.

DENBOW, D.M. et al. 1998. Soybeans transformed with fungal phytase gene

improve phosphorus availability for broilers. Poult. Sci. 77, 878–881.

DAI, Z.Y. et al. 2000. Improved plant-based production of E1 endoglucanase using

potato: expression optimization and tissue targeting. Mol. Breed. 6, 277–285.

DOY, C. H. – GRESSHOFF, P.M. – ROLFE, B.G. 1973 Biological and molecular

evidence for the transgenosis of genes from bacteria to plant cells. Proc Natl Acad Sci

USA;70:723–6.

DAVEY, M. R. – COCKING, E. C. – FREEMAN, J. – PEARCE, N. – TUDOR, I.

1980. Transformation of petunia protoplasts by isolated Agrobacterium plasmids. Plant

Sci Lett; 18:307–13.

DANIELL, H. 1999. GM crops: public perception and scientific solutions. Trends

Plant Sci. 4(12): 467–469.

DANIELL, H. - DHINGRA, A. 2002. Multigene engineering: dawn of an exciting

new era in biotechnology. Curr. Opin. Biotechnol. 13: 1326–1341.

44

DANIELL, H. - KHAN, M.S. - ALLISON, L. 2002. Milestones in chloroplast

genetic engineering: an environmentally friendly era in biotechnology. Trends Plant Sci.

76: 84–91.

DANIELL, H. – STREATFIELD, S. J. – WYCOFF, K. 2001. Medical molecular

farming: production of antibodies, biopharmaceuticals and edible vaccines in plants.

Trends Plant Sci ;6:219–26.

DAHLEEN, L. S. – MANOHARAN, M. 2007. Recent advances in barley

transformation. Vitro Cell Dev Biol ;43:493–506.

DAI, Z.Y. et al., 2000. Improved plant-based production of E1 endoglucanase using

potato: expression optimization and tissue targeting. Mol. Breed. 6, 277–285.

DE WILDE, C. et al. 2002. Expression of antibodies and Fab fragments in transgenic

potato plants: a case study for bulk production in crop plants. Mol. Breed. 9, 2871–2882.

FILIPECKI, M. - MALEPSZY, S. 2006. Unintended consequences of plant

transformation: a molecular insight. J. Appl. Genet. 47(4): 277–286.

FERNANDEZ-SAN MILLAN, A. - MINGO-CASTEL, A. - MILLER, M. -

DANIELL, H. A. 2003. chloroplast transgenic approach to hyperexpress and purify

human serum albumin, a protein highly susceptible to proteolytic degradation. Plant

Biotechnol. 1, s. 77–79.

FOX, J.L. 2006. Turning plants into protein factories, In Nature Biotechnology 24

s. 1191–1193.

45

GUERRERO-ANDRADE, O. - LOZA-RUBIO, E. - OLIVERA-FLORES, T. -

FEHERVARI-BONE, T. - GOMEZ-LIM, M. A. 2006. Expression of the newcastle

disease virus fusion protein in transgenic maize and immunological studies. Transgenic

Res ;15:455–63.

GEERTS, P. – TOUSSAINT, A. – MERGEAI, G. – BAUDOIN, J. P. 2001. Culture

of very young Phaseolus vulgaris L. pods and plantlet regeneration. In: Sorvari, S, Karhu,

S, Kanervo, E, Pihakaski, S, editors. The 4th International Symposium on in vitro culture

and horticultural breeding, Tempere, Finland, vol. 560. Acta Hortic; p. 411–7.

GEERTS, P. – SASSI, K. – MERGEAI, G. – BAUDOIN, J.P. 2000. Development of

an in vitro pod culture technique for young pods of Phaseolus vulgaris L. In vitro Cell

Dev Biol Plant ;36:481–7.

GILES, K. L. 1983. Plant protoplasts. Int Rev Cytol Suppl New York: Academic

Press; 1983.

GELVIN, S.B. 2003. Improving plant genetic engineering by manipulating the host.

Trends Biotechnol. 21(3): 95–98.

GIDDINGS, G. 2001. Transgenic plants as protein factories. Curr. Opin. Biotechnol.

12, 450–454.

GAO, J.W. - LEE, J.M. - AN, G.H. 1991. The stability of foreign protein-production

in genetically modified plant-cells, Plant Cell Reports 10 533–536.

HOGUE, R.S. - LEE, J.M. 1990. Production of a foreign protein product with

geneticallymodified plant-cells, Enzyme and Microbial Technology 12 s. 533–538.

HANSEN, G. - WRIGHT, M.S. 1999. Recent advances in the transformation of

plants, Trends in Plant Science 4 226–231.

46

HORSCH, R.B. - FRY, J.E. - HOFFMANN, N.L. - EICHHOLTZ, D. - ROGERS,

S.G. - FRALEY, R.T. 1985. A simple and general-method for transferring genes into

plants, Science 227 1229–1231.

HOOD, E.E. – WITCHER, D.R. – MADDOCK, S. – MEYER, T. –

BASZCZYNSKI, C. – BAILEY, M. 1997. Commercial production of avidin from

transgenic maize: characterization of transformant, production, processing, extraction and

purification. Mol Breed;3:291–306.

HORN, M.E. – WOODARD, S.L. – HOWARD, J.A. 2004. Plant molecular farming:

systems and products. Plant Cell Rep;22:711–20.

HOOD, E.E. et al. 2002. Monoclonal antibody manufacturing in transgenic plants –

myths and realities. Curr. Opin. Biotechnol. 13, 630–635.

HOOD, E.E. 2004. Plants as enzyme factories. In Handbook of Plant Biotechnology

(Christou, P. and Klee, H., eds), Wiley-VCH (in press).

HOOD, E.E. et al. 2002. Monoclonal antibody manufacturing in transgenic plants –

myths and realities. Curr. Opin. Biotechnol. 13, 630–635.

HIEI, Y. – OHTA, S. – KOMARI, T. – KUMASHIRO, T. 1994. Efficient

transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence

analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant J a; 6:271–82.

HIEI, Y. – OHTA, S. – KOMARI, T. - KUMASHIRO. 1994. Transformation of rice

(Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the T-DNA. Plant

J ;6:271–82.

47

HAJDUKIEWICZ, P. – SVAB, Z. – MALIGA, P. 1994. The small versatile pPZP

family of Agrobacterium binary vector for plant transformation. Plant Mol Biol ;25:989–

94.

HOU, W.S. – GUO, S.D. – LU, M. 2003. Development of transgenic wheat with a

synthetical insecticidal crystal protein gene via pollentube pathway. Acta Agron

Sin ;29(6):806–9.

HOOD, E. E. – WITCHER, D. R. – MADDOCK, S. – MEYER, T. –

BASZCZYNSKI, C. – BAILEY, M. et al. 1997. Commercial production of avidin from

transgenic maize: characterization of transformant, production, processing, extraction and

purification. Mol Breed; 3:291–306.

HOOD, E. E. 2002. From green plants to industrial enzymes. Enzyme Microb

Technol ;30: 279–83.

HORVATH, H. – HUANG, J. – WONG, O. – KOHL, E. – OKITA, T. –

KANNANGARA, C. G. 2000. et al. The production of recombinant proteins in transgenic

barley grains. Proc Natl Acad Sci U S A ;97:1914–9.

ISHIDA, Y. – SAITO, H. – OHTA, S. – HIEI, Y. – KOMARI, T. – KUMASHIRO,

T. 1996. High efficiency transformation of maize (Zea mays L.) mediated by

Agrobacterium tumefaciens. Nat Biotechnol ;14: 745–50.

JERVIS, L. - PIERPOINT, W.S. 1989. Purification technologies for plant-proteins,

Journal of Biotechnology 11 161–198.

KUMARIA, R. – WAIE, B. – RAJAMM, V. 2001. Plant regeneration from

transformed embryogenic callus of an elite indica rice via Agrobacterium. Plant Cell

Tissue Organ Cult ;67:63–71.

48

KIM, T.G. – BAEK, M. – LEE, E. K. – KWON, T. H. – YANG, M. S. 2008.

Expression of human growth hormone in transgenic rice cell suspension culture. Plant

Cell Rep. 27(5): 885-891.

KUMAR, S. G. B. – GANAPATHI, T. R. – BAPAT, V. A. 2004. Edible

vaccines:current status and future prospects. Physiol Mov Biol Plants. 10: 37-47.

KUMAR, G.B. – GANAPATHI, T.R. – REVATHI, C.J. – SRINIVAS, L. – BAPAT,

V.A. 2005. Expression of hepatitis B surface antigen in transgenic banana plants. Planta.

222(3): 484-493.

KAISER, J. 2008. Is the drought over for pharming? Science;320:473–5.

KO, K. et al. 2005. Inhibition of tumor growth by plant-derived mAb. Proc. Natl.

Acad. Sci. U. S. A. 102, 7026–7030 .

KLEIN, T.M. - HARPER, E.C. - SVAB, Z. - SANFORD, J.C. - FROMM, M.E. -

MALIGA, P. 1988. Stable genetic transformation of intact Nicotiana cells by the particle

bombardment process, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United

States of America 85 8502–8505.

KORBAN, S. S. – KRASNYANSKI, S. F. – BUETOW, D. E. 2002. Foods as

production and delivery vehicles for human vaccines. J. Am. Coll. Nutr. 21 s. 212-217.

LIÉNARD, D. – SOURROUILLE, C. – GOMORD, V. FAYE, L. 2007. Pharming

and transgenic plants. Biotechnol Annu Rev;13:115–47.

LUDWIG, D.L. et al. 2004. Conservation of receptor antagonist antitumor activity

by epidermal growth factor receptor antibody expressed in transgenic corn seed. Hum.

Antibodies 13, 81–90.

49

LIU, Y., YANG, H., AND SAKANISHI, A. (2006). Ultrasound: mechanical gene

transfer into plant cells by sonoporation. Biotechnol. Adv. 24(1): 1–16.

LAMPHEAR, B. J. – STREATFIELD, S. J. – JILKA, J. M. – BROOKS, C.A. –

BARKER, D. K. – TURNER, D. D. et al. 2002. Delivery of subunit vaccines in maize

seed. J Control Release ;85:169–80.

LAMPHEAR, B. J. – JILKA, J. M. – KESL, L. – WELTER, M. – HOWARD, J. A.

– STREATFIELD, S. J. 2004. A corn-based delivery system for animal vaccines: an oral

transmissible gastroenteritis virus vaccine boosts lactogenic immunity in swine. Vaccine

;22:2420–4.

LIU, J. – SELINGER, B. – CHENG, K. – BEAUCHEMIN, K. – MOLONEY, M.

1997. Plant seed oil bodies as an immobilization matrix for a recombinant xylanase from

the rumen fungus Neocallimastix patriciarum. Mol Breed, 3:463-470.

LAMBE, P. - DINANT, M. - MATAGNE, R.F. 1995. Differential long-term

expression and methylation of the hygromycin phosphotransferase (Hph) and

betaglucuronidase (Gus) genes in transgenic pearl-millet (Pennisetum-Glaucum) callus,

Plant Science 108, s. 51–62.

MASON, H. S. – WARZENCHA, H. – MOR, T. – ARNTZE, N. C. J. 2002. Edible

plant vaccines: applications for prophylactic and therapeutic molecular medicine. Trends

Mole. Med. 8: 324-329.

MA, J.K. – DRAKE, P.M. – CHRISTOU, P. 2003. The production of recombinant

pharmaceuticals in plants. Nat Rev Genet; 4 s. 794–805.

MA, J.K. – HIKMAT, B.Y. – WYOFF, K. – VINE, N. D. – YU, L. et al. 1998.

Characterization of a recombinant plant monoclonal secretory antibody and preventive

immunotherapy in humans. Nat Med;4:601–6.

50

MCCORMICK, A.A. et al. 1999. Rapid production of specific vaccines for

lymphoma by expression of the tumor-derived single-chain Fv epitopes in tobacco plants.

Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 703–708.

MA, J.K.C. – BARROS, E. – BOCK, R. – CHRISTOU, P. – DALE, P.J. – DIX, P.J.

et al. 2005. Molecular farming for new drugs and vaccines — current perspectives on the

production of pharmaceuticals in transgenic plants. EMBO Rep;6:593–9.

MASON, H.S. et al. 2002. Edible plant vaccines: applications for prophylactic and

therapeutic molecular medicine. Trends Mol. Med. 8, 324–329.

MOHANTY, A. – SARMA, N. P. – TYAGI, A. K. 1999. Agrobacterium mediated

high frequency transformation of an elite indica rice variety pusa Basmati and

transmission of transgenesto R2 Progeny. Plant Sci;147:127–37.

MARTON, L. WULLEMS, G. J. – MOLENDIJK, L. – SCHILPEROORT, R. A.

1979. In vitro transformation of cultured cells from Nicotiana tabacum by Agrobacterium

tumefaciens. Nature, 277:129–31.

MALIGA, P. 2003. Progress towards commercialization of plastid transformation

technology. Trends Biotechnol. 21(1): 20–28.

MENASSA, R. – NGUYEN, V. – JEVNIKAR, A. – BRANDLE, J. 2001. A self-

contained system for the field production of plant recombinant interleukin-10. Mol

Breeding; 8:177–85.

MA, J. K. – DRAKE, P. M. – CHRISTOU, P. 2003. The production of recombinant

pharmaceuticals in plants. Nat Rev Genet; 4:794–805.

51

MCGARVEY, P.B. et al. 1995. Expression of the rabies virus glycoprotein in

transgenic tomatoes. Biotechnology (N.Y.) 13, 1484–1487.

MASON, H.S. et al. 2002. Edible plant vaccines: applications for prophylactic and

therapeutic molecular medicine. Trends Mol. Med. 8, 324–329.

NOCHI, T. – TAKAGI, H. – YUKI, Y. – YANG, L. – MASUMURA, T. –

MEJIMA, M. et al. 2007. Rice-based mucosal vaccine as a global strategy for cold-chain-

and needle-free vaccination. Proc Natl Acad Sci U S A ;104:10986–91.

OCHATT, S. J. - ABIRACHED-DARMENCY, M. – MARGET, P. – AUBERT, G.

2007. The Lathyrus Paradox: « poor men's diet » or a remarkable genetic resource for

protein legume breeding. In: OCHATT, SJ, JAIN, SM, editors. Breeding of neglected and

under-utilised crops, spices and herbs. Plymouth, UK: Science. p. 41–60.

OFFRINGA, R. - DE GROOT, M.J. - HAAGSMAN, H.J. - DOES, M.P. - VAN

DEN ELZEN, P.J. - HOOYKAAS, P.J. 1990. Extrachromosomal homologous

recombination and gene targeting in plant cells

afterAgrobacteriummediatedtransformation, The EMBO Journal 9 3077–3084.

PERRIN, Y. et al. 2000. Transgenic pea seeds as bioreactors for the production of a

single-chain Fv fragment (scFV) antibody used in cancer diagnosis and therapy. Mol.

Breed. 6, 345–352.

POWER, J. B. – CUMMINS, S.E. – COCKING, E.C. 1970. Fusion of isolated

protoplasts. Nature ;223:1016–8.

PASZKOWSKI, J. – SHILLITO, R. D. – SAUL, M. – MANDAK, V. – HOHN, T. –

HOHN, B. et al. 1984. Direct gene transfer to plants. EMBO J ;3:2717–22.

52

PHILIP, R. – DARNOWSKI, D. W. – MAUGHAN, P. J. – VODKIN, L. O. 2001.

Processing and localization of bovine b-casein expressed in transgenic soybean seeds

under control of a soybean lectin expression cassette. Plant Sci , 161:323-335.

PERRIN, Y. – VAQUERO, C. – GERRARD, I. – SACK, M. – DROSSARD, J. –

STOGER, E. – CHRISTOU, P. – FISCHER, R. 2000. Transgenic pea seeds as bioreactors

for the production of a single-chain Fv fragment (scFV) antibody used in cancer diagnosis

and therapy. Mol Breed , 6:345-352.

QIAN, B. – SHEN, H. – LIANG, W. – GUO, X. – ZHANG, C. – ZANG, Y. et al.

2008. Immunogenicity of recombinant hepatitis B virus surface antigen fused with preS1

epitopes expressed in rice seeds. Transgenic Res ;17:621–31.

RODRI´GUEZ, M. et al. 2005. Transient expression in tobacco leaves of an

aglycosylated recombinant antibody against the epidermal growth factor receptor.

Biotechnol. Bioeng. 89, 188–194.

RAMESSAR, K. – RADEMACHER, T. – SACK, M. – STADLMANN, J. –

PLATIS, D. – STIEGLER, G. et al. 2008. Cost-effective production of a vaginal protein

microbicide to prevent HIV transmission. Proc Natl Acad Sci U S A;105:3727–32.

RAKOCZY-TROJANOWSKA, M. 2002. Alternative methods of plant

transformation: a short review. Cell Mol. Biol. Lett. 7(3): 849–858.

RAWEL, H.M. - KROLL, J. - KULLING, S. 2007. Effect of non-protein

components on the degradability of proteins, Biotechnology Advances 25 611–613.

RAMESSAR, K. – CAPELL, T. – CHRISTOU, P. 2007. Molecular pharming in

cereal crops. Phytochem Rev; 7:579–92.

53

RAMESSAR, K. – SABALZA, M. – CAPELL, T. – CHRISTOU, P. 2008. Maize

plants: an ideal production platform for effective and safe molecular pharming. Plant Sci;

174:409–19.

RICHTER, L.J. et al. 2000. Production of hepatitis B surface antigen in Review

TRENDS in Biotechnology Vol.21 No.12 December 2003 577 (http://tibtec.trends.com)

transgenic plants for oral immunization. Nat. Biotechnol. 18, 1167–1171.

SIJMONS, P.C. - DEKKER, B.M.M. - SCHRAMMEIJER, B. - VERWOERD, T.C.

-VANDENELZEN, P.J.M. - HOEKEMA, A. 1990. Production of correctly processed

human serumalbumin in transgenic plants, Bio-Technology 8 s.217–221.

SPÖK, A. – TWYMAN, R. M. – FISCHER, R. – MA, J. K. C. – SPARROW, P. A.

C. 2008. Evolution of a regulatory framework for pharmaceuticals derived from

genetically modified plants. Trends Biotechnol;26:506–17.

STAUB, J. M. et al. 2006. High-yield production of a human therapeutic protein in

tobacco chloroplasts. In Nature Biotechnol. 18, s. 333–338.

SHARMA, K.K. - BHATNAGAR-MATHUR, P. - THORPE, T.A. 2005. Genetic

transformation technology: status and problems, In Vitro Cellular & Developmental

Biology-Plant 41 102–112.

SHRAWAT, A.K. - LORZ, H. 2006. Agrobacterium-mediated transformation of

cereals: a promising approach crossing barriers, Plant Biotechnology Journal 4 575–603.

SCHMALE, K. - RADEMACHER, T. - FISCHER, R. - HELLWIG, S. 2006.

Towards industrial usefulness – cryo-cell-banking of transgenic BY-2 cell cultures,

Journal of Biotechnology 124, s. 302–311.

54

SUN, S.S.M. 2008. Application of agricultural biotechnology to improve food

nutrition and healthcare products. Asia Pac J Clin Nutr;17(Suppl 1):87–90.

SPÖK, A. – TWYMAN, R.M. – FISCHER, R. - MA J. K. C. – SPARROW, P. A.

C.2008. Evolution of a regulatory framework for pharmaceuticals derived from

genetically modified plants. Trends Biotechnol;26:506–17.

SHATTOCK, R.J. – MOORE, J.P. 2003. Inhibiting sexual transmission of HIV-1

infection. Nat Rev Microbiol;1:25–34.

SCHILLBERG, S. et al. 2002. Antibody molecular farming in plants and plant cells.

Phytochem. Rev. 1, 45–54.

STOGER, E. et al. 2000. Cereal crops as viable production and storage systems for

pharmaceutical scFv antibodies. Plant Mol. Biol. 42, 583–590.

SONGSTAD, D. D. – SOMERS, D. A. – GRIESBACH, R. J. 1995. Advances in

alternative DNA delivery techniques. Plant Cell Tissue Organ Cult ;40:1-15.

SCHRYER, P.A. – LU, Q. – VANDENBERG, A. – Bett, K. E. 2005. Rapid

regeneration of Phaseolus angustissimus and Phaseolus vulgaris from very young zygotic

embryos. Plant Cell Tissue Organ Cult ;83(1):67–74.

STOGER, E. – VAQUERO, C. – TORRES, E. – SACK, M. – NICHOLSON, L. –

DROSSARD, J. et al. 2000. Cereal crops as viable production and storage systems for

pharmaceutical scFv antibodies. Plant Mol Biol; 42:583–90.

STREATFIELD, S. J. – LANE, J. R. – BROOKS, C. A. – BARKER, D. K. –

POAGE, M. L. – MAYOR, J. M. et al. 2003. Corn as a production system for human and

animal vaccines. Vaccine ;21:812–5.

55

SPÖK, A. 2007. Molecular farming on the rise—GMO regulators still walking a

tightrope. Trends Biotechnol ;25:74–82.

SCHUNMANN, P. H. D. – COIA, G. – WATERHOUSE, P. M. 2002. Biopharming

the SimpliRED™HIV diagnostic reagent in barley, potato and tobacco. Mol

Breed ;9:113–21.

SAALBACH, I. – GIERSBERG, M. – CONRAD, U. 2001. High-level expression of

a

single-chain Fv fragment (scFv) antibody in transgenic pea seeds. J Plant Physiol,

158:529-533.

SCHUNMANN, P.H.D. et al. 2002. Biopharming the SimpliREDe HIV diagnostic

reagent in barley, potato and tobacco. Mol. Breed. 9, 113–121.

STOGER, E. et al. 2002. Practical considerations for pharmaceutical antibody

production in different crop systems. Mol. Breed. 9, 149–158.

SALA, F. et al. 2003. Vaccine antigen production in transgenic plants: strategies,

gene constructs and perspectives. Vaccine 21, 803–808.

TWYMAN, R.M. et al. 2005. Transgenic plants in the biopharmaceutical market.

Expert Opin. Emerg. Drugs 10, 185–218.

TAKEBE, I. – LABIB, G. – MELCHERS, G. 1971. Regeneration of whole plants

from isolated mesophyll protoplasts of tobacco. Naturwiss ;58:318–20.

TACKET, C.O. et al. 1998. Immunogenicity in humans of a recombinant bacterial-

antigen delivered in transgenic potato. Nat.Med. 4, 607–609.

56

TACKET, C.O. et al. 2000. Human immune responses to a novel Norwalk virus

vaccine delivered in transgenic potatoes. J. Infect. Dis. 182, 302–305.

TOTH, et al., 2007. Biologická bezpečnosť, Nitra, ISBN 978-80-8069-846-1.

VANDERMAAS, H.M. - DEJONG, E.R. - RUEB, S. - HENSGENS, L.A.M. -

KRENS, F.A. 1994. Stable transformation and long-term expression of the gusa reporter

gene in callus lines of perennial ryegrass (Lolium-Perenne L), Plant Molecular Biology

24, 401–405.

VASIL, I.K. 1994. Molecular improvement of cereals. Plant Mol Biol; 25: 925–937

Vol 3, Number 4, Pages 169–173.

VASIL, I. K. – VASIL, V. 1992. Advances in cereal protoplast research. Physiol

Plant 85:279–83.

WOODARD, S.L. – MAYOR, J.M. – BAILEY, M.R. – BARKER, D.K. – LOVE,

R.T. LANE, J.R., et al. 2003 Maize-derived bovine trypsin: characterization of the first

large-scale, commercial product from transgenic plants. Biotechnol Appl

Biochem;38:123–30.

WALDRON, C. – MALCOLM, S.K. – MURPHY, E. B. – ROBERTS, J. L. 1985. A

method for high-frequency DNA mediated transformation of plant protoplasts. Plant Mol

Biol; 3(4):169–73.

WITCHER, D. R. – HOOD, E. E. – PETERSON, D. – BAILEY, M. – BOND, D. –

KUSNADI, A. 1998. et al. Commercial production of β-glucuronidase (GUS): a model

system for the production of proteins in plants. Mol Breed; 4:301–12.

WOODARD, S. L. – MAYOR, J. M. – BAILEY, M. R. – BARKER, D. K. – LOVE,

R. T. –LANE, J. R. et al. 2003. Maize-derived bovine trypsin: characterization of the first

57

large-scale, commercial product from transgenic plants. Biotechnol Appl Biochem;

38:123–30.

WU, J. – YU, L. – LI, L. – HU, J. – ZHOU, J. – ZHOU, X. 2007. Oral immunization

with transgenic rice seeds expressing VP2 protein of infectious bursal disease virus

induces protective immune responses in chickens. Plant Biotechnol J ;5:570–8.

XIE, T. – QIU, Q. – ZHANGW, - NING, T. - YANGW, - ZHENG, C. et al. 2008. A

biologically active rhIGF-1 fusion accumulated in transgenic rice seeds can reduce blood

glucose in diabetic mice via oral delivery. Peptides ;29:1862–70.

XUE, G. P. – PATEL, M. – JOHNSON, J. S. – SMYTH, D. J. – VICKERS, C. E.

2003. Selectable marker-free transgenic barley producing a high level of cellulase (1,4-

beta-glucanase) in developing grains. Plant Cell Rep ;21:1088–94.

YANG, L. – WAKASA, Y. – TAKAIWA, F. 2008. Biopharming to increase

bioactive peptides in rice seed. J AOAC Int ;91:957–64.

YANG, L. – TADA, Y. – YAMAMOTO, M. P. – ZHAO, H. – YOSHIKAWA, M. –

TAKAIWA, F. 2006. A transgenic rice seed accumulating an anti-hypertensive peptide

reduces the blood pressure of spontaneously hypertensive rats. FEBS Lett ;580:3315–20.

YU, J. and LANGRIDE, W. 2003. Expression of rotavirus capsid protein VP6 in

transgenic potato and its oral immunogenicity in mice. Transgenic Res. 12, 163–169.

ZIEGLER, M.T. et al. 2000. Accumulation of a thermostable endo-1,4-b-D-

glucanase in the apoplast of Arabidopsis thaliana leaves. Mol. Breed. 6, 37–46.

ZIEGELHOFFER, T. et al. 2001. Dramatic effects of truncation and sub-cellular

targeting on the accumulation of recombinant microbial cellulase in tobacco. Mol. Breed.

8, 147–158.

58

ZHU, Z. – SUN, B. – LIU, C. – XIAO, G. – LI, X. 1993. Transformation of wheat

protoplasts mediated by cationic liposome and regeneration of transgenic plantlets. Chin J

Biotechnol 9: 257–61.

ZHENG, S. J. – KHRUSTALEVA, L. – HENKEN, B. – SOFIARI, E. –

JACOBSEN, E. – KIK, C. et al. 2001. Agrobacterium tumefacien-mediated

transformation of Allium cepa L. the production of transgenic onion and shallots. Mol

Breed ;7:101–15.

ZHONG, G. Y. – PETERSON, D. – DELANEY, D. E. – BAILEY, M. – WITCHER,

D. R. et al. 1999. Commercial production of aprotinin in transgenic maize seeds. Mol

Breed; 5:345–56.

ZEITLIN, L. – OLMSTED, S. S. – MOENCH, T. R. – CO, M. S. – MARTINELL,

B. J. -

PARADKAR, V. M. – RUSSELL, D. R. – QUEEN, C. – CONE, R. A. – WHALEY,

K. J. 1998. A humanized monoclonal antibody produced in transgenic plants for

immunoprotection of the vagina against genital herpes. Nat Biotechnol, 16:1361-1364.

1.

59