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CENTRO DE INVESTIGACION DE MATERIALES AVANZADOS, S.C.
DIVISION DE ESTUDIOS DE POSGRADO
DESARROLLO Y CARACTERIZACIÓN DE
NANOCOMPUESTO PVA/HAP POR ELECTROHILADO Y
SU RESPUESTA BIOLÓGICA
T E S I S
PARA OBTENER EL GRADO DE
DOCTOR EN CIENCIA EN MATERIALES
PRESENTA
ROSALIA RUIZ SANTOS
DIRECTOR DE TESIS
Dr. JOSÉ GUADALUPE CHACÓN
CHIHUAHUA, CHIH. 14 DE DICIEMBRE 2016
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Índice de Figuras Figura 1 Estructura Cristalina de la Hidroxiapatita Pag. 14
Figura 2. Imagen Tem de nanofibras porosas Li, L., & Hsieh, Y. L. (2006). [40] Pag 23
Figura3 Imagen Esem de nanofibras planas Lyons, J., Li, C., & Ko, F. (2004). [41]. Pag 23
Figura 4. Imagen Sem de nanofibras huecas (a, b) Bazilevsky, A.V et al. (2007) [42], (c,d)
Li, D., McCann, J. T., & Xia, Y. (2005). [43]. Pag 24
Figura 5. Imagen Sem de nanofibras ramificadas Choi, S.S., et al. 2004 [44]. Pag 25
Figura 6. Imagen Sem de nanofibras helicoidales Weng, S.,et al. (2010) [45]. Pag 26
Figura 7. Estructura Quimica del Polivinyl Alcohol Pag 31
Figura 8 Influencia del peso molecular en las propiedades del PVA. Pag 33
Figura 9. Influencia del peso molecular en las propiedades del PVA. Pag 33
Figura 10. Método de obtención HAp estado sólido Pag 40
Figura 11 Síntesis de HAp por mecoquimica Pag 41
Figura 12 Esquema de la Molienda de Alta Energia. Pag 41
Figura 13.Obtencion de Hidroxipatita método de precipitación convencional. Pag 43
Figura 14. Obtención de Hidroxipatitia método Hidrotérmico Pag 45
Figura 15.Efecto de las condiciones hidrotermales sobre la morfología de HAp Pag 45
Figura 16. Obtención de Hidroxiapatita por el método de Combustión. Pag 46
Figura 17. Método de Pirolisis para la obtención de Hidroxiapatita Pag 47
Figura 18. Método de obtención de síntesis basados en fuentes biogenicas. Pag 48
Figura 19. Anatomía del hueso cortical y esponjoso . Pag 50
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Figura 20.Representación esquemática de los componentes del hueso desde escala
nanoscópica hasta macroscópica. . Pag 52
Figura 21. Fases del remodelado óseo en la superficie del hueso trabecular. Origen y
localización de las células óseas. . Pag 56
Figura 22.Digrama de flujo para la preparacion de los polvos de Hidroxipatita a partir de
femur de puerco Pag 61
Figura 23 Imágenes de la materia prima de hueso a hidroxiapatita Pag 62
Figura 24. Molino Alta Energía Spex modelo M8000. Pag 63
Figura 25. Diagrama de flujo para el proceso de alta energía de la materia prima HAp a
partir de hueso de puerco Pag 63
Figura 26. Diagrama de proceso para la preparación de soluciones de PVA y HAp Pag 65
Figura 27.Solución del Compostito PVA/HAp. Pag 67
Figura 28. Fotografías del equipo de electrohiladura Nonobond Standar Untit NEU-01
China a) Vista del panel de Control, b) Substrato Colector, c) Sistema de alimentación de
sustancias poliméricas, d) Otra perspectiva del sustrato colector. Pag 68
Figura 29. Velos de nanofibras composito de PVA/HAp Pag 68
Figura 30 Diagrama de Proceso para elaboración de fibras de PVA/HAp. Pag 69
Figura 31. Protocolo anestésico Pag 70
Figura 32. Protocolo de cuidados posoperatorios Pag 72
Figura 33. Protocolo quirúrgico, a) Extracción, b) Inducción fractura c) Colocación del
composito de fibras de PVA con HAp. Pag 72
Figura 34. Método de Extracción de Muestra a) fémur control y b) fémur con fibras PVA y
HAp. Pag 75
4
Figura 35. Ensayo in vitro Pag 74
Figura 36. Resumen Esquemático de las pruebas de respuesta biológica al material
composito de fibras PVA-HAp Pag 76
Figura 37 Micrografias SEM con Hueso de Puerco sin tratamiento térmico Pag 78
Figura 38 Micrografias SEM de Hueso de puerco con tratamiento térmico Pag 79
Figura 39 EDS de muestras de hueso de puerco después de tratamiento térmico Pag 80
Figura 40.DRX Hueso de puerco e Hidroxipatita. Pag 81
Figura 41.Tamaño de Partícula polvo de Hidroxipatita Pag 82
Figura 42. DRX Polvos de hidroxipatita realizados después de la molienda de alta energía
Pag 83
Figura 42. DRX Polvos de hidroxipatita realizados después de la molienda de alta energía
Pag 83.
Figura 43. Viscosidad de PVA en función de la concentración Pag 85
Figura 44 DRX Composito de nanofibras Pag.87
Figura 45 Termograma de las nanofibras composito HAp/PVA Pag 88
Figura 46 Micrografias SEM de nanofibras al 10% de PVA Pag 89
Figura 47 Micrografias SEM con 15% de PVA Pag 90
Figura 48 Micrografias SEM compostio HAp/PVA con 10% en peso. a) y b) imágenes a
10,000 aumentos, c) y d) imágenes a 15,000 aumentos Pag 91
Figura 49 Micrografias SEM compostio HAp/PVA con 10% en peso. a) imagen a 27,000
aumentos , b) y c) imágenes a 30000 aumentos Pag 92
Figura 50 Mapeo de composito de HAp/PVA Pag.93
Figura 51. Imagen de composito HAp/PVA al 10% en peso y perfil de rugosidades. La
línea indica el perfil seleccionado. Pag 94
5
Figura 52. Imagen de composito HAp/PVA al 15% en peso y perfil de rugosidades. La
línea indica el perfil seleccionado Pag 95
Figura 53. a) Imagen SEM fibras composito PVA-HAp 15%, b) Histograma de frecuencias
diámetros de fibra Pag 96
Figura 54. a) Imagen SEM fibras PVA, b) Histograma de frecuencias diámetros de fibra
Figura 55. Imagen SEM Prueba in vivo 7 días, a) control,b) hueso con compositos de
nanofibras PVA-HAp Pag 97
Figura 56 Imagen SEM pruebas in vitro 21 días, a) Control, b) hueso de rata. Pag 98
Figura 57 Imagen SEM por electrones retrodispersados de las pruebas in vitro 21 días, a)
Control, b) hueso de rata. Pag 98
Figura 58 Imagen SEM pruebas in vitro 21 días. Pag 99
Figura 59 Evaluación Clínica de ratas wistar, después de la colocación del nanocomposito.
Figura 60. Imágenes de la extracción del fémur de la rata wistar después de 7 días, a)
Fémur con composito recuadro negro área de incisión y colocación del implante, b)
acercamiento a la región de acción del composito de fibras. Pag 100
Figura 61. Imágenes SEM, a) Control hueso de rata tibia a 7 días prueba in vivo, b) Hueso
de rata tibia con fibras PVA-HAp 15% Pag
101
Figura 62. Imágenes SEM, a) Control hueso de rata fémur a 7 días prueba in vivo, b)
Hueso de rata fémur con fibras PVA-HAp 15%
Pag 101
Figura 63. Imágenes SEM, a) Fibras de PVA-HAp 15%, b) acercamiento 6500000
aumentos de la misma zona. Pag 102
6
Figura 64. Imágenes SEM, a) Control hueso de rata, b) Hueso de rata con fibras de PVA-
HAp Pag
103
Figura 65. Imágenes SEM, a 1500000 aumentos hueso de rata con fibras PVA-HAp 15%
Pag 103
Figura 66. Mecanismo propuesto de regeneración en el hueso de rata cepa wistar. Pag 105
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Índice de Tablas Tabla 1 Condiciones de operación del equipo de Electrohiladura. Pag 68
Tabla 2. Reactivos con sus respectivas cantidades y pureza para la preparación de SBF [22].
Tabla 3Relación Ca/P en polvo de hidroxipatia. Pag 81
Tabla 4 Parámetros de temperatura y humedad de la solución precursora de electrohilado.
Tabla 5 Parámetros de operación del equipo de electrohilado para solucione con 10% PVA
y 15% de PVA pag 86
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Acrónimo Significado
AFM Microscopia Fuerza Atómica
DRX Difracción de Rayos X
EDS Espectroscopia de energía dispersiva de rayos X
HAp Hidroxiapatita
KV KiloVolts
PVA Poli vinil Alcohol
SBF Fluido Fisiológico Simulado
SEI Electrones secundarios
SEM Microscopia Electrónica de Barrido
TGA Análisis termogravimétrico
WD Distancia de trabajo
g gramos
mA microAmperes
mg miligramos
ml mililitros.
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1. INTRODUCCION
1.1 Biomaterial
Biomaterial se define como ―cualquier sustancia o combinación de sustancias distinta a los
fármacos, que en su origen ya sean sintéticos o naturales pueden ser utilizados en cualquier
tejido, órgano o función del cuerpo, con el fin de mantener o mejorar la calidad de vida del
individuo‖ [1]. Se han encontrado evidencia que las civilizaciones antiguas como la egipcia
utilizaban ojos, orejas y dientes artificiales [2]. Indios y chinos utilizaban ceras, gomas y
tejidos en la reconstrucción de piezas faltantes o defectuosas del cuerpo a través de los
siglos, los avances en materiales sintéticos, las técnicas quirúrgicas y métodos de
esterilización han permitido el uso de biomateriales en muchos sentidos [3].
Actualmente la práctica médica utiliza los biomateriales en un gran número de implantes
(ligamentos, injertos vasculares, válvulas cardíacas, lentes intraoculares, implantes
dentales, etc) y en dispositivos médicos (marcapasos, biosensores, corazones artificiales,
etc) los cuales son utilizados para reemplazar y/o restaurar la función de un tejido u órganos
degenerado y por lo tanto mejorar la calidad de vida de los pacientes.
En los primeros días se utilizaron todo tipo de materiales naturales como de madera,
pegamento, goma, así como metales tales como el hierro, oro zinc y el vidrio. Los
materiales biológicos, tales como la placenta fueron utilizados desde la década de 1900. El
celuloide fue el primer plástico artificial utilizado en defectos craneales y el polimetacrilato
de metilo fue aceptado como material médico a partir de la Segunda Guerra Mundial.
Sin embargo se observó lo siguiente: bajo ciertas condiciones algunos materiales fueron
tolerados por el cuerpo mientras que otros fueron rechazados en otras condiciones. Por lo
tanto durante los últimos 30 años se han logrado avances considerables para entender las
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interacciones entre los tejidos y los materiales. Generando así el concepto de
biocompatibilidad.
En 1999 Willams [1] definió la biocompatibilidad como ―capacidad de un material para
llevar a cabo una respuesta apropiada donde el huésped es sometido a una situación
específica‖. Aunque esta definición parece vaga, representa un gran salto para lo que
anteriormente se creía. La opinión que precedía a esta definición era que los materiales
―exitosos‖ jugaron en gran medida papeles inertes en el cuerpo.
Una larga lista de propiedades habían evolucionados para los biomateriales ―exitosos‖, los
cuales se definen a partir de una serie de observaciones médicas, ya que el material no debe
inducir su separación, reacción inflamatoria o de cuerpo extraño, no debe provocar
respuestas del sistema inmunológico, no debe ser bioabsorbible al extremo de su
destrucción en el medio biológico siendo eliminado naturalmente, ni debe alterar
genéticamente las células adyacentes [4].
Teniendo en cuenta que el cuerpo humano trabaja en ambientes biológicos complejos, la
idea de colocar un material extraño sin ningún tipo de respuesta parece ingenua.
Basado en la reacción del tejido, los biomateriales se pueden clasificas en tres categorías
distintas [5]:
Biotolerantes: El organismo no produce respuesta inflamatorio al implante aunque
interacciona en este encapsulándolo mediante una capa de tejido fibroso conjuntivo.
Como ejemplo de esto podemos citar el Polimetilmetacrilato PMMA (cemento óseo), acero
inoxidable utilizado en placas y otros materiales de osteosíntesis y las aleaciones de
Cromo-Cobalto.
Bioinertes: Estos biomateriales no causan ninguna respuesta de su huésped y esto se debe
generalmente a que no producen ningún tipo de reacción química entre ambos; esto es
porque la mayoría de estos materiales son metales con su superficie recubierta de una capa
de óxido estable. Como resultado de esto las células pueden estar en contacto directo con el
material pero sin formar ningún tipo de unión entre ambos, a su vez no se produce
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inhibición de la osteogenesis. Ejemplo de estos pueden ser la Alúmina, Zirconio y el
Titanio.
Bioactivos: Son biomateriales de más reciente desarrollo. Tienen la capacidad de reaccionar
con el tejido adyacente y formar enlaces químicos directos con el mismo. Normalmente las
células crecen directamente junto al biomaterial y en algunos casos van formando tejido
especializado dentro del mismo. Ejemplo: Cerámicas de Fosfato de Calcio, Cerámicas de
óxido de Silicio o Biovidrios.
La otra clasificación de biomateriales la podemos según su composición química, y los
dividiremos en:
Metales
Polímeros
Cerámicas
Compositos
1.1.1 Bioceramicas
Los materiales cerámicos son usados industrialmente en una sorprendente gama de
aplicaciones. El procesamiento de cerámicas involucra usualmente polvos, y para impedir
la introducción de defectos durante el procesamiento de este se deben de tomar rigurosos
cuidado. En años recientes ha existido un creciente interés en los principios que gobiernan
la composición, arquitectura y métodos de ensamblaje de una gran variedad de cerámicas
biológicas tales como la que se encuentra en huesos y dientes [6].
Podemos decir que las cerámicas utilizadas en medicina son materiales biocompatibles.
Presentan propiedades la de ser mas rígidos y resistentes que el acero cuando se someten a
fuerzas de compresión, soportan más calor y corrosión que los metales o los polímeros,
tienen una densidad menor que la mayoría de los metales y sus aleaciones; y sus materias
primas son abundantes y baratas.
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Por el contrario debemos decir que son materiales muy quebradizos, es decir que no tienen
deformación plástica y que tienen una escasa resistencia a las fuerzas de tracción, flexión o
cizallamiento.
Las biocerámicas se clasifican:
Según su estructura
Sólidos Cristalinos
Policristalinos por chorro de plasmas
Sólidos Amorfos
Composición química
Óxidos cerámicos
Biovidrios
Fosfatos de calcio
Actividad Biologica [7]
Bioinertes (alúmina, zirconia)
Bioactivos (hidroxiapatita, biovidrio, biovitrocerámicas)
Reabsorvibles (fosfato de calcio)
1.1.2 Hidroxiapatita
Entre las diferentes clases de biocerámicas, la hidroxiapatita (Hap) es ampliamente
utilizada en diversas aplicaciones biomédica, principalmente en ortopedia y odontología
[8]. Posee un excepcional biocompatibilidad y una bioactividad única [9,10].
El término ―apatita‖ se aplica a un grupo de compuestos (no solo fosfatos cálcicos) con una
formula general M10(XO4)6Z2, donde M2+
es un metal y la especies XO4-3
y Z- son aniones.
El nombre particular de cada apatito depende de los elementos o radicales M, X y Z. En
estos términos, la Hap tiene la estructura molecular de la apatita donde M es el calcio
(Ca2+
), X es el fósforo (P5+
) y Z es el radica hidroxilo (OH-). Esto se conoce como
hidroxiapatita estequiometria y su relación atómica Ca/P es 1.67. Su fórmula química es
Ca10(PO4)6(OH)2, con el 39% en peso de Ca, 18.5% en P y 3.38% de OH.
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La hidroxiapatita cristaliza en un sistema hexagonal, aunque con alguna excepción en un
sistema monoclínico [11,12]. El sistema pertenece al grupo espacial P63 hexagonal/m,
simetría de rotación hexagonal y un plano de reflexión m, y con parámetros a=b= 9.418 Å y
c=6.88 Å. La figura 1 muestra la celda unitaria de la hidroxipatita.
El esqueleto de la celda unitaria de la HAp, lo constituye el arreglo tetraédrico de los
fosfatos (PO4-3
). Dos de los oxígenos están alineados con el eje c
Figura 1. Estructura cristalina de la Hidroxiapatita [12].
Aunque se utilice la hidroxipatita estequimetrica como modelo, hay que destacar que las
hidroxipatitas producidas biológicamente tiene una estequiometria más complicada, con
una relación Ca/P menor a 1.67. La relación estequiometria varía de acuerdo al tipo
específico de tejido, que se relaciona con las propiedades y la bioactividad de la HAp.
Si la relación estequimetrica de Ca/P se acerca al valor 1.67, mayor la estabilidad del
material en el interior del cuerpo humano y tiende a ser inerte, por otro lado si el valor de la
relación Ca/P disminuye la Hap tendrá una mejor bioactividad.
Otro aspecto que se debe considerar es el grado de cristalinidad. Se ha observado que la
cristalinidad en los tejidos, para el esmalte de los dientes es muy alta, mientras que en los
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huesos y en la dentina, es muy pobre. Esto significa que la reactividad depende del grado de
cristalinidad, ya que la reactividad en la dentina y el hueso es mayor que el esmalte de
dientes.
Se han desarrollado un gran número de investigaciones para producir hidroxiapatita
sintética, ya sea por precipitación acuosa, síntesis hidrotermal, procesada en sólido,
hidrólisis y sol-gel entre otras. Los procedimientos o condiciones bajo las cuales se sintetiza
pueden influir en sus características físicas y químicas [13].
1.13 Aplicaciones de la Hidroxiapatita
La aplicación principal HAp es como relleno de hueso, ya que este material no soporta altas
cargas mecánicas. La idea es crear vínculos fisicoquímicos entre la cerámica y el tejido
óseo, promoviendo su integración y el crecimiento de nuevo tejido [14].
Otro factor a considerar es el fenómeno llamado osteoconductividad, que se produce en
materiales con alta afinidad con el tejido óseo, que promueven la formación de nuevo
tejido, pero también son capaces de dirigir su crecimiento, dependiendo de la estructura que
tienen.
Es conocido que estos materiales deben tener alta porosidad (del orden de cientos de
micras) para permitir el desarrollo del hueso dentro y a través de ellos. Esta propiedad ha
sido utilizada para el desarrollo de cementos con aditivos HAp [15].
Otra aplicación importe es tomar a la Hap como recubrimiento de prótesis metálicas, que se
realiza para dar a la superficie un aspecto adecuado y reconocible para el tejido dadas su
características y biocompatibilidad.
En todos los casos, estos materiales proporcionan una superficie adecuada para la adhesión
celular, que por acción enzimática permanece en largo plazo. El comportamiento in vivo de
los implantes de fosfato de calcio depende de varios factores: la relación Ca/P, la estructura
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cristalina y la porosidad. El entorno fisiológico también puede tener una influencia decisiva
en la respuesta biológica.
1.2 Electrohilado
El electrohilado ha sido reconocido como una técnica eficaz para la fabricación de
nanofibras de polímeros. Varios polímeros han sido exitosamente maquinados en fibras
ultrafinas en los últimos años. Las cuales tienen un gran potencial de aplicaciones
específicamente como refuerzo en el desarrollo de nanocompuestos [16].
1.2.1 Procesamiento
La figura 1 muestra un diagrama esquemático del funcionamiento del electrohilado. Hay
que cumplir básicamente con tres componentes: un alto voltaje, un tubo capilar con una
pipeta o aguja de diámetro pequeño, y una pantalla de metal como colector de fibras.
La alta tensión se utiliza para generar una alta carga eléctrica, donde la solución
viscoelastica se somete a un estiramiento coaxial por efecto del voltaje, donde antes de
llegar al colector el hilo de la solución se evapora o se solidifica depositándose en la
pantalla una red interconectada de pequeñas fibras [17,18].
La técnica consiste en hacer girar soluciones de polímero a través de altos campos
eléctricos, se basa en aplicar suficientes fuerzas eléctricas que superan las fuerzas de la
tensión superficial en la solución de polímero cargado, de esta forma a un voltaje
determinado, finos chorros de solución son expulsados desde el capilar hasta el plato
colector. Posteriormente el chorro se mueve en la dirección del campo eléctrico,
elongándose de acuerdo a las fuerzas externas e internas y experimentado inestabilidad en
algunas ocasiones. El disolvente se evapora y los segmentos de fibra son depositados en el
sustrato [19].
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EL electrohilado puede ser desarrollado de forma horizontal o vertical según lo desee, el
principal inconveniente al trabajar en posición vertical es la posible salida de gotas de
solución desde el capilar hacia el plato colector las cuales pueden caer sobre las fibras
depositadas haciendo defectuosa la superficie de las mismas e interrumpiendo el proceso.
Para impulsar la solución a través del capilar puede utilizarse una bomba de infusión; si se
trabaja de forma horizontal, la salida de la solución puede estar determinada por la fuerza
de gravedad ligada a la viscosidad de la solución.
Para el inicio del proceso, el polímero debe estar diluido en el o los disolventes que
permitan una dilución completa del mismo (debe ser completa, para evitar el taponamiento
del capilar durante el proceso) pero que a la vez promuevan la obtención de fibras
homogéneas. Los polímeros son dieléctricos, en presencia de un campo eléctrico pueden
considerarse como un arreglo de dipolos eléctricos microscópicos compuestos por cargas
positivas y negativas cuyos centros no coinciden perfectamente [20], se mantiene en su
lugar por acción de las fuerzas atómicas y moleculares, y solo pueden cambiar su posición
ligeramente en respuesta a fuertes campos eléctricos externos, lo que explica por qué ocurre
el estiramiento de la solución en el proceso. Son llamadas cargas ligadas en contraposición
a cargas libres que determinan la conductividad en otro material ―conductor‖ [21].
Una vez que se tiene la solución en el lugar sea jeringa o cono se inicia la aplicación de alto
voltaje, cuando este potencial eléctrico se aplica, las cargas se acumulan promoviendo la
formación de una gota en la punto del capilar, a medida que la intensidad del campo
eléctrico se incrementa, la gota se alarga para crear una forma cónica conocida como cono
de Taylor [22-24].
La fuerza de campo eléctrica supera las fuerzas de cohesion de la solución de polímero
inicia un viaje desde la punta del capilar hasta el plato colector; en su viaje, el chorro de
solución polimérica es alargado debido a las interacciones electrostáticas entre las carga
cercanas a segmentos del mismo chorro, mientras tanto, el disolvente se evapora,
finalmente, las fibras se solidifican a su llegada al plato colector [25].
18
1.2.2Parámetro del material a considerar en el proceso de
electrohilado.
En el proceso de electrohiladura intervienen una serie de variables, las cuales deben ser en
primera instancia estudiadas con detalle y seguidamente determinadas y optimizadas para
cada polímero.
El primer grupo de variables está relacionado directamente con la química precursor de las
nanofibras. Al hacer referencia a la química de los polímeros. Es condición indispensable
conseguir disolver el polímero, para obtener nanofibras de este mismo. El proceso de
disolución del polímero lleva asociado el estudio de la temperatura de disolución, la adición
de cargas, la presión de vapor del disolvente, la concentración del polímero, la viscosidad,
la tensión superficial, la constante dieléctrica y conductividades resultantes, centrándose
especialmente en la viscosidad, la tensión, y la conductividad eléctrica. [26,27].
Peso Molecular y Viscosidad de la disolución.
El peso molecular de los polímeros está en función de la longitud de la cadena polimérica,
ya que es la suma de los pesos moleculares de los monómeros que lo conforman, y afecta
directamene a la viscosidad de la disolución resultante. Generalmente al tratarse de un
mismo polímero, cuanto más alto sea el peso molecular del polímero, mayor será la
viscosidad de la disolución. Otra manera de aumentar la viscosidad de la disolución es
aumentar la concentración del polímero [28].
Viscosidades altas en la disolución, suponen una mayor interacción entre las moléculas del
polímero y las del disolvente, por lo que las moléculas del disolvente se distribuyen
enmarañadamente junto con las del polímero. Sin embargo cuando la viscosidad es baja, las
moléculas del disolvente tienden a congregarse bajo la acción de la tensión superficial.
La viscosidad dela disolución es necesaria para que tenga lugar el proceso de electrohilado.
Cuando las viscosidades son bajas, se encontrarán agregados en forma de anillo a lo largo
de toda la nanofibra. No obstante, cabe remarcar que una viscosidad demasiado alta puede
llegar a imposibilitar el proceso de electrohiladura.
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Tensión Superficial
Cuando una gota cae en el aire generalmente adopta una forma esférica, las propiedades
superficiales del líquido que provocan este fenómeno es lo que se conoce como tensión
superficial de un líquido. Se debe a que las fuerzas que afectan a cada molécula son
diferentes en el interior del líquido y en la superficie. Mientras que en el seno de un líquido
cada moléculas está sometida fuerzas de atracción que en promedio se anulan, en la
superficie hay una fuerza neta hacia el interior del líquido [29]
La tensión superficial tiene como principal efecto la tendencia del líquido a disminuir en lo
posible su superficie para un volumen dado, de aquí que un líquido en ausencia de gravedad
adopte la forma esférica, que es la que tiene menor relación área/volumen.
Energéticamente, las moléculas situadas en la superficie tienen una mayor energía
promedio que las situadas en el interior, por lo tanto la tendencia del sistema será a
disminuir la energía total, y ello se logra disminuyendo el número de moléculas situadas en
la superficie, a ahí la reducción de área hasta el mínimo posible.
En el proceso de electrohilado, las cargas de la solución del polímero deben ser lo
suficientemente altas como para vencer la tensión superficial de la misma. Cuando la
disolución se carga eléctricamente y es acelerada hacia la placa colectora, la fibra debe fluir
de forma continua, sin embargo la tensión superficial de la disolución puede ser
responsable de desintegrarla en pequeñas gotas, provocando el fenómeno de
electrosprayado en vez de la electrohiladura, también puede ser responsable de la
formación de defectos en forma de anillos en las nanofibras obtenidas.
Conductividad
La electrohiladura está muy relacionada con la repulsión entre cargas que se crea en la
superficie de la disolucion. A mayor conductividad de la disolución del polímero, mayor
facilidad tendrá para cargarse y formar finas fibras de polímero [30]. Además la adición de
sales y polielectrolitos facilitaran paralelamente el estirado de la nanofibra durante su
formación [31].
20
Otro de los factores que se ven favorecidos directamente en el proceso de electrohiladura,
como consecuencia de un aumento de la conductividad de la disolucion, es que el voltaje
crítico, para que tenga lugar la formación de nanofibras, se ve reducido notablemente. No
obstante, también es necesario señalar que, el aumento de la conductividad en la disolución
mediante la adicion de iones, puede ser la causa de un aumento de la viscosidad a niveles
no deseados.
Presión de Vapor
La presión de vapor o presión de saturación es aquella, para una temperatura dada, en la
que la fase líquida y la fase vapor se encuentran en equilibrio dinámico [29]. Este
parámetro es el responsable de que el disolvente que forma parte de la disolución
precursora, se evapore rápidamente si bien, dejando el tiempo necesario para dar lugar a la
formación de los filamentos de polímero
1.2.2.Parámetro de control del proceso de electrohilado
Intensidad del voltaje aplicado.
La aplicación de alto voltaje a la disolución es indispensable para superar la tensión
superficial de la misma, dotarla de carga y establecer un campo eléctrico entre los dos
electrodos. La intensidad de voltaje a aplicar es específica en cada caso, existe una
intensidad óptima que produce las nanofibras con las dimensiones y morfología buscadas
[32].
Cuanto más alta la intensidad del voltaje, menor es el diámetro de las fibras obtenidas, no
obstante cabe resaltar que un exceso de intensidad en el voltaje aplicado, también es la
causa de formación de chispas eléctricas, que van a provocar la aparición de
macroagregado de polímero en la placa colectora, dando lugar a la aparición de importantes
defectos y la pérdida de todas las propiedades técnicas en la zona de recubrimiento
formado.
Otra de las propiedades que se ve modificada en función de la intensidad del voltaje
aplicado es la cristalinidad de la nanofibra polimérica obtenida, el campo electrostático
21
provoca ordenación de las moléculas del polímero durante el proceso de electrohilado,
induciendo un mayor grado de cristalinidad, sin embargo, el aplicar una intensidad de
voltaje demasiado alta puede llegar a provocar el efecto contrario. El aumento de la
intensidad del voltaje acelera el proceso de formación de las nanofibras, por lo que al
depositarse en forma de velo sobre la superficie de la placa colectora, deben tener el tiempo
necesario para que se alineen ellas mismas [27].
Velocidad de alimentación de la disolución.
La cantidad de disolución disponible para el proceso de electrohilado por unidad de tiempo
es lo que conocemos como velocidad de alimentación. Para un voltaje determinado, existe
una velocidad de alimentación óptima si se quiere garantizar la estabilidad del cono de
Taylor. Cuando la velocidad de alimentación crece, hay un aumento evidente de la cantidad
de disolución, que se traduce en un aumento del diámetro de fibras y de la formación de
gotas.
Si la velocidad es alta, el chorro encontrará muchos problemas para evaporarse. Por lo
tanto, el disolvente que acarrea cada fibra, no tiene tiempo de evaporarse y se deposita
sobre el colectro de forma amalgamada y fusionada. Las velocidades de alimentación bajas
son más deseables porque proporcionan más tiempo para que se evaporen los disolventes
[33].
Distancia ente electrodos.
La separación entre electrodos debe ser lo suficientemente corta como para generar
corriente entre ambos y permitir que las fibras se depositen en la placa colectora, pero al
mismo tiempo deben estar lo suficientemente separados, para permitir la evaporación del
disolvente y la formación de fibras con una longitud que se considere aceptable. Cuando la
distancia entre electrodos es demasiado corta, el exceso de disolvente no evaporado es la
causa de un velo con una estructura amalgamada, en el que las fibras se fusionan unas entre
otras [34].
Condiciones Ambientales
22
Cualquier interacción entre el ambiente y la disolución del polímero o entre el ambiente y
el campo electrostático, puede ser causa de un cambio en la morfología de los filamentos
poliméricos. Agentes externos por los que se puede ver alterado el proceso de
electrohiladura.
Polvo. Es indispensable que el proceso de electrohilado tenga lugar en un ambiente
libre de polvo.
Temperatura. La temperatura afecta la viscosidad de la disolución y a la proporción
del disolvente evaporado, por lo que un aumento de la temperatura permitirá
acelerar el proceso de producción de fibras. Las imperfecciones morfológicas
durante la formación de las fibras pueden mejorarse con un incremento de la
temperatura de la disolución precursora [35].
Humedad. En el caso de trabajar con disoluciones en base acuosa, es recomendable
mantener un grado de humedad constante para favorecer la formación de fibras. La
humedad relativa no debe ser nunca inferior al 30%, ni superior al 50%. Sin
embargo cuando se trabaja con disolventes volátiles la presencia de humedad en el
interior de la cámara de electrohilado no resulta ventajosa, hasta el punto de que en
algunos casos, es necesario incorporar en el interior de la cámara una corriente de
aire seco para disminuir dicha humedad [36].
1.3 Tipos de nanofibras.
Nanofibras sin aditivos.
La introducción de pequeñas modificaciones en las diferentes variables que entran en juego
en el proceso de electrohilado, son las responsables de obtener importantes variaciones en
la morfología de las nanofibras, no obstante también se puede tener en cuenta el cambio de
otros elementos influyentes dando lugar a nanofibras porosas, nanofibras planas, nanofibras
huecas, nanofibras ramificadas y nanofibras helicoidales [37,38,39].
Nanofibras Porosas
23
Los poros en las nanofibras pueden ser el resultado de una humedad relativa en el interior
de la cámara demasiado elevada, sin embargo existen otros factores que pueden influir en la
formación de poros durante el proceso de electrohilado. Durante la fase de evaporación del
disolvente, la disolución es termodinámicamente inestable, hecho que resulta ser ventajoso
en la obtención de nanofibras porosas figura2, puesto que se establecen dos fases; una
formada por el disolvente mayoritariamente y otra por el polímero. Al evaporarse
definitivamente el disolvente da lugar a la matriz, mientras que la fase pobre en polímero,
da lugar a los poros.
Figura 2. Imagen Tem de nanofibras porosas Li, L., & Hsieh, Y. L. (2006). [40].
El control de la presión de vapor del disolvente va a permitir la obtención de este tipo de
nanofibras de forma regular [40,41].
Nanofibras planas.
La obtención de este tipo de nanofibras se consigue con disoluciones concentradas de
polímero de alto peso molecular, las nanofibras llegan al substrato colector húmedas y al
impactar se aplanan. En algunos casos pueden llegar a crearse puentes planos entre las
fibras cilíndricas. Figura 3.
24
a b
c d
Figura 3. Imagen Esem de nanofibras planas Lyons, J., Li, C., & Ko, F. (2004). [41].
Nanofibras huecas.
La obtención de fibras huecas mediante el proceso de electrohilado se llevan a cabo
mediante el uso de cabezal de electrohiladura coaxial para crear una estructura del tipo
core-shell [42]. El componente exterior suele ser el polímero y como componente interior
se ha de buscar un compuesto inmiscible con el polímero, normalmente se hace uso de
aceites minerales que se eliminan con facilidad [43].
25
Figura 4. Imagen Sem de nanofibras huecas (a, b) Bazilevsky, A.V et al. (2007) [42],
(c,d) Li, D., McCann, J. T., & Xia, Y. (2005). [43].
Nanofibras ramificadas.
Este tipo de nanofibras se obtienen a partir de la formación de pequeños chorros de
disolución que surgen de la superficie de los chorros primarios o iniciales. Este efecto se
consigue ejerciendo un control total sobre el balance de fuerzas electrostáticas que entrar en
juego en el campo eléctrico generado y de la tensión superficial de la misma disolución del
polímero [44].
Figura 5. Imagen Sem de nanofibras ramificadas Choi, S.S., et al. 2004 [44].
Nanofibras helicoidales
La formación de fibras helicoidales se lleva a cabo partiendo de disoluciones de más de un
polímero y además uno de los dos debe ser un polímero conductor; por ejemplo polianilina
quiral (PANI). En la formación de los ciclos helicoidales entran en juego dos variables
principalmente; la concentración del polímero no conductor, que va ser la responsable del
26
a b
diámetro del bucle y las propiedades conductores del otro polímero, deben establecerse un
equilibrio entre las fuerzas de repulsión y las fuerzas viscoelásticas de hilado de este mismo
polímero [45]
Figura 6. Imagen Sem de nanofibras helicoidales Weng, S.,et al. (2010) [45].
Nanofibras funcionalizadas con aditivos
La técnica de electrohilado permite funcionalizar las nanofibras obtenidas, adicionando
previamente la disolución polimérica precursora. Esto es posible si se utilizan una
dispersión coloidal en medio similar a la disolución polimérica, que puedan ser fácilmente
mezcladas y homogenizadas conjuntamente. Las nanoparticulas pasan a formar parte dela
estructura del velo, mejorando las propiedades mecánicas del mismo con el fin de poder ser
utilizadas como material de refuerzo en los compostios (nanowiskers de -quinina) [46], en
los andamiso de bioingeniería de tejidos (nanoparticulas de montmorillonita) [47] o
confiriendo propiedades antimicrobianas (nanoparticulas de plata, plata ionica), absorción
térmica (nanoesferes de vidrio huecas)[48].
La adición debe llevarse a cabo con partículas de tamaño nanométrico, que puedan ser
arrastradas por la acción del campo eléctrico creado y quedando atrapadas en las nanofibras
con una distribución uniforme y perfectamente funcional sobre todo el velo formado
[49,50].
27
Nanofibras conductoras
Los velos de nanofibras con propiedades conductoras se pueden obtener por dos caminos;
directamente un polímero conductor, como en el caso de la polianilina, el polipirrol o el
poliisopreno, cuyas aplicaciones son limitadas debido a su alto costo, o mediante la adición
de nanoparticulas conductoras de cobre o de negro de carbón en polímeros más económicos
con es el caso del polivinil alcohol [51].
Las nanoparticulas de negro de carbón o de cobre deben ser inferiores al diámetro de las
nanofibras, alrededor de los 30nm y la preparación de la disolución con las partículas en
dispersión deben hacerse con agua osmotizada a 85°C. La proporción de nanoparticulas del
material conductor en la disolución está en función de la aplicación final del velo de las
nanofibras, aunque se electrohilan velos de nanofibras con concentraciones del 2% hasta el
10% con respector al peso del alcohol de polivinilo en la disolución [52, 53].
Nanofibras antimicrobianas
Los velos de nanofibras con propiedades antimicrobianas se pueden obtener mediante la
adición a la disolución de diferentes sustancias y elementos, entre los que se destacan las
nanopartículas de plata, plata iónica o el quitosano cuaternizado [54-57].
Entre los polímeros utilizados para este tipo de aplicaciones destaca la poliamida por su
resistencia que confiere a los velos de nanofibras y por la posibilidad de conseguir
nanofibras de diámetros más finos que permiten aumentar el grado de porosidad del velo.
El alcohol de polivinilo vuelve a ser un polímero especialmente indicado para adicionarlo
con este tipo de elementos, su solubilidad en agua permite obtener mezclas muy
homogéneas con las sales de los iones indicados [58].
28
1.7 Aplicaciones de las nanofibras
Es una tecnología que se encuentra en pleno desarrollo experimental. La figura 2.4.1
muestra los porcentajes dedicados en investigación y desarrollo a la obtención de
nanofibras mediante la técnica de electrohilado [32].
Caracterización: Es el porcentaje más alto de dedicación en cuanto a
investigación y desarrollo, se centra en la caracterización de las nanofibras el cual
corresponde al estudio de las propiedades morfológicas, estructurales, químicas y
mecánicas.
Proceso: Dedicado al desarrollo del equipamiento y proceso, se incluye el
modelado y la ingeniería.
Aplicaciones: Dentro de este porcentaje se incluye la investigación y desarrollo
para los campos:
Ingeniería mediambiental y biontecnología. (filtración, materiales
barrera, materiales antimicrobiano) [59,60].
Bioingeniería, medicina, ingeniería de regeneración de tejidos
celulares o andamios, vendas, apósitos etc [61].
Defensa y seguridad [62,63].
Compositos, formando parte de material de refuerzo [64-66].
2.4.1 Filtración
Este tipo de estructuras creadas a partir de fibras de diámetros nanométricos, permiten el
paso de compuestos moleculares como el oxígeno o el vapor de agua, al tiempo que
impiden el paso de microorganismos, por ello tiene un importante potencial como medios
29
filtrantes y/o materiales barrer, en los que se refiere a aplicaciones destinadas al cuidado de
la salud, ejercito e incluso en la industria automotriz [67,68].
En la industria farmacéutica la calidad, pureza y seguridad en el proceso de elaboración de
los medicamento es la garantía de su eficacia y lo mismo ocurre con los campos y salas
quirúrgicas en las que los medios filtrantes utilizados aseguran la purificación del aires con
la ausencias de partículas sólidas; microorganismos, polvo, polen y partículas en estado
líquido; humos, humedad, disolventes y productos químicos evaporados [69].
Las principales ventajas del uso de nanofibras como medios filtrantes se resumen en dos;
alta eficiencia de filtración con una baja resistencia de paso al aire y la posibilidad de
retener microgotas de líquido [70,71].
1.4.2 Salud y medicina.
Dos de cada tres aplicaciones relacionadas con las nanofibras, obtenidas a partir del proceso
de electrohilado, se desarrollan en el campo de la salud y medicina.
Las nanofibras presentan un importante potencial como sistemas de liberación de
medicamentos de forma gradual. La disolución del polímero se funcionaliza
adecuadamente con el medicamento que pasará a formar parte del velo de la nanofibra,
utilizado posteriormente como parche cutáneo, vendas funcionalizadas o mediante un
encapsulado farmacéutico, que se distribuirá a partir del sistema digestivo del paciente. La
distribución del medicamento en el cuerpo humano va a depender tanto de la
biodegradabilidad del polímero como del tamaño de las nanofibras, de forma que, la
distribución es tanto más rápida cuanto más pequeño y más biodegradable es el soporte que
incluye el principio activo [72-74].
Siguiendo el mismo principio, pueden desarrollarse soluciones en el ámbito dela cosmética
y la salud, utilizando activos aromaterápicos y dermoestéticos [75].
30
1.4.3 Bioingeniería de tejidos.
De nuevo la especificidad de estas estructuras va a condicionar las aplicaciones en la
ingeniería tisular, ya que son estructuras similares a las estructuras de los tejidos vivos,
incluyendo los tejidos del cuerpo humano, por ello se proponen aplicaciones del tipo:
apósitos para regeneración de úlceras, reconstrucción de tejidos y de huesos mediante el
uso de andamios [76,77].
Los andamios en bioingeniería se utilizan para reparar los tejidos dañados, y se definen
como la construcción provisional que soporta la secuencia constructiva de un armado
complejo, dando estabilidad al proceso de armado definitivo. Utilizando las nanofibras
como andamios, las células sembradas se adhieren y crecen entre las nanofibras inmersas
en el medio nutriente, posteriormente, los andamios con las células, son implantados en los
tejidos dañados. Siguiendo esta teoría y como consecuencia de la estructura que caracteriza
a las nanofibras, es posible desarrollar andamios para todo tipo de tejidos humanos, entre
los que destacan: tejidos para reparar vasos sanguíneos, cartílagos, huesos, nervios y piel
[78].
En el desarrollo de andamios celulares, los intersticios que forman parte de los velos de las
nanofibras, deben tener el tamaño adecuado para permitir que las células sembradas quepan
y colonicen el tejido homogéneamente siguiendo los caminos marcados por las nanofibras,
tanto superficialmente como tridimensionalmente.
1.4.4 Energía y electrónica.
Entre las distintas opciones de generación de energías limpias, cabe hacer una especial
mención a las baterías poliméricas, conformadas por polímeros conductores utilizados
como gel en disoluciones electrolíticas. Las nanofibras obtenidas por el proceso de
electrohilado vuelven a ser una opción interesante para sustituir este tipo de materiales
poliméricos. Debido a su estructura porosa y de gran superficie por la que se caracterizan,
actúan como materiales conductores y resistencia interfacial, aportando estabilidad
electroquímica al sistema [62,79].
31
-[CH-CH2-]
n
OH
|
En el campo de la electrónica se están introduciendo las nanofibras como materiales para
desarrollar todos tipos de sensores, sensores de gas, químicos, ópticos y biosensores. De
nuevo la alta relación superficie/volumen que presentan los velos de nanofibras, vuelve a
ser la variable que los hace atractivos para este tipo de aplicaciones. En alguno caso se está
reemplazando el material convencional que actúa de interfase por velos y/o membranas de
nanofibras [37].
En este mismo campo se está estudiando la posibilidad de desarrollar células fotovoltaicas
para la captación de la energía solar, a partir de velos de nanofibras funcionalizados
mediante compuestos inorgánicos como dióxido de titanio [80,81]
1.7Polivinil Alcohol (PVA)
Estructura y obtención del PVA
Alcohol de polivinilo (PVA) es un polímero sintético lineal producido a través de la
hidrólisis parcial o total de acetato de polivinilo para eliminar el grupo acetato figura 7. La
cantidad de hidroxilación determina las características físicas y químicas, así como las
propiedades mecánicas del polímero [82].
Figura 7. Estructura Quimica del Polivinyl Alcohol
Esta ruta química da como resultado un producto altamente soluble en agua, pero resistente
a la mayoría de los disolventes orgánicos. Cuanto mayor sea el grado de hidroxilación y de
polimerización, menor es la solubilidad en agua y más difícil de cristalizar [83].
32
Debido a su solubilidad en agua, PVA necesita ser reticulado para para formar hidrogeles
[84]. Los hidrogeles son redes poliméricas tridimensionales capaces de absorber grandes
cantidades de líquidos, sin disolverse en ellos y con el tiempo liberarlos [85,86]. Esta
característica junto con su biocompatibilidad con los tejidos humanos, permeabilidad y bajo
coeficiente de fricción [87], los han hecho aptos para ser usados en aplicaciones médicas
[88].
Estas redes tridimensionales están compuestas de una fase sólida, fluido intersticial y
especies iónicas como se aprecia en la figura 3; se les ha considerado materiales
biointeligentes ya que responden variando su volumen, a estímulos del medio ambiente,
tales como: cambios de pH, temperatura, concentración de especies, biomoléculas (glucosa
y proteínas) [89], radiaciones y campo eléctrico [90].
Características Generales del PVA.
Las propiedades del PVA se encuentran fuertemente influenciadas por el método de síntesis
empleado. El grado de polimerización, las condiciones de hidrólisis y la etapa de secado
afectan las propiedades finales del producto [91]. Las propiedades físicas y químicas del
PVA dependen en primer lugar del peso molecular (figura 8) y en segundo lugar del
contenido de grupos acetil o grado de hidrólisis (figura 9). La solubilidad del PVA va a
estar en función del peso molecular y del grado de polimerización, de forma que cuanto
mayor es el peso molecular, más insoluble en agua es el polímero. El polímero totalmente
hidrolizado es insoluble en agua a temperatura ambiente, sin embargo se solubiliza
perfectamente por encima de los 85°C [92]. La presencia de grupos hidroxil aumentan las
interacciones por puente de hidrógeno, tanto intramolecular como intermolecularmente,
disminuyendo la solubilidad en agua, mientras que la presencia residual de grupos acetil
disminuye el número de interacciones por puente de hidrógeno, permitiendo la solubilidad
en agua del polímero a temperaturas más bajas.
33
Figura 8 Influencia del peso molecular en las propiedades del PVA.
34
Figura 9. Influencia del peso molecular en las propiedades del PVA.
Otras propiedades físicas que lo hacen interesante, es que el PVA es parcialmente
cristalino, mientras que la mayoría de los compuestos de polivino como el poliestireno o el
acetato de polivinilo son amorfos.
El PVA también se caracteriza por su buena resistencia química a compuestos del tipo
hidrocarburo, hidrocarburos halogenados, ésteres de ácidos carboxílicos, grasas y aceites
vegetales o animales. La resistencia a disolventes orgánicos aumenta con el grado de
hidrolisis [92].
El PVA además es una excelente barrera al oxígeno gaseoso en bajas condiciones humedad,
disminuyendo esta propiedad con el aumento de humedad relativa.
El punto de fusión del PVA estará en función de todas las propiedades descritas
anteriormente, dependerá tanto del grado de polimerización como el peso molecular y en
mayor medida dependerá de la distribución de zonas amorfas y cristalinas, ya que el
tamaño de los cristales determina directamente el punto de fusión de dicho polímero. De
acuerdo a la bibliografía consultada aparece un amplio rango de puntos de fusión
documentados; desde 220°C hasta 267°C. Cuando el alcohol de polivinilo se calienta
gradualmente sin disolverse durante un largo periodo, se produce su descomposición
gaseosa alrededor de los 110°C, dependiendo de la intensidad y la duración del proceso de
calentamiento[93].
Finalmente cabe señalar la bidegradabilidad del PVA, ya que es uno de los pocos polímeros
sintéticos realmente degradables, obteniéndose como productos de degradación de agua y
dióxdo de carbono[94]. Al menos 55 especies o variedades de microorganismos muestran
procesos de degradación de este polímero en diferentes entornos como son los fangos
activados, digestores anaeróbios, sistemas sépticos, compostaje, sistemas acuáticos y
lagunaje. El tiempo de degradación del PVA por la acción de los microorganismos vuelve
a depender de sus propiedades físicas y de lo adaptado que estén dichos microorganismos
para degradar este tipo de polímeros. El PVA es rápidamente biodegradable mediante el
proceso de fangos activados, si la biomasa está acostumbrada a la aportación regular de este
polímero[95].
35
2.6 Proceso de electrohilado de PVA en disolución acuosa.
La obtención de velos de nanofibras es relativamente sencilla si se compara con otros tipos
de polímeros debido a su solubilidad en agua. Esto permite trabajar en condiciones
atmosféricas, evitando el sistema de acondicionamiento y extracción de la cámara de
electrohilado, siempre y cuando se trabaje con humedades relativas entre 20% y 50%
[96,50].
Tal como se ha detallado a nivel general en el apartado 2.2.2 las variables que intervienen
directamente en el proceso de electrohilado incluyen: la conductividad de la disolución, la
presión de vapor del disolvente, el peso molecular del polímero el cual se determinará junto
con la concentración del mismo, la viscosidad de la disolución y la tensión superficial. En
cuanto a las variables del proceso en sí, destacan la distancia entre los electrodos, la
intensidad del voltaje aplicado y las condiciones ambientales de temperatura y humedad
principalmente.
Peso molecular y viscosidad de la disolución: el peso molecular de los polímeros
en disolución será responsable de las propiedades reológicas de las nanofibras, y lo
que es más importante aún, será el que determine el resto de las propiedades del
proceso, por ejemplo a mayor peso molecular mayor será la intensidad de voltaje a
aplicar. Se han conseguido electrohilar nanofibras de PVA de un amplio rango de
pesos moleculares [97].
Tensión Superficial: las cargas de la solución del polímero deber los
suficientemente altas como para vencer la tensión superficial de la misma. La
tensión superficial no se ve afectada por la adicion de cargas en forma de
electrolitos [98].
Conductividad: el proceso de electrohilado está íntimamente relacionado con la
repulsión de cargas que se crea en la superficie de la disolución. A mayor
conductividad de diolución del polímero, mayor facilidad tendrá para cargarse y
formar finas fibras de polímero. En el caso del PVA, el pH de la disolución afecta
36
notablemente las propiedades del velo obtenido, obteniéndose mejores resultados en
cuanto a uniformidad y tamaño de las nanofibras si se trabaja a pH extremos (2-12
pH) [31].
Intensidad del voltaje aplicado: la intensidad del voltaje aplicado depende como
se ha detallado en las propiedades de la disolución, empezando por el peso
molecular del polímero, su concentración, tensión superficial y viscosidad. También
depende de la distancia entre los electrodos. Cuanto mayor es el voltaje, menor es el
diámetro de las nanofibras y mayor cristalinidad del polímero a una vez
electrohilado en forma de velo de nanofibras [99].
Distancia entre electrodos: la distancia es una de las variables del proceso a
determinar exactamente, ya que de ella no sólo dependen las propiedades finales del
velo, sino que pueden llegar a formarse o no las nanofibras si la distancia entre
electrodos no está optimizada. Para que se evapore el agua que forma parte del
filamento de PVA electrohilado, es necesario una distancia mínima a partir de la
cual, si se va incrementando, se obtendrán nanofibras de diámetros más finos, hasta
alcanzar la distancia en la que se rompe el campo eléctrico entre los dos electrodos
y los filamentos dejan de fluir [30].
Velocidades de proceso: entre las que se incluyen la velocidad de paso del
substracto colector y la velocidad de alimentación de la disolución o flujo. Estas dos
variables van a interferir principalmente en el gramaje del recubrimiento y espesor
del mismo. A medida que aumenta la velocidad de paso del substrato colector,
disminuye el espesor del velo de nanofibras. Por el contrario, cuanto mayor es la
velocidad de alimentación del polímero, mayor número de nanofibras están
formándose para unas condiciones dadas de proceso, obteniéndose velos de mayor
espesor y gramaje.
Condiciones ambientales: humedad y temperatura. La humead tiene una enorme
influencia en el proceso de electrohilado ya que determina la proporción de
evaporación del disolvente de la disoluición polimérica. En el caso del electrohilado
de PVA, aunque se puede trabajar en cierto rango de humedades (HR%: 30-50%),
la concentración de humedad en el interior de la cámara deber ser controlada y
estabilizada de forma constante, con el fin de conseguir un entramado de fibras
37
óptimo y homogéneo. El exceso de humedad en la cámara o saturación hará que las
nanofibras que se forman no lleguen secas al substrato colector y al entrar en
contacto con el enmarañado de nanofibras depositadas previamente, provocarán su
disolución, generando un velo de nanofibras de mala calidad [100].
En cuanto a la temperatura, provoca dos efectos en la cámara de electrohilado, afectando la
viscosidad de la disolución y a la proporción de evaporación. Cuanto mayor es la
temperatura se obtienen nanofibras de menor diámetro, sin embargo, un exceso de
temperatura provoca una evaporación demasiado rápida, colapsando el proceso e
impidiendo que las nanofibras alcancen substrato colector. [35,101]
2.7 Substratos del Colector
El substrato colector debe mantener el campo eléctrico formado entre dos electrodos, y en
última instancia entre la disolución cargada y el propio substrato. Al encontrarse en
contacto con el electrodo superior, debe facilitar la transmisión de cargas y evitar rotura del
campo eléctrico.
Como las fibras electrohiladas se encuentran cargadas y se colocan sobre el colector, se
acumulan cargas sobre la malla de fibras, lo que puede llegar a tener una gran influencia
sobre el proceso de electrohilado, especialmente cuando se producen muchas fibras.
El campo eléctrico resultante eléctrico resultante provoca el movimiento de las cargas hacia
los puntos en equilibrio, donde la suma de las fuerzas de las repulsiones que se generan es
igual a cero. Las cargas del interior del substrato se moverán hacia la superficie de manera
que el campo en cualquier punto del interior del substrato sea igual a cero. Las carga de la
superficie se orientan según el campo eléctrico, perpendicularmente a la superficie, como el
substrato no tiene una superficie lisa y perfecta, se acumulan alrededor de los bordes o
protuberancias de la superficie.
Estas irregularidades del campo eléctrico sobre la superficie pueden provocar agujeros en el
velo de nanofibras depositado, por tanto, es necesario que el substrato presente cierta
38
regularidad superficial, y que tenga capacidad de facilitar el movimiento de cargas.
Cuando se trabaja con PVA se necesitan conductividades superficiales del orden de los 108
Ohm.
39
2.8 Métodos de Obtención de Hidroxiapatita. Durante la última década, se han desarrollado diferentes métodos para preparar
nanopartículas HAp. M. Sadat-Shojai et al [106] en 2013 ha clasificaron los métodos de
preparación en cinco grupos.
Método vía Seca.
Métodos vía Húmeda.
Procesos de Alta Temperatura.
Métodos de Síntesis basados en Fuentes Biogénicas.
Procedimientos de Combinación.
Método vía Seca.
El método por vía seca no utiliza solventes. Según la bibliografía, las características de un
polvo sinterizado por este método no requieren condiciones controladas de proceso.
Haciéndolas adecuadas para la producción en masa de polvos. Las técnicas para obtener
HAp por vía seca más utilizadas son: síntesis en estado sólido y proceso de mecano
química.
Síntesis en estado sólido
Una reacción en estado sólido, es un procedimiento que puede ser empleado para la
producción de polvos en masa [107-110]. Los precursores primero se muelen y luego se
calcinan a una temperatura muy alta [107]. La figura 10 muestra que los precursores
pueden ser productos químicos que contienen calcio y fosforo o simplemente una sal de
CaP. La alta temperatura de calcinación conduce a la formación de una estructura
cristalina. Una de las desventajas, es que un polvo sinterizado por una reacción de estado
sólido a menudo exhibe una heterogeneidad en su composición de fase, debido a los
pequeños coeficientes de difusión de iones dentro de su fase sólida [108,109].
40
Figura 10. Método de obtención HAp estado sólido
Mecano química.
El proceso de mecanoquímica, a veces conocida como mecánica aleación, es un método
simple para la fabricación en seco de diversos materiales avanzados, tales como aleaciones
nanocristalina y cerámicas [111,112]. Contrario con el método de estado sólido donde las
partículas de HAp heterogenias se producen por lo general de forma irregular, en cambio
un polvo sinterizado utilizando una ruta mecanoquímica generalmente posee una estructura
bien definida. Esto debido a la perturbación ocasionada en las superficies de las especies
químicas, así como un estudio previo del efecto termodinámico y cinética de la reacción
entre los sólidos [113-117].
El proceso mecanoquimica tiene las ventajas de simplicidad y reproducibilidad de síntesis
figura 11. Los materiales se muelen en un molino planetario mientras que la relación molar
entre los reactivos se mantiene estequimetricamente [118,119].
Las principales variables de procesamiento incluyen: el tipo de reactivos, la clase de medio
de molienda, el tipo y diámetro de las bolas de molienda, tipo de atmosfera, duración de las
etapas de molienda, intervalo de pausas, así como la proporción de polvo, masa de bola y la
velocidad rotacional figura 12.
41
Figura 11 Sintesis de HAp por mecoquimica [114]
Figura 12 Esquema de la Molienda de Alta Energia.
Método vía Húmeda
Convencionalmente se han aplicado los métodos húmedos para la preparación de partículas
HAp a escalas nanométricas con una morfología normal. Las ventajas del método por via
húmeda es su capacidad para controlar la morfología, el tamaño promedio de polvo siendo
una de las técnicas más prometedoras para la fabricación de nanohidroxiapatia.
42
Precipitación Quimica Convencional.
Entre los diversos métodos de procesamiento húmedo la precipitación química
convencional es la ruta química más sencilla para la síntesis de HAp nanometrica. La
precipitación química se basa en el hecho de que, a temperatura ambiente y pH 4.2, HAp es
menos soluble y por lo general la fase de CaP es más estable en una solución acuosa. La
reacción de precipitación es llevada a cabo a valores de pH superiores a 4.2 y temperaturas
cercanas al punto de ebullición del agua.
Para producir nanopartículas de HAp, la precipitación química se puede lograr usando
varios reactivos con contenido de calcio y fosfato, por ejemplo, hidróxido de calcio o
nitrato de calcio como fuente de Ca2+
y ácido ortofosfórico o hidrógeno-fosfato de
diamonio como fuente de PO43-
. Un procedimiento típico implica la adición gota a gota de
un reactivo a otro bajo agitación continua y suave, mientras que la relación molar de los de
los elementos (Ca/P) se mantiene estequiometricamente de acuerdo con su relación en
HAp. Como último paso, la suspensión resultante se lava inmediatamente, se filtra, es
secada y triturada en polvo. Figura 13.
Para obtener cristales de HAp, con alta pureza de fase, la reacción de precipitación se lleva
a cabo normalmente a valores de pH y temperarua. Cada vez que el valor de pH debe ser
rebajado (por ejemplo, para lograr una morfología especifica), la temperatura debe elevarse
y viceversa. Esto conduce a una dramática disminución en la generación de impurezas de
fase (por ejemplo dicálcico anhidro (DCPA) y fosfato octacálcico (OCP) lo que resulta en
HAp como una fase dominante.
Además de otros parámetros, la velocidad de mezcla de los reactivos, la temperatura de
calcinación, el método de secado, el sistema disolvente y la concentración de los reactivos
han sido reportadas como elementos que afectas las características del polvo final. Por
ejemplo, la velocidad de mezcla determina la velocidad de la reacción y por lo tanto la
estructura quimica del polvo. Por lo general, una titulación lenta se recomienda para
mejorar la homogeneidad química y la estequiometria del producto final. Por otra parta, la
43
velocidad de adición está fuertemente relacionada con el pH obtenido al final de la síntesis
y para la estabilidad de la suspensión.
Figura 13.Obtencion de Hidroxipatita método de precipitación convencional.
El método de secado, determina tanto la morfología como la dispersabilidad del producto
final. El tamaño de las partículas secadas en condiciones atmosféricas, es ligeramente más
pequeño que el producto del secado por congelación. Además, las partículas secadas en
condiciones de vacío son casi esféricas, con algunas barras, y su dispersabilidad es más
pobre. La mejor metodología de secado, constituye la liofilización, dado que genera
estructuras ultrafinas con la mejor dispersabilidad.
Método Hidrotermico.
El proceso hidrotérmico, como uno de los métodos más comunes para la preparación de
HAp, se identifica generalmente por la reacción en una solución acuosa a temperatura y
presión elevadas. También, puede considerarse como una precipitación química en la que
se lleva a cabo en la etapa de envejecimiento a una temperatura alta en el interior de la
autoclave. Se ha demostrado que las nanoparticulas de HAp obtenidas a partir de las
condiciones hidrotermales, son altamente cristalinas y estequiometricas. Por otra parte la
pureza de la fase y la relación Ca/P en HAp aumentan significativamente con el incremento
de la temperatura.
También es posible, sintetizar ―nanobastones‖ de HAp, de alta critalinidad, en condiciones
neutras, seguido por un tratamiento hidrotérmico a 200°C durante 60 horas. En este caso,
las nanoparticulas muestran estabilidad y alta dipersion, lo que indica su elevada carga de
superficie y baja tendencia a la aglomeración.
44
La formación de cristales en forma de varilla a través de la cristalización hidrotérmica,
comprende dos etapas principales: el paso de nucleación, en el que una reacción iónica
forma pequeños núcleo cristalino en un medio sobresaturado y el paso hidrotérmico, en el
que los núcleos consolidan su crecimiento hasta adquirir la forma de varilla. Figura 14
Figura 14. Obtención de Hidroxipatitia método Hidrotérmico
Por otra parte, se ha demostrado que la temperatura y el pH son factores más importantes
que afectan a las características estructurales y morfológicas de las nanopaticulas de HAp.
el aspecto fibroso de las nanoparticulas disminuye, de modo abrupto, con el aumento del
pH. La Figura 15, muestra el efecto delas condiciones hidrotermales sobre la mofología de
la HAp.
45
Figura 15.Efecto de las condiciones hidrotermales sobre la morfología de HAp
De acuerdo con la figura, un alto valor de pH genera un crecimiento isotrópico anisotrópico
débil, es decir, los cristales pueden crecer para formar nanoparticulas esféricas o en la
mayoría de nanobastones varillas muy cortas. Sin embargo, con una disminución en el
valor de pH de la suspensión se produce un crecimiento anisotrópico, es decir, critalitos
crecerán en nanobastones unidimensionales o nanoplacas bidimensionales. Además, las
formas más complicadas, incluyendo la estructura tridimensional plumosa, microcubos
tridimensionales y microfibras tridimensionales, solo se obtienen si el valos de pH
disminuye a 4.0.
Procesos Alta Temperatura.
Estos métodos se caracterizan por grabar o quemar a los precursores, dadas las elevadas
temperaturas. Sus procesos son Combustión y Pirolisis.
Combustión
Es un proceso convencional para preparar diversas cerámicas de óxido y es considerado un
método prometedor para la preparación de nanocristales de CaP. La base de la técnica de
combustión, proviene de los conceptos termoquímicos utilizados en los campos de los
propulsores y los explosivos. La característica clave de la síntesis de HAp por combustión,
es su capacidad para producir rápidamente polvos de alta pureza en una sola operación. Por
otra parte, el método hace uso de materiales de bajo costo, la preparación es relativamente
simple y proporciona gran homogeneidad química del polvo sinterizado. Como se ilustra en
la figura 16, la solución en combustión para el procesamiento de HAp implica una reacción
redox exotérmica autosostenida y rápida entre los agentes oxidantes (nitrato de calcio y
ácido nítrico) y un combustible orgánico adecuado (por ejemplo, glicina, urea, sacarosa,
ácido cítrico o ácido succínico), en una fase acuosa.
Para esto, las soluciones acuosas madre de Ca(NO3)2 y (NH4)2HPO4 se mezclan, seguido
por la adición del HNO3 concentrado para disolver el precipitado blanco resultante; una
mezcla de dos o más combustibles se incorporan posteriormente en la solución resultante.
46
La reacción puede ser iniciada por el calentamiento de la mezcla en un horno a una
temperatura bastante baja (por ejemplo 300°C); este es seguido por un aumento repentino
de la temperatura, como resultado de la combustión, a un valor máximo. El paso final, es le
enfriamiento rápido de la mezcla para inducir la nucleación máxima y para prevenir
cualquier crecimiento de las partículas mayor al deseado. La exotermicidad de la reacción
de combustión suministra el calor necesario para mantener la temperatura del sistema, y
una vez iniciada, no se necesita calentamiento externo.
El producto resultante es, generalmente, un aglomerado blando de partículas muy finas. Los
parámetros de procesamiento, incluyendo la relación de combustible/oxidante, la
temperatura inicial del horno, la naturaleza del combustible y la cantidad del precursor
inicial, afectan la temperatura máxima de reacción y en consecuencia las características del
polvo final.
Figura 16. Obtención de Hidroxiapatita por el método de Combustión.
Pirolisis
El método de pirolisis, conocido también como ―spray pirolisis‖, implica la pulverización
de las soluciones precursoras en una llama o en una zona caliente de un horno eléctrico
utilizando un generador de ultrasonidos. Esto es seguido por una reacción de los vapores y
gases generados a altas temperaturas para producir un polvo final, formando aglomerados.
[ref]. El manejar altas temperaturas permite la evaporación completa del precursor, además
de la nucleación y crecimiento de las nanoparticulas en la fase gas.
47
La figura 17 muestra la ilustración esquemática del equipo. De acuerdo a la figura, el
tamaño de las partículas depende fuertemente del tamaño de las gotas generadas durante el
proceso.
Figura 17. Método de Pirolisis para la obtención de Hidroxiapatita
Como desventaja, el proceso de pirolisis, se forman agregaciones secundarias, lo que
resulta una disminución del área superficial específica.
48
Métodos de Síntesis basados en Fuentes Biogénicas.
Las partículas de HAp, generadas, pacial o totalmente, a partir de fuentes biogénicas, es un
propósito dela comunidad científica dada su similitud con la apatita humana. La figura 18 revela
cinco grupos diferentes de fuentes naturales, incluyendo la extracción de minerales de los
residuos biológicos, síntesis a partir de cascaras de huevo, síntesis a partir del exoesqueleto de
organismos marinos, con la ayuda de síntesis de biomoléculas naturales y la síntesis usando las
biomembranas
Figura 18. Método de obtención de síntesis basadas en fuentes biogenicas.
49
2.9 Materia Prima: Hueso de Puerco
El tejido óseo está compuesto de diferente estructuras como: el hueso compacto o cortical,
que está ubicado en la parte externa, es duro, denso y su grosor depende de la exigencia
mecánica; otro es el hueso esponjoso o trabecular, que generalmente se ubica en la parte
interna de los huesos y se caracteriza por ser liviano y por tener una forma de enrejado
trabecular, con espacios óseos en los cuales se aloja la medula ósea.
Las diferencias entre ambos tipos de hueso no sólo son estructurales, sino son funcionales.
El hueso cortical tiene una mayor función mecánica de soporte y de protección, mientras el
hueso trabecular tiene una mayor función metabólica, manteniendo la homeostasis iónica
de los fluidos corporales [123]
Tanto el hueso cortical como trabecular están compuestos por 60% en peso de mineral
inorgánico, 30% en peso de material orgánico y 10% en peso de agua. La fase inorgánica
consiste en nanocristales (2-3 nm de espesor por 25-50 nm de largo o ancho) de fosfatos de
calcio, principalmente Hidroxiapatita [124,125] Ver figura 19.
50
Figura 19. Anatomía del hueso cortical y esponjoso [124].
Estructura Microscópica del Tejido Óseo
Desde el punto de vista microscópico, el hueso se divide en tres tipos: plexiforme,
haversiano y laminar [126].
Hueso Plexiforme
Corresponde a un hueso inmaduro que se encuentra en el tejido óseo esponjoso y cortical
de los individuos en crecimiento, por lo que durante la maduración es sustituto
gradualmente por hueso laminar. Este tipo de hueso está ausente en el esqueleto adulto,
aunque se puede formar cuando se acelera la producción de matriz ósea, como ocurre en los
callos de fractura y tumores óseos.
51
El hueso plexiforme carece de una relación estable entre el contenido mineral y el
colágeno, de tal manera que su densidad mineral es muy variable, a diferencia de los huesos
haversiano y laminar, los cuales mantienen una relación fija entre estos elementos.
Hueso Haversiano
Se encuentra constituido por un conjunto de láminas concéntricas, denominadas osteonas o
sistemas de Havers, con un diámetro de alrededor de 200 m y una longitud de 1-2 cm
poseen un eje neurovascular central, denominado canal haversiano, que está recubierto por
osteoblastos y células osteoprogenitoras. Las osteonas están conformadas por alrededor de
4-20 láminas óseas, entre las cuales se localizan los osteocitos. A nivel de la unión entre las
osteonas vecinas se encuentra una delgada línea de cementación, que está compuesta
principalmente por sustancia fundamental calcificada.
La microestructura de tipo osteonal o haversiana está presente en el hueso cortical maduro
y se forma como resultado de la invasión vascular del tejido óseo ya existente, por lo que
posee una menor resistencia mecánica y un sistema circulatorio menos eficiente que el del
hueso laminar.
Hueso Laminar
Las trabérculas del hueso esponjoso y los sistemas circunferenciales del hueso compacto
están compuestos por una serie de láminas óseas paralelas entre sí. Las láminas tienen un
espesor que oscila entre 3-7 m, ya están formadas por fibras de colágeno dispuestas
paralelamente unas con otras, aunque presentan una orientación distinta al respecto de la
fibras de láminas vecinas. En la interfase entre las láminas ósea se encuentran las cavidades
osteocitarias con sus correspondientes células, cuya nutrición depende de los canalículos
existentes en la matriz ósea, los que permiten el intercambio de moléculas e iones entre los
capilares sanguíneos y osteocitos.
La figura 20 muestra los niveles jerárquicos de la estructura ósea, comenzando por cristales
nanoscópicos de hidroxiapatia, los cuales se encuentran orientados y alineados en el interior
de fibras autoensambladas de colágeno; fibras de colágeno se encuentras arregladas en
52
capas paralelas formando lamelas, las cuales están orientadas concéntricamente alrededor
de vasos sanguíneos formando osteonas; finalmente, las osteronas se encuentran
densamente empacadas formando hueso compacto o formando una red trabercular de hueso
microporoso, dando lugar a las fases de hueso cortical y esponjoso [127].
Figura 20.Representación esquemática de los componentes del hueso desde escala
nanoscópica hasta macroscópica. Pasteris et al. [127]
.
53
Composición Química del Hueso.
Fase orgánica
Está constituida por fibras de colágeno tipo 1, que representan entre un 85-90% de la
fracción orgánica, y que se encuentran rodeadas por sustancia fundamental interfibrilar. Las
moléculas de colágeno son sintetizadas en el retículo endoplásmatico de los osteoblastos, y
luego son secretas a la matriz extracelular donde se organizan y asocian en fibras. Las
fibras de colágeno están compuestas por fibrillas de estructura periódica de 500-700Å de
grosor, que se encuentran íntimamente mezcladas con la fase mineral y se disponen en
paralelo en las laminillas óseas, proporcionando al hueso su estructura laminar.
Fase Inorgánica
Está conformada principalmente por fosfato cálcico de tipo amorfo, relativamente parecido
a la hidroxiapatia mineral, la cual se presenta como pequeños cristales con forma de aguja,
y estructura hexagonal de 2-7nm de diámetro y de 5-10nm de longitud con la fórmula
Ca10(PO4)6(OH)2. Esta fracción tiene una estructura sólida continua, y los cristales de
hidroxiapatita se orientan con su eje paralelo al de las fibras de colágeno tipo 1, en las que
se encuentran nucleados.
Los iones que contiene el tejido óseo son Ca+2
, Mg+2
, Na+1
, Fe+3
, CO3-2
,PO4-3
y OH-1
y hay
otros elementos en trazas[128].
También tiene pequeñas cantidades de fluoruros, sulfatos y cloruros.
Las características mecánicas de la fase mineral del tejido óseo dependen de su porosidad,
que para el hueso cortical es proporcionada por los canales de Havers y Volkmann y las
cavidades de reabsorción, y para el caso del hueso esponjoso, por los espacios
intertrabeculares. Las propiedades mecánicas del tejido óseo varían significativamente de
acuerdo a su contenido de agua, existiendo un grado de hidratación critica, ya que entre 37
y 48mg de H2O/g de hueso, el agua puede liberarse de su ligadura a la estructura ósea.
54
En conclusión, las fibras de colágeno proporcionan al tejido óseo flexibilidad y resistencia a
la tensión, mientras que las sales minerales le confieren dureza, rigidez y resistencia a la
compresión.
Histología ósea.
Fisiológicamente, cuatro tipos de células óseas son las principales responsables directas de
su formación y mantenimiento: pericitos, osteoclastos, osteoblastos y osteocitos, que
representan entre 2-5% del peso total del hueso.
Pericitos. Células planas similares a los fibroblastos, las cuales forman una membrana
continua que recubre por completo las superficies libres del hueso [129].
Osteoblastos y osteocitos. Son células que pertenecen al mismo linaje celular y derivan de
las células mesenquimales pluripotenciales de la célula ósea. Se les denomina
osteoprogenitoras por su capacidad de proliferación y diferenciación. Son células grandes
(20-30 ), de forma poliédrica, con citoplasma basófilo y con aparato de Golgi y retículo
endoplásmico rugoso de tamaño importante; su vida media oscila entre 1-10 semanas, al
término de las cuales desaparecen por apoptosis o se transforman en osteocitos (15%), o en
células limitantes o de revestimiento. Su principal función es la síntesis (matriz or´ganica u
osteoide a un ritmo de 2-3 /día), secreción, depósito y orientación de las proteínas de la
fase orgánica; posteriormente, desencadena cambios que permiten al componente proteico
formar pequeñas depresiones (100 ) sobre la matriz ósea, las cuales se rodearán por
parte de la membrana plasmática de esta célula, rica en enzimas como fosfatasa alcalina y
pirofosfatasa, lo que aumenta la concentración local de fosfato y calcio, creando centro de
nucleación de las sales que le permite su mineralización ( a un ritmo de 1 a 2 /día); una
vez que esto sucede, el osteoblasto se programa para su apoptosis [130].
Los osteocitos son en realidad osteoblastos que han concluido su función de síntesis de
matriz, tomando la responsabilidad de registrar la tensión que soporta el hueso circundante,
el envío de señales a células vecinas para iniciar la remodelación ósea, así como llevar a
cabo el proceso de osteólisis osterocítica, en el cual se reabsorben las sales amorfas de
calcio y de fosfato depositadas en la fase minera. Estas células se encuentran inmersas en la
MEC, es decir, se encuentran inmersas en lagunas osteocíticas bañadas por líquido tisular
55
en la superficie de tejido óseo. Se constituyen como las células más abundantes del hueso,
son de forma estrellada lo que les permite organizarse como un sincitio interconectadas
formado una única estructura.
Osteoclastos. Células multinucleadas, grandes (100 ), ricas en mitocondrias y vacuolas
con especificidad tisular localizadas en la superficie del tejido y que pertenecen al sistema
mononuclear fagocítico, ya que son originadas de las colonias formadoras de granulocitos y
macrófagos provenientes de la células tallo hematopoyética como resultado de su
interacción con precursores de los osteoblastos, cuya principal función es la resorción ósea,
la cual se lleva a cabo mediante la acción de enzimas ácidas y proteolíticas mismas que
disuelven el mineral y digieren la matriz proteica.
Los osteoclastos presentan dos características especiales en su membrana: un borde en
cepillo, donde tiene lugar la resorción y una zona clara rica en microfilamentos que le sirve
de anclaje a la matriz, lo que le permite movilizarse a la zona para reabsorber y
posteriormente la adhesión a la superficie mineralizada.
Ciclo de remodelación ósea.
Las fases de regeneración ósea se dividen en las siguientes fases (figura 21):
1.- Fase quiescente. Se le denomina así al estado de reposo del hueso. En esta fase, cierto
número de osteroblastos involucrados en la remodelación pueden ser incorporados en la
matriz ósea y diferenciarse de osterocitos, otros quedan sobre la superficie ósea como
células de revestimiento y otra parte de ellos mueren por apoptosis [131].
2.- Fase de activación. Fase previa a la resorción, determinada por la presencia de
microfracturas detectadas sobre las células limitantes que recubren la superficie del hueso
(osteoblastos). Cuando estas células se retraen, permiten la digestión de la membrana
endostica por acción de las colagenasas, provocando la atracción de los osteoclastos
provenientes de los vasos sanguíneos al quedar expuesta la superficie mineralizada.
56
3.- Fase de resorción. Inicia cuando los osteoclastos se adhieren a la superficie del hueso y
comienza a reabsorber hueso en dos etapas: primero disolviendo la matriz mineral
(solubilizándola) y posteriormente digestión de la matriz osteoide, provocando su
descomposición, la que permite liberar factores de crecimiento.
4. Fase de formación. En las zonas de resorción, se produce agrupamiento de
preosteoblastos, los cuales son atraídos por los factores de crecimiento previamente
liberados. Estos preosteoblastos sintetizan una sustancia cementante sobre la cual se adhiere
el nuevo tejido, expresando proteínas morfogenéticas óseas responsables de la
diferenciación celular. Posteriormente, los osteroblastos ya diferenciados sintetizan la
sustancia osteoide que llenará las zonas horadadas por los osteoclastos, para que después de
11 dias comience la fase de mineralización del osteoide, rellenando completamente la
cavidad aproximadamente entre 2-3 meses.
5. Fase de minerilización. Ocurre a los 30 días del depósito osteoide, finalizando a los 130
días en el hueso cortical y a los 90 para trabecular. Culminada esta etapa,comienza
nuevamente la fase quiescente.
Figura 21. Fases del remodelado óseo en la superficie del hueso trabecular. Origen y
localización de las células óseas. Evia [129].
57
Hipótesis
Las fibras de hidroxiapatia obtenidas por el proceso de electrospinning tomando
como precursor hueso de puerco, permitirá obtener estructuras con características de
porosidad y fibras imiten la regeneración ósea en una fractura inducida en huesos de
rata.
Objetivos
• Determinar los parámetros de proceso para la elaboración de fibras de hidroxiapatita
a través de electrospinnig.
• Caracterización química, morfológica de compuesto de nanofibras
• Evaluar las características de biocompatibilidad y degradación a través de un fluido
corporal simulado y en ratas .
58
2. MARCO TEORICO
La última década se ha caracterizado, por la aparición de una nueva clase de materiales
basados en especies orgánicas e inorgánicas combinadas en una escala nanométrica los
cuales han obtenido atención recientemente. Estos nuevos materiales, denominados
nanocompuestos o hibridos organico-inorganico, tienen la posibilidad de convertirse en el
nuevo material que tenga lo mejor de los dos mundos, la ventaja de un material orgánico
como peso ligero, flexibilidad y buena moldeabilidad y la alta resistencia mecánica, térmica
y química de los materiales inorgánicos.
En 2002 Shao et al [91], obtuvieron fibras de polivinil alcohol (PVA)/ sílice por medio de
la técnica de electrohilado. En este trabajo se investigaron sus propiedades físicas como
morfología, cristalinidad, grado de adherencia entre el material inorgánico y orgánico.
La investigación se enmarco dentro de un proyecto factible. Materiales económicos y
fáciles de conseguir. Mostrando las condiciones de operación del sistema de electrohilado.
Las técnicas utilizadas para caracterizar su composito fueron Microscopia Electrónica de
Barrido, Espectro Infrarrojo, Difracción de Rayos X y la Calorimetría Diferencial de
Barrido.
La conclusión más relevante de este trabajo es el análisis que hacen sobre la sensibilidad de
agua al momento de preparar el composito PVA/silica. Su estudio mostro el grado de
solubilidad e hinchazón de cada una de sus muestras preparadas. Determinaron que la
solubilidad del PVA disminuye por la adicion del compuesto organico y esta solubilidad
disminuyo drásticamente cuando el contenido de sílice se encontraba por encima del 34%
en peso de material inorgánico.
Este trabajo se relaciona con la investigación de Shao et al [91], con los parámetros de
carga del material inorgánico que en nuestro caso es la hidroxiapatia y el vehiculo utilizado
para realizar el electrohilado PVA.
59
En 2006 Jia et al [134] desarrollo fibras de pva con chitosan por el método de
electrospining, buscando producir una membrana con nanofibras de PVA/Chitosan donde
su aplicación más importante es utilizarlo como soldadura biomédica.
Estudio los efectos de la proporción de volumen del PVA al Chitosan analizando factores
como diámetro y morfología de las nanofibras. Asi como la influencia de los parámetros de
procesamiento en el aparato de electrospinnig.
En su trabajo realizo una serie de mezclas de PVA con Chitosan (3% al 30% en peso de
chitosan) caracterizándolas por las siguientes técnicas: Microscopia Electrónica de barrido
(SEM), Transformada de Fourier de Infrarrojo (FTIR), Rayos X (XRD) y Calorimetría
Diferencial de Barrido (DSC).
Sus resultados indicaron que el diámetro medio de la fibra disminuyo gradualmente con el
aumento en el contenido de Chitosan del 10% al 30%. Pon encima del 30% de Chitosan en
la mezcla, las nanofibras no se podían formar. De acuerdo con la morfologia una
concentración menor al 3% en Chitosan solo generó aglomerados, las formación de fibras
continuas empezaron a partir de concentraciones del 9%, sin embargo a partir de un 10% de
concentración de Chitosan el proceso de electospining fue más difícil por la alta viscosidad
de la solución. Los análisis FTIR y XRD demostraron que hay fuertes enlaces de hidrogeno
entre el Chitosan y el PVA. La Calorimétria Diferencial de Barrido mostró la
microestructura cristalina de la mezcla de PVA/Chitosan no se desarrolló bien en
comparación de las fibras que solo tienen PVA. Esto debido a que la mayoría de las
cadenas se encuentran en un estado no cristalino debido a la solidificación rápida del
material a causa del estiramiento de la solución que produce el electrospining.
La relación de este trabajo con el de Jia [134] nos ayudó a establecer las concentraciones de
soluto-solvente (Hidroxiapatita/ PVA). Garantizando la formación de estas en el aparato de
electrospining.
Ruksudajrit obtuvo nanohidroxiapatita a partir de hueso de bovino mediante el método de
molino de vibración. El hueso de bovino fue desproteinizado con agua caliente se calcino a
800°C durante 3 horas. El producto resultante lo trituro. El material triturado se sometió a
diferentes tiempos de molienda (2h, 4h y 8h). Caracterizó los polvos por Difracción de
60
Rayos X, Microscopia Electrónica de Transmisión (TEM), Microscopia Electrónica de
Barrido (SEM) y Dispersión de Rayos X (EDS).
Determino que el método de molienda de vibración fue una ruta muy simple para la síntesis
de polvo nanocristalino de HAp a partir de hueso de bovino. Se encontró que el periodo
óptimo fue alrededor de 2-4 horas que puede separar y dispersar los cristales de HAp.
La aportación de Ruksudajrit en este trabajo fue los rangos de tiempo de residencia para la
molienda de alta energía para la reducción de tamaño de partícula la HAp tomando como
precursor al hueso de puerco.
Teng et al [135] proponen en el 2008 un método diferente para la producción de fibras de
hidroxiapatita tomando como vehículo de transporte al Colágeno. Si se ha informado de
que las propiedades de la solución tales como la viscosidad conductividad y la tensión
superficial, juegan un papel importante durante el proceso de electrospinnig para materiales
poliméricos. Así que Teng et al [135] propusieron que el estado del precursor sea una
emulsión, para que sea un factor básicamente significativo para la producción uniforme de
nanopartículas llena de fibras de polímero en este caso el Colágeno.
El método convencional, el precursor se presenta en polvo precipitado y secado, se utilizan
para mezclar con soluciones de polímero. Sin embargo, durante el proceso en seco, la
aglomeración entre las nanopartículas debido a su alta energía superficial, lo que sería
desventajoso para la dispersión de partículas en la solución de polímero. En su estudio,
propusieron preparar soluciones de compuestos homogéneos, tanto del precursor de HAp, y
Colágeno.
Las nanopartículas de HAp fueron preparados por un titulación simultanea de Ca(OH)2 y
H3PO4. Después de mezclado y un proceso de centrifugación y lavado posterior, el gel
precipitado se mezcla directamente con una solución de colágeno, seguido de agitación
continua durante 24 horas. El precursor de nanocompuesto resultante se dejó reposar hasta
varios días.
Se probaron distintas formulaciones se logró un 30% en peso de HAp, una concentración
muy alta con referencia a la literatura reportada entre un 10 y 12% en peso [134].
61
Las soluciones del material compuesto homogéneo fueron sometidas a un proceso de
electrospinnig, para formar fibras.
Las fibras preparadas tuvieron un diámetro de 60 nm, y los cristales de nanohidroxiapatia
fueron incrustadas en la matriz de colágeno sin ninguna aglomeración. El procedimiento
modificado demostró una mayor eficiencia en la preparación de nanofibras inorgánicas
uniformes con compuestos orgánicos en comparación al método convencional.
Parte de la aportación de este trabajo que se está presentando, es preparar la materia prima
de una manera natural a partir de hueso de puerco. Por lo que hay que considerar lo
publicado por Sobczak-Kupiec en 2011 [135]. Estudió el efecto de la temperatura de
calcinación y el contenido de CaO libre en la hidroxipatita de origen natural obtenida a
partir de huesos de cerdo mediante tres etapas: hidrólisis con aplicación de ácido láctico,
pre-calcinación a 600° y calcinación dentro de un rango de temperatura de 750-950°C. La
calcinación se llevó a cabo en un horno de cámara estacionaria calentado eléctricamente en
atmósfera de aire, en un horno rotatorio a escala de laboratorio equipado con un quemador
de gas.
La presencia de CaO en la hidroxiapatita diseñada para aplicaciones médicas no puede ser
aceptada. En contacto con moléculas de agua CaO, que se encuentra en la hidroxiapatita se
conviere en Ca(OH)2. Eso da a lugar a tensiones y grietas en el material cerámico
generando una fuerte alcalinidad en el entorno del implante. Este es problema de la
presencia de óxido de calcio en la HAp de origen animal es significativa con respecto a sus
aplicaciones como biomaterial. Sobczak-Kupiec et al investigaron el efecto de los
parámetros de calcinación en el calcio libre contenido en la hidroxiapatia obtenida a partir
de hueso de puerco.
Con este trabajo consideramos primordial calcular el contenido de CaO libre en la
producción natural de HAp a partir de fémur de hueso de puerco con técnicas como EDS o
DRX al momento de caracterizar nuestra materia prima.
62
3.-Metodología Experimental
Preparación de Materia Prima.
Como se mencionó anteriormente en este trabajo utilizamos como precursor de
hidroxipatita hueso de puerco, enfocándonos en el fémur de cerdo.
El fémur se hirvió en agua durante 5 horas, a fin de eliminar todos los tejidos suaves, grasa
y componentes externos. Limpio y seco el hueso, se sumerge por 24 horas en una solución
de H3PO4 17mg/100g . Después 2 horas en la estufa a 250°C. La inmersión en la solución
de H3PO4 y el tratamiento térmico en la estufa permite a la muestra hacerla quebradiza,
para que el hueso sea manipulado en los siguientes procesos
Después el hueso es sometido a un atricionador de baja velocidad donde se obtienen
astillas.
Los polvos obtenidos son secados a 250°C por 2.5h y sinterizada a 1050°C por 2.5h. El uso
de altas temperaturas nos garantiza un material seguro, idóneo para evitar cualquier tipo de
contaminación microbiana, la alta temperatura también ayuda a descomponer y volatizar
componentes orgánicos, proporcionando la cristalinidad característica de la HAp. Como lo
muestra la siguiente figura 22.
Figura 22.Digrama de flujo para la preparacion de los polvos de Hidroxipatita a
partir de femur de puerco.
63
En la figura 23 se puede ver claramente la diferencia en color y textura de astillas de hueso
con polvo de hidroxipatita despues a tratamiento térmico.
Figura 23 Imágenes de la materia prima de hueso a hidroxiapatita
Distribucion de Tamaño de Particula
La molienda de alta energía es el proceso que la partícula se fractura en pequeñas partículas
sin cambiar su estado de agregación. Además de obtener un tamaño específico de partícula
incrementa el área superficial e induce defectos dentro de su red cristalina que favorecen
regiones alta actividad [137].
Un tamaño de partícula adecuado permite la homogenización de la HAp dentro de la
solución de PVA (polivinil alcohol) y esto permite que la salida de la solución por el
orificio de aguja sea manera fluida en el electrospinnig.
Utilizando un molino de alta energía tipo Spex modelo M800. Se trabajó la HAp a
diferentes tiempos de residencia (1h, 2h, 3h). Figura 24.
Empleando como medio de molienda 3 bolas de acero inoxidable de 12.66 milímetros de
diámetro con un peso de 8.37 gramos, 3 bolas de acero inoxidable de 11.05 milímetros de
diámetro con un peso de 5.56 gramos. La carga al contenedor fue de 5 gramos de Hap.
64
Figura 24. Molino Alta Energía Spex modelo M8000.
Una vez terminado el tiempo de residencia en el molino de alta energía, la muestra se
limpia con una solución al 10% de HCl en agitación constante con el fin de eliminar trazas
de fierro provenientes de los medios de molienda. Se filtra con papel filtro y embudo, el
lodo se deja secar; obteniendo un polvo de HAp
Siguiendo la metodología descrita en la siguiente figura 25
Figura 25. Diagrama de flujo para el proceso de alta energía de la materia prima HAp
a partir de hueso de puerco.
Preparación de la solución de PVA.
El uso de polímeros naturales, se ve con particular interés ya que sus productos de
degradación pueden ser incorporados en formas de trayectorias metabólicas normales del
65
huésped evitando efectos secundarios. Al mismo tiempo, los polímeros naturales presentan
una excelente adhesión celular, la proliferación y diferenciación. [138]
EL PVA está aprobado para uso en diversas aplicaciones médicas incluyendo parches
transdérmicos, la preparación de jaleas que se secan rápidamente cuando se aplica sobre la
piel, y en formulaciones de comprimidos de liberación inmediata y sostenida. En soluciones
oftálmicas, como lágrimas sintéticas, contienen PVA ya que proporciona una buena
dispersión y revestimiento de sus propiedades. [139]
Se utilizó PVA de la marca J.T. Baker 99-99.8% Hidrolizado, con un peso molecular
promedio de MW= 77000 – 79000. En la disolución de PVA se debe de tener cuidado de no
formar grumos o una película delgada en la superficie del recipiente. Por ello se utilizó un
baño de agua caliente a la temperatura de 85°C bajo agitación constante y se consideró
disuelto cuando se obtuvo una solución transparente homogénea.
Se prepararon 60 ml de PVA a diferente porcentaje en peso con agitación constante a una
temperatura de 80°C adicionando 1 gramo de HAp.. Figura 26
66
Figura 26. Diagrama de proceso para la preparación de soluciones de PVA y HAp.
Se buscó la formación de una emulsión blanca, la cual posteriormente se aplicó en el
aparato de electrospining para formar las fibras. Figura 27
Figura 27.Solución del Compostito PVA/HAp
67
Preparación de fibras Composito de PVA/HAp
El proceso de electrohiladura permite obtener a partir de una emulsion de PVA/HAp, las
nanofibras en forma de velo recogido sobre un substrato de hoja de aluminio.
La solución se colocó en una jeringa con una aguja de acero inoxidable de calibre 9.
Utilizando el Equipo Nonobond Standar Untit NEU-01 China.
La instalación típica de electrohiladura consta de dos electrodos entre los que se aplica una
corriente de alto voltaje. En este caso, el electrodo superior es la aguja donde se encuentra
la solución polimerica con hidroxipatita. Por otro lado, el electrodo receptor, cargado con
signo contrario, se sitúa en la parte inferior de la máquina y se mantiene en contacto con el
substrato colector.
Los controles están disponible en la cara frontal del equipo, mientras que la unidad de alto
voltaje está situada en el interior de la máquina figura 28. Por último destacar que la cabina
de electrohiladura está sellada durante la marcha del equipo, y en ella se genera una
corriente de aire que mantiene la ventilación apropiada.
La estructura principal del equipo se distingue 3 partes bien diferenciadas:
Área de electrohiladura. Se compone de la cabina en la parte intermedia del equipo,
donde tiene lugar el proceso de electrohiladura y la formación sobre substrato del
velo de nanofibras.
Área de alimentación. Situada al costado derecho del equipo, se encuentran las
jeringas de alimentación de las soluciones poliméricas.
Parte Inferior se ubica el panel de mando exterior para el control de todos los
parámetros del proceso (velocidades, voltaje intensidad…), además del cableado e
instalación eléctrica interior.
68
Figura 28. Fotografías del equipo de electrohiladura Nonobond Standar Untit NEU-01
China a) Vista del panel de Control, b) Substrato Colector, c) Sistema de alimentación
de sustancias poliméricas, d) Otra perspectiva del sustrato colector.
El equipo dispone además de un sistema de descarga de electricidad de la cabina de
electrohiladura, la cual queda cargada de electricidad residual al terminar cada proceso.
El voltaje aplicado y la distancia entre la punta de aguja y el colector fueron 20KV y 15 cm
respectivamente. La velocidad de alimentación de la solución de HAp fue de 0.3 ml/hora.
Para conseguir el electrohilado de los velos de nanofibras se sigue el procedimiento
adjunto:
1.- Se prepara el substrato, la hoja de aluminio se debe de encontrar perfectamente
extendida.
2.- Se controlan las condiciones ambientales dentro de la cabina de electrohiladura.
3.-Se fijan las condiciones de alimentación de la solución polimérica.
4.- Se somete la alta tensión
69
5.- Una vez terminado el proceso de electrohilado se checa por seguridad que todo el
equipo este descargado.
Condiciones de operación para el proceso de electrohilado.
Parámetros
Voltaje 20 KV
Distancia aguja-colector 15 cm
Velocidad de flujo. 0.3 ml/hora
Tabla 1 Condiciones de operación del equipo de Electrohiladura.
Después de un tiempo de residencia de 30 minutos se obtienen un velo abundante de
nanofibras que se observan a simple vista, su textura es suave y se deshacen al tacto. Figura
29.
Figura 29. Velos de nanofibras composito de PVA/HAp
70
El diagrama de flujo muestra las técnicas de caracterización a las que se van a someter los
velos de PVA/HAp. Figura 30.
Figura 30 Diagrama de Proceso para elaboración de fibras de PVA/HAp.
Una vez de tener los velos de nanofibras se prepara la siguiente fase de pruebas biológicas
y evaluar la regeneración de hueso de rata.
Pruebas Biológicas.
Animales de Experimentación. Fueron seleccionadas 10 ratas Wistar (Rattus norvergicus
albinus) cuyo peso varió entre 180 y 200 gramos, las cuales fueron desparasitadas y
alojadas en una jaula durante 15 días, antes de la intervención quirúrgica con el propósito
de que se adaptaran.
Condiciones de Estabulación. La cirugía, mantenimiento y sacrificio de los animales se
realizó en el laboratorio de materiales en la Facultad de Odontología de la Universidad
Autónoma de Chihuahua, según los requisitos éticos y legales vigentes.
Las ratas fueron mantenidas en 2 jaulas cada quien según el grupo de estudio al que
pertenecían. Todas las ratas fueron mantenidas en las condiciones ambientales regladas
para estabulación de animales de laboratorio: 12 horas de luz y 12 de oscuridad, 20-24°C
de rango de temperatura y un grado de humedad relativa en el rango de 55±10%.
71
Normativas éticas y de bienestar. Todas las ratas utilizadas en el estudio recibieron un
trato digno, de acuerdo a la norma mexicana NOM-062-ZOO-1999.
Comité ético de bienestar animal. El estudio se obtuvo el permiso necesario para la
experimentación animal en el comité de experimentación bioética animal de la Facultad de
Medicina de la Universidad Autónoma de Chihuahua.
Ensayos In Vivo
Protocolo anestésico: para la intervención, cada rata fue anestesiada con una solución de
ketanina (Ketolar, 125mg/kg), diazepam (Valium, 10 mg/kg), y atropina (o.05 mg/Kg)
administrada por vía intrapertoneal. (0.5 ml de solución con 2 mg de ketamina). En caso de
precisar más tiempo quirúrgico se administran inyecciones de 0.1 ml de la misma solución.
Figura 31.
Figura 31. Protocolo anestésico
Protocolo analgésico. Tras la intervención cada individuo recibió una dosis profiláctica de
analgésicos y antibióticos: 5 mg de enroflaxicna (Baytril, 5-10 mg/kg) en dosis única por
via subcutánea.
Protocolo de cuidados posoperatorios. Se reintrodujo la dieta líquida a las 4 horas y
sólida pasadas 12 horas tras la cirugía. Durante la primera hora posoperatoria el espécimen
72
permaneció en una jaula asilada. Una vez recuperada y comprobando la estabilidad de sus
funciones vitales, la rata se introdujo con las otras de su mismo grupo. Figura 32.
Figura 32. Protocolo de cuidados posoperatorios.
Protocolo quirúrgico
Colocación del Xenoinjerto (Composito de PVA y Hap, nanofibras) induciendo fractura.
Con la rata en decúbito lateral se procede al rasurado y limpieza de la zona a operar. Se
realiza un abordaje sobre la cara lateral de la pata de la rata. El abordaje de los planos
musculares se realiza a través de las fascias sin necesidad de realizar ninguna sección
muscular que haría especialmente dolorosa la recuperación del animal. Se realiza una
osteotomía con una fractura continua diafisaria a unos 10 mm de la interlinea articular. Para
reproducir las condiciones fisiológicas de la fractura, esta se realizó mediante sierra de
Gillies, dejando como patrón de fractura una oblicua larga con mínima conminución. Se
introduce el material composito de nanofibras de PVA y HAp en la fractura inducida.
Posteriormente se procede al lavado de la superficie ósea con suero fisiológico y cierre por
plano de las heridas quirúrgicas, con material reabsorbible (Vicryl 3/0 para el plano
muscular y de 4/0 par tejido celular subcutáneo y piel). Figura 33.
73
Figura 33. Protocolo quirúrgico, a) Extracción, b) Inducción fractura c) Colocación
del composito de fibras de PVA con HAp
Cada intervención tuvo un tiempo de duración de aproximadamente 30 minutos.
Protocolo Eutanásico. Tras cumplir el tiempo determinado según el grupo, las ratas fueron
sacrificadas mediante una inyección intraperitoneal diluida en suero de 0.4 mg de
pentobarbital.
Método de obtención de muestras. Una vez sacrificadas, según el protocolo eutanásico, se
extrajeron las siguientes estructuras Figura 33.
1. Fémur
2. Tibia
Estas muestras fueron extraidas, para posteriormente limpiarlas de tejido muscular y
fijados en formaldehido al 10%, para poder ser deshidratados. Figura 34.
74
Figura 34. Método de Extracción de Muestra a) fémur control y b) fémur con fibras PVA y
HAp.
Ensayo In Vitro
Se siguieron los mismos protocolos descritos en la sección anterior, a excepción que el la
tibia y el fémur fueron sumergidos en Fluido Corporal Simulado dentro de una incubadora
a 37°C figura 35.
Para la preparación del fluido corporal simulado (SBF) se utilizó el protocolo publicado por
KoKubo et al. Tabla 2 [22].
75
Figura 35. Ensayo in vitro
Tabla 2. Reactivos con sus respectivas cantidades y pureza para la preparación de SBF
[22].
76
Figura 36. Resumen Esquemático de las pruebas de respuesta biológica al material
composito de fibras PVA-HAp.
Caracterización estructural y morfológica.
Se presentan las diferentes técnicas de caracterización, así como los detalles del protocolo
usado para la evaluación los materiales elaborados.
Análisis térmicos.
Se llevaron a cabo análisis Termogravimétrico (TGA) utilizando una atmósfera de gas
argón, calentando las muestras desde temperatura ambiente (25 ºC) hasta 800ºC, con una
rampa de 10 ºC / min utilizando crisoles de alúmina. Se utilizó el equipo TA SDT Q 600 de
la marca TA instruments.
La técnica consiste en registrar las pérdidas de peso de la muestra conforme se sigue un
programa de calentamiento.
77
Difracción de rayos X.
Se utilizó la técnica de difracción de rayos X de polvos para determinar la estructura de los
materiales. Se utilizó un difractómetro Panalytical modelo XPert PRO con detector X
Celerator y una radiación monocromática emitida por Cu Kα (λ = 1.5406 Ǻ). El ángulo
inicial fue de 2θ = 20º y el ángulo final de 80º, con un paso de 0.05º y iempo de 10 s,
voltaje = 40 kV y corriente de 30 mA. Los patrones fueron comparados con las cartas
cristalográficas de hidroxiapatita.
Microscopía electrónica de barrido y EDS.
Las micrografías obtenidas se realizaron con un microscopio electrónico de barrido
Jeol JSM5800-LV con filamento de tungsteno y con un microscopio de barrido de emisión
de campo Jeol JSM7401F. El porcentaje atómico elemental de los materiales se determinó
con el sistema de microanálisis EDX- mod DX. La preparación de las muestras consistió en
fijarlas sobre cinta de cobre. Las micrografías fueron tomadas utilizando diferentes voltajes
de aceleración y con diferentes distancias de trabajo (WD). Se utilizaron las señales de
electrones secundarios (SEI) y electrones retrodispersados (COMPO).
Microscopia de Fuerza Atómica
Las pruebas texturales de las fibras se analizaron mediante la técnica de microscopia de
fuerza atómica VEECO Instruments Multimode IVA .
La técnica de AFM se basa en el efecto piezoeléctrico inverso, que es un acoplamiento
lineal entre las propiedades eléctricas y mecánicas de un material. Es decir, cuando la
muestra se encuentre expuesta a un campo eléctrico, el material presentara cambios en sus
dimensiones. Por lo tanto, un microscopio de fuerza atómica es operado en modo contacto
con una tensión alterna aplicada en la punta.
La punta se mueve sobre la superficie de la muestra. El campo eléctrico generado en la
muestra, hace que los dominios con polarización paralela al campo eléctrico se expandan y
con polarización opuesta se contraigan.
78
Si el vector de polarización es perpendicular al campo eléctrico, no hay deformación
piezoeléctrica a lo largo de la dirección del campo, sino una deformación de corte, dando
lugar a desplazamientos de la superficie de la muestra paralelas a si misma a lo largo de la
dirección de la polarización.
La punta de la sonda al estar en contacto con estos desplazamientos, ocasiona movimientos
verticales o de torsión en el voladizo de AFM. La dirección de esta desviación depende de
la orientación del campo eléctrico y la polarización del dominio. En caso general, mediante
el análisis de las amplitudes y fases de las vibraciones de torsión o movimiento verticales
del voladizo se puede reconstruir las estructuras de los dominios de la muestra.
Tamaño de Partícula
El tamaño de partícula se mide mediante difracción laser para distintos tiempos de
residencia de 1, 2 y 3 horas en el SPEX 8000. El equipo utilizado fue Mastersizer 2000
Malvern Instruments.
79
4.- Resultados y Discusión
Polvos de Hidroxiapatita.
Antes de usar el polvo de hidroxiapatita para la preparación de los compositos de fibras se
realiza un análisis SEM/EDS a dichos polvos para determinar la relación Ca y P
determinado la relación estequiométrica nos indicará si el material es adecuado para
implantes y regeneración de hueso.
La figura 37 muestra la morfología de hueso de puerco previo al tratamiento térmico, se
puede observar una superficie rugosa sin evidencia del granos.
Figura 37 Micrografias SEM con Hueso de Puerco sin tratamiento térmico.
80
Se tomaron fotografías después del tratamiento térmico (temperatura de 1050°C) y se
observó partículas más limpias, aglomerados conformados por granos esféricos lisos,
evidencia de que se formó una estructura simétrica figura 38 Las micrográficas se tomaron
en un rango de 5000 a 15000 aumentos.
Figura 38 Micrografias SEM de Hueso de puerco con tratamiento térmico.
Mediante la dispersión de rayos X, usando el sistema acoplado al SEM, se analizó la
proporción de cada uno de los elementos. Las fotografías de la figura 39 muestran las
zonas donde se analizó la relación Ca/P.
Todas las mediciones se encuentran dentro del rango aceptable (1.30 a 1.80) un promedio
de 1.40, de acuerdo con la relación teórica de Ca/P de 1.67. Esto se debe a la naturaleza del
material, fémur de puerco, la alimentación y las condiciones de crianza del animal pueden
afectar la calidad mineral de sus huesos.
81
Figura 39 EDS de muestras de hueso de puerco después de tratamiento térmico.
Un análisis DRX confirma la presencia de hidroxipatita, en la figura 40 se muestra la
estructura de un hueso sin tratamiento térmico, se puede observar un material semi
amorfizado y una vez con el tratamiento térmico a 1050°C se refinan los picos
característicos de la HAp. El pico principal de la Hap a 2 = 31.67 corresponde al plano
(211), los picos secundarios de menor intensidad 2 = 32 y 2 = 33 pertenecen a los planos
(112) y (300) respectivamente y para confirmar la presencia de Hap este en el polvo, se
compara con la base de datos JCPDS file # 09-0432.
El CaO en un análisis de rayos X se ubica en la posición 32.34° 2 , JCPDS file # 37-1497;
la figura 26 muestra que en dicha posición 2 no hay pico, por lo tanto con la temperatura
de calcinación de 1050°C no hay formación de óxido de calcio en el material que se tomara
como materia prima para la fabricación del composito de HAp/PVA.
,
82
Tabla 3Relación Ca/P en polvo de hidroxipatia.
Figura 40.DRX Hueso de puerco e Hidroxipatita.
Para seguir con la fabricación del composito de nanofibras, fue necesario someter al polvo
de hidroxipatita a una molienda de alta energía con el fin de conseguir un tamaño adecuado
83
de particular para el polvo y garantizar así una mayor suspensión de hidroxiapatita dentro
de la solución de PVA.
La figura 41 muestra la distribución de partícula antes de la molienda la cual fue de ±
115.63 la molienda reduce el tamaño de partícula de ± 115. 63 a ±38.53 .
Podemos observar que el tamaño de partícula no cae drásticamente entre los tiempos
establecidos de residencia. Por lo tanto una 1 hora de molienda es un tiempo óptimo para
obtener un tamaño de partícula que facilite la operación del electrospinnig
Figura 41.Tamaño de Partícula polvo de Hidroxipatita.
84
Figura 42. DRX Polvos de hidroxipatita realizados después de la molienda de alta
energía.
Como se puede observar en la figura 42 la posición de los picos no cambia, solo la
intensidad de ellos, lo que indica que por la acción de la molienda de alta energía el
material se va amorfizando. Se determinó que el tiempo de molienda de alta energía para
los polvos será de 1 hora.
Composito de Nanofibras HAp/PVA.
En el proceso de obtención y deposición de los velos de nanofibras, mediante
electrohiladura sobre un substrato metálico, se distiguen tres variables con las que trabajar:
el sustrato colector, la disolución del polímero, precursora del velo de nanofibras y el
proceso de fabricación del velo de nanofibras.
Sustrato Colector: la influencia del susbtrato colector del velo de nanofibras en el proceso
de electrohiladura es determinante, hasta el punto que puede llegar a no tener lugar el
proceso si el substrato no reúne las condiciones adecuadas como colector de las nanofibras.
85
Disolución precursora del velo de nanofibras: este grupo de variables está relacionado con
la química del PVA y más concretamente con su solubilidad en agua, ya que es condición
indispensable conseguir disolver el polímero para obtener velos de nanofibras de dicho
polímero. El proceso de disolución del polímero lleva asociado el estudio de las
condiciones de concentración y viscosidad.
Proceso de Electrohiladura: en el proceso de electrohiladura intervienen principalmente
cuatro variables; la intensidad de voltaje aplicado, velocidad de alimentación de la
disolución, la distancia entre electrodos y la velocidad de paso del substrato colector. No
obstante en el presente trabajo se establecen como fijas: la intensidad del voltaje aplicado,
velocidad de alimentación y la distancia de los electrodos.
Efecto de la concentración de PVA sobre los parámetros de la disolución
En este apartado se procede a evaluar la influencia de la incorporación de diferentes
cantidades de PVA a la disolución. Para la caracterización de la disolución precursora del
velo de nanofibras se realizan pruebas de viscosidad.
Se realizaron el estudio de dos concentraciones diferentes, las cuales van a permitir
observar la tendencia de la influencia de cada variable.
86
Figura 43. Viscosidad de PVA en función de la concentración.
La figura 43se representa la tendencia de la viscosidad en función de la concentración para
una concentración del 10% PVA se tuvo en promedio 276 cps y 15% de PVA con un
promedio de 374 cps.
Una vez determinada la viscosidad más adelante se observará el efecto de la concentración
para suspender polvo de hidroxiapatia.
Efecto de la concentración de PVA sobre la producción de nanofibras.
Una vez estudiado y caracterizado el efecto que la concentración del polímero ejerce sobre
los parámetros de la disolución precursora del velo de nanofibras, en este apartado, se lleva
a cabo el estudio dela influencia que este mismo parámetro ejerce sobre los velos
electrohilados.
Antes de empezar a exponer el estudio y caracterización de los velos de nanofibras, es
necesario presentar el resto de los parámetros que intervienen en el proceso de
electrohiladura para la obtención de dichos velos.
Hay que tener en cuenta, las condiciones ambientales de humedad y temperatura así como
la temperatura propia de la disolución las cuales se muestran en la tabla 4
87
Referencia Temperatura de
Disolución
Temperatura de
Operación
Humedad %
Solución 10%
PVA
80°C
25°C 22
Solucion 15%
PVA
80°C 25°C 22
Tabla 4 Parámetros de temperatura y humedad de la solución precursora de electrohilado.
El resto de las variables que intervienen en el electrohilado de los velos de nanofibras,
corresponden a los parámetros del propio proceso; voltaje, intensidad, distancia entre
electrodos, flujo de alimentación de la disolución. Todos estos parámetros se muestran en la
tabla 5, para cada una de las concentraciones de PVA estudiadas.
Referencia Voltaje Distancia aguja-colector Velocidad de flujo
Solución 10%
PVA
20 KV
15 cm 0.3 ml/hora
Solucion 15%
PVA
20KV 15 cm 0.3 ml/hora
Tabla 5 Parámetros de operación del equipo de electrohilado para solucione con 10% PVA
y 15% de PVA
88
Caracterización Identificación
Una manera de asegurar la formación del composito a los velos de nanofibras fue
realizando un análisis de rayos X tomando como referencia el polvo de hidroxipatita y una
muestra donde solo se electrohilo una solución de PVA al 10 % en peso
Figura 44 DRX Composito de nanofibras.
El patrón de XRD de las fibras compuestas revelo los picos característicos tanto de la HAp
como el PVA Figura 44. La ampliación la superposición de los picos de difracción se
atribuyó a la cristalinidad y el tamaño de cristales de HAp Sin embargo, el grado de
cristalinidad de HAp en las fibras compuestas permaneció sin cambios con respecto a la del
polvo de HAp que sirvió como materia prima
Caracterización Térmica
La caracterización térmica de los velos se lleva a cabo con el fin de conocer la carga de
HAp de los velos y como ésta se ve modificada con la variación de las diferentes variables
89
que entran en juego en el proceso de electrohiladura, incluyendo las variables asociadas a la
disolución de partida. Durante el proceso de electrohilado y debido al estiramiento que
sufre el polímero en el vuelo entre electrodo y electrodo, tiene lugar cierto grado de
ordenación de las cadenas poliméricas.
Se muestran las curvas calométricas del TGA de los velos electrohilados, para cada una
delas concentraciones de polímeros de PVA estudiadas. Figura 45
Figura 45 Termograma de las nanofibras composito HAp/PVA
La medición se realizó hasta la temperatura de 700°C. El termograma muestra que la mayor
concentración de PVA puede suspender más cantidad de HAp. La solución de 15% de PVA
deja una carga de 15% sólidos en el composito.
Caracterización Microscópica
Mediante la caracterización microscópica se llevará a cabo el estudio de la morfología de
los velos, las caracterización del diámetro de las nanofibras y la caracterización dela
topografía y rugosidad de la superficie de los mismos.
90
El estudio dela morfología de los velos se llevó a cabo mediante microscopía electrónica de
barrido (SEM). Se estudian los velos de nanofibras a 5000 hasta 300000 aumentos. Al
analizar los velos a menores aumentos, se examina el conjunto del velo, su homogeneidad y
morfología identificando la aparición de agujeros y macroagregados de mayor tamaño. El
estudio a mayores aumentos permite conocer al detalle la estructura que forman las
nanofibras y sus imperfecciones.
Para empezar elaboraron nanofibras de PVA a 10 y 15% en peso con el fin de tener un
patrón en blanco de la conformación del velo del composito.
Tanto la concentración de 10% y 15 % en peso de PVA presentaron nanofibras
perfectamente definidas aunque en un 15% de peso de PVA la cantidad de fibras es mayor.
La morfología de los velos es homogénea. Se observan agregados de polímero debido a que
las nanofibras de polímero no llegan secas al substrato colector, sino que arrastran parte del
agua de la disolución precursora, por lo que acaban disolviéndose y uniéndose unas con
otras. Figura 46.
Figura 46 Micrografias SEM de nanofibras al 10% de PVA
91
Con una concentración de 15% en peso se presentó una morfología bastante homogénea,
sin agujeros y con nanofibras perfectamente perfiladas, ausencia de agregados de polímero.
Figura 47
Figura 47 Micrografias SEM con 15% de PVA
Se tomaron fotografías de los compositos de HAp/PVA a 10% y 15% en peso. El objetivo
es observar que tanta cantidad de polvo de HAp se logró suspender dentro de las fibras de
PVA. Las fotografías muestran figura 48 y figura 49muestran fibras con 10% de PVA en
peso perfectamente perfiladas y con inscrustaciones de HAp dentro del entramado de la
fibra. Aunque se ve muy poca cantidad de HAp en el composito.
Un mapeo figura 50 confirma la presencia de elementos Ca y P dentro de la red de fibras.
92
Figura 48 Micrografias SEM compostio HAp/PVA con 10% en peso. a) y b) imágenes
a 10,000 aumentos, c) y d) imágenes a 15,000 aumentos.
93
Figura 49 Micrografias SEM compostio HAp/PVA con 10% en peso. a) imagen a
27,000 aumentos , b) y c) imágenes a 30000 aumentos
94
Figura 50 Mapeo de composito de HAp/PVA.
95
Caracterización de la topografía y rugosidad de la superficie de los velos
del composito de nanofibras.
La segunda parte dela caracterización microscópica se lleva a cabo mediante AFM, esta
técnica de análisis completa la información obtenida a partir del SEM, ya que permite el
estudio de la topografía y rugosidad de la superficie de los velos de nanofibras. El perfil de
rugosidades se ha seleccionado evitando en la medida de lo posible la imperfecciones, ya
sean agujeros o del tipo macroagregados de polímero.
Las imágenes de AFM, confirman lo observado y comentado en las imágenes del SEM a
diferentes aumentos. Las imágenes de las concentraciones de 10% de PVA y 15% PVA en
los compositos de HAp mostraron una superficie bastante homogéneas, sin porosidades en
su fabricación. Figura 51
Figura 51. Imagen de composito HAp/PVA al 10% en peso y perfil de rugosidades. La
línea indica el perfil seleccionado.
96
La figura 52 presenta la topografía de las fibras al 15% de PVA donde también las
nanofibras no presentaron ningún defecto como poros o aglomerados en su fabricación.
Figura 52. Imagen de composito HAp/PVA al 15% en peso y perfil de rugosidades. La
línea indica el perfil seleccionado.
La muestra del composito de HAp con 15% de PVA, fue le velo mejor procesado, según las
imágenes durante el proceso de caracterización, por lo que a partir del AFM se concluye
que es la muestra en las nanofibras están mejor perfiladas.
Caracterización del diámetro de las Nanofibras.
Para la caracterización y medida del diámetro del diámetro de las nanofibras se tomaron
entre 15 y 20 medidas de diámetros de nanofibras. Para cada una de las microfotografías de
los velos de las nanofibras entre 10,000 y 15,000 aumentos, evitando las imperfecciones,
agujeros y agregados de polímero y centrándose únicamente en aquellas zonas en las que se
observa un enmarañado de nanofibras más o menos regular.
Para la primera muestra referenciada nanofibras PVA al 15% debido a que se mostró una
mayor cantidad de agregados de hidroxiapatita suspendidos en las fibras. En la micrografía
correspondiente a la condición de 15% de PVA figura 53, muestran nanofibras muy bien
perfiladas, de hecho el histograma de frecuencias muestra que la mayoría de los diámetros
se encuentran entre 302 y 344 nanómetros. En la micrografía de fibras de solo polímero
97
PVA figura 54, donde también se observan fibras bien perfiladas se encuentran diámetros
medios entre 243 y 273 nanómetros.
Figura 53. a) Imagen SEM fibras composito PVA-HAp 15%, b) Histograma de
frecuencias diámetros de fibra.
Figura 54. a) Imagen SEM fibras PVA, b) Histograma de frecuencias diámetros de
fibra
Aunque estudios anteriores registran que a mayor conductividad de la disolución de
polímero, mayor facilidad presenta la solución de cargarse y formar finas fibras de
polímero [140]. En este caso el agregar partículas de un cerámico, en este caso
Hidroxiapatita aumentan el diámetro de fibra, es el efecto de la formación del composito.
98
Caracterización de la respuesta biológica del composito de nanofibras
PVA-HAp.
Pruebas in Vivo Caracterización Microscópica.
De acuerdo con lo mencionado en el aparatado de metodología, las pruebas in vitro como in
vivo se registraron a los 7 y 21 días. Primeramente tenemos los resultados evaluados en la
prueba in vivo. La figura 55 muestra los primeros 7 días del composito en el hueso, llevado
a condiciones artificiales en la incubadora bajo fluido corporal simulado.
Figura 55. Imagen SEM Prueba in vivo 7 días, a) control,b) hueso con compositos de
nanofibras PVA-HAp
Se puede observar que no existe rechazo, ni desprendimiento del material, así que esta
primera fase de la prueba nos confirma que el material huésped es perfectamente
biocompatible con su anfitrión el hueso de rata.
Veintiún días después, se realizaron los siguientes análisis SEM para mostrar el progreso
del composito en el hueso. Las imágenes de la figura 56 y 57 revelan que el acoplamiento
de las fibras con el hueso de rata fue exitoso, de hecho en la figura 58 una imagen con
acercamiento se puede observar la regeneración de material óseo sobre la superficie de las
fibras.
99
Figura 56 Imagen SEM pruebas in vitro 21 días, a) Control, b) hueso de rata.
Figura 57 Imagen SEM por electrones retrodispersados de las pruebas in vitro 21
días, a) Control, b) hueso de rata.
100
Figura 58 Imagen SEM pruebas in vitro 21 días.
Pruebas in vivo
Después de la intervención quirúrgica en la rata wistar, se realizaron evaluaciones clínicas
de las pruebas in vivo. Las variables evaluadas durante todo el experimento comprendieron:
dolor, inflamación, edema, fistulas y dehiscencia.
Ninguna rata mostró complicaciones postoperatorias, la reacción inflamatoria
postquirúrgica fue normal, no se observaron cambios de salud en los animales. No se
presentaron signos de rechazo o infección en los sitios del implante, así como movimiento
del mismo. Por lo que se puede decir que los implantes fueron clínicamente tolerados por
las ratas ver figura 59.
Figura 59 Evaluación Clínica de ratas wistar, después de la colocación del nanocomposito.
101
Caracterización Microscópica. Prueba in vivo 7 días.
Se realizaron imágenes SEM para evaluar la respuesta biología del composito de PVA-HAp
el primer juego de muestras se extrajeron 7 días después de la operación. En la figura 60 se
puede observar a simple vista la rasgadura que se indujo sobre el hueso así como la
colocación del velo de nanofibras sobre dicha incisión.
Figura 60. Imágenes de la extracción del fémur de la rata wistar después de 7 días, a)
Fémur con composito recuadro negro área de incisión y colocación del implante, b)
acercamiento a la región de acción del composito de fibras.
A simple vista se puede ver una herida cerrada y con un acoplamiento entre el hueso y el
composito de fibras de PVA/HAp.
Para observar con más detalle el comportamiento de las nanofibras bajo condiciones in
vivo, se realizaron pruebas en microscopio electrónico de barrio y así no perder de vista la
respuesta del material dentro de la rata. Y si hay evidencia de una consolidación ósea
primaria. Fin de la fase reactiva, las células van muriendo [141] los fibroblastos sobreviven
y comienzan a multiplicarse formado un agregado celular que, junto pequeños vasos
sanguíneos, forman el tejido granular [141].
A siete días de interacción a 20000 aumentos podemos observar la formación de un callo
óseo inmaduro en la tibia figura 61 como en el fémur figura 62.
102
Figura 61. Imágenes SEM, a) Control hueso de rata tibia a 7 días prueba in vivo, b)
Hueso de rata tibia con fibras PVA-HAp 15%
Figura 62. Imágenes SEM, a) Control hueso de rata fémur a 7 días prueba in vivo, b)
Hueso de rata fémur con fibras PVA-HAp 15%
103
Imágenes tomadas a mayores aumentos, 75000 aumentos la integración de las fibras fue
favorable, se pueden ver indicios de osteointegración un buen indicador para la siguiente
fase de consolidación: la formación de un callo maduro en hueso de rata. Figura 63.
Figura 63. Imágenes SEM, a) Fibras de PVA-HAp 15%, b) acercamiento 6500000
aumentos de la misma zona.
Caracterización Microscópica. Prueba in vivo 21 días.
A 21 días de pruebas por medio de la microscopia se observó el inicio de la formación de
un callo óseo maduro. El abultamiento de tejido fibrocartilaginoso termina cerrando la
fractura y mineralización [141]. A 20000 aumentos figura 64
104
Figura 64. Imágenes SEM, a) Control hueso de rata, b) Hueso de rata con fibras de
PVA-HAp
Imágenes SEM a 1500000 aumentos muestran la integración del composito y formación de
un callo maduro en el hueso de la rata figura 65.
Figura 65. Imágenes SEM, a 1500000 aumentos hueso de rata con fibras PVA-HAp
15%
.
105
Mecanismo de regeneración
La cinética de reabsorción de la HAp es puede ser modulada por parámetros texturales
como
o El área superficial disponible; orden descendente de reactividad: polvo> solido
poroso> sólido compacto
o El tamaño de los cristales que conforman el material; menor tamaño mayor
rectividad
o El contenido de imperfecciones de la celda cristalina; mayor número de
imperfecciones y vacantes más reactivo.
La principal propiedad de la HAp como material de regeneración de lesiones óseas no es
probablemente su similitud composicional con la fase mineral ósea, ni su susceptibilidad de
ser reabsorbida por el organismo. Su característica más importante es la bioactividad [142].
La bioactividad se define como la capacidad de un material para unirse a través de un
enlace directo con el tejido óseo que lo rodea. Por lo tanto, un material bioactivo crea un
microambiente compatible con la osteogénesis [143,144]. In vitro la bioactividad se
determina por la formación de una capa o película apatitica sobre la superficie del material
cuando es sumergido en el fluido fisiológico simulado (SBF)[] y el mismo comportamiento
fue observado en las pruebas in vivo.
Se propone que este mecanismo de formación de la capa apatitica está dominado por la
teoría clásica de la nucleación, de tal forma que tanto el incremento de la concentración
iónica local, como la disminución de la energía superficial de la HAp, producirá un mayor
número de núcleos que espontáneamente crecerán sobre la superficie. Debido a que
estamos trabajando con un HAp no estequiometria por la tanto más reactiva.
La figura 66 muestra de manera gráfica el mecanismo propueto.
106
Figura 66. Mecanismo propuesto de regeneración en el hueso de rata cepa wistar.
Por lo tanto el mecanismo controlante de regeneración está controlado por mecanismos de
transporte como la difusión de los iones en la superficie de HAp de puerco o factores
termodinámicos como la saturación local de iones en el SBF o en fluido corporal de la rata.
Los diferentes componentes tanto en la fase líquida como en la sólida, pueden modificar la
cinética de la reacción, originando diferentes morfologías de los cristales precipitados y por
lo tanto diferentes propiedades del material.
107
5.- Conclusiones
Se fabricaron por Electrohilado fibras compuestas PVA / HAp.
La hidroxiapatita se obtuvo a partir de un precursor natural hueso de cerdo.
Se estudió y evaluó el efecto de la concentración de PVA sobre la morfología y la
cantidad de partículas HAp dispersadas en las fibras compuestas PVA / HAp .A una
concentración de PVA al 15%, se obtuvo una mejor dispersión de partículas de
HAp, en comparación con la encontrada para la concentración de PVA al 10%.
Los resultados indicaron que, cuando se comparan entre sí, el diámetro medio de las
fibras de electrohilado PVA y las fibras compuestas electrohilado PVA / HAp
formadas no cambia significativamente
Pruebas Biológicos: Esta técnica es conocida como Xenoinjerto, en el cual se toma
material ajeno al huésped y se evalúa su integración ósea fenómenos de
ontogénesis, ortoclasa y osteoconductivdad
En los experimentos in vitro en suero corporal simulado se logró la integración de
las fibras, obteniendo resultados positivos que favorecen la estimulación de la
actividad osteoplastia en hueso de rata
El composito de PVA con HAp a partir de hueso de puerco ha demostrado ser una
opción viable para la regeneración de hueso.
Se propone un mecanismo simple de regeneración de hueso
108
Referencias
[1] Williams, D. F. (1999). The Williams dictionary of biomaterials. Liverpool University
Press.
[2] Chandler, H. H. (1981). Williams D. F. Cunningham J. Materials in clinical
dentistry1979 Oxford University Press Oxford, England 376 pages, illustrated, indexed.
The Journal of Prosthetic Dentistry, 45(5), 574-575.
[3] Hench, L. L. (1991). Bioceramics: from concept to clinic. Journal of the American
Ceramic Society, 74(7), 1487-1510.
[4] Lyman, D. J., & Rowland, S. M. (2007). Biomedical materials. Encyclopedia Of
Polymer Science and Technology.
[5] Voegeli, A. V. (Ed.). (2001). Lecciones básicas de biomecánica del aparato locomotor.
Springer Science & Business Media.
[6] Muratore Moreno, G., Ojeda Castellano, J. S., Erdocia Eguía, P., Carrasco Martínez, L.,
Chirino Cabrera, A., & Rodríguez Álvarez, J. P. (2003). Biomateriales cerámico.
[7] M.Vallet-Regi, L.Munuera, Biomateriales Aquí y Ahora, Dykinson, Madrid, 2000.
[8] Nayak, A. K. (2010). Hydroxyapatite synthesis methodologies: an overview.
International Journal of ChemTech Research, 2(2), 903-907.
[9] Bagambisa, F. B., & Joos, U. (1990). Preliminary studies on the phenomenological
behaviour of osteoblasts cultured on hydroxyapatite ceramics. Biomaterials, 11(1), 50-56.
[10] Chen, Q. Z., Wong, C. T., Lu, W. W., Cheung, K. M. C., Leong, J. C. Y., & Luk, K.
D. K. (2004). Strengthening mechanisms of bone bonding to crystalline hydroxyapatite in
vivo. Biomaterials, 25(18), 4243-4254.
[11] Elliott, J. C., Mackie, P. E., & Young, R. A. (1973). Monoclinic hydroxyapatite.
Science, 180(4090), 1055-1057.
[12] Rivera-Muñoz, E. M. (2011). Hydroxyapatite-based materials: synthesis and
characterization. INTECH Open Access Publisher.
[13] Kohn, D. H., & Ducheyne, P. (1992). Materials for bone and joint replacement.
Materials science and technology.
[14] Oonishi, H. (1992). Development and application of bioceramics in orthopaedic
surgery. BIOMATERIALS-Hard Tissue Repair and Replacement, 3.
109
[15] Castaldini, A., & Cavallini, A. (1985). Setting properties of bone cement with added
synthetic hydroxyapatite. Biomaterials, 6(1), 55-60.
[16] Huang, Z. M., Zhang, Y. Z., Kotaki, M., & Ramakrishna, S. (2003). A review on
polymer nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites.
Composites science and technology, 63(15), 2223-2253.
[17] Deitzel, J. M., Kleinmeyer, J. D., Hirvonen, J. K., & Tan, N. B. (2001). Controlled
deposition of electrospun poly (ethylene oxide) fibers. Polymer, 42(19), 8163-8170.
[18] Fong, H., Chun, I., & Reneker, D. H. (1999). Beaded nanofibers formed during
electrospinning. Polymer, 40(16), 4585-4592.
[19] Chew, S. Y., Wen, Y., Dzenis, Y., & Leong, K. W. (2006). The role of electrospinning
in the emerging field of nanomedicine. Current pharmaceutical design, 12(36), 4751.
[20] Dekker, A. J. (1959). Electrical engineering materials. Prentice Hall.
[21] Sánchez, L. M. D., Rodriguez, L., & López, M. (2013). Electrospinning: la era de las
nanofibras. Revista Iberoamericana de Polímeros, 14(1), 10-27.
[22] Taylor, G. (1969, December). Electrically driven jets. In Proceedings of the Royal
Society of London A: Mathematical, Physical and Engineering Sciences (Vol. 313, No.
1515, pp. 453-475). The Royal Society.
[23] Reneker, D. H., Yarin, A. L., Fong, H., & Koombhongse, S. (2000). Bending
instability of electrically charged liquid jets of polymer solutions in electrospinning.
Journal of Applied physics, 87(9), 4531-4547.
[24] Ramakrishna, S., Fujihara, K., Teo, W. E., Lim, T. C., & Ma, Z. (2005).
Electrospinning process. An Introduction to Electrospinning and Nanofibers. World
Scientific Publishing, Singapore, 135-137.
[25] Lannutti, J., Reneker, D., Ma, T., Tomasko, D., & Farson, D. (2007). Electrospinning
for tissue engineering scaffolds. Materials Science and Engineering: C, 27(3), 504-509.
[26] Huang, Z. M., Zhang, Y. Z., Kotaki, M., & Ramakrishna, S. (2003). A review on
polymer nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites.
Composites science and technology, 63(15), 2223-2253.
[27] Subbiah, T., Bhat, G. S., Tock, R. W., Parameswaran, S., & Ramkumar, S. S. (2005).
Electrospinning of nanofibers. Journal of Applied Polymer Science, 96(2), 557-569.
110
[28] Rein, D. M., Shavit‐Hadar, L., Khalfin, R. L., Cohen, Y., Shuster, K., & Zussman, E.
(2007). Electrospinning of ultrahigh‐molecular‐weight polyethylene nanofibers. Journal of
Polymer Science Part B: Polymer Physics, 45(7), 766-773.
[29] Mott, R. L. (2006). Mecánica de fluidos. Pearson educación.
[30] Chuangchote, S., & Supaphol, P. (2006). Fabrication of aligned poly (vinyl alcohol)
nanofibers by electrospinning. Journal of nanoscience and nanotechnology, 6(1), 125-129.
[31] Son, W. K., Youk, J. H., Lee, T. S., & Park, W. H. (2005). Effect of pH on
electrospinning of poly (vinyl alcohol). Materials letters, 59(12), 1571-1575.
[32] Huang, Z. M., Zhang, Y. Z., Kotaki, M., & Ramakrishna, S. (2003). A review on
polymer nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites.
Composites science and technology, 63(15), 2223-2253.
[33] Deitzel, J. M., Kleinmeyer, J., Harris, D. E. A., & Tan, N. B. (2001). The effect of
processing variables on the morphology of electrospun nanofibers and textiles. Polymer,
42(1), 261-272.
[34] He, J. H., Wu, Y., & Zuo, W. W. (2005). Critical length of straight jet in
electrospinning. Polymer, 46(26), 12637-12640.
[35] Viswanathan, G., Murugesan, S., Pushparaj, V., Nalamasu, O., Ajayan, P. M., &
Linhardt, R. J. (2006). Preparation of biopolymer fibers by electrospinning from room
temperature ionic liquids. Biomacromolecules, 7(2), 415-418.
[36] Casper, C. L., Stephens, J. S., Tassi, N. G., Chase, D. B., & Rabolt, J. F. (2004).
Controlling surface morphology of electrospun polystyrene fibers: effect of humidity and
molecular weight in the electrospinning process. Macromolecules, 37(2), 573-578.
[37] Burger, C., Hsiao, B. S., & Chu, B. (2006). Nanofibrous materials and their
applications. Annu. Rev. Mater. Res., 36, 333-368.
[38] Macossay, J., Marruffo, A., Rincon, R., Eubanks, T., & Kuang, A. (2007). Effect of
needle diameter on nanofiber diameter and thermal properties of electrospun poly (methyl
methacrylate). Polymers for Advanced Technologies, 18(3), 180-183.
[39] Helgeson, M. E., & Wagner, N. J. (2007). A correlation for the diameter of electrospun
polymer nanofibers. AIChE journal, 53(1), 51-55.
[40] Li, L., & Hsieh, Y. L. (2006). Chitosan bicomponent nanofibers and nanoporous
fibers. Carbohydrate research, 341(3), 374-381.
111
[41] Lyons, J., Li, C., & Ko, F. (2004). Melt-electrospinning part I: processing parameters
and geometric properties. Polymer, 45(22), 7597-7603.
[42] Bazilevsky, A.V., A.L. Yarin, and C.M. Megaridis, Co-electrospinning of coreshell
fibers using a single-nozzle technique. Langmuir, 2007. 23(5): p. 2311-2314.
[43] Li, D., McCann, J. T., & Xia, Y. (2005). Use of electrospinning to directly fabricate
hollow nanofibers with functionalized inner and outer surfaces. Small, 1(1), 83-86.
[44] Choi, S.S., et al., Formation of interfiber bonding in electrospun poly(etherimide)
nanofiber web. Journal Of Materials Science, 2004. 39(4): p. 1511-1513.
[45] Weng, S., Lin, Z., Chen, L., & Zhou, J. (2010). Electrochemical synthesis and optical
properties of helical polyaniline nanofibers. Electrochimica Acta, 55(8), 2727-2733.
[46] Shin, M. K., Kim, S. I., Kim, S. J., Kim, S. K., & Lee, H. (2006). Reinforcement of
polymeric nanofibers by ferritin nanoparticles. Applied physics letters, 88(19), 193901.
[47] Ji, Y., Li, B., Ge, S., Sokolov, J. C., & Rafailovich, M. H. (2006). Structure and
nanomechanical characterization of electrospun PS/clay nanocomposite fibers. Langmuir,
22(3), 1321-1328.
[48] Zhan, S., Li, Y., & Yu, H. (2008). LiCoO2 Hollow Nanofibers by Co‐Electrospinning
Sol‐Gel Precursor. Journal of Dispersion Science and Technology, 29(5), 702-705.
[49] Shao, C. L., Guan, H. Y., Wen, S. B., Chen, B., Yang, X. H., & Gong, J. (2004).
Preparation of Mn3O4 nanofibres via an electrospinning technique. Chinese Chemical
Letters, 15(4), 471-474.
[50] Shao, C., Yang, X., Guan, H., Liu, Y., & Gong, J. (2004). Electrospun nanofibers of
NiO/ZnO composite. Inorganic Chemistry Communications, 7(5), 625-627.
[51] Dong, H., Nyame, V., MacDiarmid, A. G., & Jones, W. E. (2004). Polyaniline/poly
(methyl methacrylate) coaxial fibers: The fabrication and effects of the solution properties
on the morphology of electrospun core fibers. Journal of Polymer Science Part B: Polymer
Physics, 42(21), 3934-3942.
[52] Chuangchote, S., Sirivat, A., & Supaphol, P. (2007). Mechanical and electro-
rheological properties of electrospun poly (vinyl alcohol) nanofibre mats filled with carbon
black nanoparticles. Nanotechnology, 18(14), 145705.
[53] Jang, J. (2006). Conducting polymer nanomaterials and their applications. In Emissive
Materials Nanomaterials (pp. 189-260). Springer Berlin Heidelberg.
112
[54] Jin, W. J., Jeon, H. J., Kim, J. H., & Youk, J. H. (2007). A study on the preparation of
poly (vinyl alcohol) nanofibers containing silver nanoparticles. Synthetic Metals, 157(10),
454-459.
[55] Son, W. K., Youk, J. H., & Park, W. H. (2006). Antimicrobial cellulose acetate
nanofibers containing silver nanoparticles. Carbohydrate Polymers, 65(4), 430-434.
[56] Siddheswaran, R., Sankar, R., Ramesh Babu, M., Rathnakumari, M., Jayavel, R.,
Murugakoothan, P., & Sureshkumar, P. (2006). Preparation and characterization of ZnO
nanofibers by electrospinning. Crystal Research and Technology, 41(5), 446-449.
[57] Shao, C., Guan, H., Liu, Y., & Mu, R. (2006). MgO nanofibres via an electrospinning
technique. Journal of materials science, 41(12), 3821-3824
[58] Ignatova, M., Starbova, K., Markova, N., Manolova, N., & Rashkov, I. (2006).
Electrospun nano-fibre mats with antibacterial properties from quaternised chitosan and
poly (vinyl alcohol). Carbohydrate Research, 341(12), 2098-2107.
[59] Chattopadhyay, B. C., & Chakravarty, S. (2009). Application of jute geotextiles as
facilitator in drainage. Geotextiles and Geomembranes, 27(2), 156-161.
[60] Li, D., McCann, J. T., Xia, Y., & Marquez, M. (2006). Electrospinning: a simple and
versatile technique for producing ceramic nanofibers and nanotubes. Journal of the
American Ceramic Society, 89(6), 1861-1869.
[61] Aluigi, A., Varesano, A., Montarsolo, A., Vineis, C., Ferrero, F., Mazzuchetti, G., &
Tonin, C. (2007). Electrospinning of keratin/poly (ethylene oxide) blend nanofibers.
Journal of Applied Polymer Science, 104(2), 863-870.
[62] Ma, M., Gupta, M., Li, Z., Zhai, L., Gleason, K. K., Cohen, R. E., ... & Rutledge, G. C.
(2007). Decorated electrospun fibers exhibiting superhydrophobicity. Advanced Materials,
19(2), 255-259.
[63] Lee, S., & Kay Obendorf, S. (2006). Developing protective textile materials as barriers
to liquid penetration using melt‐electrospinning. Journal of Applied Polymer Science,
102(4), 3430-3437.
[64] Chronakis, I. S. (2005). Novel nanocomposites and nanoceramics based on polymer
nanofibers using electrospinning process—a review. Journal of Materials Processing
Technology, 167(2), 283-293.
[65] Huang, Z. M., Zhang, Y. Z., Kotaki, M., & Ramakrishna, S. (2003). A review on
polymer nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites.
Composites science and technology, 63(15), 2223-2253.
113
[66] Wang, B., & Sain, M. (2007). Dispersion of soybean stock‐based nanofiber in a plastic
matrix. Polymer International, 56(4), 538-546.
[67] Wang, X., Chen, X., Yoon, K., Fang, D., Hsiao, B. S., & Chu, B. (2005). High flux
filtration medium based on nanofibrous substrate with hydrophilic nanocomposite coating.
Environmental science & technology, 39(19), 7684-7691.
[68] Gopal, R., Kaur, S., Ma, Z., Chan, C., Ramakrishna, S., & Matsuura, T. (2006).
Electrospun nanofibrous filtration membrane. Journal of Membrane Science, 281(1), 581-
586.
[69] Hwa Hong, K., & Jin Kang, T. (2006). Hydraulic permeabilities of PET and nylon 6
electrospun fiber webs. Journal of applied polymer science, 100(1), 167-177.
[70] Saeed, K., Haider, S., Oh, T. J., & Park, S. Y. (2008). Preparation of amidoxime-
modified polyacrylonitrile (PAN-oxime) nanofibers and their applications to metal ions
adsorption. Journal of Membrane Science, 322(2), 400-405.
[71] Alcock, B., Cabrera, N. O., Barkoula, N. M., Spoelstra, A. B., Loos, J., & Peijs, T.
(2007). The mechanical properties of woven tape all-polypropylene composites.
Composites Part A: Applied Science and Manufacturing, 38(1), 147-161.
[72] Lee, L. J. (2006). Polymer nanoengineering for biomedical applications. Annals of
biomedical engineering, 34(1), 75-88.
[73] Chew, S. Y., Hufnagel, T. C., Lim, C. T., & Leong, K. W. (2006). Mechanical
properties of single electrospun drug-encapsulated nanofibres. Nanotechnology, 17(15),
3880.
[74] Qi, R. L., Yu, J. Y., & Shi, X. Y. Electrospun Poly (lactide-co-glycolide)/Nanotube
Composite Nanofibers for Drug Encapsulation and Sustained Release.
[75] Huang, Z. M., He, C. L., Yang, A., Zhang, Y., Han, X. J., Yin, J., & Wu, Q. (2006).
Encapsulating drugs in biodegradable ultrafine fibers through co‐axial electrospinning.
Journal of Biomedical Materials Research Part A, 77(1), 169-179.
[76] Boudriot, U., Dersch, R., Greiner, A., & Wendorff, J. H. (2006). Electrospinning
approaches toward scaffold engineering—a brief overview. Artificial organs, 30(10), 785-
792.
[77] Sombatmankhong, K., Suwantong, O., Waleetorncheepsawat, S., & Supaphol, P.
(2006). Electrospun fiber mats of poly (3‐hydroxybutyrate), poly (3‐hydroxybutyrate‐co‐3‐
hydroxyvalerate), and their blends. Journal of Polymer Science Part B: Polymer Physics,
44(19), 2923-2933.
114
[78] Lee, Y. H., Lee, J. H., An, I. G., Kim, C., Lee, D. S., Lee, Y. K., & Nam, J. D. (2005).
Electrospun dual-porosity structure and biodegradation morphology of Montmorillonite
reinforced PLLA nanocomposite scaffolds. Biomaterials, 26(16), 3165-3172.
[79] Chronakis, I. S., Grapenson, S., & Jakob, A. (2006). Conductive polypyrrole
nanofibers via electrospinning: electrical and morphological properties. Polymer, 47(5),
1597-1603.
[80] Onozuka, K., Ding, B., Tsuge, Y., Naka, T., Yamazaki, M., Sugi, S., ... & Shiratori, S.
(2006). Electrospinning processed nanofibrous TiO2 membranes for photovoltaic
applications. Nanotechnology, 17(4), 1026.
[81] Macak, J., Duchoslav, J., & Rubacek, L. (2009, July). Dye-sensitized solar cell based
on titania nanofibers produced by electrospinning. In Meeting Abstracts (No. 9, pp. 774-
774). The Electrochemical Society.
[82] Baker, M. I., Walsh, S. P., Schwartz, Z., & Boyan, B. D. (2012). A review of
polyvinyl alcohol and its uses in cartilage and orthopedic applications. Journal of
Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials, 100(5), 1451-1457.
[83] Jones, J. I. (1973). Polyvinyl alcohol. Properties and applications. Edited by CA Finch.
John Wiley, Chichester. 1973. Pp. xviii+ 622.
[84] Londoño López, M. E. Principio fenomenológico del comportamiento dieléctrico de
un hidrogel de alcohol polivinílico-Phenomenological principle dielectrical behaviour of
poly (vinyl alcohol) hidrogel (Doctoral dissertation, Universidad Nacional de Colombia,
Sede Medellín).
[85] Lozinsky, V. I., & Plieva, F. M. (1998). Poly (vinyl alcohol) cryogels employed as
matrices for cell immobilization. 3. Overview of recent research and developments. Enzyme
and microbial technology, 23(3), 227-242.
[86] Hassan, C. M., & Peppas, N. A. (2000). Structure and applications of poly (vinyl
alcohol) hydrogels produced by conventional crosslinking or by freezing/thawing methods.
In Biopolymers· PVA Hydrogels, Anionic Polymerisation Nanocomposites (pp. 37-65).
Springer Berlin Heidelberg.
[87] Konsta, A. A., Daoukaki, D., Pissis, P., & Vartzeli, K. (1999). Hydration and
conductivity studies of polymer–water interactions in polyacrylamide hydrogels. Solid State
Ionics, 125(1), 235-241.
[88] Ni, N., & Zhao, K. (2007). Dielectric analysis of chitosan gel beads suspensions:
Influence of low crosslinking agent concentration on the dielectric behavior. Journal of
colloid and interface science, 312(2), 256-264.
115
[89] Yui, N., Mrsny, R. J., & Park, K. (Eds.). (2004). Reflexive polymers and hydrogels:
understanding and designing fast responsive polymeric systems. CRC Press.
[90] El-Sherbiny, I. M., Lins, R. J., Abdel-Bary, E. M., & Harding, D. R. K. (2005).
Preparation, characterization, swelling and in vitro drug release behaviour of poly [N-
acryloylglycine-chitosan] interpolymeric pH and thermally-responsive hydrogels.
European Polymer Journal, 41(11), 2584-2591.
[91] Shao, C., Kim, H. Y., Gong, J., Ding, B., Lee, D. R., & Park, S. J. (2003). Fiber mats
of poly (vinyl alcohol)/silica composite via electrospinning. Materials Letters, 57(9), 1579-
1584.
[92] Krumova, M., Lopez, D., Benavente, R., Mijangos, C., & Perena, J. M. (2000). Effect
of crosslinking on the mechanical and thermal properties of poly (vinyl alcohol). Polymer,
41(26), 9265-9272.
[93] Peppas, N. A., & Merrill, E. W. (1976). Differential scanning calorimetry of
crystallized PVA hydrogels. Journal of Applied Polymer Science, 20(6), 1457-1465.
[94] El-Mohdy, H. A., & Ghanem, S. (2009). Biodegradability, antimicrobial activity and
properties of PVA/PVP hydrogels prepared by γ-irradiation. Journal of Polymer Research,
16(1), 1-10.
[95] Matsumura, S., Kurita, H., & Shimokobe, H. (1993). Anaerobic biodegradability of
polyvinyl alcohol. Biotechnology letters, 15(7), 749-754.
[96] Ding, B., Kim, H. Y., Lee, S. C., Shao, C. L., Lee, D. R., Park, S. J., ... & Choi, K. J.
(2002). Preparation and characterization of a nanoscale poly (vinyl alcohol) fiber aggregate
produced by an electrospinning method. Journal of Polymer Science Part B: Polymer
Physics, 40(13), 1261-1268.
[97] Koski, A., Yim, K., & Shivkumar, S. (2004). Effect of molecular weight on fibrous
PVA produced by electrospinning. Materials Letters, 58(3), 493-497.
[98] Yu, N., Shao, C., Liu, Y., Guan, H., & Yang, X. (2005). Nanofibers of LiMn 2 O 4 by
electrospinning. Journal of colloid and interface science, 285(1), 163-166.
[99] Hong, Y., Shang, T., Li, Y., Wang, L., Wang, C., Chen, X., & Jing, X. (2006).
Synthesis using electrospinning and stabilization of single layer macroporous films and
fibrous networks of poly (vinyl alcohol). Journal of membrane science, 276(1), 1-7.
[100] Zhang, C., Yuan, X., Wu, L., Han, Y., & Sheng, J. (2005). Study on morphology of
electrospun poly (vinyl alcohol) mats. European Polymer Journal, 41(3), 423-432.
116
[101] Givens, S. R., Gardner, K. H., Rabolt, J. F., & Chase, D. B. (2007). High-temperature
electrospinning of polyethylene microfibers from solution. Macromolecules, 40(3), 608-
610.
[102] Kneser, U., Schaefer, D. J., Polykandriotis, E., & Horch, R. E. (2006). Tissue
engineering of bone: the reconstructive surgeon's point of view. Journal of cellular and
molecular medicine, 10(1), 7.
[103] Bilezikian, J. P., Raisz, L. G., & Martin, T. J. (Eds.). (2008). Principles of Bone
Biology: Two-Volume Set. Academic Press.
[104] Mistry, A. S., & Mikos, A. G. (2005). Tissue engineering strategies for bone
regeneration. In Regenerative Medicine II (pp. 1-22). Springer Berlin Heidelberg.
[105] Dorozhkin, S. V. (2007). Calcium orthophosphates. Journal of materials science,
42(4), 1061-1095.
[106] Sadat-Shojai, M., Khorasani, M. T., Dinpanah-Khoshdargi, E., & Jamshidi, A.
(2013). Synthesis methods for nanosized hydroxyapatite with diverse structures. Acta
biomaterialia, 9(8), 7591-7621.
[107] Pramanik, S., Agarwal, A. K., Rai, K. N., & Garg, A. (2007). Development of high
strength hydroxyapatite by solid-state-sintering process. Ceramics International, 33(3),
419-426.
[108] Zhang, H. G., & Zhu, Q. (2006). Preparation of fluoride-substituted hydroxyapatite
by a molten salt synthesis route. Journal of Materials Science: Materials in Medicine,
17(8), 691-695.
[109] Teshima, K., Lee, S., Sakurai, M., Kameno, Y., Yubuta, K., Suzuki, T., ... & Oishi, S.
(2009). Well-formed one-dimensional hydroxyapatite crystals grown by an
environmentally friendly flux method. Crystal Growth and Design, 9(6), 2937-2940.
[110] Taş, A. C. (2001). Molten salt synthesis of calcium hydroxyapatite whiskers. Journal
of the American Ceramic Society, 84(2), 295-300.
[111] Silva, C. C., Graça, M. P. F., Valente, M. A., & Sombra, A. S. B. (2007). Crystallite
size study of nanocrystalline hydroxyapatite and ceramic system with titanium oxide
obtained by dry ball milling. Journal of materials science, 42(11), 3851-3855.
[112] Fahami, A., Ebrahimi-Kahrizsangi, R., & Nasiri-Tabrizi, B. (2011).
Mechanochemical synthesis of hydroxyapatite/titanium nanocomposite. Solid State
Sciences, 13(1), 135-141.
117
[113] Mochales, C., Wilson, R. M., Dowker, S. E., & Ginebra, M. P. (2011). Dry
mechanosynthesis of nanocrystalline calcium deficient hydroxyapatite: Structural
characterisation. Journal of Alloys and Compounds, 509(27), 7389-7394.
[114] Nasiri-Tabrizi, B., Honarmandi, P., Ebrahimi-Kahrizsangi, R., & Honarmandi, P.
(2009). Synthesis of nanosize single-crystal hydroxyapatite via mechanochemical method.
Materials Letters, 63(5), 543-546.
[115] Nasiri-Tabrizi, B., Honarmandi, P., Ebrahimi-Kahrizsangi, R., & Honarmandi, P.
(2009). Synthesis of nanosize single-crystal hydroxyapatite via mechanochemical method.
Materials Letters, 63(5), 543-546
[116] Silva, C. C., Pinheiro, A. G., De Oliveira, R. S., Goes, J. C., Aranha, N., De Oliveira,
L. R., & Sombra, A. S. B. (2004). Properties and in vivo investigation of nanocrystalline
hydroxyapatite obtained by mechanical alloying. Materials Science and Engineering: C,
24(4), 549-554.
[117] El Briak-BenAbdeslam, H., Ginebra, M. P., Vert, M., & Boudeville, P. (2008). Wet
or dry mechanochemical synthesis of calcium phosphates? Influence of the water content
on DCPD–CaO reaction kinetics. Acta biomaterialia, 4(2), 378-386.
[118] Fathi, M. H., & Zahrani, E. M. (2009). Mechanical alloying synthesis and bioactivity
evaluation of nanocrystalline fluoridated hydroxyapatite. Journal of Crystal Growth,
311(5), 1392-1403.
[119] Yeong, B., Junmin, X., & Wang, J. (2001). Mechanochemical synthesis of
hydroxyapatite from calcium oxide and brushite. Journal of the American Ceramic Society,
84(2), 465-67.
[120] Vallet-Regi, M., & González-Calbet, J. M. (2004). Calcium phosphates as
substitution of bone tissues. Progress in Solid State Chemistry, 32(1), 1-31.
[121] Kim, D. W., Cho, I. S., Kim, J. Y., Jang, H. L., Han, G. S., Ryu, H. S., ... & Hong, K.
S. (2009). Simple large-scale synthesis of hydroxyapatite nanoparticles: in situ observation
of crystallization process. Langmuir, 26(1), 384-388.
[122] Ikoma, T., Yamazaki, A., Nakamura, S., & Akao, M. (1999). Preparation and
structure refinement of monoclinic hydroxyapatite. Journal of Solid State Chemistry,
144(2), 272-276.
[123] Mistry, A. S., & Mikos, A. G. (2005). Tissue engineering strategies for bone
regeneration. In Regenerative medicine II (pp. 1-22). Springer Berlin Heidelberg.
[124] Bilezikian, J. P., Raisz, L. G., & Martin, T. J. (Eds.). (2008). Principles of Bone
Biology: Two-Volume Set. Academic Press.
118
[125] SERGEY, V. D., & Dorozhkin, S. V. (2007). Calcium orthophosphates. Journal of
materials science, 42, 1061-1095.
[126] Sanzana Salamanca, E. S. (2004). Estudio comparativo de la utilidad de los cementos
y vidrios basados en fosfatos de calcio como sustitutivos óseos en defectos cavitarios
experimentales. Universitat de Barcelona.
[127] Pasteris, J. D., Wopenka, B., & Valsami-Jones, E. (2008). Bone and tooth
mineralization: Why apatite?. Elements, 4(2), 97-104.
[128] López, M. E., Echavarría, A., Suárez, R., & Herrera, N. (2003). Hidroxiapatita
macroporosa obtenida en la Universidad de Antioquia: síntesis, caracterización y
comparación con el hueso esponjoso y calcinado de bovino. Revista Facultad de
Ingeniería, 30, 109-124.
[129] Evia, J. B. (2011). Marcadores del Remodelado Oseo y Osteoporosis. Revista
Mexicana Patologıa Clınica, 58(3), 113-137.
[130] Fernández-Tresguerres Hernández-Gil, I., Alobera Gracia, M. A., Canto Pingarrón,
M. D., & Blanco Jerez, L. (2006). Bases fisiológicas de la regeneración ósea I: Histología y
fisiología del tejido óseo. Medicina Oral, Patología Oral y Cirugía Bucal (Internet), 11(1),
47-51.
[131] Raisz, L. G. (2005). Pathogenesis of osteoporosis: concepts, conflicts, and prospects.
The Journal of clinical investigation, 115(12), 3318-3325.
[134] Jia, Y. T., Gong, J., Gu, X. H., Kim, H. Y., Dong, J., & Shen, X. Y. (2007).
Fabrication and characterization of poly (vinyl alcohol)/chitosan blend nanofibers produced
by electrospinning method. Carbohydrate Polymers, 67(3), 403-409.
[135] Teng, S. H., Lee, E. J., Wang, P., & Kim, H. E. (2008). Collagen/hydroxyapatite
composite nanofibers by electrospinning. Materials Letters, 62(17), 3055-3058.
[136] Sobczak-Kupiec, A., & Wzorek, Z. (2012). The influence of calcination parameters
on free calcium oxide content in natural hydroxyapatite. Ceramics International, 38(1), 641-
647.
[137] Bernotat S., Schöner, K. Size Reduction. In: Ullmann’s Encyclopedia of Industrial
Chemistry. VCH Verlagsgesellschaf, Weinhem, Vol B2, pp. 5.1-5.39 1998.
[138] Bonino, D.S., Krebs, M.D., Squing, C.D. Jeong S. I., Shearer, K.L., Alsberg, E. et al.
Electrospinning alginate-based nanofiber: From blends to crosslinked low molecular weight
alginate-only sistems. Carbohydrate Polymers, 85 (1), 111-119. 2011
119
[139] DeMerlis, C.C., Schoneker D.R., Review of de oral toxicity of polyvinyl alcohol
(PVA). Food a Chemical Toxicology 41, 319- 326. 2003
[140] Chuangchote, S., & Supaphol, P. (2006). Fabrication of aligned poly (vinyl alcohol)
nanofibers by electrospinning. Journal of Nanoscience and Nanotechnology, 6(1), 125-129.
[141] Garcia- Rodriguez, J. Modelo de regeneración de callo óseo de fractura de fémur
humano. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla. 2014.
[142] Kim, H. M. (2003). Ceramic bioactivity and related biomimetic strategy. Current
opinion in solid state and materials science, 7(4), 289-299.
[143] Hench, L. L., Splinter, R. J., Allen, W. C., & Greenlee, T. K. (1971). Bonding
mechanisms at the interface of ceramic prosthetic materials. Journal of Biomedical
Materials Research, 5(6), 117-141.
[144] Cao, W., & Hench, L. L. (1996). Bioactive materials. Ceramics international, 22(6),
493-507.
[145] Kokubo, T., & Takadama, H. (2006). How useful is SBF in predicting in vivo bone
bioactivity?. Biomaterials, 27(15), 2907-2915.
120