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ベルケイド注射用 3 mg

CTD 第２部資料概要

2.6 非臨床試験の概要文及び概要表－薬理－

ヤンセンファーマ株式会社

ボルテゾミブ 2.6.2 薬理試験の概要文 3

目次

2.6 非臨床試験の概要文及び概要表

2.6.2 薬理試験の概要文 ............................................................................................... 7

2.6.2.1 まとめ ........................................................................................................... 7

2.6.2.2 効力を裏付ける試験.................................................................................... 11

2.6.2.3 副次的薬理試験 ........................................................................................... 33

2.6.2.4 安全性薬理試験 ........................................................................................... 34

2.6.2.5 薬力学的薬物相互作用 ................................................................................ 45

2.6.2.6 考察及び結論 .............................................................................................. 50

2.6.2.7 図表 ............................................................................................................. 54

2.6.2.8 参考文献...................................................................................................... 55

2.6.3 薬理試験概要表................................................................................................... 1


略号一覧表

PS-341

JNJ-26866138

{(1R)-3-Methyl-1-[(2S)-3-phenyl

-2-(pyrazine-2-carboxamido)

propanamido]butyl} boronic acidN

O

N

N

H

N

O

BOH

H

CH3

OH

H3C

H

H

19S

20S

26S 19S 20S

5-FU 5-

AMC

BMSCs

CFU-E

CFU-GM

CNS

CPT-11

DBP

Dox 40

ECG

GI50 50%

GLP

GT-1

HEK293

hERG ether-à-go-go

HPP-CFC

Hs Sultan

HT-29

IC50 50%

IL-6 -6

IM-9

KD

Kiapp

kobs/[I] 2

koff

kon


LOVO

LR5

MIA-PaCa-2

MM

MM.1R

MM.1S

MR 20

MRP

MTD

Na2

NCI

NF-κB L

NT-2

P-gp P-

PNS

PSI

RPMI 8226

SBP

t1/2

TK

TNFα α

U266

UPP


2.6.2 薬理試験の概要文

2.6.2.1 まとめ

in vitro in vivo

GLP

In vitro試験

(Kiapp=0.62 nmol/L)

1500

NF-κB

IκBα

NCI

60,000

1)

MM 2.5 30 nmol/L 50%

GI50

sub-G0/G1 3

24

BMSCs

BMSCs BMSCs

IL-6 BMSCs IL-6

3.0 40 nmol/L GI50 P- P-gp

MRP 3 MRP5


MM.1

RPMI8226 MM.1

P-gp MRP3 MRP4 MRP5

In vitro RPMI8226

M MM

M MM2,3)

M

M

F J 2 3 4

>99%

>98

KD F J

1%

In vivo試験

in vivo

in vivo

副次的薬理試験

proteinase K PrPSc

NT-2 N2a GT-1

NT-2 N2a GT-1 PrPSc


安全性薬理試験

Sprague-Dawley Irwin

0.10 0.25 mg/kg 0.25 mg/kg

0.065 mg/kg ECG ECG

0.2 mg/kg

QTc ECG

ECG

BALB/c

37

Sprague-Dawley

薬力学的薬物相互作用

In vitro

In vivo

5- 5-FU

CPT-11


in vivo


2.6.2.2 効力を裏付ける試験

(1) 作用機序

UPP

UPP

C

2.6.2-1 26S

図 2.6.2-1 ユビキチン－プロテアソーム系

26S 20S 19S

2.6.2-2

図 2.6.2-2 プロテアソームの構造

20S

1 2 5 3

C

2 54

6

7

3

Chymo-tryptic

Tryptic

Post-glutamyl

1

α β

19S

20S

26S


20S

20S 20S

19S 19S lid base

lid base 20S

20S

19S 26S

UPP NF-κB

UPP NF-κB

4)

NF-κB IκBα

IκBα 26S

5,6) 2.6.2-3

図 2.6.2-3 ボルテゾミブの作用機序

NF-κB IκBα

IκBα

IκBαNF-κB

NF-κB

IκBα

NF-κB

NF-κB

IκBα

2 54

6

7

3

Chymo-tryptic

Tryptic

Post- glutamyl

1


5 N-

47~9)

2.6.2-4

IκBα NF-κB

図 2.6.2-4 ボルテゾミブとキモトリプシン様活性中心の結合

1) ボルテゾミブのin vitro酵素活性阻害作用

4.2.1.1.1

20S in vitro

20S Kiapp 0.62 nmol/L

20S

Kiapp 970 nmol/L 20S 1500

2.6.2-1

表 2.6.2-1 ボルテゾミブのin vitro酵素活性阻害作用

Kiapp (nmol/L)

20S Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC 0.62

Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC 970

Bz-Val-Gly-Arg-AMC >10,000

B Z-Arg-Arg-AMC >10,000

MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-AMC 5,700

I Suc-Leu-Tyr-AMC >10,000

II Suc-Leu-Tyr-AMC >10,000

N-(3[2-Furyl]acryloyl)-Phe-Gly-Gly-OH 4,900

Bz-Phe-Val-Arg-AMC >10,000

Z-Lys-Phe-Arg-pNA >10,000

D-Ile-Pro-Arg-pNA >10,000

Ac-Phe-Gly-pNA >10,000


2) ボルテゾミブのプロテアソーム活性阻害作用の可逆性

4.2.1.1.2

Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC in

vitro

20S 37 1 20S

>95% 20S

500 37 20S

20S off

500 2.6.2-5

20S

koff 5.9×10-4

/ t1/2=19.4

図 2.6.2-5 ボルテゾミブのin vitro酵素活性阻害作用の可逆性

－20Sプロテアソームとの解離－

3) 受容体及び酵素に対するボルテゾミブの作用

4.2.1.1.3

in vitro

10 µmol/L

B4 µ 22% 2.6.2-2

2.6.2-3

Koff : 5.9×10-4

s-1

t1/2 : 19.4 min


表 2.6.2-2 各種受容体結合能に対するボルテゾミブ（10 µmol/L）の作用

% % %

AT1 -17 (CNS) 5 D1 -3

B2 -18 NMDA 12 D2A 8

A -5 -11 -8

B -6 PAF 15 GABAA 2

D3 6 5-HT1A 12 15

D4.2 7 5-HT3 -6 -3

ETA 6 1 -7 ( ) -25

ETB -2 -2 -14 3

-12 A2 -1 9

H1 -10 TRH -2 -10

H3 -19 VIP 1 µ µ 22

-4 A1 -2 -13

B4 22 A2A 18 [IK(ATP)] 7

M1 5 - 1 -12 -12

M2 -1 - 2 -10 5-HT1 7

M3 0 - 1 -10 5-HT2 15

M4 -13 - 2 -13 -6

NK1 1 (L) -2 4

Y2 -2 9

表 2.6.2-3 各種酵素活性に対するボルテゾミブ（10 µmol/L）の作用

% % %

2NO

( )-14 C 24 a)

-17 NO

( )-2

EGF -24 C 20 a)

a) 100 µmol/L

4) 多発性骨髄腫細胞におけるボルテゾミブのIκBα分解及びNF-κB活性化に対する作用

4.2.1.1.4

IκBα NF-κB

5 µmol/L MM.1 MM.1S 2 TNFα

5 ng/mL 10, 15 30 IκBα Western blot NF-κB

EMSA electrophoretic mobility shift analysis

MM.1S TNFα IκBα NF-κB

MM.1S TNFα IκBα NF-κB

2.6.2-6


図 2.6.2-6 骨髄腫細胞におけるIκBα分解及びNF-κB活性化に対するボルテゾミブ（5 µmol/L）の作用

(2) In vitro試験

National Cancer Institute NCI in

vitro Cancer Screen1)

50% GI50 7 nmol/L

60,000

1) 骨髄腫細胞に対するボルテゾミブのin vitro抗腫瘍活性

4.2.1.1.4

MTT in vitro

U266 IM-9 Hs Sultan RPMI8226

GI50 3, 6, 20 30 nmol/L 2.6.2-4

4 GI50

3.5, 5, 30 2.5 nmol/L 2.6.2-5

表 2.6.2-4 骨髄腫及びリンパ腫細胞株に対するボルテゾミブの増殖抑制作用

GI50 nmol/L

U266 3

IM-9 6

Hs Sultan 20

RPMI8226 30

DMSO ボルテゾミブボルテゾミブ

p65：抗NF-kB抗体

TNF stimulation (min) TNF stimulation (min)

DMSOp65 Ab DMSO

NF-kB

IkB

0 10 15 30 0 10 15 300 10 15 30 0 10 15 30 0 10 15 30

-tubulinp65 supershift


表 2.6.2-5 多発性骨髄腫患者由来細胞に対するボルテゾミブの増殖抑制作用

GI50 nmol/L

MM1 3.5

MM2 5

MM3 30

MM4 2.5

2) 骨髄腫細胞におけるボルテゾミブのアポトーシス誘導作用

4.2.1.1.4

U266

RPMI8226 Pat MM

① アポトーシス誘導作用

U266 Pat MM 10 nmol/L 0, 4, 6, 8, 12 16

sub-G0/G1 U266 10 nmol/L 0, 8, 16

24 U266 3 p32 3 p17

Western blot

U266 Pat MM sub-G0/G1 2.6.2-6

U266 3

2.6.2-7

表 2.6.2-6 骨髄腫細胞株（U266）及び患者由来骨髄腫細胞（Pat MM）の

細胞周期に及ぼすボルテゾミブ（10 nmol/L）の影響

sub-G0/G1 %

0 h 4 h 6 h 8 h 12 h 16 h

U266 2.9 4.1 10.6 25.2 70.4 86.5

Pat MM 14.7 19.3 19.7 20.5 48.8 49.1

図 2.6.2-7 骨髄腫細胞株（U266）におけるボルテゾミブのカスパーゼ活性化作用

ボルテゾミブ（10 nmol/L）

Caspase3

p32

p17

0 h

8 h

16 h

24 h


② アポトーシス誘導作用の可逆性

10 nmol/L RPMI8226 0, 2, 4, 6,

8, 12 24 24 sub-G0/G1

RPMI8226 24

sub-G0/G1

6 24 50%

2.6.2-8

図 2.6.2-8 ボルテゾミブ（10 nmol/L）処理後の骨髄腫細胞株（RPMI8226）の生存率及び

細胞周期に及ぼす影響

3) ボルテゾミブの腫瘍周囲微小環境に及ぼす影響

4.2.1.1.4

BMSCs IL-6

MM.1S 1.25 2.5 nmol/L 12

Na251

CrO4 MM.1S BMSCs 96 1

BMSCs MM.1S BMSCs MM.1S

10 100 nmol/L 48 IL-6

MM.1S DMSO 1.25 2.5 nmol/L MM.1S BMSCs

2.6.2-9

BMSCs IL-6 MM.1S 3 BMSCs IL-6

100 nmol/L MM.1S BMSCs IL-6 BMSCs

0 h

4.5% 18.3% 45.3%

79.5% 80.7% 90.8%

2 h 4 h

8 h6 h 12 h

% sub-G0/G1

RP

MI8

22

6 c

ells

0 h

2 h

4 h

6 h

8 h

12 h

24 h


IL-6 2.6.2-9

BMSCs BMSCs IL-6

図 2.6.2-9 骨髄腫細胞と骨髄ストローマ細胞の相互作用に及ぼすボルテゾミブの影響

4) 化学療法剤耐性骨髄腫細胞に対するボルテゾミブの作用

4.2.1.1.4

MTT in

vitro

RPMI8226 Dox40 RPMI8226 MR20

RPMI8226 LR5 20 40

nmol/L GI50 MM.1 MM.1S

MM.1 MM.1R 1.5 3 nmol/L GI50 2.6.2-7

表 2.6.2-7 化学療法剤耐性骨髄腫細胞株に対するボルテゾミブの作用

GI50 nmol/L

RPMI8226 30

Dox40 40

MR20 20

LR5 20

MM.1S 1.5

MM.1R 3


5) 多剤耐性細胞に対するボルテゾミブの作用

4.2.1.1.5

multi-drug resistance-associated protein MRP

P- P-glycoprotein P-gp MRP3 MRP5

vector 2.6.2-8

表 2.6.2-8 多剤耐性関連蛋白質発現細胞

Vector

Control Hela Vector pREV-TRE

P-gp Hela Clone 28 MDR1/pREV-TRE P-gp

MRP3 Hela Clone 12 MRP3/pREV-TRE MRP3

MRP3 Hela Clone 15 MRP3/pREV-TRE MRP3

Control Hek293 Vector pIRESneo

MRP5 Hek293 Clone 7 MRP5/pIRESneo MRP5

MRP5 Hek293 Clone 36 MRP5/pIRESneo MRP5

P-gp Clone28 P-gp Clone28 GI50

3.75 nmol/L P-gp Clone28

P-gp 2.6.2-9

MRP3 Clone12 15 GI50 3.75 nmol/L MRP3

Clone12 15 1.88 nmol/L MRP3

Clone12 2.6.2-10

MRP5 Hek293 Vector GI50 0.0037 µmol/L MRP5

Clone7 36 0.00047 0.00094 µmol/L ,

, , C, , 5- 5-FU ,6-

Clone7 36 2.6.2-11

P-gp HeLa Clone28 MRP3 HeLa Clone12

15 MRP5 Hek293 Clone7 36 P-gp MRP3

MRP5


表 2.6.2-9 ボルテゾミブの細胞増殖抑制作用に対するP-gpの影響

GI50 nmol/L

VectorVector

induceda Clone28 Clone28

induced a

1.88 1.88 3.75 3.75

310 310 310 ~10000

2500 2500 2500 ~20000

630 630 1250 1250 a

表 2.6.2-10 ボルテゾミブの細胞増殖抑制作用に対するMRP3の影響

GI50 nmol/L

VectorVector

induced a Clone12

Clone12

induced a Clone15

Clone15

induced a

3.75 3.75 3.75 1.88 3.75 1.88

500 500 500 5000 Not done Not done

27 27 33 88 Not done Not done a

表 2.6.2-11 ボルテゾミブの細胞増殖抑制作用に対するMRP5の影響

GI50 µmol/L

Vector Clone7 Clone36

0.0037 0.00047 0.00094

2.5 5.5 5.5

0.63 2.5 1.25

0.00097 0.0078 Not done

C 2300 9360 18700

25 200 Not done

5-FU 2.4 4.8 Not done

6- 71 1300 1280

0.009 0.009 Not done

2.5 40 44

0.00975 0.00217 0.00217

0.00234 0.00234 Not done

51 32 38


6) 骨髄腫細胞株のボルテゾミブに対する耐性の獲得とその特性

4.2.1.1.6

2 RPMI8226 MM.1

① RPMI8226

RPMI8226 5.4 0.5 nmol/L RPMI8226 2

RPMI8226 RPMI8226

RPMI8226 GI50 P6 0.03 µmol/L

RPMI8226 R14 50 µmol/L RPMI8226

MG-132

proteasome-specific inhibitor PSI Epoxomicin GI50

2.6.2-12 RPMI8226

IC50 30 nmol/L

表 2.6.2-12 RPMI8226親株及び耐性株に対するボルテゾミブの細胞増殖抑制作用

GI50 µmol/L

P6 R14

0.03 50

1 1

MG-132 4 4

PSI 2 8

Epoxomicin 0.1 0.12

0.12 0.13

BALB/c in vivo

2.6.2.2 3 1 8 106

BALB/c

0.3 0.6 1.0 mg/kg 500 mm3

2

37 2

2.6.2-11

RPMI8226 in vitro

in vivo


RPMI8226 in vitro

② MM.1

MM.1 IL-6 0.5 nmol/L MM.1 2

MM.1 MM.1

P-gp MRP3 MRP4 MRP5

MM.1 GI50 0.01 µmol/L MM.1

>100 µmol/L MM.1 IL-6

PSI Epoxomicin

2.6.2-13 MM.1

IC50 5 10 nmol/L

P-gp MRP3 MRP4 MRP5

表 2.6.2-13 MM.1親株及び耐性株に対するボルテゾミブの細胞増殖抑制作用

GI50 µmol/L

0.01 >100

2 >100

PSI 32 >100

Epoxomicin 0.05 >100

10 >100

7) Mタンパク産生に対するボルテゾミブの作用

4.2.1.1.7

M

1 10 nmol/L MM.1S 0 16 24 32 40 48

M -L Western blot MM.1S

Poly ADP-ribose polymerase PARP

Western blot

MM.1S M Western blot 1 10

nmol/L MM.1S M M

1 nmol/L MM.1S PARP

10 nmol/L MM.1S PARP

2.6.2 24

10 nmol/L M

2.6.2-10

2.6.2-10 M PARP

(3) In vivo

1)

4.2.1.1.6, 4.2.1.1.8

RPMI8226

8 106

RPMI8226 P6 R14 BALB/c

0.3 0.6 1.0 mg/kg 500 mm3

2 2 37

2.6.2-11

2.6.2-11 RPMI8226

M PARP

1 nmol/L 10 nmol/L 1 nmol/L 10 nmol/L

Hours: 16 24 32 40 48 0 16 24 32 40 48 Hours:

anti-Lambda light chain

anti-Actin anti-Actin

anti-PARP

0 16 24 32 40 48 0 16 24 32 40 48

Uncleaved PARP

Cleaved PARP

Vehicle 0.3 mg/kg0.6 mg/kg1.0 mg/kg

Vehicle 0.3 mg/kg0.6 mg/kg1.0 mg/kg

n=15 n=15

P6 R14


RPMI8226

20S

3 107

RPMI8226 BNX beige-nude-xid

0.05, 0.1, 0.5 1.0 mg/kg 4

2 1

1 20S

0.05 0.1 mg/kg 0.5 1.0 mg/kg

0.05 0.1 mg/kg

2.6.2-12

2.6.2-13 0.5 1.0 mg/kg

p<0.05 2.6.2-12

p<0.01 2.6.2-13

20S

2.6.2-14 2.6.2-15

図 2.6.2-12 RPMI8226骨髄腫細胞移植マウスにおける腫瘍増殖に及ぼすボルテゾミブの影響

図 2.6.2-13 RPMI8226骨髄腫細胞移植マウスにおける生存日数に及ぼすボルテゾミブの影響

対照 (n=13)

ボルテゾミブ 0.5mg/kg (n=14)


対照 (n=13)

ボルテゾミブ 0.05 mg/kg (n=13)


対照 (n=13)



対照 (n=13)



Mean S.E.Mean S.E.


図 2.6.2-14 ボルテゾミブのRPMI8226骨髄

腫細胞移植マウスにおける骨髄腫細胞中20S

プロテアソーム活性阻害率

図 2.6.2-15 RPMI8226骨髄腫細胞移植マウス

における腫瘍中の血管新生に及ぼすボルテゾ

ミブの影響

2) Lewis肺がんモデルに対するボルテゾミブの作用

4.2.1.1.9, 4.2.1.1.10

Lewis

1 106

Lewis C57BL/6

0.3 0.6 1.0 mg/kg 4 2 2

20S

0.6 mg/kg 2.6.2-16

1.0 mg/kg 2.6.2-14

1.0 mg/kg MTD 2.6.6.3

1 20S

20S

2.6.2-17

0.05 0.5 1.00.1

ボルテゾミブ (mg/kg, mean+S.E.)

Mean

ves

sel

co

un

t/H

PF

20S比活性

(% c

ontr

ol in

hib

itio

n)

ボルテゾミブ (mg/kg, mean±S.E.)

0.5 1.0

対照


図 2.6.2-16 Lewis肺がん移植マウスにおける腫瘍体積に対する

ボルテゾミブの週2回静脈内投与の作用

表 2.6.2-14 Lewis肺がん移植マウスにボルテゾミブを週2回静脈内投与したときの生存率

mg/kg %

30 25 83

0.3 30 25 83

0.6 30 22 73

1.0 34 20 59

図 2.6.2-17 Lewis肺がん移植マウスにおけるボルテゾミブ静脈内投与1時間後の

血液、腫瘍組織及び肝臓中20Sプロテアソーム比活性

Lewis C57BL/6

0.1 0.3 1.0 mg/kg 7 16 1 4 18 2

A:血液

溶媒 0.3 0.6 1.0

3

2.5

2

1.5

1

0.5

0

20S比活性

(pm

ol A

MC

/ 秒/m

g蛋白質

)

ボルテゾミブ (mg/kg) ボルテゾミブ (mg/kg)

B: 腫瘍組織 50

40

30

20

10

0

溶媒 0.3 0.6 1.0

C: 肝臓 30

25

20

15

10

5

0

溶媒 0.3 0.6 1.0

ボルテゾミブ (mg/kg)

ボルテゾミブ投与

腫瘍体積（

mm

3）

Mean S.E.


0.1 1.0 mg/kg 1

2.6.2-15 2.6.2-18 0.1 1.0 mg/kg

2.6.2-18

0.1 1.0 mg/kg 2

2.6.2-15 2.6.2-19 1.0 mg/kg

2.6.2-19

表 2.6.2-15 Lewis肺がん細胞移植マウスにおける腫瘍増殖に対する

ボルテゾミブの作用

1000 mm3

mg/kg 1 2

10 9 10.5

0.1 10 10 11.5

0.3 10 10.5 12.5

1.0 10 12.5 18

図 2.6.2-18 ボルテゾミブ週1回投与によるLewis肺がん細胞移植マウスの

腫瘍体積及び体重に及ぼす影響（n=10）

図 2.6.2-19 ボルテゾミブ週2回投与によるLewis肺がん細胞移植マウスの

腫瘍体積及び体重に及ぼす影響（n=10）

*Represents p<0.05 with respect to vehicle-treated group




3) ヒト結腸がんHT-29モデルに対するボルテゾミブの作用

4.2.1.1.11

HT-29

5 106

HT-29

0.03 0.1 0.3 mg/kg HT-29 4 45 18 45 5

500 1000 mm3

DMSO

HT-29 4 18

500 1000 mm3

4 18

2.6.2-16

表 2.6.2-16 HT-29結腸腫瘍細胞移植マウスにおける腫瘍の増殖に対するボルテゾミブの作用

500 1,000 mm3 mean S.E.

4 18mg/kg

500 mm3 1,000 mm3 500 mm3 1,000 mm3

9 24.8 4.6 31.8 3.2 24.8 4.6 31.8 3.2

10 24.2 1.9 33.0 3.0 N.A. N.A.

0.03 10 23.8 0.8 32.7 1.3 24.4 1.6 31.6 2.2

0.1 10 26.8 3.4 36.1 3.0 23.0 3.3 33.7 3.3

0.3 10 31.8 4.8 40.3 4.0 25.7 4.0 35.6 4.2

N.A.

(4) 造血幹細胞機能に対するボルテゾミブの作用

4.2.1.1.12

0.6 0.8 mg/kg 1 4 8 11 10 1

4 3 B6.SJL

4 24 2 3 12

18 CFU-E

CFU-GM HPP-CFC, high proliferative

potential-colony forming cells 4

24 1 106

10.5 Gy X C57BL/6

63 3


CFU-E CFU-GM HPP-CFC

2.6.2-20

2.6.2-21 0.6 0.8 mg/kg

2.6.2-21

図 2.6.2-20 造血前駆細胞に及ぼす

ボルテゾミブの影響

CFU-GM

1 2 3

saline

1 2 3

ボルテゾミブ0.6 mg/kg

1 2 3


HPP-CFC

1 2 3

saline

1 2 3


1 2 3


CFU-E

1 2 3

saline

1 2 3


1 2 3



図 2.6.2-21 ボルテゾミブ投与マウスの骨髄細胞を移植したレシピエントマウスにおける末梢血球数

Saline Group 1 Saline Group 2

Saline Group 3

0.6 mg/kgGroup 10.6 mg/kgGroup 2 0.6 mg/kgGroup 3

Low Normal

Pre 12 24 36 48 60

Time after transplant (d)


Saline Group 3

0.8 mg/kgGroup 1 0.8 mg/kgGroup 2 0.8 mg/kgGroup 3

Low Normal

Pre 12 24 36 48 60


PLT

Pre 12 24 36 48 60


Pre 12 24 36 48 60



Saline Group 3


Low Normal

High Normal

Saline Group 1Saline Group 2

Saline Group 3


Low Normal

High Normal

WBC

RBC

Pre 12 24 36 48 60


Pre 12 24 36 48 60



Saline Group 3


Low Normal

High Normal

Saline Group 1Saline Group 2

Saline Group 3


Low Normal

High Normal


20S 2 kobs/[I]

kon koff KD=koff/kon

F J kobs/[I] 3 4

K A

2.6.2-17 F J KD 0.23 0.18 nmol/L

KD 0.69 nmol/L 3 4

2.6.2-18

>99%

>98 20S

20S 2.6.2-18

表 2.6.2-18 ボルテゾミブ，高純度ボルテゾミブ並びに類縁物質F及び

類縁物質Jのプロテアソーム活性阻害

KDa)

nmol/L

kon

nmol/L -1 s-1

koff

s-1

0.69 (2.61 0.15) 10-4 (1.81 0.67) 10-4

0.74 (2.65 0.16) 10-4 (1.95 0.91) 10-4

F 0.23 (5.31 0.15) 10-4 (1.20 0.39) 10-4

J 0.18 (8.08 0.22) 10-4 (1.49 0.41) 10-4

a) KD=koff/kon

2.6.2.3 副次的薬理試験

(1) 神経細胞株におけるプリオン蛋白質に及ぼすボルテゾミブの影響

4.2.1.2.1

proteinase K PrPSc

NT-2 N2a GT-1

10 100 nmol/L 16

Western blot

AUST 00/01

NT-2 PrPC

PrPSc

NT-2 PrPC

PrPSc

2.6.2-22 NT-2

10 100 nmol/L 83.8 96.8 % 2.6.2-19

PrPC

PrPSc


N2a

PrPC

PrPSc

PrPC

PrPSc

2.6.2-22 GT-1

PrPSc

図 2.6.2-22 神経芽細胞腫におけるプリオン蛋白質に及ぼすボルテゾミブの影響

表 2.6.2-19 ヒト神経芽細胞腫NT-2におけるボルテゾミブのプロテアソーム活性阻害作用

nmol/L %

0 0

10 83.8

100 96.8

10000 97.0

2.6.2.4 安全性薬理試験

GLP GLP

(1) 中枢神経系に関する試験（GLP）

4.2.1.3.1

Sprague-Dawley Irwin

0.10 0.25 mg/kg ( 0.6 1.5 mg/m2) 5

7

2.5 mg/mL

2.6.2-20

NT-2 N2aP

lac

eb

o

Pla

ce

bo

+P

rotK

ボルテゾミブ

1

0 n

mo

l/L

ボルテゾミブ

1

0 n

mo

l/L

+P

rotK

ボルテゾミブ

1

00

nm

ol/

L

ボルテゾミブ

1

00

nm

ol/

L+

Pro

tK

ボルテゾミブ

1

0 n

mo

l/L

ボルテゾミブ

1

0 n

mo

l/L

+P

rotK

Pla

ceb

o

Pla

ce

bo

+P

rotK

ボルテゾミブ

1

00

nm

ol/

L

ボルテゾミブ

1

00

nm

ol/

L+

Pro

tK

mo

us

e b

rain

PrPc

PrPSc

PrPc

PrPSc

AU

ST

00

/01

AU

ST

00

/01+

Pro

tK

CJD(+)

brain

148

3650

8496

2216

6

4

Mr

(kDa)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

148

3650

8496

221664


0.10 0.25 mg/kg 0.10 mg/kg

3 3/5 0.25 mg/kg 3 6 5/5 3/5

0.25 mg/kg 6 0.10

0.25 mg/kg

7

7

表 2.6.2-20 Irwin変法によるラット症状観察（n=5）

(mg/kg) -1 d -2 h 0.5 h 1 h 3 h 6 h 24 h 7 d

( ) 0 0/5 1/5 1/5 1/5 2/5 1/5 0/5 1/5

( / ) 0.10 0/5 1/5 2/5 0/5 3/5 2/5 2/5 1/5

0.25 1/5 2/5 2/5 2/5 5/5 3/5 1/5 2/5

( mean S.E.) 037.8

0.1

38.0

0.2

38.1

0.2

37.9

0.2

37.6

0.2

37.4

0.2

37.7

0.2

37.9

0.2

0.10 37.3

0.2

37.4

0.2

37.6

0.2

37.7

0.1

37.3

0.2

37.3

0.1

37.3

0.1

37.5

0.2

0.25 37.3

0.3

37.7

0.2

37.6

0.2

37.8

0.2

37.1

0.1

36.9

0.1

37.5

0.2

37.1

0.2

(2) 心血管系に関する試験

1) テレメータ装着・無麻酔ビーグル犬におけるボルテゾミブの心血管作用（GLP）

4.2.1.3.2

0.065 0.2 mg/kg 1.3 4 mg/m2 4

30 5 1, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 24 (SBP)

(DBP) (HR) II ECG RR PR QRS

QT QTcF Fridericia QTcB Bazett

2

HR II ECG 4

2 0.065 0.2 mg/kg 7 30 1 2 4 8

24 48 72 0.2 mg/kg 26

48 72

0.065 mg/kg SBP DBP HR ECG ECG

0.2 mg/kg 4 18 SBP

DBP HR 6 20

HR RR 6 24 PR QT

QRS QTcF QTcB

2.6.2-23 0.2 mg/kg 2


ECG

P T ST 2

ECG

図 2.6.2-23 テレメータ装着・無麻酔ビーグル犬における心血管系に及ぼすボルテゾミブの影響

0.2 mL/kg i.v.0.2 mg/kg i.v.


Mean S.E., n=2 4 Mean S.E., n=2 4






Mean S.E., n=2 4*:p<0.05 vs paired t-test

Mean S.E., n=2 4








0.065 mg/kg

0.2 mg/kg

0.065 mg/kg 0.2 mg/kg

0.065 0.2 mg/kg 0 C0 31.0

284 ng/mL AUC(0 24)

2) カニクイザルにおけるボルテゾミブの心血管作用

4.2.1.3.3, 4.2.1.3.4, 4.2.1.3.5

GLP

1 / 0.2 0.3 mg/kg

0.3 mg/kg 0.2 mg/kg

0.2 mg/kg 32

0.2 mg/kg 0.3 mg/kg

HR

1 / 0.1 0.2 0.25 0.3 mg/kg

0.1 mg/kg 0.2 mg/kg

0.2 mg/kg

0.25 mg/kg 0.3 mg/kg

0.1 mg/kg HR HR 1

0.2 mg/kg HR 1 1 HR

12 2.5

6

0.25 mg/kg HR 1 HR 13

7 13

( 25 mmHg) HR

0.3 mg/kg HR 2 7 (250 BPM)


3.5 7 14 HR

HR

0.25 0.3 mg/kg HR

HR

( 1 / ) 0.03 0.30 0.50 mg/kg ( 0.36

3.60 6.00 mg/m2)

6

HR

0.03 0.30 0.50 mg/kg

3) その他の心血管系作用に関する検討

① hERG発現ヒト胎児腎臓細胞における膜カリウムイオン電流に及ぼす影響

4.2.1.3.6

ether-à-go-go (hERG) (HEK293)

IKr

10 100 300 1000 3000 10000 nmol/L 6 3 10

30 nmol/L 3 2.6.2-21

10 10000 nmol/L IKr

3 nmol/L IKr

hERG


表 2.6.2-21 hERGチャネルを介した膜カリウムイオン電流（IKr）に対する作用

% mean S.E.nmol/L

10 3.4 ± 2.7(n = 5) 3.8 ± 2.4(n = 5) N.S.

100 6.6 ± 1.3(n = 5) 3.8 ± 2.4(n = 5) N.S.

300 10.8 ± 1.9(n = 5) 6.6 ± 1.9(n = 5) N.S.

1000 15.2 ± 2.4(n = 5) 13.2 ± 2.5(n = 5) N.S.

3000 13.2 ± 2.3(n = 5) 6.6 ± 1.9(n = 5) N.S.

10000 13.2 ± 3.6(n = 5) 11.8 ± 3.1(n = 5) N.S.

3 49.4 ± 8.2(n = 5)

10 81.6 ± 6.4(n = 5)

30 95.4 ± 1.4(n = 5)

N.S.:not significant vs Mann-Whitney U-test

② モルモット摘出心臓を用いたLangendorff法による心血管作用の検討（GLP）

4.2.1.3.7

Langendorff

10, 100, 300, 1000, 3000 10000 nmol/L

HR 3000 nmol/L 300 nmol/L 300 nmol/L

100 nmol/L 10000 nmol/L QT

PQ QRS QTc

Langendorff

2.6.2-22

表 2.6.2-22 Langendorff法による心血管系に及ぼすボルテゾミブの影響（n=6, mean）

min

HR

(BPM)

LVP

(mm Hg)

dP/dt max

(mm Hg)

dP/dt min

(mm Hg)

RR

(ms)

PQ

(ms)

QRS

(ms)

QT

(ms)

QTc(F)

(ms)

0 0 191 67 653 -634 315 62 20 168 246

mmol/L 1 15 190 78 747 -714 318 63 20 171 250

1 30 186 82 780 -726 325 67 23 177 257

1 45 190 78 750 -694 318 68 22 172 251

1 60 188 72 685 -634 320 69 23 176 257

1 75 191 64 615 -580 314 70 23 175 258

1 90 193 57 549 -526 311 72 23 176 260

0 0 205 67 654 -633 283 62 18 167 254

nmol/L 10 15 199 77 741 -686 304 68 20 168 250

100 30 193 74 716 -639 313 68 22 175 258

300 45 193 64 616 -552 315 73 23 178 262

1,000 60 194 53 509 -471 312 73 22 179 265

3,000 75 189 44 420 -392 320 75 20 187 273

10,000 90 183 38 369 -347 330 75 23 195 282


③ テレメータ装着・無麻酔ビーグル犬におけるボルテゾミブの心血管作用に対する処置法

の検討

4.2.1.3.8

0.30 mg/kg 24 2.5, 5

10 µg/kg/ 15 2

6 µg/kg/ 10 µg/kg/ 15

6 µg/kg/ 15 24

dP/dt ECG 1

0.30 mg/kg

24

0.30 mg/kg

2.6.2-24

12 22 PR QRS QT QTc

QRS QT QTc

ECG

図 2.6.2-24 テレメータ装着・無麻酔ビーグル犬におけるドパミン及びフェニレフリン投与による

心血管系変化に及ぼすボルテゾミブの影響（続く）

Mean S.E., n=4

Dopamine / phenylephrine


図2.6.2-24 テレメータ装着・無麻酔ビーグル犬におけるドパミン及びフェニレフリン投与による

心血管系変化に及ぼすボルテゾミブの影響（続く）



Mean S.E., n=4

Mean S.E., n=4


図2.6.2-24 テレメータ装着・無麻酔ビーグル犬におけるドパミン及びフェニレフリン投与による

心血管系変化に及ぼすボルテゾミブの影響（続き）

④ 無麻酔マウスにおけるボルテゾミブの心血管作用の検討

4.2.1.3.9

BALB/c

0.1, 0.3, 1.0, 3.0 10.0 mg/kg 6.5

ECG

10.0 mg/kg water blanket 37 2, 4 5



Mean S.E., n=4

Mean S.E., n=4


ECG

10.0 mg/kg 0.5 mg/kg 2, 4 5 ECG

10.0 mg/kg 4 Langendorff ex vivo

10.0 mg/kg

PR QRS QTc 3.0 mg/kg

ECG 2.6.2-25 10 mg/kg

2.6.2-23 10 mg/kg

37 2.6.2-26

10 mg/kg

2.6.2-26

図 2.6.2-25 無麻酔マウスにおける心血管系に及ぼすボルテゾミブの影響

表 2.6.2-23 ボルテゾミブ（10 mg/kg）投与マウスから摘出した心臓における心血管系パラメータ

LVP (mmHg) 61 16 82 28

EDP (mmHg) 8 3 10 2

dP/dtmax (mmHg/s) 2028 479 2581 880

dP/dtmin (mmHg/s) 1598 511 1739 449

Tau (ms) 16 2 16 2.3

n=3 mean S.D.

Mean S.D., n=5 Mean S.D., n=5


図 2.6.2-26 ボルテゾミブの心血管系変化に対する体温維持及びアトロピンの影響

(3) 呼吸系に関する試験（GLP）

4.2.1.3.10

0.10 0.25 mg/kg 8

Sprague-Dawley 15 60 120

360 24

0.10 0.25 mg/kg 9

15 60 120 360 24 72 3

0.10 0.25 mg/kg

2.6.2-24

0.10 0.25 mg/kg AUC 0

72 85.3 201 ng h/mL C0 8.64

133 ng/mL 2.6.2-24

Mean S.D., n=5 Mean S.D., n=3


表 2.6.2-24 ラットの呼吸に対するボルテゾミブの作用

(mg/kg) 15 60 120 360 24

0 136.82

±9.59

127.41

±8.60

138.01

±9.63

153.32

±13.37

134.42

±5.09

140.57

±13.72

0.10 145.93

±10.21

126.17

±10.81

131.79

±8.12

137.12

±6.59

123.33

±3.70

159.65

±8.33( / n=8

mean S.E.)

0.25 147.40

±12.23

148.38

±9.29

139.72

±8.61

129.78

±7.50

123.17

±3.17

164.59

±5.16

0 1.94

±0.15

1.86

±0.11

1.81

±0.07

1.73

±0.10

1.73

±0.04

1.77

±0.07

0.10 2.00

±0.17

1.85

±0.14

1.69

±0.05

1.74

±0.11

1.73

±0.12

1.68

±0.09(mL n=8

mean S.E)

0.25 2.05

±0.15

1.80

±0.08

1.77

±0.04

1.80

±0.07

1.61

±0.06

1.77

±0.10

TK

ng/mL mean S.D. n=3

(mg/kg) 15 60 120 360 24 72

C0

ng/mL

AUC(0 72)

ng h/mL

0.10 6.66

±1.23

3.05

±1.98

1.33

±0.607

1.04

±0.0379

1.24

±0.155

0.968

±0.1798.64 85.3

0.25 63.9

±37.4

7.14

±2.36

3.74

±0.699

3.55

±1.93

1.83

±0.194

1.96

±0.235133 201

2.6.2.5 薬力学的薬物相互作用

(1) In vitroにおけるボルテゾミブと化学療法剤との併用

4.2.1.4.1, 4.2.1.4.2

1) メルファラン及びドキソルビシンとの併用効果

RPMI8226/LR5

U266/dox4

5 ng/mL 0.03 300000 nmol/L 3

10-11

3 10-4

mol/L 0.004 4000 nmol/L 4 10-12

4 10-6

mol/L

RPMI8226/LR5 U266/dox4 24 MTT

RPMI8226/LR5 5 ng/mL

30000 nmol/L 3 10-5

mol/L 5 ng/mL

0.03 nmol/L 3 10-11

mol/L

100

U266/dox4 5 ng/mL

4 nmol/L 4 10-9

mol/L 40 nmol/L 4

10-8

mol/L

0.04 nmol/L 4 10-11

mol/L 2.6.2-27

2.6.2 46

2.6.2-27

2)

MM.1S

1 5 25 125 625 nmol/L 2.5

5 nmol/L MM.1S 48

MM.1S

2.6.2-28

mol/L

0

50

100

U266/dox4

mol/L4 10–6 4 10-7 4 10-8 4 10-9 4 10-10 4 10-11 4 10-12 0

%

5 ng/mL 5 ng/mL+

5 ng/mL 5 ng/mL+

3 10-4 3 10-5 3 10-6 3 10-7 3 10-8 3 10-9 3 10-10 3 10-11 0

RPMI8226/LR5 %

0

50

100


図 2.6.2-28 MM.1S細胞におけるボルテゾミブの

デキサメタゾンとの併用効果

(2) In vivoにおけるボルテゾミブと化学療法剤との併用試験

1) Lewis肺がん移植モデルにおけるボルテゾミブと5-フルオロウラシルとの併用効果

4.2.1.4.3

5-FU Lewis

Lewis 2 106

Lewis C57BL

0.01 0.03 0.1 mg/kg 4 18

5-FU 20 25 30 mg/kg 7 11

5-FU 500 mm3

DMSO

500 mm3

5-FU 500 mm3

5-FU 500 mm3

2.6.2-25

表 2.6.2-25 ボルテゾミブと5-FUの併用によるLewis肺がん細胞移植モデルにおける

腫瘍増殖に対する作用（n=15）

500 mm3

mg/kg i.p.mg/kg i.p.0 0.01 0.03 0.1

0 0.9 1.6 1.8

20 1.8 2.0 3.3 3.7

25 2.5 2.8 3.6 4.2 5-FU

30 4.0 4.8 4.9 5.0

2.6.2 48

2)

4.2.1.4.4

CPT-11 LOVO

LOVO 5 106

LOVO NCR nu/nu

0.01, 0.1, 0.5 1 mg/kg 33 mg/kg

1 cm 2 4

26% 48% 1 mg/kg 33 mg/kg

94% 2.6.2-29

0.01, 0.1, 0.5 1 mg/kg 33 mg/kg

2.6.2-29

2.6.2-29 LOVO

3)

MIA-PaCa-2

10)

MIA-PaCa-2 1 106

MIA-PaCa-2

30, 33, 37, 40, 44, 47 51 0.25 mg/kg

125 mg/kg 6

0.01mg/kg i.v. 33mg/kg i.v. 0.1mg/kg i.v. 33mg/kg i.v. 0.5mg/kg i.v. 33mg/kg i.v. 1mg/kg i.v. 33mg/kg i.v.

33mg/kg i.v 1mg/kg i.v. 1mg/kg i.v. 33mg/kg i.v.

cm3

cm3

Mean S.E., n=8 10

n=8 10

2.6.2 49

2.6.2-30

2.6.2-30 MIA-PaCa-2

125 mg/kg i.p.

0.25 mg/kg i.v.

0.25 mg/kg i.v.

125 mg/kg i.p.

mm

2

p<0.05p<0.05

p<0.05

125 mg/kg i.p.

0.25 mg/kg i.v.

0.25 mg/kg i.v.

125 mg/kg i.p.

p<0.05

8

6

4

2

0

gn=4

Mean S.D., n=4


2.6.2.6 考察及び結論

UPP

UPP

UPP 80%

UPP 3

26S 26S

20S 19S UPP

11,12)

13)UPP

NF-κB

in vitro in vivo

(MM)

in

vitro in vivo

in vitro 20S

Kiapp=0.62 nmol/L 20S

Kiapp=970 nmol/L 1500

20S

NCI

GI50=7 nmol/L 60,000

MM 2.5 30 nmol/L GI50

14)p53 Bax

Bcl-2

11,12,15,16)

IL-617~21)

MM IL-6

22~24)VLA-4 VLA-5 BMSCs


VCAM-1 ICAM-125~27,33)

IL-6

21,28~30)BMSCs TGF- 1 TNF

IL-1 IL-631~33)

IL-6

34)

BMSCs BMSCs IL-6 BMSCs

BMSCs IL-6

MM

35,36)MM

P-gp MM35)

P-gp MRP3 MRP5

P-gp MRP

IκB NF-κB

IκB NF-κB

37)

M MM

M MM2,3)

MM

M M

RPMI8226 in vivo

1.0 mg/kg

2

in vivo

MM


MM

2

>99%

2

38,39)

80%

proteinase K

Irwin

(CNS) (PNS)

CNS

HR QTc

ECG

ECG


In vitro

In vivo

5-FU

in vivo


2.6.2.7 図表


2.6.2.8 参考文献

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