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Simbiosis endofítica con plantas de gramíneas Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología

Tamara García Nieto 1

DATOS DE LAS PRÁCTICAS EMPRESA: Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología

TUTOR EN LA EMPRESA: Iñigo Zabalgogeazcoa González

DIRECCIÓN: C/ Cordel de Merinas 40-52, Salamanca

DURACIÓN DE LAS PRÁCTICAS: 11 junio 2007- 28 julio 2007

17 septiembre 2007- 28 septiembre 2007 (225 horas)



ÍNDICE 1. Introducción pág. 3

2. Objetivos pág. 3

3. Metodología

3.1 Recogida de muestras pág. 4

3.2 Preparación del medio PDA pág. 5

3.3 Aislamiento del hongo endofítico Epichloe typhina pág. 6

3.4 Aislamiento del cultivo puro de Epichloe typhina pág. 6

3.5 Extracción de ADN pág. 7

3.6 Limpieza de las muestras de ADN pág. 8

3.7 PCR pág. 9

3.8 Preparación del gel de agarosa pág. 11

3.9 Electroforésis pág. 13

3.10 Revelar el gel de agarosa pág. 14

3.11 Secuenciación pág. 15

3.11.1 Purificación del ADN amplificado por PCR pág. 15

3.11.2 Cuantificación del ADN amplificado por PCR pág. 17

3.12 Tinción con azul de anilina pág. 18

4. Tratamiento informático de los datos

4.1 Chromas lite pág. 19

4.2 Clustal X pág. 19

4.3 Mega 4 pág. 20

5. Resultados pág. 20

6. Bibliografía pág. 23



SIMBIOSIS ENDOFÍTICA CON PLANTAS DE GRAMÍNEAS 1. Introducción

Los hongos endofíticos son organismos que viven en asociación con plantas en la mayor parte o

en todo su ciclo de vida, y se encuentran en las hojas y los tallos de muchas plantas. Con respecto a

nuestro estudio, se ha visto que existe una simbiosis entre las plantas pertenecientes a la familia de las

Poaceae y los hongos que pertenecen a la familia de las Clavicipitaceae. El hongo endofítico involucrado

en esta simbiosis corresponde al género Epichloe, cuya forma asexual es Neotyphodium, ganando en

esta asociación refugio, nutrición y diseminación.

Observando al microscopio se ve que el micelio de estos endofitos está localizado

intercelularmente en las hojas y en los ápices.

Los endofitos son agentes causantes de la asfixia o también llamada “choke disease” que se

caracteriza por la presencia de un estroma fúngico, cilíndrico, que envuelve la influorescencia inmadura e

inhibe el desarrollo de los tallos reproductivos.

El ciclo de vida se inicia a la vez que se produce la elongación del ápice del hospedador,

entonces se desarrolla el micelio, debido a que las hifas del hongo rodean las hojas. El espermacio es

producido en la superficie del estroma. Éste debe ser transferido al estroma del tipo contrario para que

haya cruzamiento, y se transfiere por el viento o por insectos. Después de la fertilización, los peritecios

formados en el estroma, el cual aumenta, pasa de blanco a amarillo. Dentro del peritecio hay numerosas

ascas, cada una de las cuales contiene ocho ascosporas. Las ascosporas se separan dentro del asca

para formar células individuales llamadas partesporas.

En cuanto a los efectos que el endofito produce sobre el hospedador son los siguientes: una

mayor resistencia a herbívoros debido a que los endofitos producen alcaloides que afectan principalmente

a insectos, y son tóxicos para el ganado. Un mayor desarrollo vegetativo, resistencia a patógenos

fúngicos, a sequía, bajos niveles de nutrientes, y a la presencia de metales pesados en el suelo.

2. Objetivos

Estudiar la enfermedad de asfixia o “choke disease” causada por el hongo endofítico llamado

Epichloe typhina en dos tipos de gramíneas silvestres (Dactylis glomerata y Lolium perenne). Lo que se

quiere comprobar es la hipótesis de que cada especie huésped es infectada por formas especializadas de

Epichloe typhina, y ver si la secuencia genética del hongo de cada gramínea es distinta y si esa secuencia

genética corresponderá con un fenotipo determinado o morfología determinada.

Para la realización de este trabajo se utilizará una secuencia genómica llamada tub 2 que

pertenece al gen β-tubulina, de la cual se van a utilizar los tres primeros intrones, porque son secuencias

poco parecidas en Epichloe typhina de diferentes especies. De esta manera observamos si Epichloe

typhina es la misma especie en las anteriores gramíneas citadas.



3. Metodología 3.1 Recogida de muestras

Se recolectaron dos especies de gramíneas Dactylis glomerata y Lolium perenne en distintas

dehesas localizadas en:

1. Los Valles (Sando) (Fig.1)

2. Servández (Tamames) (Fig. 2)

3. Membribe de la Sierra (Fig. 2)

4. Ermita de la Vega (cerca de Piedrahita) (Fig. 3)

5. Gargabete (Pelabravo) (Fig.1)

6. Porqueriza (Fig. 1)

Fig. 1. Los Valles, Gargabete y Porqueriza.

Fig. 2. Membribe de la Sierra y Servández.



Fig. 3. Piedrahita.

De cada gramínea seleccionada, se muestrearon 4 individuos con estroma de Dactylis

glomerata, 4 individuos con estroma de Lolium perenne y 10 individuos sin estroma de Lolium perenne.

Éstas fueron puestas en bolsas de plástico y llevadas al invernadero para transplantarlas a macetas que

contenían una mezcla de turba y perlita (1:1) a partes iguales.

3.2 Preparación del medio PDA

El medio de cultivo utilizado para el crecimiento de Epichloe typhina es agar de patata y dextrosa

(PDA). Es un medio muy nutritivo que permite el crecimiento de hongos endofíticos.

3.2.1 Materiales y compuestos

- Autoclave - Matraces

- Balanza de precisión - Vaso de precipitados

- Cámara de flujo laminar - Placas Petri

- Espátula - Medio PDA

- Mechero alcohol - Agua destilada

- Pipetas - Cloranfenicol

3.2.2 Procedimiento

Para la elaboración del medio PDA basta con disolver el agar patata dextrosa que se

comercializa como polvo, en agua destilada, agitar y añadir por último lugar un antibiótico como el

cloranfenicol que inhibe el crecimiento de bacterias. Las proporciones que utilizamos son las siguientes:

Tabla 1 Ingredientes del medio PDA

INGREDIENTES Medio PDA 0.25 g Agua destilada 800 ml Cloranfenicol 1600 μl



Una vez preparada la disolución y antes de utilizarla es necesario esterilizarla en el autoclave

entre 15 y 20 minutos a 121 ºC.

La esterilización se realiza para asegurar que el medio no contenga microorganismos ni otros

contaminantes.

El siguiente paso es verter el medio en placas Petri. Esto se realiza en condiciones totalmente

estériles, dentro de una cámara de flujo laminar.

3.3 Aislamiento del hongo endofítico Epichloe typhina El aislamiento del hongo Epichloe typhina se realiza para poder observar si la planta está

infectada por este hongo o en el caso de que ya esté presente dicho hongo en una manifestación

sintomática llamado estroma, verificar que también lo posee y obtener un cultivo puro.


- Bisturí

- Pinzas

- Mechero alcohol

- Botes pequeños

- Probeta de 50 ml

- Cámara de flujo laminar

- Lejía

- Agua destilada

- Vaso de precipitados

3.3.2 Procedimiento

De cada individuo muestreado se cortó un tallo para seccionarlo en segmentos de unos 4 mm,

para ello se utilizó un bisturí que era esterilizado en llama cada vez que se hacía un corte. Estos

segmentos de tallos se depositaron en unos botes pequeños para proceder a la esterilización de los

mismos.

La esterilización consistía en bañar a estos segmentos en agua con lejía al 20% durante 10

minutos. Pasado ese tiempo dentro de la cámara de flujo laminar se quita el agua con lejía al 20% en un

vaso de precipitados, se enjuaga con agua destilada estéril.

Después de la esterilización, las secciones correspondientes a cada tallo se colocaron en cajas

Petri con agar patata dextrosa (PDA) dentro de la cámara de flujo laminar y con pinzas lavadas en alcohol

y esterilizadas en llama. Se colocaron aproximadamente 10 secciones de tallo en cada caja Petri con

medio PDA, teniendo dos cajas Petri con segmentos del mismo tallo. Las cajas se rotularon (planta-

localidad-fecha), se sellaron con parafilm e incubaron en el laboratorio a temperatura ambiente expuestas

a periodos naturales de luz y oscuridad.

El crecimiento de los hongos endofíticos en tallos con estroma se observó pasadas dos

semanas, sin embargo en tallos sin estroma es mucho más lento, pueden llegar a alcanzar las cuatro

semanas.



3.4 Aislamiento de cultivos puros de Epichloe typhina El cultivo puro se realiza para la obtención de una sola especie de hongo, en este caso de

Epichloe typhina, para después proceder a la extracción de su material genético.

3.4.1 Materiales

- Bisturí - Cámara de flujo laminar

- Mechero alcohol - Placas Petri pequeñas con medio PDA

3.4.2 Procedimiento

El cultivo puro que se obtiene es de gran interés ya que nos garantiza la obtención de una

especie de hongo que necesitamos para la realización del trabajo.

El proceso se lleva a cabo dentro de la cámara de flujo laminar.

De la colonia fúngica crecida sobre PDA se corta con un bisturí estéril una pequeña zona de

aproximadamente 3 mm de tamaño y se coloca en cajas Petri más pequeñas que las anteriores y que

contienen el mismo medio de cultivo. El riesgo de contaminación es alto por eso se sellan las placas con

parafilm, y se rotula el nombre de la planta, localidad y fecha del día que se ha realizado el cultivo puro.

De una misma colonia se tiene Epichloe typhina en dos cajas Petri y se dejan incubar en el

laboratorio a temperatura ambiente y a periodos naturales de luz y oscuridad.

El crecimiento del cultivo puro de Epichloe typhina se observa pasada una semana

aproximadamente.

Los resultados del crecimiento de Epichloe typhina como cultivo puro se observa en la figura 4.

Fig. 4 Cultivo puro de Epichloe typhina

3.5 Extracción de ADN La extracción de ADN se lleva a cabo para realizar estudios sobre la genética de Epichloe

typhina. Lo que se extrae es ADN que contiene una secuencia genómica correspondiente a la tub 2, que

es la β-tubulina, que codifica para una proteína estructural llamada tubulina cuya función es, formar parte

de los microtúbulos, que se definen como componentes del citoesqueleto y del núcleo, y que además

participan en la formación del huso mitótico durante la mitosis.



En este estudio se utiliza el gen β-tubulina porque como ya he dicho anteriormente es un gen

cuyos intrones están poco conservados, de manera que hay diferencias de Epichloe typhina en diferentes

gramíneas.

El gen β-tubulina consta de cuatro exones y cuatro intrones. Los tres primeros intrones de la β-

tubulina son los que se utilizan para observar las posibles relaciones entre las gramíneas, porque se trata

de secuencias muy diferentes, de manera que en el caso de que hubiese alguna diferencia, se podría

observar.


- Bisturí - Centrifugadora

- Baño - Solución de extracción

- Vórtex - Solución de dilución

- Pipetas - Hielo

- Eppendorf

3.5.2 Procedimiento

Las soluciones necesarias para la extracción de ADN en Epichloe typhina son dos: una solución de

extracción señalada como E (extracción), y una solución de dilución marcada como D (dilución).

Primero se coloca una pequeña muestra de hongo, cuadraditos de 3x3 mm en un Eppendorf y

se agregan 70 μl de la solución E. Se incuba a 95º C, preferentemente con agitación, en el baño durante

10 minutos. Después se añaden 70 μl de la solución D.

De nuevo se vuelve a agitar con el vórtex y se centrifuga a 13.000 rpm durante 10 minutos.

Después se pipetean 100 μl de sobrenadante a un Eppendorf limpio que ha sido marcado anteriormente.

Si se quieren conservan durante algunos días se dejan en el congelador.

3.6 Limpieza de las muestras de ADN Este proceso se realiza para eliminar las proteínas y los contaminantes, es decir todo aquello que no

sea ADN. Se realiza inmediatamente después de que se haya añadido la solución D.

3.6.1 Materiales y compuesto

- Eppendorf

- Pipetas

- Vórtex

- Centrifugadora

- Fenol

- Cloroformo

3.6.2 Procedimiento

1º. En los Eppendorf donde se encuentran las muestras de ADN, verter 100 μl de fenol.

El fenol tiene dos fases, hay que coger la fase de la parte inferior con una pipeta porque es la fase que

necesitamos para la limpieza del ADN.



Nota: Hay que tener cuidado con no derramar el fenol en la piel porque puede absorberse provocando

quemaduras cutáneas graves.

2º. Agitar en el vórtex.

3º. Centrifugar a la máxima velocidad durante 10 minutos.

Una vez centrifugado, en el Eppendorf hay tres fases:

- Una fase en la base del Eppendorf que es el fenol.

- Una fase intermedia que son las proteínas desnaturalizadas.

- Una fase en la parte superior del Eppendorf que es el ADN.

4º. Se coge la fase de la parte superior que es el sobrenadante, 80 μl.

Nota: Hay que tener precaución de no mezclar las fases que se obtienen, porque en el caso de que

cojamos una pequeña cantidad de fenol, al hacer la PCR, las muestras no amplificarían.

5º. Añadir 80 μl para eliminar los restos de fenol que pudiese haber.

6º. Centrifugar a la máxima velocidad durante 5 minutos.

7º. Coger 50 μl de sobrenadante.

3.7 PCR

Es la reacción en cadena de la polimerasa que consigue aumentar el número de copias de un

fragmento determinado de ADN, por lo tanto, con una mínima cantidad de muestra de ADN, se puede

conseguir toda la que se necesite para un determinado estudio.

Para poder amplificar este gen de la β- tubulina se necesitan unos oligos que lo que hacen es

hibridar con la región complementaria de la secuencia de ADN.

3.7.1 Cálculos

Se quiere obtener 100 μl de oligo 5 μM partiendo de una solución inicial 50μM

Teniendo en cuenta la siguiente fórmula:

ffii CVCV ×=×

5010050 ×=×x

ll

llx μμ

μμ 1050

50100=

×=


- Pipetas

- Eppendorf

- Vórtex

- Termociclador

- Solución Tub F (forward) es el oligo Forward que sintetiza la cadena de ADN hacia delante, y

consta de los siguientes nucleótidos: ACCGAGAAAATGCGTGAGAT.



- Solución Tub R (reverse) es el oligo Reverse y replica la cadena de ADN en sentido inverso a

como lo hace la forward, y consta de los siguientes nucleótidos: GTTTGCTCCGAGTTCTCGAC.

- Agua Milli-Q

- Mix PCR

- Solución E+D

3.7.3 Procedimiento

1º. En dos tubos Eppendorf marcados como Oligo F y Oligo R se añaden;

- 90 μl de agua Milli- Q

- 10 μl de oligo F y R (anteriormente calculado) que proceden de otros dos tubos Tub F (forward)

y Tub R (reverse) de un kit comercial.

2º. Agitar los tubos en el vórtex.

3º. Se cogen un nuevo tubo Eppendorf para hacer la siguiente mezcla:

Tabla 2 Mezcla para PCR.

- La Mix PCR es una ADN polimerasa que es una enzima que copia las cadenas de ADN.

- E+D es un mezcla de las soluciones de extracción más dilución.

Esta mezcla se multiplica por el número de muestras que se va a realizar, si por ejemplo

tenemos seis muestras serían 60 μl de Mix PCR, 18 μl de Oligo F y Oligo R, y 12 μl de E+D.

De la mezcla se agregan en cada uno de los Eppendorf especiales para termociclador (de 0,5 ml)

anteriormente señalados, 18 μl.

Después se añaden 2 μl de ADN muestra para al final obtener un volumen final en cada

Eppendor de 20 μl. Se agitan en el vórtex.

Por último se introducen en el termociclador que es un aparato que permite realizar los ciclos de

temperaturas necesarios para una reacción de amplificación de ADN. Contiene en su interior una gradilla

de metal donde se introducen los tubos de la muestra.

Componentes de la mezcla Cantidad Mix PCR 10 μl Oligo F 3 μl Oligo R 3 μl E+D 2 μl TOTAL 18 μl



Fig. 5 Termociclador. Fig. 6 Muestras en el termociclador.

Se programa el termociclador en tub 55, se repetirá generalmente 35 veces. Los ciclos consisten

en lo siguiente:

1. Desnaturalización

En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos hebras de las cuales está constituido). Este

paso se realiza a dos temperaturas a 95ºC y a 94ºC durante dos y un minuto respectivamente.

2. Unión del cebador

A continuación se producirá la hibridación del cebador, es decir, el cebador se unirá a su secuencia

complementaria en el ADN molde. Para esto es necesario que la temperatura descienda generalmente, a

55 ºC durante un minuto.

3. Extensión de la cadena

Por último actúa la ADN polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y

partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la síntesis de nuevo ADN. Se aumenta la

temperatura hasta 72 ºC (para la Taq Polimerasa), temperatura a la cual la ADN polimerasa presenta su

máximo de actividad, aumentando geométricamente la cantidad de fragmentos de ADN en la muestra.

Una vez completados todos los ciclos, se finaliza con dos pasos, uno de extensión de la cadena

a la temperatura óptima de la ADN polimerasa, normalmente 72ºC, para finalizar se enfría la muestra a

4ºC para su conservación.

Fig. 5 y 6 Fuente de los dibujos http://www.biologia.edu.ar

3.8 Preparación del gel de agarosa El gel de agarosa es un soporte que constituye una matriz o trama tridimensional de fibras

poliméricas, embebida en gran cantidad de líquido, que retarda el paso de las moléculas de ácido

nucleico a su través, en mayor medida cuanto más grandes sean éstas.

A este gel de agarosa se le añade bromuro de etidio que es un colorante fluorescente que tiene

la capacidad de intercalarse entre las bases nitrogenadas, para la visualización de los ácidos nucleicos.

Este gel se utiliza en la electroforésis.


- Matraz

- Espátula

- Hornillo

- Balanza de precisión

- Molde para gel



- Peine para formar los pocillos

- Tampón TAE 50X

- Agua Milli-Q

- Agarosa

- Bromuro de Etidio que es un agente intercalante que se fija entre las bases nitrogenadas del

ADN y emite fluorescencia al aplicarle luz ultravioleta en el transiluminador.

Precaución: el bromuro de etidio es un carcinógeno y debe manejarse con cuidado, por eso hay que

utilizar guantes para manipularlo.

3.8.2 Procedimiento

En un matraz añadir:

- 0.5 ml de tampón TAE 50X (50 veces concentrado). Esta compuesto por: Tris 40 mM,

ácido acético 19 mM, EDTA 1mM, pH= 7,5

- 20 ml de agua Milli-Q.

- 0. 25 g de agarosa al 1%.

Lo primero que hay que hacer es calentar la mezcla anterior hasta que se funda la agarosa. Se

observa que se ha disuelto la agarosa porque la mezcla al final está totalmente transparente. No hay que

dejarla hervir mucho tiempo porque si no la agarosa se puede pegar en el interior del matraz. Se deja

enfriar el matraz y se añade 1 μl de bromuro de etidio.

Después se coloca en el molde en una superficie horizontal y se sitúa el peine que formará los

pocillos a unos centímetros del borde.

A continuación se añade la solución del matraz al molde.

Por último se retira el peine del molde, se coloca el gel en la cubeta de electroforesis y se cubre

con tampón TAE que permite mantener las moléculas de ADN con una carga negativa uniforme y

constante.

Fig. 7 Cubeta de electroforesis.



3.9 Electroforésis

Este proceso permite la separación del los ácidos nucleicos como consecuencia de su diferente movilidad

en un campo eléctrico.


- Gel de agarosa

- Pipetas

- Cubeta de electroforésis

- Matraz

- Tinte

- Tampón

- Parafilm

3.9.2 Procedimiento

En un trozo de parafilm previamente señalado con rotulador indicando el lugar donde vamos a

colocar la muestra se añade:

Tabla 3. Componentes de carga de la electroforesis.

En el parafilm se agrega una gota de tinte, otra gota de tampón y una tercera gota de muestra

que se utiliza para mezclar las anteriores gotas en una, obteniendo un volumen final de 8 μl.

En el primer pocillo del gel de agarosa se depositan 5 μl de marcador. Después con una pipeta

de 10 μl se cogen los 8 μl de la solución anterior y se introduce en el gel de agarosa, es decir se cargan

los pocillos.

La cubeta de electroforésis se conecta a la fuente de alimentación para correr el gel. El extremo

negro generará una carga negativa y el rojo, una positiva (Fig. 8). Esa diferencia de potencial hará que

pase la corriente a través del gel. Como el ADN tiene carga negativa, para que se mueva es necesario

colocar el cable negro en el lado próximo a los pocillos.

Fig. 8 Conexiones de la cubeta de electroforesis

Para cada muestra Tinte 2 μl

Tampón TE 4 μl Muestra 2 μl



El ADN avanza desde el polo negativo hacia el otro extremo. Las moléculas cortas de ADN

migrarán más rápidamente que las moléculas largas. Se observa la migración del marcador y de las

bandas de ADN porque las hemos teñido. Una vez que ya ha terminado de correr el gel, después de

aproximadamente una hora, se saca el molde de la cubeta de electroforesis.

3.10 Revelar el gel de agarosa

Para este procedimiento se utiliza un aparato llamado transiluminador que permite la

visualización de las bandas de ADN marcadas con bromuro de etidio.

3.10.1 Materiales

- Transiluminador

- Gel de agarosa

- Ordenador

3.10.2 Procedimiento

Se coloca la muestra con los pocillos hacia el interior, dentro del transiluminador. El programa

que hay que seleccionar es “Quantity One”. Se pulsa el botón “Position”, dejando la tapa del

transiluminador abierta, de manera que aparece en el ordenador el gel cargado. Se cierra la tapa del

transiluminador y se selecciona “Prewiev” que obtendrá la imagen (Fig. 9) con las muestras amplificadas.

Por último se escoge el botón “Acquire” para poder adquirir la imagen y guardarla.

Fig. 9 Revelado de un gel de agarosa

Lo que se observa en la figura 9 es una imagen real del revelado de la electroforesis, donde se

ve que han amplificado cuatro muestras que corresponden al gen de la β-tubulina.

También aparecen una serie de bandas en el borde inferior izquierdo, que son las bandas del

marcador. Este marcador determina el tamaño de la β-tubulina, apareciendo el marcador a su misma

altura, en este caso a 1 kb.



3.11 Secuenciación Es una técnica que permite saber cuál es el orden o secuencia de los nucleótidos que forman parte

de un gen.

3.11.1 Cálculos

Se quiere obtener un volumen final de 8 μl, teniendo 3 μl de oligo a una concentración 1 μM, y

partiendo de una solución inicial 5 μM. Lo que queremos saber es el volumen de muestra que tenemos

que añadir.

Pero primero calculamos el volumen final que queremos obtener de la solución de oligo anterior:

ffii CVCV ×=×

501100 ×=× x

ll

llx μμ

μμ 250

1100=

×= de oligo F/R

El volumen final de oligo F/R son 2 μl más 98 μl de agua. De esta mezcla que son 100 μl

cogeremos 3 μl más el volumen que sea de la muestra.

Después se calcula el volumen de la muestra a partir de una regla de tres, pero para ello se tienen en

cuenta los valores obtenidos en la cuantificación con el nanodrop:

Ejemplo:

21 ng ___________________ 1 lμ

100 ng ___________________ x

lng

lngx μμ 7,421

1100=

×= de muestra

Como el volumen final de la muestra son 4,7 μl y de oligo son 3 μl ya tenemos el volumen final de

la solución que es necesaria para secuenciar (8 μl)

En el caso de que obtuviésemos un volumen de la muestra de menos de 5 μl, lo que habría que

hacer sería añadir agua destilada hasta obtener los 5 μl.

3.11.1 Purificación del ADN amplificado por PCR 3.11.1.1 Materiales y compuestos

- Tubos Eppendorf

- Tubos Eppendorf azules específicos para la purificación

- Tubos eppendor transparentes especificos para la purificación, que son los tubos de

recogida.

- Binding Buffer

- Columnitas

- Agua destilada

- Pipetas



3.11. 1.2 Procedimiento

1º. Agregar 250 ml de Binding buffer en los tubos eppendorf pequeños donde se encuentran las muestras.

2º. Añadir la mezcla anterior a los eppendorf azules a los cuales se les ha colocado la columnita. Esta columna de pequeño tamaño posee en la parte inferior una pequeña lámina de celulosa donde

quedará retenido el ADN. En la parte inferior del tubo estarán los productos de la PCR.

Fig.10 Adicción de la mezcla del eppendorf rojo al azul.

3º. Centrifugar durante 3 minutos a 12.000 rpm.

Fig. 11 Centrifugadora

4º. Pasar la columnita desde el eppendorf de color azul, al eppendorf transparente especifico para

purificar.

Fig. 12 Eppendorf con columna



5º. Pipetear 20 μl de agua encima de la placa de celulosa de la columnita, pero en el centro de la misma,

teniendo cuidado de no pipetear en las paredes del tubo, ya que queremos recuperar el ADN que ha

quedado retenido en esa placa de celulosa.

6º. Centrifugar el eppendorf con la columnita durante 1 minuto a 10.000 rpm.

7º. Quitar la columnita.

Al final del tubo quedará el ADN sin los componentes que hemos utilizado antes para hacer la PCR, de

esta manera se podrá mandar al servicio de secuenciación. Mantenerlo en hielo.

3.11.2 Cuantificación del ADN amplificado por PCR Para este proceso se usa un aparato llamado Nanodrop (Fig. 13), es un espectrofotómetro que

cuantifica y valora la pureza de los ácidos nucleicos. Permite analizar 1 μl de muestra con gran precisión.

3.11.2.1 Materiales

- Nanodrop

- Agua destilada

- Muestra

- Pipetas Fig. 13 Nanodrop

3.11.2. 2 Procedimiento

Primero se levanta el brazo del aparato y se pipetea 1μl de agua destilada, que es el blanco, sobre

el pedestal del nanodrop. Se baja el brazo, el agua destilada sube ligeramente y se forma una columna de

liquido.

Con el programa de ordenador al que está conectado el nanodrop, se da el botón “Blank”, como

el agua es el blanco, el resultado de la absorbancia tiene que ser 0 ng/ μl.

Una vez ajustado el nanodrop con el blanco, se pipetea 1μl de la muestra que se quiere

cuantificar. En el programa de ordenador se selecciona la casilla “Measure” que determina la absorbancia

de la muestra.

La medición se hace en menos de 10 segundos.

Con el programa de ordenador se obtiene una gráfica como la que se muestra en la figura 14.

Fig. 14 Cuantificación



3.11.2. 3 Resultados

El rango de cuantificación va desde los 2 ng hasta los 3000 ng/μl.

3.12. Tinción con azul de anilina

Este procedimiento se realiza para detectar la posible presencia del hongo en tallos de

plantas de gramíneas mediante su observación en el microscopio. Se observa que el micelio de Epichloe typhina aparece intercelularmente, de manera que las hifas crecen

entre las paredes celulares de las células de los ápices y de las hojas (Fig. 15).

3.12.1 Materiales

- Bisturí - Portaobjetos

- Azul de anilina - Cubreobjetos

- Ácido láctico - Microscopio óptico

3.12.2 Procedimiento

1º. Se escogen a los individuos en los que se quiere comprobar la posible presencia del hongo endofítico.

2º. Se realiza un corte longitudinal desde la base del tallo hasta la base de la espiga.

3º. Se tiñen los cortes con azul de anilina.

4º. Tras esperar unos minutos, se raspa la médula, intentando no arrancar el tejido conductor.

5º. La muestra obtenida se coloca sobre un portaobjetos, y de nuevo se vuelven a añadir unas gotas de

azul de anilina para mejorar la tinción.

6º. Tras unos minutos de espera, se seca el exceso de azul de anilina con papel.

7º. Se añade el ácido láctico que actúa de agente espesante.

8º. Se extiende la preparación sobre el portaobjetos y se cubre con el cubreobjetos.

9º. Se observa al microscopio óptico.

3.12.3 Resultados

Se observa, en el caso de que el tallo esté infectado con el hongo, hifas que se cruzan en las

paredes celulares de las epidermis de la planta

Fig.15 Hifas de Epichloe typhina



4. Tratamiento informático de los datos

4.1 CHROMAS LITE Del servicio de secuenciación nos llega un cromatograma que contiene una serie de picos

de diferentes colores y que corresponden a la separación electroforética de los productos de la reacción

de secuenciación, es decir cada pico es un nucleótido, cuya altura depende de la cantidad de ADN que se

haya mandado al servicio de secuenciación.

Chromas lite es un programa informático que permite la visualización del cromatograma,

observando una secuencia de ADN, como la que se muestra en la figura 16.

Fig. 16 Cromatograma

4.2 CLUSTAL X Este programa informático permite el alineamiento de las secuencias que se han obtenido

en el cromatograma de una manera muy gráfica.

Alinea dos secuencias, una secuencia FC de forward complement ,“hacia delante”, con

otra secuencia R reverse “inverso”.

Fig. 17 Alineamiento con Clustal X

De esta manera podemos comprobar que las secuencias que hemos mandado con los

respectivos oligonucleótidos son complementarias.



4.3 MEGA Con este programa informático se realizan árboles filogenéticos. Para ello se introducen las

secuencias ya alineadas de manera que de forma automática, el programa forma el árbol.

5. Resultados

Con nuestro estudio hemos llegado a la obtención de un árbol filogenético, en el que las

secuencias que forman parte del mismo, poseen todas la misma terminación porque han sido cortadas en

el extremos 3´ del tercer intrón, y se basa en la siguiente secuencia de nucleótidos: …GACAG. En general

se comparan todos los nucleótidos que codifican para β-tubulina.

Nuestras secuencias de estudio, señaladas con números, carecen de los nucleótidos iniciales,

es decir carecen de los nucléotidos del extremo 5´ del primer intrón, en comparación con las secuencias

indicadas con letras y números, que poseen todos los nucleótidos. Pero una manera de solventar este

problema sería añadiendo a nuestras secuencias durante el proceso de secuenciación, unos oligos que

anillen con la misma para ir sintetizándola.

Aún faltando la secuencia inicial de nuestras muestras, se pudo elaborar un árbol filogenético

que se muestra en la Fig. 18 según el método “neighbor joining”, que es el método del vecino más

cercano, lo que significa que los nodos más cercanos son vecinos.

Dentro del árbol se puede observar que no hay raíz, por lo tanto no hay un ancestro común del

que se pueda partir. Después, cada una de las ramas que se muestran en el árbol corresponde a una

especie distinta de Epichloe, de manera que podremos observar especies como Epichloe amarillans,

Epichloe festucae, Epichloe bromicola,… y Epichloe typhina. De la rama de Epichloe typhina se pueden

observar diferencias que se deben a las distintas plantas de las que se ha aislado el hongo.

Así podríamos decir que entre las secuencias de Epichloe typhina de Lolium perenne sintomática

(posee estroma) y Dactylis glomerata, hay pequeñas diferencias de algunos nucleótidos, por esta razón

están en grupos separados.

Sin embargo todas las gramíneas de Lolium perenne sintomático son iguales, es decir Epichloe

typhina posee el mismo genotipo, y por eso están juntas.

Con Dactylis glomerata ocurre lo mismo que con el caso de Lolium perenne sintomático, es decir

todos los Dactylis glomerata están juntos porque su Epichloe typhina tiene el mismo genotipo. Aunque

también cabe destacar que dos plantas de Dactylis glomerata (plantas número 2 y 32) están separadas

un poco del resto, y esto puede ser debido a la falta del extremos 5´ del primer intrón.



Lolium

perenne

sintomático

Dactylis

glomerata

Fig. 18 Árbol filogenético según el modelo “neighbor joining”, de la β-tubulina.

19

21

X52616etypLp

18

17

73

37

38

L78281clarkii

2

32

51

L78287typhinaDg

35

86

L78292typhinaBp

L78291esyls

l78278esylj

AF062429ETPOANEM

Phoenic

BP14

AF25075etpoaprat

L78271brachyelytri

AF062427brachyelytri

AF062428ely

L78273elymi

L78275glyc

L78276glyceriae

AF062430bromicola

L78290bromicola

l06961ebac

L78279baconii

L06955ef

L06957festucae

L06959ama

L06958amarillans

AF062646Claviceps

0.05



El porcentaje de infección en las gramíneas por parte de Epichloe typhina en Lolium perenne según

las localidades:

Localidades Porcentaje Lolium perenne

asintomático infectados (%)

Los Valles 10

Servández 20

Membribe 70

Gargabete 20

Porqueriza 20

Cedeira 0

Tabla 5. Porcentajes de Lolium perenne asintomático infectados

El porcentaje de infectados en Lolium perenne sintomático y Dactylis glomerata es mucho mayor

que en el caso de Lolium perenne asintomático, porque estas gramíneas presentan síntomas de infección

como la aparición de un estroma que envuelve a la influorescencia. Sin embargo la incidencia es menor

en Lolium perenne asintomático porque el endofito puede o no estar presente.

Valoración de las prácticas La realización de estas prácticas me ha servido para poder desarrollar una corta pero intensa

actividad investigadora, que nunca había hecho. Me ha servido para aprender a utilizar aparatos y

técnicas, que teóricamente si sabía pero que en la práctica apenas utilizamos, ya que a la hora de realizar

prácticas en la facultad, somos muchos alumnos, y eso empeora su manejo.

En mi caso, he podido abordar las dos ramas de la biología, el campo y el laboratorio, de

manera que he aprendido, a realizar un proyecto de investigación desde el inicio hasta casi el final, ya que

por cuestiones de tiempo no he podido terminar.

También he llegado a la conclusión de que para realizar un proyecto de investigación, es

necesario tener mucha paciencia, porque hay momentos en las que obtienes muchos resultados, pero

hay otros en las que tienes que probar muchas veces para poder llegar a algo. Creo que no tengo

paciencia.

En definitiva, me ha gustado trabajar al lado de una persona que sabe tanto como es Iñigo,

además de ser un orgullo y también al lado de unas chicas tesinandos que de vez en cuando me han

echado una mano. Y por supuesto me ha gustado, porque he aprendido mucho.



6. Bibliografía

Christopher L. Schardl, Adrian Leutchmann y Martin J. Spiering. “Symbioses of grasses with seedborne

fungal endophytes”.

Keith Clay and Christopher Schardl. 2002. “Evolutionary Origins and Ecological Consequences of

endophyte Symbiosis with Grasses”. Vol. 160, supplement. The American Naturalist.

James F. White, Jr. “Endophyte-host associations in forage grasses. XI. Proposal concerning origin and

evolution”.1988, PP 442-443. The New York Botanical Garden, Bronx,

C. L. Schardl, A. Leutchmann y B. A. McDonald. “Relationship of Epicloe typhina isolares from different

host grasses”. New Zekand Grassland Association: Endophyte Symposium.

Alfred D. Byrd, Christopher L. Schardl, Peeranan J. Songlin, Kim L. Mogen y Malcolm R. Siegel. 1990.

“The β-tubulin gene of Epichloe typhina from perennial ryegrass (Lolium perenne).” Current Genetics 18:

347-354.

datos de las prÁcticas - usalfacultadbiologia.usal.es/documentos/practicasempr/... · 2011. 12....

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