ゲノムワイド多型を利用した遺伝解析の実際

白澤 健太

かずさDNA研究所

なぜ、ゲノムワイド多型データが必要か？

•マーカー数：少

•解像度：低MAS

QTL

GWAS•マーカー数：多

•解像度：高GS

ゲノムワイド多型データの集め方

• RFLP– サザンブロット分析

• RAPD, AFLP– PCR→電気泳動

• SSR (microsatellite)– PCR→電気泳動

• SNP– PCR→電気泳動

– qPCR

– チップ

– NGS

NGSを利用したゲノムワイド多型分析

• 全ゲノム解読

• トランスクリプトーム

• エキソンキャプチャ

• ターゲットアンプリコンシークエンス

• Reduced-representationライブラリ– RAD-Seq

– GBS

– ddRAD-Seq

Davy et al. (2011) Nat Rev Genet 12, 499-510

WGS

RAD-Seq

Digestion

Adapter ligation

PCR amplification

Sequencing

RAD-Seq in Kazusa

100PE 250PE

RAD-Seqワークフロー

1日目 2日目 3日目 4日目 5日目

9:00 PCR・精製 シークエンス シークエンス

10:00 情報処理

11:00 サイズセレクション12:00

13:00 サンプリング 精製・定量

14:00 DNA抽出

15:00 シークエンス

16:00 制限酵素処理

アダプター付加17:00 SNPリスト

DNA調整からSNPリストまで最短で5日

情報処理

FastQ

Bowtie2

SAM

BAM

BCF

VCF

Filtering

CNV-seq

CNVs

SNPs Indels

SAMtools

BCFtools

VCFtools

SAMtools

ファイル

ソフト

結果

手作業

ReferenceFASTX-toolkit

RAD-Seqの成功のポイント

1.制限酵素選び

2.ゲノム中のSNP密度

3.ゲノム中のSNP分布

トマトゲノム中の制限酵素サイト数

制限酵素サイト数

0

50,000

100,000

150,000

200,000

250,000

300,000

350,000

400,000

450,000

500,000

SalI PstI EcoRI HindIII MspI

Nu

mb

er

of

res

tric

tio

n s

ite

s

制限酵素断片数（300-900 bp）

0

10,000

20,000

30,000

40,000

50,000

60,000

70,000

80,000

SalI - PstI PstI -EcoRI

EcoRI -HindIII

PstI -MspI

Nu

mb

er

of

res

tric

tio

n f

rag

me

nts

RAD-SNP数と制限酵素断片数との関係

SalI - PstI

PstI - EcoRI

EcoRI - HindIII

PstI - MspI

y = 0.281x - 2129.8R² = 0.995

0

2,000

4,000

6,000

8,000

10,000

12,000

14,000

16,000

18,000

20,000

0 10,000 20,000 30,000 40,000 50,000 60,000 70,000 80,000

#RA

D-S

NP

s

No. of fragments (300-900 bp)

RAD-SNPのゲノム中の位置

0%

20%

40%

60%

80%

100%

WGS SalI - PstI PstI - EcoRI EcoRi - HindIII PstI - MspI

Intergenic SNPs Genic SNPs

6品種における全ゲノムSNP数

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

SNP

s /

10

kb

RAD-SNP数と全ゲノムSNP数との関係

Regina

Micro-Tom

M82

Moneymaker

San Marzano

Ailsa Craig

y = 0.0237x - 1849.3R² = 0.7304

0

5,000

10,000

15,000

20,000

25,000

30,000

0 200,000 400,000 600,000 800,000 1,000,000 1,200,000

#RA

D-S

NP

s

#Genome-wide SNPs

F2集団からデータを取る

0

100

200

300

400

500

600

700

800

Nu

mb

er

of

ead

s (k

)

F2 lines

ゲノムの0.6%を15xの厚みでカバーするデータが得られた。

RMF2-01 RMF2-02 RMF2-96

Micro-TomRegina x↓F1

…

Index-01 Index-02 Index-96…

MiSeq

Fastq-01 Fastq-02 Fastq-96…

BAM-01 BAM-02 BAM-96…

F2-VCF

Filtered VCF

Imputed VCF

Index-REG Index-MT

Fastq-REG Fastq-MT

BAM-REG BAM-MT

P-VCF

Filtered VCF

Excluding identical loci

解析の流れ

F2 lines

Seq. library

Sequencing

Seq. data

Mapping

SNP calling

Filtering

Imputing

Applications

Cleaning

欠失データの補間

補間前 補間後

連鎖地図と物理地図の比較

1.2 M SNPs (WGS) vs 1.3 K SNPs (RAD-Seq)

まとめ

• RAD-Seqの成功のポイント– 制限酵素選び– ゲノム中のSNP密度– ゲノム中のSNP分布

• RAD-Seq・GBSの次にあるもの

• 情報解析のことをよく知る（逆も然り）– 自分でできなくて良い– できても良い– 計算機でできること・できないことを知る– お互いの理解を深める