d neurobiología neurobiology · 2015-07-06 · premio al grupo: medalla de oro de la comunidad de...

D

NeurobiologíaNeurobiology

D.1 Microtubulos

D.2 Mecanismos de transducción;modulacion por Neuropeptidose implicaciones farmacológicas

D.3 Bases moleculares de laneurotransmisión glicinérgica*

D.4 Regulación de la expresión delgen de la apolipoproteína E

D.5 Bases moleculares de laadaptación al ejercicio y de laplasticidad muscular

D.6 Mecanismos de señalización yregulación de receptoresacoplados a proteínas G.

D.7 Interacción de los nucleotidosde guanina con los receptoresionotrópicos de glutamato

D.8 Mecanismos de envejecimientoy neurodegeneracion

D.9 Neuropatología molecular de laenfermedad de Alzheimer

D.10 Bases Moleculares de laPlasticidad Neuronal

D.1 Microtubules

D.2 Transduction mechanisms;modulation by neuropeptides andpharmacological implications

D.3 Molecular basis of the glycinergicneurotransmission*

D.4 Regulation of the apolipoproteinE gene expression

D.5 Molecular bases of the adaptationto exercise and of skeletal muscleplasticity

D.6 G protein-coupled receptorssignaling and regulatorymechanisms.

D.7 Interaction of guanine nucleotideswith ionotropic glutamatereceptors

D.8 Mechanisms of ageing andneurodegeneration

D.9 Molecular neuropathology ofAlzheimer’s disease

D.10 Molecular basis of neuronal plasticity

Resumen de Investigación

Durante este bienio los objetivos de

nuestro laboratorio han sido el estudio de

la función de las proteínas microtubulares

en el desarrollo de la forma neuronal; la

implicación de la proteína asociada a los

microtúbulos, tau, en procesos de

degeneración neuronal (tauopatías); y el

análisis de la regeneración de axones de

neuronas del sistema nervioso central.

En el primer objetivo se ha caracterizado

un ratón deficiente en la proteína asociada

a los microtúbulos (MAPs) conocida como

MAP1B, la primera MAP que se expresa

“in situ” en una neurona. Los resultados

obtenidos indican que la deficiencia de

dicha proteína afecta a la normal

elongación axonal. Este tipo de análisis

sigue realizándose actualmente.

En el segundo objetivo se han estudiado

tres de las características específicas de

la proteína tau, que se encuentra presente

en los cerebros de pacientes con la

enfermedad de Alzheimer u otras

tauopatías; su hiperfosforilación, su

deficiente unión a los microtúbulos y su

agregación aberrante para dar lugar a

polímeros filamentosos. Sobre el primer

punto se ha observado que el grado de

fosforilación de tau puede afectar no solo

a su unión con microtúbulos sino a su

asociación con la membrana plasmática.

Adicionalmente se ha observado que en

un tipo de tauopatía, la demencia

frontotemporal asociada al cromosoma 17

(FTDP-17), mutaciones en la proteína tau

pueden dar lugar a cambios en su nivel de

fosforilación. Por otra parte, en dicha

proteína tau mutada se encuentra

alterada la interacción de tau con los

microtúbulos, una alteración que también

puede ocurrir por la fosforilación de la

proteína normal y basada en la

fosforilación de las proteínas, que puede

afectar a la morfología neuronal (como se

describe en otro trabajo). El tercer punto,

es decir la agregación anormal de la

proteína tau, se ha estudiado in vitro,

habiéndose observado que la proteína tau

mutada en determinados residuos, posee

una mayor capacidad para agregar que la

proteína no mutada. Adicionalmente, se

observó que la proteína tau

hiperfosforilada, pero no la modificada,

puede polimerizar en presencia de un

producto de la peroxidación lipidica que se

produce durante el envejecimiento, el

hidroxinonenal (HNE).

Finalmente, los estudios sobre

regeneración axonal indicaron que, tras

realizar lesiones medulares en rata, se

obtenía regeneración axonal, y

recuperación funcional, tras ser

transplantada la rata lesionada (en la zona

de la lesión) con células de glia

envolvente.

Jefe de Línea / Group Leader:

Jesús Avila de Grado

Personal Científico / Scientific

Personnel:

Rosario Armas Portela, Javier Díaz

Nido, Felix Hernández Pérez,

Filip Lim, Juan José Lucas Lozano,

Esteban Montejo de Garcini, Mar Pérez

Martínez, Almudena Ramón Cueto,

Marina Sánchez García

Becarios Postdoctorales /

Postdoctoral Fellows:

Montserrat Arrasate Iragui, Christian

González Billault, Carlos Sánchez

Martín

Becarios Predoctorales / Graduate

Students:

Marta Agudo Barriuso, Gretchen Lorio

García, Esther Martín Aparicio, Mª

Auxiliadora Parrales Mena, Silvia

Sánchez Muñoz, Laura Sayas

Casanova

Técnicos de investigación /

Technical Assistance:

Raquel Cuadros Catalan, Paloma

López Abengozar

Estudiantes / Undergraduate Students:

Matthias Engelke, Elsa Champion

Científicos Visitantes / Visiting Scientist:

Claudio Coello

(McGill University, Montreal)

Margarita Alvarez de la Rosa (Yale

University, New Haven)

MicrotubulosD.1NeurobiologíaNeurobiology

66

Tesis Doctorales/ Doctoral ThesesChristian González Billault: “Análisis funcional

de la proteína asociada a microtubulos 1B.

Aspectos celulares y moleculares”.

Sobresaliente cum laude. Noviembre 2000.

Montserrat Arrasate Iragui: “La proteína tau:

localización subcelular, interacción con

nuevas proteínas y agregación patológica”.

Sobresaliente cum laude. Diciembre 2000.

Colaboraciones con la Industria /Collaborations with Industry

Proyectos de colaboración con Synthelabo y

Pharma Mar

Premios y Distinciones / AwardsPremio al grupo: medalla de oro de la

Comunidad de Madrid

Neurona de hipocampo de ratón, en un estado inicial de desarrollo, teñida con anticuerpos

contra tubulina.

Developping mouse hippocampal neuron, stained with tubulin antibodies.

Ramón-Cueto, A. and Avila, J. (1999). Two modes of microtubule-

associated protein 1B phosphorylation are differentially regulated

during peripheral nerve regeneration. Brain Res. 815, 213-226.

Fanarraga, M., Aloria, K., Avila, J. and Zabala, J.C. (1999). Expression

of unphosphorylated class III beta tubulin isotype in neuroepithelial

cells evidences neuroblast commitment and differentiation. Europ.

J. Neurosci. 11, 517-527.

Arrasate, M., Pérez, M., Armas-Portela, R. and Avila, J. (1999).Polymerization of tau peptides into fibrillar structures. The effect ofFTDP-17 mutations. FEBS Lett. 446, 199-202.

Sayas, L., Moreno-Flores, M.T., Avila, J. and Wandosell, F. (1999).The neurite retraction induced by lysophosphatidic acid increasesAlzheimer’s disease-like tau phosphorylation. J. Biol. Chem. 274,37046-37052.

Mu–oz-Monta–o, J.R., Lim, F., Moreno, F.J., Avila, J. and D’az Nido,J. (2000). Glycogen synthase kinase 3 regulates axonal outgrowthin cultured neurons. J. Alzh. Disease 1, 361-378.

Gong, C.X., Wegiel, J., Lidsky, T., Zuck, L., Avila, J., Wisniewski,H., Grundke-Iqbal, I. and Iqbal, K. (2000). Regulation ofphosphorylation of neumonal microtubule associated proteins MAP1Band MAP2 by protein phosphatase 2A and 2B in rat brain. BrainRes. 853, 299-309

Arrasate, M., Pérez, M. and Avila, J. (2000). Tau dephosphorylationat tau 1 site correlates with its association to cell membrane.Neurochem. Res. 25, 43-50.

Cuadros, R., Montejo de Garcini, E., Wandosell, F., Faircloth, G.,Fern‡ndez-Sousa, J.M. and Avila, J. (2000). The marine compoundspisulosine, an inhibitor of cell proliferation, promotes the disassemblyof actin stress fibers. Cancer Lett. 152, 23-29.

Bullido, M.J., Aldudo, J., Frank, A., Goria, F., Avila, J. and Valdivieso,F. (2000). A polymorphism in the tau gene associated with risk forAlzheimer’s disease. Neurosc. Lett. 278, 49-52.

Ram—n Cueto, A., Cordero, M.I., Santos Benito, F. and Avila, J.(2000). Functional recovery of paraplegic rats and motor axonregeneration in their spinal cords by olfactory ensheating glia. Neuron25, 425-435.

Sánchez-Martín, C., Ledesma, D., Dotti, C. and Avila, J. (2000).Microtubule associated protein 2 located in growth cones of rathippocampal neurons is highly phosphorylate at its proline-richregion. Neuroscience 101, 885-893.

Sánchez, C., Pérez, M. and Avila, J. (2000). GSK3β-mediatedphosphorylation of the microtubule associated protein 2C (MAP2C)prevents microtubule bundling. Europ. J. Cell Biol. 79, 252-260.

Pérez, M., Lim, F., Arrasate, M. and Avila, J. (2000). The FTDR17linked mutation R406W abolishes the interaction of phosphorylatedtau with microtubules. J. Neurochem. 74, 2583-2589.

González Billault, C. and Avila, J. (2000). Molecular geneticapproaches to microtubule associated protein function. Histol.Histopathol. 15, 1177-1183.

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Quintana, C., Lancin, M., Marhic, C., Perez, M., Martin-Benito, J.,Avila, J. and Carrascosa, J. L. (2000). Initial studies with highresolution TEM and electron energy loss spectroscopy studies offerritin cores extracted from brain of patients with progressivesupranuclear palsy and Alzheimer disease. Cell and Mol. Biol. 46,807-820.

Takeda, A., Smith, M. A., Avila, J., Nunomura, A., Siedlak, S. L.,Zhu, X., Perry, G. and Sayre, L. M. (2000). In Alzheimer's disease,heme oxygenase is coincident with Alz50, an epitope of tau inducedby 4-hydroxy-2-nonenal modification. J. Neurochem. 75, 1234-1241.

Avila, J. (2000). Tau aggregation into fibrillar polymers: taupathies.FEBS Lett. 472, 89-92.

González Billault, C., Demandt, E., Wandosell, F., Torres, M. Bonaldo,P., Stoykova, A., Chowdhung, K., Gruss, P., Avila, J. and Sáncez,M. (2000). Perinatal lethality of microtubule associated protein 1B,deficient mice expressing alternative isoforms of the protein at lowlevels. Mol. Cell Neurosci. 16, 408-421.

Jiménez, C., Armas Portela, R., Mellado, M., Rodríguez Frade, J.M.,Collard, J., Serrano, A., Martínez, A.C., Avila, J. and Carrera, A.C.(2000). Role of P13 regulatory subunit in the control of actinorganization and cell migration. J. Cell Biol. 151, 249-261.

Microtubules

Publicaciones /Publications:

Research summary

During the years 1999-2000 we have

developed three objectives in our

laboratory: the role of microtubule

proteins in neural morphology

development; the role of microtubule

associated protein, tau, in

neurodegenerative disorders

(tauopathies); and the analysis of

axonal regeneration in central neurons

system neurons.

For the first objective a mouse,

deficient in microtubule associated

protein MAP1B was characterized. We

studied that protein since it is the first

MAP that is expressed “in situ” in a

neuron. Our results indicated that in

MAP1B deficient mouse it is a

reduction in axonal elongation

compared with that observed in the

normal countepart. These studies

continue at the present time.

For the second objective we have

analysed the three specific

characteristics of tau protein present in

the brain of Alzheimer´s disease

patients (or in other tauopathies); its

hyperphophorylation; its deficient

interaction with microtubules and its

aberrant aggregation into filamentous

polymers. About the first point we have

found that the phosphorylation level of

tau protein may affect not only to its

binding to microtubules but also to its

association with the plasma

membrane. Also, its has been found

that in one type of tauopathy,

frontotemporal dementia linked to

chromosome 17 (FTDP-17), mutations

in tau protein could change the level of

protein phosphorylation. Additionaly,

the mutated tau protein binds to

microtubules in a different way than

normal tau. Also, it has been found that

in normal protein, changes in its level of

phophorylation, correlate with changes

in neural morphology.

The development of the third point,

aberrant tau aggregation, has been

studied by in vitro analysis. Our results

indicates that FTDP-17 tau protein,

mutated at some specific residues,

shows a higher capacity for self

aggregation than normal protein. Also,

it was observed that

hyperphosphorylated tau protein, but

not unmodified tau, is able to assemble

in the presence of a product,

hydroxynonenal (HNE), raised from

lipid peroxidation, a process that could

occur in Alzheimer´s disease patients,

since is related with aging.

Finally, our studies on axonal

regeneration showed that after

performing spinal cord lesions in rat,

olfactory ensheating glia

transplantation, at the lesion site,

results in axonal regeneration, (and

functional recovery), of the lesioned

rats.

67

Lucas, J.J., Hernández, F. and Avila, J. (1999). Nuclear localization

of β catenin in adult mouse thalamus correlates with low levels of

GSK-3β. Neuroreport 10,2699-2703.

Alvarez de la Rosa, M., Nilsen, J., Avila, J. and Naftolin, F. (1999).

Effect of estrogen in tau protein isoforms expression in PC12. Mol.

Biol. Cell. 10, 373a (Abst.).

Alvarez, G., Muñoz-Montaño, J.R., Satrustegui, J., Avila, J., Bogonez,

E. and Diaz-Nido, J. (1999). Lithium protects cultured neurons

against β amyloid induced neurodegeneration. FEBS Lett. 453, 260-

264.

Fanarraga, M.L., Parraga, M., Aloria, K., del Mazo, J., Avila, J. and

Zabala, J.C. (1999). Regulated expression of p14 (cofactor A) during

spermatogenesis. Cell Motil. Cytoskeleton 43, 243-254.

García-Pérez, J., Avila, J. and Diaz-Nido, J. (1999). Lithium induces

morphological differentiation of mouse neuroblastoma cells. J.

Neurosci. Res. 57, 261-270.

Zambrano, R., Briones, E., Avila, J. and García Ballesta, J.P. (1999).

Phosphorylation of P'1 serine inhibits peptide bond sensitivity to

Staphylococcus aureus V8 protease. Arch. Biochem. Biophys. 368,

207-209.

Muñoz-Montaño, J.R., Moreno, F.J., Avila, J. and Diaz-Nido, J.

(1999). Downregulation of glycogen synthase kinase-3β (GSK-3β)

protein expression during neuroblastoma IMR-32 cell differentiation.

J. Neurosci. Res. 55, 278-285.

Moreno, F.J., Bagnat, M., Lim, F. and Avila, J. (1999). OP18/stathmin

binds near the C-terminus of tubulin and facilitates GTP binding.

Eur. J. Biochem. 262, 557-562.

Armas-Portela, R., Parrales, M.A., Albar, J.P., Martinez-A, C. and

Avila, J. (1999). Distribution and characteristics of βII tubulin-enriched

microtubules in interphase cells. Exp. Cell. Res. 248, 372-380.

Hoenicka, J., Perez, M., Perez-Tur, J., Barabash, A., Godoy, M.,

Vidal, L., Astarloa, R., Avila, J., Nygaard, T. and Yebenes, J.G.

(1999). The tau gene A0 allele and progressive supranuclear palsy.

Neurology 53,1219-1225

Pérez, M. and Avila, J. (1999). The expression of casein kinase 2α'

and phosphatase 2A activity. Biochim. Biophys. Acta 1449, 150-

156.



El objetivo principal del proyecto de

investigación lo constituye el estudio de

los mecanismos de transducción

implicados en la acción de la endotelina

(ET), así como la implicación de agentes

farmacológicos específicos. Los objetivos

particulares de este proyecto han sido:

a) Estudio del efecto de la ET en el

metabolismo de lípidos y fenómeno de

fosforilación-defosforilación. Los estudios

llevados a cabo han confirmado el

mecanismo de acción de la ET a través

del ciclo PI-PA; de manera paralela se ha

iniciado un análisis de los esfingolípidos

como otro posible mecanismo de

transducción. Se ha demostrado también

la participación de la proteína quinasa C y

de la fosforilación de alguno de sus

sustratos específicos como la MARCKS

en la acción de la ET, estableciéndose de

manera paralela la relación existente

entre el neuropéptido y la fosforilación de

proteínas en restos de tirosina; en este

sentido se ha comprobado la acción de la

ET en la fosforilación de dos proteínas de

adhesión a través de la activación de

receptores tipo B. Asimismo, se ha

estudiado la translocación de

fosfoproteína fosfatasas y la generación

del sistema cAMP por acción del

neuropéptido.

b) Estudio de la funcionalidad de la

barrera hematoencefálica a nivel de

sistemas de transducción. Se han

obtenido nuevos datos acerca de la

acción de la ET modulando el efecto de la

histamina a través de receptores tipo A.

c) Estudio de la participación de

mediadores en la acción de la ET. Se ha

analizado el papel de ciertos mediadores

(PAF y NO) en la acción de la ET,

estableciéndose el papel del PAF en

sistema nervioso a nivel de la modulación

de isoformas de proteína quinasa C,

proteínas de adhesión, metabolismo de

esfingolípidos y la posible relación con el

sistema NO-cGMP; de manera particular

algunos de estos aspectos han sido

analizados en núcleos aislados.

d) Estudio de la modulación de los

sistemas de transducción mediante

agentes farmacológicos.


Edgardo Catalán


Students :

Eduardo Latorre

Técnicos de Investigación /

Technical Assistance :

Victoria Mora-Gil

Mecanismos de transducción; modulación porNeuropeptidos e implicaciones farmacológicas

D.2NeurobiologíaNeurobiology

68

Pérez-Alvarez, M.J., Calcerrada, M.C., Catalán, R.E.

and Martínez, A.M. (1999). Phosphorylation of

MARCKS by endothelin in rat cerebral cortex slices.

Neurosci. Res. Commun. 24, 155-162.

Calcerrada, M.C., Miguel, B.G., Catalán, R.E. and

Martínez, A.M. (1999). Sphingosylphosphorylcholine

increases calcium concentration in isolated brain

nuclei. Neurosci. Res. 33, 229-232.

Pérez, M.J., Calcerrada, M.C., Catalán, R.E. and

Martínez, A.M. (1999). Endothelin stimulates tyrosine

phosphorylation of p125FAK and p130Cas in rat cerebral

cortex. Neurochem. Int. 34, 483-490.

Calcerrada, M.C., Catalán, R.E., Pérez-Alvarez, M.J.,

Miguel, B.G. and Martínez, A.M.(1999). Platelet-

activating factor stimulation of p125FAK and p130Cas

tyrosine phosphorylation in brain. Brain Res. 835, 275-

281.

Latorre, E., Aragonés, M.D., Fernández, I. and Catalán,

R.E. (1999). Platelet-activating factor modulates brain

sphingomyelin metabolism. Eur. J. Biochem. 262, 308-

314.

Hernández, F., Catalán, R.E. and Martínez A.M. (1999).

Endothelin enhances adenosine and isoprenaline

elevated cyclic AMP levels in rat cerebellar slices.

Peptides 20, 1115-1122.

Calcerrada, M.C., Catalán, R.E. and Martínez A.M.

(1999). Glutamate release is involvead in PAF-

increased cyclic GMP levels in hippocampus. Biochem.

Mol. Biol. Int. 47, 529-535.

Calcerrada, M.C., Pérez, M.J., Catalán, R.E. and

Martínez, A.M. (1999). Modulation of protein kinase C

isoforms by PAF in cerebral cortex, Prostagl. Lipid Med.

58, 19-27.

Catalán, R.E., Gargiulo, L., Martínez, A.M. and Liras, A.

(1999). Endothelin-1 effect on tyrosine phosphory-

lation and on tyrosine phosphatase (PTP-1C)

translocation in rabbit platelets. J. Receptor Signal

Transduct. Res. 19, 909-925.

Pérez-Alvarez, M.J., Calcerrada, M.C., Hernández, F.,

Catalán, R.E. and Martínez, A.M. (2000). Endothelin-1

increases isoprenaline enhanced cyclic AMP levels in

cerebral cortex. Regul. Peptides 88, 41-46.

Liras, A., Catalán, R.E. and Martínez, A.M. (2000).

Synergistic effect of endothelin-1 and serotonin in

rabbit platelets: effect on tyrosine phosphorylation.

Thromb. Res. 100, 325-331.

Miguel, B.G., Calcerrada, M.C., Mata, F., Aller, P.,

Clemente, R., Catalán, R.E. and Martínez, A.M. (2000).

Differential redistribution of protein kinase C isoforms

by cyclic AMP in HL60 cells. Biochem. Biophys. Res.

Commun. 274, 596-602.

Hernández, F., Martínez, A.M., Piedra, D. and Catalán,

R.E. (2000). Endothelin inhibits histamine-induced

cyclic AMP accumulation in bovine brain vessels.

Microvasc. Res. 60, 49-54.

Transduction mechanisms; modulation byneuropeptides and pharmacological implications


Research summary

The main goal of this project is to study

the biochemical mechanisms at the

transduction level involved in the action

of neuropeptides, in particular

endothelin (ET), and the involvement of

new pharmacological agents. In this

regard, the particular objectives are:

a) Study of the effect of ET on lipid

metabolism and the phosphorylation-

dephosphorylation phenomenon. Our

data have confirmed that the

mechanism of action of ET involves the

PI-PA cycle. The involvement of

sphingolipids as other transduction

mechanism has been analyzed. The

involvement of protein kinase C and the

phosphorylation of some specific

substrates as MARCKS has also been

demonstrated. Furthermore, the

relationship between the neuropeptide

and the phosphorylation of tyrosine

proteins has been studied; in this

regard, the action of ET on the

phosphorylation of two adhesion

proteins through the activation of type

B receptors has been observed.

The translocation of phosphoprotein

phosphatase and the generation of the

cAMP system have been studied.

b) Functioning of the blood-brain

barrier mainly at the transduction level.

New data about the modulation of the

histamine action through type A

receptors by ET, have been obtained.

c) Study of the involvement of

mediators in the mechanism of action

of ET. The role of mediators such as

PAF and NO in the action of ET has

been studied. The role of PAF in the

nervous system, on protein kinase C

isoforms, adhesion proteins,

sphingolipid metabolism and the NO-

cGMP system has been analyzed; in

particular, some of these aspects have

been studied in isolated nuclei.

d) Modulation of the transduction

systems by pharmacological agents.

69


El neurotransmisor glicina ejerce dos

funciones en el SNC de vertebrados.

Actúa como inhibidor a través de la

interacción con receptores de glicina

sensibles a estricnina en médula espinal y

tallo cerebral y tiene además un papel

excitador al actuar como co-agonista de

glutamato sobre receptores NMDA en

corteza e hipocampo. Ambas funciones

requieren un estricto control de la

concentración de glicina extracelular. Este

cometido es llevado a cabo por los

transportadores específicos de glicina

localizados en la membrana plasmática

de neuronas (GLYT2) y células gliales

(GLYT1). Alteraciones funcionales de la

neurotransmisión glicinérgica están

relacionados con desórdenes en la

actividad neuromuscular y en la función

cognitiva. La posibilidad de desarrollar

una farmacología mediante la que se

pueda modular la actividad de los

transportadores de glicina y por tanto la

cantidad de neurotransmisor en el espacio

sináptico es de un enorme interés

terapeútico. El desarrollo de fármacos

específicos requiere del conocimiento, a

nivel molecular, de la estructura,

mecanismo funcional y regulación de las

proteinas dianas. Esto último constituye el

objetivo de nuestro grupo.

Con respecto a la relación estructura-

función, mediante mutaciones puntuales y

utilizando técnicas bioquímicas y

electrofisiológicas, hemos identificado

dominios y residuos de GLYT2 implicados

en el mecanismo de transporte. Por otra

parte, mediante técnicas de microscopía

electrónica e inmunocitoquímica hemos

determinado la expresión de GLYT2 en el

sistema auditivo durante el desarrollo, lo

que ha sugerido una participación de este

transportador en el proceso de

maduración de sinapsis glicinérgicas.

En cuanto a la regulación de estas

proteinas, hemos demostrado una

interacción física y funcional entre la

proteina SNARE sintaxina 1A y los

transportadores GLYT1 y GLYT2.

Sintaxina 1A parece regular el tráfico de

estas proteinas entre el compartimento

intracelular y la membrana plasmática.

Utilizando clones de lineas celulares HEK

293 que expresan de forma estable

GLYT1 y GLYT2, hemos descrito efectos

diferenciales sobre la actividad y/o

expresión en la membrana plasmática de

estas proteinas por parte de algunos

compuestos con actividad antidepresiva

(amoxapina) y sedativa/tóxica (etanol).

Bases moleculares de la neurotransmisiónglicinérgica

D.3NeurobiologíaNeurobiology

70

Jefe de Linea/Group Leader:

Carmen Aragón*


Personnel:

Beatriz López-Corcuera

Becario Postdoctoral/ Postdoctoral

Fellow:

Arjan Geerlings

Becarios predoctorales / Graduate

Students:

Rodrigo Martinez-Maza,

Julia Ponce,

Amparo Fornés

Técnico de Investigación / Technical

Assistance:

Enrique Núñez

Estudiantes/Undergraduate

Students: :

Jesús Romero, Ruth Espinosa

Científico Visitante/Visiting Scientific :

Juan Madoz (Instituto de Petroquímica

y Catálisis, CSIC)

*Jefe de Línea Asociado

Estructura de transportadores para neurotransmisores.

Structure of neurotransmitter transporters.

Molecular basis of the glycinergicneurotransmission


Research summary

Glycine plays a dual role in the SNC of

vertebrates. In the spinal cord and

brain stem glycine acts as an inhibitory

neurotransmitter on the postsynaptic

glycine receptors sensitive to

strychnine. Moreover, glycine

potentates the action of glutamate on

the NMDA glutamate receptors in the

cortex and the hippocampus. For both

glycine functions, the extracellular

levels of glycine must be finely

regulated. The removal of glycine is

accomplishes through specific

transporters located both in the plasma

membrane of neurons (GLYT2) and

the fine glial processes (GLYT1).

Dysfunction in any of the mentioned

glycine roles in neurotransmission

would lead to neurological disorders

associated with musculoskeletical

activity, or in cognitive functions.

Therefore, a new role for the glycine

transporters as targets of therapeutic

drugs is now emerging. The

development of a specific

pharmacology requires a knowledge at

the molecular level, of the

structure/function relationship and the

regulation of the GLYT1 and GLYT2

glycine transporters from CNS. This

represents the aim of the group.

By point mutations and by using

biochemical and electrophysiological

techniques, we have identified

structural domains and amino acid

residues of GLYT2 involved in the

intrinsic mechanism of glycine

transport. By electronic microscopy

and immunocitochemistry techniques,

we have study the expression of

GLYT2 during development in the rat

central auditory system. The onset of

GLYT2 suggest that the transporter

molecules participate in the process of

early synapse maduration during

development. As far as the regulation

properties of the transporters is

concern, we have demonstrated a

functional and physical interaction

between GLYT1 and GLYT2 and the

SNARE protein syntaxin 1A in COS

cells and in rat brain tissue. Sintaxin 1A

regulates the intracellular trafficking of

these proteins.

We have described differential effects

of tricyclic antidepressant

drugs(amoxapine) and ethanol on the

activity and/or plasma membrane

expression of the recombinant GLYT1

and GLYT2 glycine transporters.

GLYT2 modulation may account for the

sedative and psychomotor side effects

of amoxapine. Changes induced by

ethanol on these transporters may

contribute to understand the molecular

mechanism of ethanol intoxication.

71

Friauf, E., Aragón, C., Lohrke, S., Westenfelder, B and

Zafra, F. 1999. Developmental expression of the

glycine transporter GLYT2 in the auditory system of

rats suggests involvement in synapse maturation. J.

Comp. Neurol. 412, 17-37.

Ponce, J., Biton, B., Benavides, J., Avenet, P.and

Aragón, C. (2000). Transmembrane domain III plays an

important role in ion binding and permeation in the

glycine transporter GLYT2. J. Biol. Chem. 275, 13856-

62.

Geerlings, A, López-Corcuera, B. and Aragón C.

(2000). Characterization of the interactions between

the glycine transporters GLYT1 and GLYT2 and the

SNARE protein syntaxin 1A. FEBS Lett. 470, 51-4

Núñez, E., López-Corcuera, B., Vázquez ,J., Giménez,

C., Aragón, C. (2000). Differential effects of the tricyclic

antidepressant amoxapine on glycine uptake mediated

by the recombinant GLYT1 and GLYT2 glycine

transporters.Br. J. Pharmacol.129, 200-6.

Núñez, E., López-Corcuera, B., Martínez-Maza, R.and

Aragón, C. (2000). Differential effects of ethanol on

glycine uptake mediated by the recombinant GLYT1

and GLYT2 glycine transporters. Br. J. Pharmacol. 129,

802-10.

López-Corcuera, B., Martínez-Maza, Núñez, E.,

Geerlings, A., and Aragón, C. (2000). Glycine

transporters in the central nervous system. Recent

Res. Dev. Neurochem. 3, 161-173.

Tesis Doctorales/ Doctoral Theses

Julia Ponce: “Clonaje de un nuevo transportador de

glicina de sistema nervioso central. Estudio de la

relación estructura-función de la proteína”. Universidad

Autónoma de Madrid. 1999. Sobresaliente cum laude.

Rodrigo Martínez: “Caracterización funcional de

dominios estructurales del transportador neuronal de

glicina GLYT2”. Universidad Autónoma de Madrid.

2000. Sobresaliente cum laude.

Jefe de Linea/Group Leader:

Cecilio Giménez,


Personnel:

Francisco Zafra

Becarios predoctorales / Graduate

Students:

Julia Ponce,

Irene Poyatos,

Enrique Salero

Técnico de Investigación / Technical

Assistance:

Enrique Núñez

D.4

72



La apolipoproteína E está codificada en el

cromosoma 19 y presenta tres isoformas

(E2, E3 y E4) que corresponden a tres

alelos del gen. Aparte de sus funciones en

el transporte y metabolismo de lípidos

plasmáticos, ApoE desempeña

importantes papeles en el sistema

nervioso, tanto en la respuesta del mismo

a daños neurológicos, como en la

patogénesis de la enfermedad de

Alzheimer. Estas funciones dependen de

manera crítica de la isoforma alélica. Los

niveles de ApoE parecen jugar un papel

esencial en estas funciones fisiológicas, y

de hecho este gen esta sometido a una

fina regulación por factores nutricionales,

hormonales, específicos de tejido y de

desarrollo ontogénico. Además, responde

de forma dramática a diversos daños

neurales, presumiblemente en respuesta

a señales activadas por la lesión, tales

como las citoquinas o quimioquinas

proinflamatorias. Estas respuestas son

mediadas por la unión de una serie de

factores de transcripción tanto a la región

promotora proximal como a la distal,

aunque muchos de ellos están

pobremente caracterizados, en especial

los relacionados con el sistema nervioso.

En nuestro laboratorio intentamos

identificar y caracterizar los componentes

de esta maquinaria transcripcional.

En los últimos dos años hemos

encontrado tres sitios de unión para los

factores de transcripción ZIC1 y ZIC2 que

regulan tanto construcciones artificiales

del promotor ApoE como el gen

endógeno. Las proteínas ZIC parecen

tener un importante papel en el desarrollo

embrionario, aunque sus genes diana no

se conocen. Mediante la utilización de

microarrays de cDNA hemos encontrado

que aparte de ApoE, muchos otros genes

son regulados por Zic. Algunos de los

cambios de expresión detectados podrían

explicar el fenotipo observado en la

holoprosencefalia tipo 5, una

malformación debida a mutaciones en

ZIC2. En la actualidad continuamos la

busqueda de factores de transcripción

que regulen el gen ApoE, en especial en

las respuestas a factores asociados con el

daño neural y los especificos de tejido y

del desarrollo.

Regulación de la expresión del gen de laapolipoproteína E

Estructura genómica y proteica de la lipoproteína E

Friauf, E., Aragón, C., Lohrke, S., Westenfelder,

B and Zafra, F. (1999). Developmental

expression of the glycine transporter GLYT2

in the auditory system of rats suggests

involvement in synapse maturation. J. Comp.

Neurol. 412, 17-37.

Poyatos, I., Ruberti, F., Martinez-Maza, R.,

Giménez, C., Dotti, C.G.and Zafra, F. (2000)

Polarized distribution of glycine transporter

isoforms in epithelial and neuronal cells.

Mol.Cell. Neurosci. 15, 99-111.

Núñez, E., López-Corcuera, B., Vázquez , J.,

Giménez, C., Aragón, C. (2000). Differential

effects of the tricyclic antidepressant

amoxapine on glycine uptake mediated by the

recombinant GLYT1 and GLYT2 glycine

transporters.Br. J. Pharmacol.129, 200-206.


Julia Ponce: “Clonaje de un nuevo

transportador de glicina de sistema nervioso

central. Estudio de la relación estructura-

función de la proteína”. Universidad Autónoma

de Madrid. 1999. Sobresaliente cum laude.

Irene Poyatos: “Mecanismos implicados en el

tráfico intracelular, localización y regulación

de los transportadores de glicina”. Universidad

Autónoma de Madrid. 2000. Sobresaliente

cum laude.

Research Summary

ApolipoproteinE (apoE) is encoded

by a single gene on chromosome 19

with three isoforms (E2, E3 and E4)

arising from three alleles at the gene

locus. Apart from its functions on the

transport and metabolism of plasma

lipids, apoE has emerged as an

important molecule in the nervous

system playing a key role in

response to injurious agents

causing neuronal damage, or in

Alzheimer disease. As all the above

mentioned functions of apoE are

isoform-specific, and depend of the

level of the expression of the

protein, the APOE gene is under a

fine and complex regulation

including dietary, hormonal,

ontogenic and tissue-specific

factors. Moreover, its expression

raises dramatically after nerve

injuries, probably in response to the

release of cytokines or chymiokines

as modulator inflammatory

mediators. All the regulatory

responses of APOE are mediated

by interactions of a number of

proteins which bind to both proximal

and distal regions of the APOE gene

promoter. The identification and

characterization of components

involved in this transcriptional

machinery constitutes the aim of our

group.

In the last two years, we have

identified three binding sites for the

transcription factors ZIC1 and ZIC2

able to trans-stimulate chimeric

constructions or endogenous

expression of apoE. Although Zic

proteins seem to be involved in the

embryonic development, further

clarification of its natural targets still

would be necessary. By using cDNA

microarrays we have found that,

apart of APOE, other genes are

regulated by Zic. Some of the

observed changed gene expression

patterns may explain the

holoprosencepfaly 5 phenotype, a

inherited disease related to Zic

mutations. Currently we are

interested in finding new

transcription factors involved in the

regulation of apoE, specially those

associated to neural injury and in

development.

73

Regulation of the apolipoprotein E geneexpression


Genomic and proteinic structure of the lipoprotein E

Jefe de Linea / Group Leader:

Rafael Manso Martínez

Doctorandos / Graduate Students:

Beatriz González Alonso,

Pilar Negredo Madrigal (desde Abril de

2000)

D.5

74



El interés investigador del laboratorio seha centrado en tres aspectos. Un primeraspecto se refiere a la caracterización defactores y mecanismos implicados en laadaptación al ejercicio crónico,considerando el posible papel de larespuesta celular de estrés y la participaciónde las proteínas de estrés en este proceso.

La expresión incrementada de algunasproteínas de estrés proporciona un soportemolecular para entender la forma en queel músculo esquelético puede incrementarsu tolerancia al ejercicio, aún antes de quese observen otros cambios fenotípicos. Laadaptación de células no contráctiles, comolas del hígado, podría implicar señales quese liberan durante la actividad física, seaen el músculo o en otros tejidos, que sedistribuyen por todo el organismo. Lainducción de la respuesta celular de estréstras ejercicio en células hepáticas, podríaexigir la intervención de hormonas de estrésquizás con la participación de otrosmensajeros celulares entre los que, por sufunción reguladora de la inflamación y laremodelación tisular, se están estudiandolas citoquinas. El segundo de los objetivos

investigadores del laboratorio se dirige adeterminar el mecanismo molecularresponsable de la diversidad de variantesde las isoformas lenta y rápida de lascadenas ligeras reguladoras de la miosina(rMLCs) de músculo estriado, considerandola posibilidad de fosforilación múltiple.

El interés de este estudio es doble, ya quepodría contribuir a entender el papel de lasdiferentes isoformas de las rMLCs y de susestados fosforilados en el ciclo decontracción-relajación muscular y aestablecer una posible correlación entreestas variantes y las isoformas conocidasde las cadenas pesadas de miosina en elmúsculo esquelético adulto. El terceraspecto se refiere a la influencia de factoresneurales y hormonales en la expresión deproteínas contráctiles y de estrés en elmúsculo esquelético, utilizando para ellomodelos de ratas ejercitadas,cordotomizadas y estimuladaseléctricamente (a través del nervio) conpatrones definidos de impulsos.

Bases moleculares de la adaptación alejercicio y de la plasticidad muscular


González, B., R. Hernando y R. Manso. (1999)

Caracterización de la respuesta celular de

estrés inducida por el ejercicio: Efecto de la

aplicación de un programa incremental de

entrenamiento en tapiz rodante. Serie Icd,

Investigaciones en Ciencias del Deporte 23,

69-94

González, B., R. Hernando and R. Manso.

(2000). Stress proteins of 70 kDa in chronically

exercised skeletal muscle. Pflügers Arch-Eur.

J. Physiol. 440, 42-49

González, B., R. Hernando and R. Manso.

(2000). Anabolic steroid and gender-dependent

modulation of cytosolic HSP70s in fast- and

slow-twitch skeletal muscle. J. Steroid Biochem

Molec Biol. 74, 63-71

Molecular bases of the adaptation to exerciseand of skeletal muscle plasticity

75

Research Summary

The research interest of the laboratory wasdirected toward three main objectives. Oneof the research aims was to characterizefactors and mechanisms involved in wholeorganism adaptation to chronic exercise,considering the possible role of the cellularstress response and the participation ofstress proteins in this process. Expressionof increased levels of some stress proteinsprovides molecular support to understandingthe way skeletal muscle fibres increase theirtolerance to exercise, even before otherphenotypic changes may be observed.

Adaptation of non-contractile cells, such asthose of the liver parenchyma, could involvesignals that are liberated during physicalactivity from skeletal muscle or other tissuesand are distributed through the wholeorganism. Induction of the cellular stressresponse following exercise in the liver,could require increased levels of stresshormones, eventually associated with thepresence of other intercellular messengers.Due to their putative regulatory role ininflammation and tissue remodelling, therole of some cytokines is being the object

of consideration. A second research aimwas directed towards an understanding ofthe mechanism involved in generating thediversity of variants of the fast and slowisoforms of the regulatory myosin light chains(rMLCs) that we have detected in differentskeletal muscle types of various mammals,considering the possibility of multiplephosphorylation.

The interest of this study is dual, to interpretthe role of the different rMLC-isoforms andof their phosphorylation states in the cross-bridge cycle and to determine the possiblecorrelation between rMLC-variants and theknown isoforms of the myosin heavy chainsin adult skeletal muscle. A third researchaim concerns the effects of neural andhormonal factors in defining the expressionof contractile and stress proteins in skeletalmuscle, using models of exercising rats,spinal cord transection and indirect (throughthe nerve) electrical stimulation with definedimpulse-patterns.

Resumen de investigación

Los receptores acoplados a proteínas G

(GPCR) median las acciones de múltiples

mensajeros que controlan la diferenciación,

proliferación y función celular. Además de

con proteínas G heterotriméricas, los GPCR

activados interaccionan con quinasas de

receptores acoplados a proteínas G (GRKs)

y con las proteínas moduladoras

denominadas arrestinas. Estas proteínas

desempeñan diversos papeles muy

importantes: desacoplan los GPCR de las

proteínas G (desensibilización); promueven

la internalización y reciclaje de receptores;

y permiten el reclutamiento de otras

proteínas celulares, iniciando así nuevas

vías de señalización, como la modulación

de cascadas de quinasas mitogénicas

(MAPK) por GPCR. Por tanto, GRKs y

arrestinas son tanto moduladores como

componentes esenciales de la transducción

de señales mediada por GPCR. Nuestro

laboratorio tiene especial interés en el

estudio de su papel en el sistema

cardiovascular y en células del sistema

inmune, ya que alteraciones en GRKs se

han asociado a situaciones de fallo cardiaco

congestivo, hipertrofia cardiaca o

hipertensión, así como a procesos

inflamatorios.

En este contexto, los principales objetivos

de nuestro grupo son: 1) profundizar en las

interrelaciones funcionales entre las GRKs

y componentes de las vías de señalización

desde GPCR a cascadas MAPK; 2)

investigar los principales mecanismos que

gobiernan la actividad y expresión de GRKs

y arrestinas; 3) identificar nuevos sustratos

y funciones celulares para GRKS; y 4)

comprender el papel de GRKs en procesos

de migración celular en respuesta a

quimioquinas y en el desencadenamiento

y progresión de patologías cardiovasculares,

para así contribuir a la identificación de

nuevas dianas y estrategias terapeúticas.

Así, durante este periodo nuestro laboratorio

ha identificado la fosforilación de GRK2 por

c-Src y MAPK, lo que puede alterar la

actividad de esta quinasa, promover su

degradación por la vía del proteasoma y

modular la interacción de GRK2 con Gq.

También hemos descrito alteraciones en

los niveles de GRKs en hipotiroidismo,

estudiado en detalle la regulación de la

actividad transcripcional del promotor del

gen GRK2 humano en células del sistema

cardiovascular y caracterizado el patrón de

expresión de GRK2 en el desarrollo

embrionario del ratón. Se han identificado

a las fosducinas como nuevos sustratos

solubles de GRK, y se ha avanzado en el

estudio de los mecanismos y regulación de

la señalización de distintos GPCRs (ß-

adrenérgicos y de quimioquinas) a cascadas

MAPK. Además de este tema principal,

nuestro grupo colabora con otros

laboratorios del Centro en el estudio de la

relación entre sistemas de señalización

celular y procesos alterados en la

enfermedad de Alzheimer.

Jefe de Línea / Group leader:

Federico Mayor, jr.


personnel:

Ana Ruiz-Gómez

Catalina Ribas

Cristina Murga (desde Abril 2001)


Post-doctoral Fellows:

Esperanza Morato

Petronila Penela


Students:

Ana Elorza

M. Carmen Jiménez

Susana Sarnago

Sandra Peregrín

Antonio Sobrado

Técnico de investigación / Technical

Assistance:

Ramón Campos

Científicos Visitantes / Visiting

Scientists:

Stefania Mariggio (Consorzio Mario

Negri Sud, Italia)

Modelo propuesto para la implicación de ß-arrestina y Src en la degradación de GRK2

Proposed model for the ß-arrestin and c-Src-mediated degradation of GRK2

Mecanismos de señalización y regulación dereceptores acoplados a proteínas G.

D.6

76


Sarnago, S., Elorza, E. and Mayor, F., Jr. (1999) Agonist-

dependent phosphorylation of the G protein-coupled

receptor kinase 2 (GRK2) by Src tyrosine kinase. J. Biol.

Chem. 274, 34411-34416

Avila, J. and Mayor, F., Jr. (1999) Eladio Viñuela, pioneer

of molecular biology in Spain. (Obituary) Nature 400, 822

Mayor, F., (1999) Jr. Mecanismos de regulación de

receptores acoplados a proteínas G. en Transducción

de señales como diana farmacológica. (J.M. Baeyens y

A. Zorzano, editores). Monografías Dr. Antonio Esteve,

Barcelona

Ramos-Ruiz, R., Penela, P., Penn, R.B. and Mayor, F.,

Jr. (2000) Analysis of the human G protein-coupled

receptor kinase 2 (GRK2) gene promoter. Regulation by

signal transduction systems in aortic smooth muscle

cells. Circulation 101, 2083-2089

Elorza, A., Sarnago, S. and Mayor, F., Jr. (2000) Agonist-

dependent modulation of G protein-coupled receptor

kinase 2 by mitogen-activated protein kinases. Mol.

Pharmacol. 57, 778-783

Penela, P., Alvarez-Dolado, M., Muñoz, A. and Mayor,

F., Jr. (2000) Expression patterns of the regulatory proteins

G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) and ß-

arrestin 1 during rat postnatal brain development. Effect

of hypothyroidism. European J. Biochem. 267, 4390-

4396

Sefton, M., Blanco, J.M., Penela, P., Mayor, F., Jr. and

Nieto, A.M. (2000) Expression of the G protein-coupled

receptor kinase 2 during early mouse development. Mech.

of Development 98, 127-131

Ruiz-Gómez, A., Humrich, J., Murga, C., Quitterer, U.,

Lohse M.J., and Mayor, F., Jr. (2000) Phosphorylation of

phosducin and phosducin-like protein by G protein-

coupled receptor kinase 2. J. Biol. Chem. 275, 29724-

29730

G protein-coupled receptors signaling andregulatory mechanisms.


Research Summary

G protein-coupled receptors (GPCR)

mediate the actions of a variety of

messengers that modulate cell function,

proliferation and differentiation. Activation

of GPCR leads to its interaction with at

least two kinds of proteins: heterotrimeric

G proteins and GRKs (G protein-coupled

receptor kinases), which in turn promote

the binding of arrestins. GRKs and

arrestins play different important roles:

they uncouple GPCR from G proteins

(desensitization); promote GPCR

internalization and recycling; and allow

the recruitment of other cellular proteins,

thus triggering new signaling pathways,

such as the modulation of MAPK

cascades by GPCR. Therefore, GRKs

and arrestins can be considered as both

regulators and key components of the

GPCR signal transduction pathways. Our

laboratory is specially interested in

understanding the role of these proteins

in the cardiovascular system and in

immune cells, since alterations in GRKs

levels have been related to congestive

heart failure, cardiac hypertrophy or

hypertension, and to inflammatory

processes.

In this context, the main objectives of our

group are: 1) to study the functional

relationships among GRKs and different

components of the GPCR signaling

pathways leading to the activation of

MAPK cascades; 2) to investigate the

mechanisms governing the activity and

expression levels of GRKs and arrestins;

3) to identify new substrates and cellular

functions for GRKs; and 4) to understand

the role of GRKs in chemokine-induced

cell migration and in the triggering and

progression of cardiovascular diseases,

thus contributing to the identification of

new therapeutic targets and strategies.

Along these lines, our laboratory has

reported during this period the

phosphorylation of GRK2 by c-Src and

MAPK, that leads to changes in kinase

activity, promotes its degradation by the

proteasome pathway and modulates the

GRK2/Gq interaction. We have also

described changes in GRK2 levels in

hypothyroidism, investigated the

modulation of the transcriptional activity

of the human GRK2 gene promoter in

cardiovascular cells, and characterized

the GRK2 expression pattern in the mouse

embryo. We have identified the

phosducins as new cellular targets for

GRKs, and we have investigated in detail

the mechanisms and regulation of ß-

adrenergic and chemokine receptor

signaling to MAPK cascades. In addition

to this main effort, our laboratory

collaborates with other groups in our

Center in the study of relationships

between signal transduction pathways

and cellular alterations in Alzheimer's

disease.

77

La estimulación de receptoresß2AR promueve la redistribuciónde ß-arrestina.Células 293 que expresan Flag-ß2AR y ß-arrestina2-GFP seincubaron en ausencia (C) opresencia de isoproterenol 10µMdurante 5 min y la localización delreceptor y la ß-arrestina se analizómediante microscopía confocal,utilizando anticuerpos monoclonalesanti-Flag (color rojo), o lafluorescencia de ß-arrestina-GFP(color verde).

ß2AR stimulation promotesß-arrestin translocation .293 cells expressing Flag ß2AR andß-arrestin2-GFP were incubated inthe absence (C) or presence of10µM isoproterenol for 5 min, andthe localization of these protein wasanalyzed by confocal microscopyusing anti-Flag monoclonalantibodies (red color) or thefluorescence of ß-arrestin-GFP(green color)


Tras caracterizar la afinidad de los

nucleótidos de guanina (GNs: GMP y

análogos lentamente hidrolizables de GDP

y GTP) por los receptores ionotrópicos de

glutamato (iGluRs) (ver Memoria anterior),

hemos analizado la relevancia fisiológica

de dicha interacción mediante paradigmas

experimentales que ponen de relieve la

modulación funcional de los iGluRs por los

GNs. Así, utilizando registros eléctricos (con

fijación de potencial) en ovocitos quiméricos

de Xenopus, que incorporan fragmentos de

membranas celulares de retina de pollo,

hemos demostrado que la interacción de

los GNs con el receptor de AMPA se traduce

en un claro efecto antagonista de las

respuestas del receptor al agonista kainato.

Otro ensayo de la activación de los

receptores de AMPA, kainato y NMDA,

midiendo la entrada de 45Ca2+ mediada por

los respectivos agonistas, en explantes de

retina embrionaria de pollo, confirma este

antagonismo funcional. A la vista de estos

resultados hemos valorado la capacidad

neuroprotectora de los GNs frente a la

excitotoxicidad de los agonistas

glutamatérgicos en tres protocolos

experimentales. Así, los GNs protegen

contra la toxicidad derivada de la adición

directa de agonistas al medio, o de la

supresión del Ca2+ (que hipersensibiliza el

receptor de NMDA), en explantes de retina

embrionaria de pollo y, más

específicamente, el GMP protege contra

las convulsiones causadas por la inyección

intracerebroventricular de ácido quinolínico

(agonista específico del receptor de NMDA)

en ratones.

En función de estos resultados estamos

diseñando, mediante modelización

molecular, una nueva línea de antagonistas

de glutamato que interaccionarían con los

iGluRs de la misma forma que lo hace el

GMP.


Galo Ramírez


personnel:

Ana Barat

Jesús Mendieta (Dr. contratado / under

contract)

Becario Predoctoral / Predoctoral

Fellow:

Javier S. Burgos

Técnicos de Invest igación /


José Luis García-Mira

Interacción de los nucleotidos de guanina conlos receptores ionotrópicos de glutamato

D.7

78


Interaction of guanine nucleotides withionotropic glutamate receptors

Research Summary

After confirmation and characterization

of the affinity of guanine nucleotides (GNs:

GMP and slowly hydrolyzable analogs of

GDP and GTP) for ionotropic glutamate

receptors (iGluRs) (see previous Report)

we have studied the physiological

meaning of such interaction in

experimental paradigms geared to

evidence a functional modulation of

iGluRs by GNs. Voltage-clamp recordings

in chimeric Xenopus oocytes,

incorporating chick retinal cell

membranes, show that GNs antagonize

kainate responses in AMPA receptors, in

a dose–dependent manner. GNs also

block agonist-induced 45Ca2+ inflow in

chick embryonic whole retinal explants.

In view of this consistent antagonistic

behavior we have analyzed the possible

neuroprotective properties of GNs in three

different excitotoxicity protocols. Thus,

GNs efficiently protect against the toxicity

caused by glutamatergic agonists added

to the medium in high concentrations, or

by Ca2+ omission (which destabilizes the

NMDA receptor), in chick embryonic whole

retinal explants. Furthermore, GMP blocks

convulsive crises caused by

intracerebroventricular injections of

quinolinic acid (a NMDA receptor-specific

agonist) in mice.

Taking into account these results we are

designing a new line of glutamate

antagonists that interact with the active

site of the iGluRs in the same way as

GMP does.

79


Aleu, J., Barat, A., Burgos, J., Solsona, C., Marsal, J.

and Ramírez, G. (1999) Guanine nucleotides, including

GMP, antagonize kainate responses in Xenopus oocytes

injected with chick cerebellar membranes. J. Neurochem.

72, 2170-2176.

Tasca, C.I., Burgos, J.S., Barat, A., Souza, D.O. and

Ramírez, G. (1999) Chick kainate binding protein lacks

GTPase activity. NeuroReport 10, 1981-1983.

Ramírez, G. (1999) La excitotoxicidad en la patología

del sistema nervioso central: mecanismos y estrategias

terapéuticas. En, Miguel Kreisler, In memoriam. Clínica

Puerta de Hierro 1997-1998, pp. 133-143.

Burgos, J.S., Barat, A., and Ramírez, G. (2000) Guanine

nucleotides block agonist-driven 45Ca2+ influx in chick

embryo retinal explants. NeuroReport 11, 2303-2305.

Burgos, J.S., Barat, A., and Ramírez, G. (2000) Cl- -

dependent excitotoxicity is associated with 3H2O influx in

chick embryonic retina. NeuroReport 11, 3779-3782.

Burgos, J.S., Barat, A., and Ramírez, G. (2000) Ca2+ -

dependent kainate excitotoxicity in the chick embryonic

neural retina ex vivo. NeuroReport 11, 3855-3858.


Burgos, Javier S. (2000). Interacción de los nucleótidos

de guanina con los receptores ionotrópicos de glutamato.

Facultad de Ciencias, Universidad Autónoma de Madrid.

Sobresaliente cum laude.


Nuestro laboratorio estudia los

mecanismos moleculares del

envejecimiento, neurodegeneración y

neuro-regeneración en el sistema

nervioso central y la resistencia a la

insulina en la vejez.

La regulación celular de calcio en

neuronas cerebrales se desajusta en la

vejez, particularmente la distribución de

calcio en mitocondrias. Las proteinas

responsables de esta distribución se

desconocen aún, y estamos intentando

identificarlas mediante la información

disponible tras la secuenciación de

genomas completos. Así hemos

encontrado Aralar1 y citrin/Aralar2, dos

isoformas del primer transportador de

metabolitos mitocondrial regulable por

calcio. Estamos ahora estudiando la

función transportadora de estas

proteinas y su papel en neuronas.

Para entender el papel de la mitocondria y

los transportadores mitocondriales en

neurodegeneración, estamos estudiando

la muerte neuronal producida por la

exposición a beta-amiloide, el péptido que

se acumula en las placas seniles en la

enfermedad de Alzheimer. Estudiamos los

sucesos tempranos que conducen a la

muerte celular en este modelo incluyendo

la activación de caspasas, y el papel de la

provisión de sustratos a la mitocondria en

la regulación de la muerte celular por

necrosis o apaptosis.

Un instrumento prometedor para evitar la

degeneración del SNC se basa en el uso

de células troncales neurales para el

diseño de terapias de reemplazamiento

celular, así como terapia génica ex vivo,

como la transferencia génica de factores

neurotróficos. Hemos desarrollado las

condiciones para la expansión e

inmortalización de estas células, para

generar lineas neurales útiles en estudios

bioquímicos y moleculares, que además

mantienen propiedades adecuadas para

su transplante cerebral. Además, como

estas lineas siguen siendo multipotentes,

estamos explorando como instruir a estas

células para seguir programas de

diferenciación específcos de los linajes de

neuronas, astrocitos o oligodendrocitos

humanos.

La resistencia a la insulina del

envejecimiento implica múltiples

modificaciones en la transducción de la

señal de la insulina en adipocitos.

Estamos estudiando las vías de

señalización implicadas en las acciones

lipogénica y antilipolítica de la insulina en

adipocitos. Además, como hormona

relacionada con la obesidad y la insulina,

estamos estudiando a la leptina, para

conocer si sus acciones en células diana

se modifican en animales viejos y

pudieran contribuir a la alteración de la

homeostasis metabólica de la vejez.

Jefe de Linea / Group leader:Jorgina Satrústegui

Personal Cientifico / ScientificPersonnel:Elena Bogónez,Jose M. Carrascosa,Alberto Martinez-Serrano

Becarios Postdoctorales /Postdoctoral Fellows:Ana Villa, Milagros Ramos, BeatrizPardo (desde Marzo 2000)

Becarios Predoctorales / GraduateStudents:Gema Alvarez, Yasmin Fermín,Francisco Javier Rubio, SantiagoCavero, Beatriz Navarro, CarlosBueno, Coralia Perez, BelénPrados (hasta Octubre 2000).

Estudiantes de Licenciatura /Undergraduate Students:Carmen Galián (Marzo 1999-Octubre2000 ), Vera Martos (Marzo 1999-Octubre 2000), Ivan Andres Chignier(Octubre 1999 a Junio 2000).

Tecnicos de Investigación /Technical Assistance:Bárbara Sesé, Inmaculada Ocaña(desde Enero 2000).

Científicos Visitantes / Visiting

Scientists:Araceli del Arco (Universidad deCastilla-la-Mancha)Miguel Hernández-Carrasquilla(Conserjería de Salud, ComunidadAutónoma de Madrid)

Mecanismos de envejecimiento yneurodegeneracion

D.8

80


Mechanisms of ageing and neurodegeneration

Research Summary

Our laboratory is interested in the study

of the molecular mechanisms of ageing,

neurodegeneration and neuro-

regeneration in the central nervous

system, and in the study of insulin

resistance in ageing.

Calcium regulation in neurons becomes

impaired during ageing, and calcium

handling by neuronal mitochondria is

particularly affected. The proteins

responsible for calcium handling in brain

mitochondria are still unknown, and we

are attempting to identify these proteins

with the use of the information available

from the sequencing of complete

genomes. We have thus found Aralar1

and citrin/Aralar2, two isoforms of the

first mitochondrial metabolite carrier

known to be regulated by calcium. We

are currently studying the transporter

function of these proteins, and their role

in neuronal function in health and

disease.

To understand the role of mitochondria

and mitochondrial carriers in

neurodegeneration, we are studying

neuronal death obtained by exposure to

beta-amyloid, the peptide that

accumulates in senile plaques

characteristic of Alzheimer’s disease.

We are currently analyzing the early

events that trigger cell death in this

paradigm, the activation of caspases,

and the role of metabolite supply to

mitochondria as means of regulation of

cell death by necrosis or apoptosis.

A promising tool to prevent CNS

degeneration relies in the use of

multipotent neural stem cells for the

design of cell replacement- and ex vivo

gene- therapies, such as gene transfer

of neurotrophic factors. We are

presently using human derived neural

stem cells and have set up conditions to

expand and immortalize them, to

generate cell lines useful for

biochemistry and molecular biology

studies, while retaining optimal

properties for their transplantation to the

brain. In addition, as these cell lines are

still multipotent, we are exploring how to

instruct them to follow specific

developmental programs for human

neurons, astrocytes and

oligodendrocytes.

Insulin resistance during ageing

involves a number of modifications in

insulin signal transduction cascade in

adipocytes. We are now exploring the

pathways involved in the lipogenic and

antilipolitic actions of insulin in

adipocytes. In addition, as an obesity-

and insulin- related hormone, we are

studying leptin, to investigate whether

its actions in target cells are modified in

old rats and may contribute to the

altered homeostasis of ageing.

81


Alvarez, A., Muñoz-Montaño, JR., Satrustegui, J., Avila, J.,Bogónez, E., and Diaz-Nido, J. (1999) Lithium protectscultured neurons against -amyloid-inducedneurodegeneration. FEBS Lett. 453, 260-264.

Rubio FJ., García-Simón MI., Kokaia Z., Lindvall O., delArco A., Satrústegui J. and Martínez-Serrano A. (1999)BDNF-gene transfer to the mammalian brain using CNS-derived neural precursors. Gene Therapy, 6, 1851-1866.

Del Arco, A., Agudo, M., & Satrústegui, J. (2000)Characterization of a second member of the subfamily ofcalcium binding mitochondrial carriers expressed in humannon-excitable tissues. Biochem J. 345, 725-732.

Sanz, R., del Arco, A., Ayuso, C., Ramos, C., andSatrústegui, J. (2000) Assignment of the calcium-bindingmitochondrial carrier gene ARALAR1, to humanchromosome band 2q31 by in situ hybridization.Cytogenetics and Cell Genetics 89, 143-4.

Ruiz F, Alvarez G, Ramos M, Hernandez M, Bogonez E,Satrústegui J. (2000) Cyclosporin A targets involved inprotection against glutamate excitotoxicity. Eur JPharmacol. 404, 29-39.

Villa A, Snyder EY, Vescovi, A and Martínez-Serrano A(2000) Establishment and properties of a growth factordependent, perpetual neural stem cell line from the humanCNS. Experimental Neurology, 161, 67-84.

Dissen GA, Lara HE, Leyton V, Paredes A, Hill DF, CostaME, Martinez-Serrano A and Ojeda SR (2000) Intraovarianexcess of nerve growth factor increases androgen secretionand disrupts estrous cyclicity in the rat. Endocrinology,141,1073-1082.

Rubio JF, Villa A, Navarrro B, Bueno C and Martínez-Serrano A (2000) Genetically perpetuated Human NeuralStem Cells engraft and differentiate into the adultmammalian brain. Molecular and Cellular Neuroscience, 16,1-13.

Martínez-Serrano A, Villa A, Navarro B, Rubio FJ and BuenoC (2000) Human neural progenitor cells: Better blue thangreen?. Nature Medicine, 6, 2-3.

Tesis doctorales/ Doctoral theses

Mª Isabel Garcia Simón. Caracterización del antiportadorH+/Ca2+ y otros posibles transportadores mitocondrialesdependientes de calcio. Generación de herramientas parasu identificación mediante estudios de diferenciación yregulación de calcio en células neurales. Diciembre 1999.Universidad Autónoma de Madrid. Sobresaliente CumLaude.

Gema Alvarez Nieto. Sucesos tempranos en laneurodegeneración inducida por el péptido -amiloide en unmodelo de cultivo primario de neuronas..Octubre 2000.Universidad Autónoma de Madrid. Sobresaliente CumLaude.


La de Alzheimer es una enfermedad

compleja resultante de la interacción entre

una serie de factores genéticos y no

genéticos. El alelo 4 de la apolipoproteína

E (APOE, gen; ApoE, proteína) es el factor

genético más relevante en cuanto al riesgo

para la forma senil de la enfermedad de

Alzheimer (EA); de los otros genes

asociados con la EA, son de especial interés

el de la proteína relacionada con el receptor

de LDL (LRP) y el de la α-2 macroglobulina

(A2M), ya que dichas proteínas están

funcionalmente relacionadas con la ApoE

y con la proteína precursora del péptido

beta amiloide (Aβ), la APP. La manera en

la que participan ApoE, LRP y A2M en la

patogénesis de la EA es aún desconocida,

aunque una serie de evidencias sugieren

que las alteraciones estructurales, o en los

niveles de cualquiera de ellas, podrían

provocar un desequilibrio de sus

interacciones, interferiendo en el correcto

aclaramiento del Aβ y generando agregados

tóxicos para las neuronas. Si esto es cierto,

estas proteínas compondrían un módulo

funcional, y los polimorfismos en cada uno

de los genes podrían modular el riesgo

asociado a los demás. Con el fin de estudiar

la contribución de APOE, LRP y A2M al

riesgo de EA y las posibles interacciones

entre ellos, hemos llevado a cabo un estudio

de polimorfismos en una muestra caso-

control de EA esporádica. El estudio mostró

que los polimorfismos en la región

codificante y promotora de APOE están

asociados con susceptibilidad para la EA.

También se observó interacción entre estos

dos polimorfismos, sugiriendo que el efecto

combinado de la estructura y los niveles de

apoE es relevante en relación con la EA.

Los datos indican que el sexo modula el

riesgo asociado a polimorfismos en el

promotor de APOE y en el gen LRP,

sugiriendo que estos genes pueden ser, al

menos en parte, responsables del menor

riesgo de EA observado en los varones

respecto a las mujeres. El estudio de un

polimorfismo en el gen tau mostró que un

alelo de éste está asociado con riesgo para

EA en individuos portadores del alelo apoE4,

lo que sugiere que el efecto combinado de

ApoE y tau es relevante en relación con la

patogénesis de la EA.

Además de los estudios genéticos, estamos

desarrollando modelos celulares y animales

de la EA mediante manipulación genética

de los factores de susceptibilidad para la

enfermedad.


Fernando Valdivieso


Personnel:

Mª Jesús Bullido,

José A. López-Guerrero



Jesús Aldudo,

Mª Jesús Artiga,

María Recuero

Becarios Predoctorales /

Graduate Students:

María Alonso, Julio Pozueta,

Mª Carmen Ramos,

Elena Serrano

Técnica de Investigación /


Isabel Sastre

Neuropatología molecular de la enfermedadde Alzheimer

D.9

82


Molecular neuropathology of Alzheimer’sdisease

Research Summary

Alzheimer’s disease (AD) appears to be

a complex trait resulting from the

interaction between genetic and non-

genetic factors. The E4 allele of

apolipoprotein E (APOE, gene; ApoE,

protein) is the most important genetic

determinant for late-onset AD; from the

other genes reported as AD risk factors,

the protein related with the LDL receptor

(LRP) and the α2-macroglobulin (A2M)

are of interest, since they are functionally

related with ApoE and with the β-amyloid

peptide (Aβ) precursor (APP). Current

evidences suggest a scenario in which

different isoforms and/or activities of apoE,

APP, and/or A2M could produce a

decreased clearance of Aβ through LRP,

resulting in enhanced A deposition and

toxicity. If this hypothesis is true, functional

polymorphisms in each of these genes

could modulate the AD susceptibility

conferred by the other ones. With the aim

of finding out the contribution of APOE,

LRP and A2M to AD risk and the possible

interactions between them, we have

analysed polymorphisms in a sample of

sporadic AD cases and controls. The

study shows that polymorphisms in the

coding (apoE4) and promoter region of

APOE were associated with AD

susceptibility. Besides, an interaction

between these two types of polymorphism

seems to exist, suggesting that the

combined effect of apoE structure and

levels is relevant in relation with AD. The

study also suggest that gender modulates

AD risk associated with APOE and LRP

polymorphisms, and raise the possibility

that the effect posed by these loci could

be, at least in part, responsible for the

lower AD risk observed in males

compared to females. We also have

analyzed a polymorphism in the tau gene,

and found that is associated with AD risk

in individuals carrying the apoE4 allele,

strongly suggesting that the combined

effect of tau and apoE is relevant in

relation with AD pathogenesis.

In addition to the genetic approach, we

are developing cellular and animal models

of AD by genetic manipulation of

susceptibility factors for the disease.

83


Aldudo, J., Bullido, M.J., Valdivieso, F. (1999). A DGGE method

for the mutational analysis of the coding and proximal promoter

regions of the Alzheimer’s disease presenilin-1 gene". Hum.

Mutat. 14, 433-439

Chen, L., Baum, L., Ng, H.K.,. Chan, L.Y.S, Sastre, I, Artiga,

M. J., Valdivieso, F, Bullido, M. J., Chiu, H.F.K., Pang, C.P.

(1999). Apolipoprotein E promoter and 2-Macroglobulin

polymorphisms are not genetically associated with Chinese

late onset Alzheimer's disease. Neurosci Lett 269:173-177

Garcia MA, Campillos M, Marina A, Valdivieso F,

Vazquez J. (1999). Transcription factor AP-2 activity is

modulated by protein kinase A-mediated phosphorylation.

FEBS Lett 444:27-31

Bullido MJ, Aldudo J, Frank A, Coria F, Avila J, Valdivieso F.

(2000). A polymorphism in the tau gene associated with risk

for Alzheimer's disease. Neurosci Lett 278:49-52

Garcia MA, Campillos M, Ogueta S, Valdivieso F, Vazquez J.

(2000). Identification of amino acid residues of transcription

factor AP-2 involved in DNA binding. J Mol Biol 301:807-16

Bullido MJ, Guallar-Castillón P, Artiga MJ, Ramos MC, Sastre

I, Aldudo J, Frank A, Coria, F, Rodriguez-Artalejo F, Valdivieso

F. (2000). Alzheimer's risk associated with human apolipoprotein

E, alpha-2 macroglobulin and lipoprotein receptor related

protein polymorphisms: absence of genetic interactions, and

modulation by gender. Neurosci Lett 289: 213-6

Bullido MJ, Valdivieso F. (2000). Apolipoprotein E gene promoter

polymorphisms in Alzheimer's disease”. Microsc Res

Tech 50: 261-7


El funcionamiento normal del sistema

nervioso depende de la capacidad de las

células nerviosas para adaptarse a distintas

situaciones de su entorno. Esta capacidad,

denominada plasticidad neuronal, se

manifiesta especialmente durante el

desarrollo -generación y especificación de

circuitos básicos-, la regeneración que sigue

al daño neuronal -formación de nuevos

contactos sinápticos- y los procesos de

aprendizaje y almacenamiento de

información (Memoria) -en los que se

producen cambios en el número y eficacia

de los contactos sinápticos. El conocimiento

profundo de los mecanismos moleculares

responsables de la plasticidad neuronal

abrirá fundamentadas expectativas en el

desarrollo de tratamientos que promuevan

la recuperación funcional después de

lesiones medulares y en el desarrollo de

tratamientos más eficaces y específicos

para prevenir la neurodegeneración masiva

asociada a las epilepsias.

Nuestro trabajo de investigación se orienta

hacia la comprensión de los mecanismos

moleculares que sustentan el crecimiento

y navegación de axones, su ramificación y

el establecimiento de contactos sinápticos

funcionales. Más concretamente, estamos

interesados en analizar las características

estructurales y funcionales de proteínas

neuronales asociadas a la plasticidad neural.

Durante el período 1999-2000 hemos

trabajado con Neurogranina, una proteína

muy abundante en regiones telencefálicas

de localización dendrítica, y con GAP-43,

una proteína con elevadas tasas de

expresión durante el desarrollo del sistema

nervioso y durante los procesos de

regeneración post-lesión.

Ambas proteínas son firmes candidatas a

intervenir en procesos de plasticidad

neuronal debido a su localización altamente

polarizada en neuronas, su interacción con

calmodulina de modo dependiente de

fosforilación por proteína kinasa C y su

capacidad de modificar el dinamismo del

citoesqueleto de actina, posiblemente a

través de su interacción con fosfolípidos.

Nuestra hipótesis de trabajo propone que

ambas proteínas están implicadas en

promover desorganización del citoesqueleto

de actina en zonas restringidas de la

membrana plasmática, lo cual promueve

una mayor dinamismo del mismo en

respuesta a señales externas y la formación

de frentes de avance (lamelipodios) y

filopodios.


F. Javier Díez Guerra

Becarios Predoctorales / Predoctoral

Fellowships:

Noa Martín Cófreces



Paloma Rodríguez Sánchez

Técnicos de Investigación /


Carlos F. Parrondo Vélez

Lorena Barrero Hervás

Pedro Sanz Ballesteros

D.10

84

NeurobiologíaNeurobiology Bases Moleculares de la Plasticidad Neuronal

Molecular basis of neuronal plasticity

Research Summary

The normal operation of the nervous

system depends on the capacity of

nervous cells to adapt to different

situations of its environment. This capacity,

also called neuronal plasticity, is especially

manifested during the development -

generation and specification of basic

circuits -, post-traumatic neuronal

regeneration -formation of new synaptic

contacts - and in the processes of learning

and storage of information (Memory) -in

which changes in the number and efficacy

of synaptic contacts take place. A deeper

knowledge of the molecular mechanisms

responsible for neuronal plasticity will

open new horizons in the development

of treatments that promote functional

recovery after medullary lesions and in

the development of more effective and

specific treatments to prevent the massive

neurodegeneration associated to the

epilepsies.

Our investigation effort is focused at the

understanding of the molecular

mechanisms responsible of axonal growth

and orientation, its ramification and the

establishment of functional synaptic

contacts. More specifically, we are

interested in analyzing the structural and

functional characteristics of proteins

associated to neuronal plasticity. During

the 1999-2000 period we have worked

with Neurogranin, a very abundant protein

in telencephalic regions which localizes

in dendrites, and GAP-43, a protein with

high expression levels during the

development of the nervous system and

post-lesion regeneration processes.

Both proteins are firm candidates to

intervene in processes of neuronal

plasticity based on their highly polarized

localization in neurons, their interaction

with calmodulin which is dependent of

protein kinase C phosphorylation and

their ability to modify the dynamism of

the actin cytoskeleton, possibly through

their interaction with phospholipids.

Our working hypothesis puts forward that

both proteins are implicated in promoting

actin disorganization in restricted areas

of the plasma membrane. This implies

localized increases in cytoskeleton

dynamism and enhanced responses to

external signals that initiate the formation

of lamellipodia and filopodia.

85


Pedro Tejero-Díez, Paloma Rodríguez-Sánchez y F Javier

Díez-Guerra (1999). “ Microscale purification of proteins

exhibiting anomalous electrophoretic migration. Application

to the analysis of GAP-43 phosphorylation” . Analytical

Biochemistry 274, 278-282

Pedro Tejero-Díez, Paloma Rodríguez-Sánchez, Noa

Beatriz Martín-Cófreces and F. Javier Díez-Guerra. (2000).

“bFGF stimulates GAP-43 phosphorylation at Ser41 and

modifies its intracellular localization in cultured

hippocampal neurons”. Molecular and Cellular

Neuroscience 16, 766-780

Tesis doctorales presentadas:

“Implicacion de GAP-43 en la Orientación y Avance del

Cono de Crecimiento en Neuronas de Hipocampo en

Cultivo. Análisis de su Fosforilación y Localización

Subcelular”, Dr. Pedro Tejero Díez, Universidad Autónoma

de Madrid, Facultad de Ciencias, Marzo, 1999,

Sobresaliente Cum Laude.

“Estudio Funcional e Neurogranina: Participación en

Mecanismo de Plasticidad Neuronal”, Dr Paloma

Rodríguez Sánchez, Universidad Autónoma de Madrid,

Facultad de Ciencias, Noviembre, 1999, Sobresaliente

Cum Laude.

d neurobiología neurobiology · 2015-07-06 · premio al grupo: medalla de oro de la comunidad de...

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