Universidade de São Paulo –––––––––––––––– Instituto de Química

DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO DE

SISTEMA ENVOLVENDO INTERFACE DE ANÁLISE POR INJEÇÃO EM FLUXO COM

ELETROFORESE CAPILAR

FABIANO SOUZA PALGROSSI

Dissertação de Mestrado

ORIENTADOR: IVANO GEBHARDT ROLF GUTZ

São Paulo, 26 de novembro de 2002

“... A criação não é uma alegria no sentido vulgar. É uma servidão, uma terrível escravidão voluntária – e a alegria se assemelha muito às das

grandes vitórias, tem um perfume de melancolia.” Albert Camus

“...Nem sempre faço o que é melhor pra mim,

Mas nunca faço o que não ‘tô a fim de fazer.” Humberto Gessinger

(Engenheiros do Hawaii)

À minha amada, Erika, pela dedicação, compreensão, carinho e por ter transformado minha vida em um mundo de amor e alegria, te amo.

Ao meu Pai, Osvaldo (meu herói), pelo amor e apoio em todo meu viver.

À minha Mãe, Cleuza (In Memorian) que nesse momento está radiante de

alegria, por mais esta etapa cumprida.

À minha Tia, Maria Helena, que foi como uma mãe para mim ao ter, ao modo dela, me incentivado nesta jornada.

AGRADECIMENTOS

Agradeço à minha irmã, por todo carinho e incentivo.

Ao meu orientador, Professor Ivano Gebhardt Rolf Gutz, meu pai científico,

pela paciência e amizade.

Aos professores Claudimir Lúcio do Lago e Lúcio Agnes pelo apoio

científico e financeiro (pelas tantas FUVESTs).

Ao meu amigo Flávio Rocha, um exemplo a ser seguido como pesquisador

e pessoa.

Ao amigão Tacio Philip Sansonovisk que sempre me acompahou nas

fotografias, aventuras radicais e acampamentos.

À minha amiga Adriana De Donato (minha irmã científica) por sempre

permanecer ao meu lado nos momentos de dificuldade, mesmo estando fora da

academia.

Ao Amigo, Escoteiro e Sacerdote Monsenhor Danilo de Oliveira Ohl pela

orientação moral, cívica e espiritual.

Ao amigo José Alberto Fracassi pela herança tecnológica (equipamento

CE).

Ao amigo Jairo pela minha iniciação à pesquisa científica.

Aos companheiros de laboratório: Alexandre, Andrea, Carlos, Carol, Dosil,

Escobar(Rodrigo), Giza, Heron, Osmar, Lúcia, Daniela, Eduardo, Márcio, Sérgio,

Vitor, Zé Geraldo, Zé Maria, pelas brincadeiras e discussões infindáveis que só

vieram a acrescentar conhecimento em minha trajetória acadêmica.

Aos técnicos: Ricardo e Fernando e ex-técnico: Rogério pela correria a

procura de reagentes, cotações e compras.

À secretária Marlene por nunca esquecer um de meus recados.

Aos compositores e cantores: Humberto Gessinger, Marisa Monte, Roberto

Frejat, Elis Regina, Zé Ramalho, Cazuza, Thedy Correa, Herbert Vianna, entre

muitos outros que me ajudaram a escrever, alegrando esta difícil jornada com

suas músicas.

À Fapesp e ao CNPq pelo apoio financeiro.

i

ÍNDICE

ABREVIATURAS UTILIZADAS........................................................................................ ii RESUMO............................................................................................................................. iii ABSTRACT......................................................................................................................... iv INTRODUÇÃO....................................................................................................................1 DESENVOLVIMENTO DE COMPONENTES DO SISTEMA......................................7

Dispositivos.......................................................................................................................7 Equipamento de Eletroforese Capilar .......................................................................7 Circuitos Eletrônicos ..................................................................................................10

Sistema de termostatização ..................................................................................10 Fontes de alta tensão .............................................................................................11 Detector ....................................................................................................................13

Pressiostato para transferência hidrodinâmica .....................................................15 Circuito de controle da Bomba de Vácuo ...............................................................17 Válvula multicanal para múltiplos eletrólitos ..........................................................18

Circuito de alimentação para válvula multicanal................................................18 Injetor para FIA ...........................................................................................................19

Circuito de alimentação do injetor FIA.................................................................23 Detector condutométrico sem contato para FIA ....................................................24 Interface FIA-CE.........................................................................................................25 Sistema completo .......................................................................................................26 Interfaceamento com microcomputador .................................................................27 Software do FIA-CE ...................................................................................................27

REAGENTES E CONDIÇÕES EXPERIMENTAIS......................................................30 RESULTADOS E DISCUSSÃO......................................................................................31

Otimização da separação.............................................................................................31 Avaliação da repetibilidade do injetor FIA .................................................................33 Estudo do sincronismo FIA -CE ...................................................................................35 Resultados FIA-CE........................................................................................................37

CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS..............................................................................43 REFERÊNCIAS.................................................................................................................45 ANEXO 1 ............................................................................................................................47

Software ..........................................................................................................................47 Program EletroforeseCapilar_Praia; .......................................................................47 Unit EC;........................................................................................................................52 Unit PCL; .....................................................................................................................55 Unit Graficos; ..............................................................................................................56

ANEXO 2 ............................................................................................................................58 Currículum vitae .............................................................................................................58

ii

ABREVIATURAS UTILIZADAS

φ – Vazão

∆P – Diferença de Pressão

A/D – conversor analógico/digital

AT – Alta Tensão

CE – Capillary Electrophoresis (Eletroforese Capilar)

Conversor i/e – Conversor corrente em tensão

d.c. – Corrente contínua

D/A – conversor digital/analógico

DCE – dupla camada elétrica

DCSC – Detector condutométrico sem contato ou detector oscilométrico

d.e. – Diâmetro Externo

DI – Entrada digital

d.i. – Diâmetro Interno

DPR – Desvio padrão relativo

DO – Saída digital

EOF – electroosmotic flow (Fluxo eletroosmótico)

FIA – Flow Injection Analysis (Análise por Injeção em Fluxo)

His – Histidina

HLact – Ácido Láctico

HPLC – High Performance Liquid Chromatography (Cromatografia Líquida

de Alta Performance)

IC – integrated circuit (Circuito integrado)

MES – Ácido 2-(N-morfolino)etanosulfônico

MTBF – tempo médio antes de falha (de um componente ou equipamento)

s – Estimativa do Desvio Padrão Relativo

SMD – Surface mounted device (componentes de montagem em

superfície)

u.a. – Unidade arbitrária

V dc – Tensão contínua

iii

RESUMO

A combinação sinérgica da análise por injeção em fluxo com eletroforese

capilar, FIA-CE, é um novo campo em rápida expansão, que se estende da

simples justaposição de equipamentos (FIA-CE at-line) ao verdadeiro

interfaceamento ou hifenação (FIA-CE in-line ou on-line). Tipicamente, circuitos

FIA construídos nos laboratórios são interfaceados com equipamentos comerciais

de eletroforese capilar providos com detecção espectrofotométrica UV-Vis, e

operam sob injeção (ou melhor, transferência) eletrocinética de amostra do

circuito FIA para o capilar, vez que esta é mais simples para implementar que a

transferência hidrodinâmica. Um novo sistema FIA-CE que combina a detecção

condutométrica sem contato elétrico, DCSC, com transferência hidrodinâmica ou

eletrocinética de amostra foi projetado e construído no laboratório utilizando-se

material de baixo custo, além de uma fonte de alta tensão, uma bomba peristáltica

e um microcomputador. No circuito FIA, utilizou-se um único solenóide na

construção de injetor multicanal com válvulas de estrangulamento de dimensões

reduzidas. O DCSC foi anteriormente desenvolvido por outros componentes do

grupo. A interface FIA-CE consiste de uma agulha hipodérmica de aço inoxidável

conectada à saída do circuito FIA, atuando como eletrodo aterrado, traspassada

pelo capilar. Quatro diferentes eletrólitos podem ser chaveados por intermédio do

microcomputador para alimentar o circuito FIA. Na CE, três níveis de pressão

podem ser aplicados ao reservatório contendo o eletrodo ao qual se aplica a alta

tensão, correspondente ao extremo do capilar mais próximo do detetor: a) potente

aspiração, durante o procedimento de limpeza rápida; b) pequena pressão sub-

ambiente (ajustada com um pressiostato simples) para a transferência

sincronizada de amostra da interface; e c) pressão ambiente, durante a aquisição

de dados do eletroferograma. O sistema opera sob controle de um flexível

software de código aberto, aceitando procedimentos FIA usuais. As avaliações

mostraram, afora a comodidade de uso do sistema, freqüência analítica maior,

limites de detecção similares e melhor repetibilidade da área e posição dos picos

em comparação a CE operada manualmente.

iv

ABSTRACT

The synergistic combination of flow injection analysis with capillary

electrophoresis, FIA-CE, is a new and rapidly evolving field, comprising

juxtaposition of equipments (at-line FIA-CE) and true interfacing or hyphenation

(in-line or on-line FIA-CE). Typically, FIA circuits assembled in the laboratory are

interfaced to commercial electrophoresis equipments provided with UV-Vis

detection and operated under electrokinetic sample injection (or better, transfer

from the FIA circuit), that is simpler to implement than hydrodynamic transfer. A

new FIA-CE system that combines contactless conductivity detection, CCD, with

hydrodynamic and electrokinetic sample transfer was designed and constructed in

the laboratory from low cost parts, besides a high voltage supply, a peristaltic

pump and a PC. In the FIA circuit, a solenoid actuated multi-channel pinch-valve

injector was downsized from a previous prototype. The oscillometric CCD was

formerly developed by other components of the group. The interface consists of a

hypodermic needle, connected to the FIA circuit and serving as grounded

electrode, trespassed by the capillary. Four different electrolytes can be switched

by the PC and three levels of pressure can be applied to the vial with the HV

electrode and the tip of the capillary near the detector (opposite to the FIA-CE

interface): a) strong aspiration, during fast cleansing procedure; b) slightly sub-

ambient pressure (adjusted with a simple pressurestat) for synchronized sample

transfer at the interface; and c) ambient pressure, during data acquisition of the

electropherogram. The system runs under control of flexible, open-code software,

accepting usual FIA procedures. Evaluations showed, besides convenience of

use, higher analytical frequency, similar detection limits and better repeatability of

peak positions and areas in comparison with manually operated CE.

1

INTRODUÇÃO

Em duas décadas e meia, os métodos de análise em fluxo assumiram

grande importância, como se pode aquilatar pelos mais de 11.000 artigos

relacionados ao assunto, mais de uma dúzia de livros e pela instituição de duas

conferências internacionais especializadas (International Conference on Flow

Analysis e International Conference on Flow Injection Analysis)[1,2]. No Brasil, onde

foram realizados vários trabalhos pioneiros, 1/4 dos trabalhos científicos em

química analítica publicados nos últimos anos, faz uso de análise em fluxo, em

geral, com detecção espectrofométrica[3]. Entretanto, alguns grupos, como, por

exemplo, o do orientador desta dissertação, trabalham preferencialmente em

combinação com técnicas eletroanalíticas[4-8] ou mesmo, espectro-

eletroanalíticas[9]. O crescente interesse na análise em fluxo se deve

principalmente devido: à relativa facilidade de obtenção de uma alta freqüência

analítica, ao pequeno consumo de amostra/reagentes, ao maior isolamento do

sistema de interferências externas e à facilidade de automação, diminuindo assim

a influência do operador e minimizando desvios nos resultados. A eletroforese é uma técnica de separação baseada na migração

diferenciada de compostos iônicos ou ionizáveis sob efeito do campo elétrico, ou

seja, baseia-se em separação não cromatográfica (apesar de haver variantes em

que esta distinção deixa de ser nítida). A paternidade da eletroforese

convencional é atribuída a Tiselius que, no inicio da década de trinta, introduziu o

método de fronteira móvel, empregado na separação de algumas proteínas do

soro sangüíneo. Essas pesquisas renderam-lhe o prêmio Nobel de 1948[10]. Mas

foi somente na década de 80, com a implementação das técnicas capilares, que a

eletroforese passou a encontrar ampla utilização na pesquisa e em análises de

rotina devido, entre outros fatores, à sua elevada capacidade de separação, ao

baixo custo da instrumentação, ao menor tempo de análise e ao menor consumo

de reagentes frente a HPLC[11].

O material tipicamente utilizado na fabricação dos capilares é a sílica

fundida, que lhes confere muitas propriedades interessantes, como dimensões

2

precisas, alta condutividade térmica, boa resistência mecânica, maleabilidade,

resistência ao ataque químico, alta transmitância óptica (190 a 900 nm) e,

principalmente, um conveniente processo de transporte de massa, o fluxo

eletroosmótico, que se estabelece sob campo elétrico em ampla faixa de pH.

A sílica fundida é caracterizada por possuir em sua superfície grupos

silanol, os quais em contato com meio aquoso podem ser desprotonados,

tornando-se negativamente carregados. Os grupos desprotonados são chamados

de grupos silanolatos. O resultado de tal ocorrência é o surgimento da dupla

camada elétrica, DCE, região na qual há uma distribuição espacial não

homogênea de carga[12,13].

O modelo combinado de Gouy-Chapman-Stern-Grahame descreve a região

imediatamente adjacente à superfície interna do capilar, onde predominam os

grupos silanolatos. Cátions hidratados aproximam-se da superfície do capilar a

uma distância correspondente ao raio de hidratação, sendo que o centro destes

íons define o plano externo de Helmholtz, delimitando a camada compacta da

dupla camada elétrica. As camadas mais externas de cátions, menos atraídas

eletrostaticamente e sob efeito do movimento térmico aleatório, apresentam

concentração que decai com a distância, formando a camada difusa, que se

estende até o ponto em que a concentração se confunde com a do âmago da

solução.

Quando um campo elétrico intenso é imposto ao capilar, seu efeito sobre a

DCE coloca em movimento cátions da camada difusa (mas não da camada

compacta) em direção ao eletrodo de carga negativa. Na distância em que uma

fração da camada difusa consegue escapar às forças de atração da superfície

pode-se atribuir a passagem de um plano teórico denominado plano de

cisalhamento. O processo resultante, conhecido como fluxo eletroosmótico,

decorre do fato de os cátions da camada difusa arrastarem consigo não somente

a sua esfera de solvatação mas todo o conteúdo do tubo capilar cilíndrico. Como

decorrência, a velocidade linear do fluxo é similar em toda a seção do capilar,

afora a interface, razão pela qual a dispersão causada é muito menor que quando

o líquido é deslocado hidrodinamicamente por efeito de uma bomba (como no

FIA) ou da gravidade.

3

O fluxo eletroosmótico é utilizado, via de regra, para acelerar a corrida, estando

direcionado no sentido do detector. Eventualmente, pode servir para aumentar a

eficiência de separação das substâncias a serem analisadas, quando no sentido

contrário ao detector (às custas do aumento do tempo de separação).

Para se inverter o fluxo eletroosmótico inverte-se a polaridade dos eletrodos

e/ou modifica-se a carga efetiva da superfície do capilar, tipicamente (mas não

exclusivamente) pela adsorção de uma bicamada de moléculas de tensoativo ou

micelas carregadas positivamente.

Cabe observar que a análise por injeção em fluxo não abrange, por

convenção[14], a cromatografia nem a eletroforese capilar, apesar destas duas

famílias de técnicas se basearem em fluxo de soluções.

No entanto, é evidente que a implementação de sistemas combinando FIA

e técnicas de separação têm enormes potencialidades, pois assim reúnem-se

procedimentos analíticos implementados em fluxo, facilmente automatizáveis e

realizados com alta repetibilidade e rapidez – tais como acumulação (pré-

concentração), diluição, transferência de fases, condicionamento, adição de

reagentes, reações – com um estágio posterior de separação altamente eficiente,

possibilitando incrementar, principalmente, a seletividade frente à análise em fluxo

empregada isoladamente.

Por ser um campo ainda muito novo, há somente cerca de 4 dezenas de

trabalhos na literatura sobre FIA-CE, quase todos surgidos na segunda metade da

década de 90, mas já reunidos em revisões sobre o assunto[15,16,17,18]. Trabalhos

como a diálise in vivo para o monitoramento da ação de fármacos em ratos[19], a

pré-concentração de metais em coluna C18[20] ou de troca iônica[21,22],

monitoramento de dissolução de medicamentos[23], separação de espécies

voláteis com unidade de difusão gasosa[24], extração de polifenóis de chá por

microondas[25], ou amostragem por extração da fase gasosa[26]. Naturalmente,

existem amplas possibilidades de inovação neste campo em expansão.

Pode-se constatar que a introdução de amostras nos instrumentos de

eletroforese capilar, CE, constitui uma etapa crítica e, portanto, limitante

especialmente nas aplicações de rotina, vez que envolve a troca do recipiente

(vial) de eletrólito pelo de amostra e vice-versa. Esta operação requer cuidado

4

especial, pois uma das extremidades do frágil capilar, juntamente com um dos

eletrodos, devem ser imersos na solução, cujo nível também precisa ser ajustado.

Para aplicações de rotina com grandes séries de amostras, existem no mercado

intercambiadores automáticos, de custo expressivo em relação ao restante da

instrumentação e muito dependentes de dispositivos adicionais para realizar

qualquer tratamento prévio das amostras.

Historicamente, o primeiro passo rumo ao interfaceamento entre sistemas

em fluxo e a eletroforese remonta ao trabalho de Tsuda e Zare em 1991[27] no

qual, para evitar a manipulação em torno do capilar da CE durante a introdução

de amostra, os autores introduziram uma técnica designada de “split injector”

(termo emprestado da cromatografia de gás com coluna capilar). Este consiste

em bombear um plugue de amostra até o capilar, onde a maior parte desta é

descartada, enquanto apenas uma porção mínima de alguns nanolitros é

transferida para o capilar. Por envolver uma válvula de injeção e uma bomba

propulsora para movimentar a amostra até a interface, não demorou para que tal

arranjo fosse designado como FIA-CE por Hogan et al., em trabalho que já

compreende diálise em fluxo, precedendo a interface[19]. Apesar do uso da

terminologia FIA-CE ser discutível neste caso, visto que a determinação analítica

dos componentes da amostra passa a dar-se após sua separação eletroforética, o

termo FIA-CE vem se propagando, sendo apenas eventualmente substituído por

FI-CE.

Contudo, em todos os trabalhos subseqüentes, com uma exceção[28], na a

transferência de amostra do circuito em fluxo para o capilar se utilizam da assim

chamada injeção eletrocinética (que, no contexto FIA-CE, pode ser mais

precisamente designada como transferência eletrocinética de amostra).

A maneira pela qual a amostra é introduzida no capilar tem implicação

direta na análise quantitativa. Na transferência eletrocinética, um gradiente de

potencial é estabelecido ao longo do comprimento do capilar por um período de

tempo conhecido. Já na transferência hidrodinâmica utiliza-se uma diferença de

pressão que pode ser estabelecida por diferentes mecanismos: pressurização ou

vácuo em um dos reservatórios de solução nos extremos do capilar, ou por

5

gravidade (desnivelamento dos dois reservatórios), sendo a amostra introduzida

por sifonagem.

A transferência eletrocinética é a alternativa mais prática, pois pode ser

realizada sem interrupção da aplicação da alta-tensão entre os extremos do

capilar, deixando assim, de ser imprescindível o sincronismo perfeito entre a

posição da amostra no sistema FIA e a transferência ao capilar. Entretanto,

dependendo da aplicação, a transferência hidrodinâmica apresenta vantagens

sobre a eletrocinética, por ser menos dependente da composição da matriz e

inteiramente não discriminatória ao analito, conduzindo à obtenção de

eletroferogramas mais reprodutíveis. Preferencialmente, ambas as opções

deveriam ficar disponíveis, para que o químico analítico possa escolher a

modalidade mais apropriada a cada circunstância de análise. Assim, a

implementação da transferência hidrodinâmica mereceu atenção no sistema FIA-

CE desenvolvido, vez que a eletrocinética não depende de recursos adicionais

aos dispositivos usados.

Com relação à etapa de detecção, nos trabalhos disponíveis de FIA-CE,

invariavelmente, foram utilizados métodos ópticos, especialmente a absorção na

região do visível ou UV (direta ou indireta) e, eventualmente, a fluorescência

induzida por laser[19]. Não foram considerados ainda os métodos eletroquímicos,

entre os quais se mostra particularmente atraente a oscilometria, modalidade de

condutometria em que os eletrodos não entram em contato com a solução.

A oscilometria opera com freqüências da ordem de centenas de kHz a

MHz, bastante superiores às freqüências usualmente utilizadas na condutometria

convencional, para a qual a faixa de 60 Hz a 1000 Hz é típica. A oscilometria tem

como principal vantagem o fato dos eletrodos não entrarem em contato com o

eletrólito, ou seja, de poderem ser instalados do lado externo do recipiente de

material dielétrico dentro do qual se encontra a amostra. Assim, esta técnica é

bastante difundida em medições on-line em processos industriais, quando as

matrizes são constituídas de componentes que podem causar a contaminação ou

deterioração dos eletrodos (que não precisam mais ser feitos de Pt). Justifica-se,

também, o nome preferencial de condutometria "sem contato", CSC.

6

A utilização de freqüências relativamente altas na oscilometria minimiza a

reatância capacitiva (das paredes do recipiente que acomoda a amostra), que se

apresenta em série com a solução e permite que variações de condutividade e

permissividade possam ser registradas.

Visto que a detecção condutométrica é simples, econômica e

particularmente favorável para a determinação de íons em geral,

independentemente de serem coloridos ou não, levando em conta que o melhor

detector oscilométrico disponível para CE foi desenvolvido por pesquisadores do

IQ-USP[29,30], escolheu-se este detetor para o sistema FIA-CE de que trata a

dissertação. Naturalmente, outros detetores podem ser utilizados quando

necessário, sem necessidade de modificações significativas no restante do

sistema.

7

DESENVOLVIMENTO DE COMPONENTES DO SISTEMA

Dispositivos

Equipamento de Eletroforese Capilar

O equipamento de CE utilizado neste projeto foi planejado e confeccionado

com base em protótipo desenvolvido por A. Fracassi & C. L. do Lago[29,30]. Este

compreende essencialmente (figuras 1 e 2), sob condições típicas: 1) um capilar

de sílica (50 cm de comprimento, DI de 75 µm, adquirido da J&W Scientific

Incorporated) externamente revestido de poliimida (do mesmo tipo utilizado para

as colunas capilares da cromatografia de gás), no qual ocorre a separação dos

componentes da amostra; 2) uma fonte de alta tensão d.c. ajustável (0 até 30 kV,

resolução 0,1 kV), para a aplicação de uma diferença de potencial entre os

extremos do capilar que, para tanto, são imersos em dois pequenos recipientes

(1,5mL cada) contendo eletrólito (ou amostra) e eletrodos ligados à fonte; 3) um

detector condutométrico de tipo oscilométrico. Este dispositivo será descrito em

detalhes nas próximas páginas.

Figura 1 – Esquema do Equipamento de CE: 1-capilar; 2-fonte de alta tensão; 3-eletrodos; 4-detetor; 5-vials; 6-eletroferograma.

2

13 3

4

5 56

8

A aparelhagem foi distribuída em dois módulos: 1) módulo termostatizado -

o capilar, os reservatórios das soluções, o detector e os transdutores do sistema

de termostatização (aquecedor, constituído de resistência de chuveiro elétrico

sub-alimentada, e sensor de temperatura) foram acomodados dentro de um

recipiente plástico de 17 litros, em forma de paralelepípedo (25 x 35 x 25 cm),

marca Plasútil®. Este recipiente foi usado em posição invertida e a tampa foi

reforçada para servir de base, à qual foram afixados todos os componentes,

facilitando a remoção da "cúpula"; 2) módulo não termostatizado – as fontes de

alimentação dos circuitos e alta tensão, os circuitos de termostatização,

conversão de corrente/tensão e oscilador foram instalados sob a base (figura 3).

Figura 2 – Foto do Equipamento de CE construído: Vista Frontal, com cúpula instalada.

Figura 3 – Vista interna do aparelho CE.

9

Em relação a versões anteriores do equipamento[29], foram realizados

alguns aperfeiçoamentos, tais como: ajuste fino inicial do nível de líquidos dos

reservatórios de solução, com auxílio de uma plataforma (feita de acrílico)

acoplada num mecanismo com parafuso de rosca sem fim (figura 4); e

construção de uma gaiola de Faraday mais compacta envolvendo o detector,

utilizando como material caixa de lamínulas e fita adesiva metalizada (cobre).

Figura 4 – Dispositivo para ajuste fino do nível de líquido.

10

Circuitos Eletrônicos

Uma modificação importante em relação ao protótipo publicado[29] foi a

inversão do extremo do capilar que é mantido aterrado, em relação à alta tensão.

Ao invés da prática usual de aterrar o lado do detector (com o intuito de protegê-lo

de eventuais fugas), aterrou-se o lado da introdução da amostra, para proteger o

circuito FIA a ele interfaceado, vez que o detetor miniaturizado, sem contato com

a solução, abre esta alternativa, desde que rigorosamente isolado do

eletrodo/eletrólito na extremidade do capilar.

Sistema de termostatização

O sistema de termostatização utilizado foi similar ao desenvolvido por

Fracassi e do Lago[29,30], (figura 5).

Figura 5 – Circuito do sistema de controle de temperatura[30]: A parte tracejada

encontra-se dentro da câmara termostática.

Utilizou-se um sensor de temperatura linear, LM35 (10 mV/oC) interligado a

um canal A/D da placa de interfaceamento A-8111, para monitoramento da

temperatura dentro da cúpula do equipamento CE.

LF 356+ 12 V

+

LM 35 OUT

GND

C4 100 nF

C1,C2,C3,C4 100 nF

TIP 122RL

5

Ω0,3

Ω

/ 5 W

R4 + 17 V não reg.

1N 914

5

6

7

63

2

- 12 V

R2

R3

1N 914

1N 914

- 12 V

+ 12 VLF356 pino 7

LF356 pino 4

IC2

IC1

2

31

VT

D1D2 D3

18 k

1 k

1 k

1 k

Ω

Ω

Ω

Ω

C3 100 nF

9

108

IC3

IC4IC5

1/4 TL084

1/4 TL084

1/4 TL084

TL084 pino 4

TL084 pino 11

Tout

Vadj

R1

P1

11

Para o controle da potência aplicada à resistência aquecedora instalada na

cúpula, ao invés de um simples comparador para desligar ou ligar a plena

potência à resistência, ou um circuito de controle proporcional, em que a potência

é diretamente proporcional ao sinal de erro, foi utilizada amplificação logarítmica

do sinal de erro. Assim, ao ligar o equipamento, a temperatura estará bem abaixo

da estabelecida e a potência aplicada se aproximará da máxima, acelerando o

aquecimento do ar no interior da cúpula; quando a temperatura se aproximar do

valor estipulado, a redução na potência será mais drástica que com amplificador

linear, assegurando um ajuste mais fino do ponto escolhido.

Um potencial de referência é ajustado através do potenciômetro P1 e é

somado ao potencial gerado pelo sensor de temperatura LM35. A soma dos dois

sinais é então entregue a um amplificador logarítmico formado pelo IC2, D1 e D2

e, por fim, o sinal na saída do amplificador é aplicado na base de um transistor de

potência TIP 122. A resistência de carga utilizada foi uma bobina de fio de NiCr,

aproveitada de um chuveiro elétrico, apresentando 5Ω quando fria. Com a tensão

aplicada, de 17 V, a dissipação máxima (transistor saturado) fica ao redor de 50

W, suficiente para aquecer o ar contido na câmara. Próximo à temperatura

ajustada, a dissipação é menor e se dá, preponderantemente, no próprio

transistor de potência que, por esta razão, é montado dentro da câmara (ver linha

tracejada na figura 5), tal como o sensor de temperatura, logo acima de uma

ventoinha (12 V dc). A ventoinha assegura a uniformização da temperatura dentro

do compartimento e promove a remoção convectiva do calor dissipado pelo

capilar.

Fontes de alta tensão (FAT)

Diferentemente do protótipo de Fracassi e do Lago[29], que utiliza fonte de

tensão bipolar, procurou-se alternativa de custo inferior, sem prejuízo do

desempenho. Para tanto, compararam-se as características e preços de

diferentes marcas do mercado internacional, optando-se pelas fontes da Ultra-

Volt, em particular, o modelo 30A12 que é muito compacto, tem alto MTBF e

apresenta o limite superior de tensão e a estabilidade requeridas (30 kV, 0,01%),

12

ao preço FOB de US$394,00. Trata-se de fontes unipolares, ou seja, para

passar, por exemplo, da análise de ânions para a de cátions, há necessidade de

alternar entre a fonte positiva, 30A12-P4, e a fonte negativa, 30A12-N4. Todavia,

comparado a outras alterações necessárias ao trocar de método analítico (p. ex.,

troca de eletrólito e, eventualmente, de capilar), trata-se de um inconveniente

pequeno, compensado pela excelente relação custo/benefício.

As fontes utilizadas possuem saídas para monitoramento de corrente e de

tensão, de modo que se adaptou o programa de aquisição e controle para

aproveitar estes sinais. O monitor de corrente fornece 6,23 mV/µA. Como a

corrente máxima fornecida pela fonte de AT é de 114 µA, a tensão do monitor de

corrente varia entre 0 e 0,710 V, intervalo este dentro do limite dos A/Ds

presentes na placa de interface A8111. Já o monitor de tensão fornece 1V para

cada kV aplicado. Como a máxima tensão aplicada é 30 kV a tensão do monitor

de corrente varia entre 0 e 30 V o que supera muito o limite dos ADs da placa

A8111. Para deixar este intervalo dentro do limite dos ADs foi feito um divisor de

tensão conforme a figura 6.

Figura 6 – Divisor de tensão para o monitor de Tensão da Fonte AT.

Para a proteção do usuário contra choques, em caso de abertura da

cúpula, foi desenvolvido um circuito para desligar a aplicação da AT, visto na

figura 7. A presença do pino enable na fonte escolhida facilita deveras esta

proteção. Este pino deve ser colocado em nível lógico alto para habilitar a fonte.

Somente nas fases da operação em que a AT é requerida, o programa de

computador mantém alta a porta lógica que aciona o enable da fonte, sendo que a

conexão se dá pelo circuito com uma chave magnética (reed-switch) em série. O

A/D A8111

Pino9 FAT

12 kΩ

110 kΩ

13

reed foi instalado na base do equipamento de CE, enquanto o imã está preso à

cúpula removível.

Figura 7 – Circuito de inibição da fonte de alta tensão. DigOut corresponde a uma das saídas lógicas da placa A8111.

Detector

O detector utilizado foi desenvolvido por Fracassi e do Lago[29,30]; trata-se

de um detector de condutividade em que os eletrodos não tem necessidade de

entrar em contato com a solução eletrolítica, por ser aplicada freqüência superior

à empregada em condutivímetros convencionais (60 a 1000 Hz), por isto mesmo

designada também de oscilometria. Nos experimentos apresentados, a freqüência

foi fixada próximo 600 kHz. O circuito eletrônico de Fracassi e do Lago é

reproduzido na figura 8.

DigOut A8111

reed-switch

330Ω Pino4 - enable FonteAT

14

BNC1Osc.

EletrodosR2

R1

R3

R4

C1

PT A

12

34

5

67

8

1

2

3

+ 12 V

- 12 V

OPA 2604 AU

BAV 99

1 M

1 k10 k

100 nF

C2

C3

+ Vcc

- Vcc

GND

+ 12 V

- 12 V100 nF

100 nF

1 k

a

Figura 8a – Circuito eletrônico do DCSC SMD [30].

R3

R4

PT A

12

34

5

67

8

+ 12V

- 12 V

OPA 2604 AP

10 k

R5

R6

R7

R8

Pot1

D1

D2

C3

C4

C2

S1

S2

SC

Saída

D/APT1

10 k

10 k

BZX79C4V7 x 2

10 k

100 nF

300 k

P1PCP2+ 12 V

C5

C7

+ Vcc

- Vcc

GND

+ 12 V

- 12 V100 nF

100 nF

C6

C8

2.2 / 35 V Tântalo

2.2 / 35 V Tântalo

100 nF

28 k

b

Figura 8b – Circuito eletrônico do DCSC[30], módulo 2.

O oscilador, por ser comercial, não foi representado. A montagem do

módulo a foi executada com componentes para SMD, de modo que todo o

circuito, incluindo os eletrodos coube numa placa de 3,3 cm2, que foi encapsulada

dentro de um invólucro metálico que serve como gaiola de Faraday.

15

Pressiostato para transferência hidrodinâmica

Um aperfeiçoamento importante foi feito para promover a transferência

(injeção) hidrodinâmica de amostra de forma compatível com a interface FIA. Ao

invés da introdução da amostra no capilar por sifonação (desnivelamento manual

ou automático do recipiente, vial, contendo a amostra, no qual está imerso o

capilar), preferiu-se fazer vácuo no recipiente correspondente à extremidade do

detetor, durante o período de injeção. Para tanto, conectou-se o reservatório,

utilizando-se de uma válvula solenóide controlada pelo microcomputador, a um

pressiostato ajustado para manter pressão inferior à ambiente em 11 cm de

coluna d'água (Pamb-1080 Pascal). O primeiro pressiostato construído

compreendia um contato ajustável de Pt adaptado a uma coluna de Hg em forma

de U, que ligava pequena bomba de vácuo (de diafragma, do tipo usado para

aeração de aquário) sempre que a pressão sub-ambiente de um reservatório

(frasco de vidro de 1L) se elevava. Enquanto a bomba estava desligada, uma

válvula de esfera (aproveitada de bico de injeção do carburador do automóvel

marca Fiat modelo 147) colocada entre a bomba e o reservatório, impedia a

entrada de ar no reservatório. Quando a bomba de vácuo era acionada, a redução

na pressão se dava rapidamente, provocando certa pulsação na pressão aplicada

ao vial e conseqüente perda de precisão nas injeções. Adicionalmente, devido à

alta densidade do Hg no manômetro e à pequena queda de pressão desejada, o

controle era pouco preciso.

Para superar os problemas, ligaram-se dois reservatórios de um litro em

série, através de um tubo capilar, configurando um amortecedor pneumático,

como pode se observar na figura 9. Adicionalmente, o Hg do manômetro em

forma de U, foi substituído por óleo fino e a variação de nível passou a ser feita

por acoplador óptico e circuito de controle, representado na figura 10. Um

manômetro de precisão conectado ao vial, revelou desvio padrão relativo de

0,73% (N=106) na pressão durante uma hora de operação.

16

Figura 9 – Pressiostato: A- Acoplador Óptico; B- Manômetro (Tubo em U contendo óleo fino); C- Bomba de Vácuo (bomba aeradora de aquário modificada); D- Válvula de esfera;

E- Reservatório1 (Frasco de um litro reagente Merck); F- Capilar; G- Reservatório 2 (Frasco de um litro); H- Válvula de três vias controlada por computador; I- o vial de um

extremo do capilar (detector); J- Manômetro de confirmação da pressão aplicada no vial (Tubo em U contendo água).

+12V+12V+12V

+12V

A

B

C

D

E

F

G

H I J

LM

N

110V

Figura10 – Circuito de controle: A- resistência 1 kΩ; B- Acoplador Óptico; C- resistência

10 kΩ; D- Amplificador Operacional (CI TL084); E- Potenciômetro 50 kΩ; F- Potenciômetro 2 kΩ; G- resistência 1 MΩ; H- resistência 5 kΩ;

I e L- diodos 1N4007; J- transistor TIP122; M- relê; N- Bomba de vácuo.

17

Circuito de controle da Bomba de Vácuo

Para etapa de limpeza do capilar e de descarga acelerada do capilar

utilizou-se um compressor elétrico de nebulizador (modelo: INALEX marca:

NEVONI) modificado para atuar como bomba de vácuo.

O circuito de controle e alimentação, representado na figura 11, é

controlado pelo microcomputador que por uma das portas lógicas de saída de um

cartão A - 8111 (fabricada pela ICP - DAS Co.) aciona o transistor (cuja finalidade

é ampliar a capacidade de corrente) que comuta o relê, ligando a bomba de

vácuo.

Figura 11 – Circuito de controle e alimentação para a bomba de vácuo, controlada por computador: A – resistor 1,0 kΩ; B – transistor TIP 122;

C – Diodo 1N2007; D – relê; E – Motor da bomba de vácuo.

18

Válvula multicanal para múltiplos eletrólitos

Utilizou-se de uma “válvula quádrupla” (4 válvulas solenóide com 4

entradas independentes e uma saída comum) para a automação da limpeza do

sistema FIA e do capilar do equipamento CE, devido à necessidade de se utilizar

alternadamente soluções de NaOH e tampão, além de água deionizada. Para

seu controle rápido e preciso desenvolveu-se um circuito de alimentação

controlado pelo microcomputador.

Circuito de alimentação para válvula multicanal

O circuito de alimentação, representado na figura 12, é controlado pelo

microcomputador. Quatro portas lógicas de saída de um cartão A - 8111

(fabricada pela ICP - DAS Co.), acopladas a transistores, permitem acionar

qualquer um dos solenóides, abrindo o canal de admissão da solução

correspondente.

Figura 12: Circuito de alimentação para cada solenóide, controlado por

computador: A – resistor 4,7 kΩ; B – transistor TIP 122; C – Diodo 1N2007; D– Um dos Solenóides da válvula quádrupla.

19

Injetor para FIA

A redução da escala de um injetor multicanal para FIA, anteriormente

desenvolvido pelo autor [31], baseado em um solenóide que aciona um conjunto de

válvulas de estrangulamento, deu origem ao dispositivo reproduzido na figura 13.

Figura 13 – Injetor multicanal.

No intuito de diminuir o volume interno do circuito do injetor, passou-se a

usar nas válvulas de estrangulamento, tubos de silicone muito mais finos e

flexíveis (~0,5 mm de d.i. e ~2,0 mm de d.e.). Com esta alteração, foi possível

reduzir também a capacidade do solenóide, sendo que ao invés do modelo de 4

Kgf[1], conseguiu-se acionar o injetor com solenóide de 0,5 Kgf. A haste que

pressiona os tubos foi obtida a partir de um parafuso de aço-inox do qual, com

auxílio do torno, se removeu a rosca das duas extremidades, conforme a figura

14. A rosca remanescente na parte central possibilita a fixação

perpendicularmente ao eixo do solenóide, enquanto as duas extremidades

permitem estrangular os conjuntos de tubos de silicone.

Figura 14 – Eixo estrangulador.

20

O mecanismo de comutação das válvulas, em número máximo de 16, é

ilustrado na figura 15. Na posição de repouso (mantida por ação de uma mola), o

pino estrangula até 8 tubos finos e flexíveis fixados na base de PVC, só

pressionando os tubos da face oposta quando a bobina do solenóide estiver

energizada, ocasião em que o outro conjunto de válvulas será aberto. A tensão da

mola acoplada ao solenóide pode ser ajustada controlando o número de espiras

tensionadas, de modo a se conseguir o efetivo estrangulamento de todos os tubos

sem pressioná-los excessivamente ou sobrepujar a força do solenóide. Para

acionar a bobina do solenóide, foi construído um circuito alimentador

adequadamente dimensionado e controlado por microcomputador, que será

convenientemente considerado no próximo tópico.

Figura 15 – Corte lateral esquemático do Injetor para FIA: A – Base de PVC; B e C – Tubos capilares de Silicone; D – Eixo estrangulador; e E – Contra-base de acrílico.

A B

D

C

E

A B

D

C

E

A B

D

C

E

21

A figura 16 traz a configuração do sistema FIA, na situação de descarga

da amostra (solenóide desligado), previamente admitida na alça de amostragem

com o solenóide ligado. Das até 16 válvulas suportadas pelo comutador, somente

3 normalmente fechadas e 3 normalmente abertas foram utilizadas, servindo uma

destas para aspirar ar com auxílio de um dos canais da bomba peristáltica quando

não se está carregando a alça com amostra.

Figura 16 – Configuração do sistema FIA, na posição de descarga da amostra (a posição das válvulas é invertida na admissão de amostra): Bomba – Bomba Peristáltica;

Água – Fluido Transportador; Alça – Alça de Amostragem.

Construir as conexões em forma de Y com baixo volume interno, requeridas na

entrada e saída do injetor, não foi tarefa fácil. Para exemplificar, serão citadas

somente duas aproximações. 1) Furou-se um pedaço de tubo de silicone com

ferramenta preparada a partir de uma agulha de injeção e colou-se, centrado no

orifício, outro pedaço de tubo com cola de silicone. Este procedimento se mostrou

trabalhoso e pouco eficiente, pois na maioria das vezes a cola escorria e tampava

o orifício. 2) Construiu-se confluências utilizando capilares de sílica fundida

22

(aproveitado de uma coluna capilar para cromatografia de gás) e ponteiras de

pipeta, de polipropileno. Neste modelo, visualizado na figura 17, corta-se uma

ponteira de pipeta de 100µL de modo que um pedaço do capilar de sílica fundida

(d.i.=0,5 e d.e.=0,7 mm) entre justo pela extremidade mais fina; amassa-se a

extremidade mais larga do tubo cônico, deixando-o oval, possibilitando a

introdução de dois pedaços de capilar de sílica. A vedação entre os componentes

foi conseguida com adesivo epóxi (Araldite 2 min). Esta confluência, de

fabricação relativamente simples e custo pequeno, preenche o requisito de

apresentar volume morto interno reduzido, sendo que certo cuidado é necessário

na montagem e manipulação, devido à fragilidade dos tubos capilares.

Figura 17 – Micro-confluência: A, E e F – Capilares de Sílica Fundida (d.i.=0,5 e

d.e.=0,7 mm); B e D – Cola Araldite; C – Seção de ponteira de pipeta.

23

Circuito de alimentação do injetor FIA

O circuito de alimentação elétrica do solenóide encontra-se representado

na figura 18, tratando-se de adaptação de projeto anterior[31]. A tensão da rede foi

retificada com auxílio de uma ponte de diodos seguida de um capacitor, cujos

bornes alcançavam tensão de aproximadamente 160 V. Em série com a

alimentação da ponte de diodos, colocou-se uma lâmpada incandescente de 60

W. Ao ligar-se o solenóide utilizando-se de um relê controlado pelo

microcomputador, ocorria, inicialmente, um pico de tensão, visto que o capacitor

se encontrava carregado, e a lâmpada, apagada, apresentava resistência interna

baixa, da ordem de 19 Ω. Em frações de segundo, a lâmpada acendia, elevando

sua resistência para mais de 200 Ω, e fazia a tensão de manutenção aplicada ao

solenóide decair para cerca de 20 V d.c. Esta tensão mostrou-se apropriada para

manter os 8 tubos estrangulados.

Para interfacear o relê de acionamento ao microcomputador, recorreu-se a

uma das portas lógicas de saída de um cartão A - 8111 (fabricada pela ICP - DAS

Co.), munida de um transistor para aumentar sua capacidade de corrente.

Figura 18 – Circuito de alimentação do solenóide, controlado por computador: A – resistor 4,7 kΩ; B – transistor TIP 31; C – Diodo 1N2007; D – relê; E – Capacitor

eletrolítico 200 µF 200 V; F – Solenóide do injetor/comutador, bobina de 61 Ω; G – Ponte retificadora para 2 A; H – Lâmpada incandescente 115 V, 60 W, que acende após a

magnetização do solenóide, reduzindo a corrente.

24

Detector condutométrico sem contato para FIA

Para testar o sistema FIA, especialmente o injetor, antes do

interfaceamento com a CE, aproveitou-se o circuito já construído para o detector

do equipamento CE, modificando apenas a dimensão dos eletrodos e o invólucro.

Um par de eletrodos em forma de anel foi obtido cortando-se duas seções de 2

mm de largura de um cilindro de latão de 2 mm de espessura, previamente furado

com broca de 0,7 mm, ou seja, o d.e. do tubo capilar de sílica fundida (o mesmo

já utilizado na fabricação das confluências). Os anéis alinhados foram fixados por

soldagem à uma placa de circuito impresso, a qual foi montada, por sua vez, no

interior do invólucro metálico de um cristal piezoelétrico – convenientemente

removido –, como pode ser visto na figura 19. Um dos terminais externos do

invólucro foi soldado ao cabo blindado que traz o sinal do oscilador e outro, ao

que leva o sinal captado pelo anel detetor ao circuito amplificador/retificador. A

figura 19B mostra o detetor encapsulado na gaiola de Faraday, com o tubo

capilar inserido através dos anéis. Este detector funciona em paralelo com o

detetor para CE (para capilar muito mais fino), mantido inalterado.

Figura 19A – DCSC p/ FIA s/ o encapsulamento: a - Eletrodos anelares

para detecção oscilométrica; b - Capilar de sílica fundida (d.i.=0,5mm); c - Tubo de PP

(d.i.=0,5mm).

Figura 19B – Gaiola de Faraday obtida aproveitando o encapsulamento

retirado de um cristal piezelétrico.

25

Interface FIA-CE

A interface FIA-CE foi construída essencialmente a partir de uma seringa

hipodérmica e agulhas de aço inox. Na figura 20 é possível compreender o

funcionamento da interface FIA-CE.

Figura 20 – Interface FIA-CE: A – Tampa (êmbolo da Seringa hipodérmica); B – Adaptador da tampa (corpo de seringa hipodérmica); C – Respiro (agulha de aço-inox); D – Eletrodo (agulha hipodérmica com conector Luer-Lock); E – Capilar de Sílica Fundida (d.i.=75 µm); F – Tubo de Tygon (d.i.=0,5 mm) proveniente do circuito FIA; G – Dreno (Agulha dobrada em U); H – tubo para aspiração pela bomba peristáltica.

A solução, oriunda do percurso FIA, adentra a agulha de inox (D), que

serve como eletrodo aterrado da eletroforese capilar. O nível de solução dentro da

agulha se mantém constante, devido a um dreno (agulha de aço inox, G). A

solução é aspirada com vazão superior à do circuito FIA de alimentação (φ do

fluido transportador =2,00 mL/min e φ do dreno =12,0 mL/min). O nível é ajustado

de forma a igualar-se com o do reservatório existente na extremidade oposta do

capilar. A coluna capilar da CE (d.i.=75 µm) (E) encontra-se mergulhada na

solução dentro da agulha de aço-inox (D), sendo que a ponta do capilar está

26

posicionada dentro de um tubo de Tygon(F), situado antes da agulha de aço-inox

(D), para, assim, evitar uma possível admissão e interferência de espécies que

tenham sido oxidadas ou reduzidas neste eletrodo. Esta interface é compatível

tanto com o modo eletrocinético como hidrodinâmico de introdução de amostra

(no segundo caso, o controle de pressão é exercido no extremo oposto do

capilar).

Sistema completo

O sistema completo é esquematizado na figura 21, estando sob controle

do microcomputador o acionamento de todas as válvulas e da bomba peristáltica,

assim como a tensão do FAT, o que confere grande flexibilidade na

implementação de métodos mediante reprogramação. Pode-se escolher um entre

quatro líquidos para alimentar o circuito (p. ex., tampão, água, NaOH para limpeza

do capilar).

Figura 21 – Sistema Completo FIA-CE: Eletrólitos 1 – Tampão; 2 – H2O; 3 – NaOH; 4 – HCl; Bomba – Bomba Peristáltica; Alça – Alça de Amostragem; Inter – Interface FIA-CE;

Capilar – Capilar de sílica (l=50 cm, di=75 µm); FAT – Fonte de Alta Tenção; DCSC – Detector condutométrico sem contato elétrico; Pressiostato – conjunto de dispositivos para injeção hidrodinâmica; Bomba de Vácuo – para limpeza do capilar.

Para executar uma análise, em linhas gerais, ocorrem as seguintes etapas:

liga-se a bomba, aspirando tampão; aciona-se o injetor por tempo suficiente para

preenchimento da alça; reverte-se o injetor introduzindo amostra no fluxo, para

27

que possa ser submetida a etapas não representadas como diluição,

derivatização, acumulação (pré-concentração) e coluna de troca iônica,

permeação através de membrana, etc., ou conduzida diretamente à interface FIA-

CE; uma vez estando a interface preenchida com a amostra, o fluxo é suspenso

(com desligamento da bomba); para promover injeção hidrodinâmica, a pressão

no capilar é reduzida por abertura da válvula de interligação com o pressiostato

(p. ex., 20 s); a bomba é ligada para preencher a interface com eletrólito; a FAT é

ligada, promovendo a separação eletroforética; os dados gerados pelo detector

condutométrico são armazenados; o sistema está pronto para novo ciclo, que

pode ser de amostragem ou, periodicamente, de limpeza.

Interfaceamento com microcomputador

O hardware usado no interfaceamento foi um microcomputador AMD K6-2 475

MHz e uma placa de interfaceamento A-8111 da ICP DAS (equivalente à PCL-711

da Advantech Co.). Esta placa possui um conversor A/D de 12 bits com 8

entradas endereçáveis e um conversor D/A, também de 12 bits, além de 16 portas

digitais de entrada e 16 de saída e 2 contadores ou geradores de pulsos. Os

programas de controle da instrumentação e a aquisição de dados foram

elaborados em Turbo Pascal, de modo a aproveitar módulos (units) de

comunicação com a placa, anteriormente elaborados em Pascal por outros

componentes do grupo[29].

Software do FIA-CE

O programa principal que controla o sistema FIA-CE faz uso das seguintes

units (ANEXO 1):

• EC: Sub-rotinas que controlam os equipamentos FIA-CE.

• PCL: “Driver” que controla a placa A-8111 (de interfaceamento A/D e D/A)

desenvolvido anteriormente por colaboradores deste Laboratório[29].

• Gráficos: Sub-rotina que controla a parte gráfica do programa.

28

Dentre as tarefas que são realizadas pelo programa está:

1) A limpeza e o condicionamento do capilar:

Liga a bomba peristáltica durante o tempo necessário para o NaOH chegar até a

interface FIA-CE

Aciona um dos canais da válvula multicanal [NaOH] = 0,1 mol/L

Liga a bomba de vácuo durante 10 minutos; etapa de limpeza do capilar com

NaOH

Liga a bomba de vácuo durante 20 minutos; etapa de limpeza do capilar com

H2O deionizada

Aciona um dos canais da válvula multicanal

(H2O deionizada)

Liga a bomba peristáltica durante o tempo necessário

para a H2O deionizada chegar na interface FIA-CE

Aciona um dos canais da válvula multicanal

(tampão)

Liga a bomba de vácuo durante 20 minutos, etapa de condicionar o capilar

com tampão

Equipamento FIA-CE pronto para análise.

Liga a bomba peristáltica durante o tempo necessário para o tampão chegar até a

interface FIA-CE

29

2) O controle do equipamento FIA-CE e aquisição de dados:

Aciona um dos canais da válvula multicanal

(tampão) e liga a bomba peristáltica

Aciona o solenóide do injetor FIA durante tempo suficiente para

preencher a alça com amostra (p. ex. 60s)

Desliga a bomba peristáltica e válvula multicanal após tempo suficiente para o

plugue de amosta chegar na interface FIA-CE

(p. ex. 22s)

Opção modo de transferência eletrocinético

Liga fonte de alta tensão no potencial

e tempo pré-definidos

(p. ex. 2 kV por 2 s)

Desliga a fonte de alta tensão

Opção modo de transferência hidrodinâmico

Liga válvula de três-vias do pressiostato

durante tempo pré –determinado

(p. ex. 20s)

Aciona um dos canais da válvula multicanal

(tampão) e liga a bomba peristáltica

tempo suficiente para o tampão chegar na interface FIA-CE

(p. ex. 40 s)

Liga fonte de alta tensão no potencial de corrida

pré-definido (p. ex. –22 kV)

Aquisição e armazenamento

de dados de condutividade

Liga a bomba de vácuo durante 1 minuto, etapa de

descarga acelerada do capilar – limpeza do capilar com

tampão

30

REAGENTES E CONDIÇÕES EXPERIMENTAIS

Todos os reagentes utilizados foram de grau analítico ou superior. Todas

as soluções utilizadas foram preparadas pela diluição de soluções estoque de

concentração 100 mmol/L, com exceção das soluções de KCl 0,5 mol/L e 1 mol/L.

As diluições e as soluções estoque foram feitas com água deionizada (18 MΩ) e

filtrada com filtro de 0,22 µm (NANOpure, Barnstead).

Foram utilizados capilares de sílica fundida (J&W Scientific,USA) de d.i.=

75 µm ou 50 µm para CE e d.i.=0,5 mm para FIA. O comprimento do capilar foi

de 60 cm, sendo 50 cm entre o ponto de injeção e o detector. O condicionamento

do capilar foi feito no início dos experimentos pela passagem de (1) hidróxido de

sódio 0,1 mol/L por 10 min, (2) água deionizada por 20 min e (3) tampão de

corrida por 20 min, seguido da aplicação do potencial de separação até a

estabilização da linha base do sinal do detector. Naturalmente, estes períodos

podem ser reprogramados conforme a conveniência.

31

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Otimização da separação

Na figura 22 tem-se um dos primeiros exemplos de eletroferograma obtido

com o equipamento CE construído.

Figura 22 – Eletroferograma de uma amostra sintética: [Cátions]=150 µmol/L; Tampão [MES/HIS]=30 mmol/L; Potencial de Corrida=20 kV; Injeção Eletrocinética - Potencial de

Injeção =2 kV; Tempo de injeção =2 s.

Como se pode observar, o sistema de CE já apresentava operação

satisfatória, mas não havia separação de todos os componentes da amostra, pois

necessitava-se melhorar as condições de corrida e injeção. O pico negativo por

volta de 4 minutos é o plugue de água injetado passando pelo detector

oscilométrico.

1 2 3 4

0,0

0,4

Li +

Na + ,Mg 2+

Ca 2+ K +

C o n d u t i v i d a d e

(u.a.)

Tempo (min) 1 2 3 4

0,0

0,4

Li +

Na + ,Mg 2+

Ca 2+ K +

32

Com a troca do tampão MES/His por HLac/His conseguiu-se a separação

completa de todos os cátions da amostra, como é possível se observar na figura

23.

Figura 23 – Eletroferograma de uma amostra sintética: [K+]=70 µmol/L; [Na+]=50 µmol/L; [Ca2+]=10 µmol/L; [Mg2+]=30 µmol/L; [Li+]=30 µmol/L; Tampão [HLac/His]=20/20 mmol/L; Potencial de Corrida=20 kV; Injeção Eletrocinética - Potencial de Injeção =2 kV; Tempo

de injeção =2 s.

1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0

0,25

0,30

0,35

0,40 C o n d u t i v i d a d e

(u.a.)

Tempo(min)

K+

Na+

Ca2+

Mg2+

Li+

33

Avaliação da repetibilidade do injetor FIA

Na figura 24 é apresentado o registro expandido de um pico obtido com o

injetor construído durante a injeção de solução de KNO3, utilizando-se do DCSC

modificado para FIA. Pode-se observar que o pico apresenta um perfil normal,

não sendo detectada qualquer anomalia como alargamento da base ou outro

sintoma indicativo de oscilação ou vazamento das válvulas.

Figura 24 – Fiagrama de uma injeção de uma amostra sintética: [KNO3]=200 µmol/L; fluido transportador =Água deionizada; φ=2,0 mL/min;

Volume da alça de amostragem =50 µL.

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 -0,1

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5 C o n d u t i v i d a d e

(u.a.)

Tempo (min)

34

A repetibilidade dos picos, mesmo com uma alça de amostragem de volume

reduzido (50 µL) é muito boa (s=0,6 %), como pode ser apreciado na figura 25,

comprovando não só a qualidade do injetor como também do próprio detector,

quando usado diretamente em FIA, tendo como amostra um eletrólito forte na

concentração de 200 µmol/L. Note-se, ainda, que não foi observada qualquer

interferência elétrica do circuito de acionamento do solenóide do injetor/comutador

no sinal do DCSC.

Figura 25 – Fiagrama de 23 injeções de uma amostra simulada: [KNO3]=200 µmol/L. Antes do detetor, imergiu-se a serpentina de 30 cm num banho para uniformização da

temperatura. Fluido transportador=Água deionizada, φ=2,0 mL/min, Volume da alça de amostragem =50 µL,s=0,6%.

0 10 20

0,0

0,4

X = (0,507±0,003) V

s = 0,6%

C o n d u t i v i d a d e

(u.a.)

Tempo(min)

0,2

N = 23

35

Estudo do sincronismo FIA-CE

Para se avaliar o tempo que o plugue de amostra, injetado no sistema FIA,

gasta para percorrer o circuito até a interface FIA-CE, utilizou-se do DCSC

modificado para FIA e intercambiou-se alças de amostragens de volumes

diferentes (200, 300, 400 e 500µL).

Figura 26 – Fiagrama de 7 injeções de uma amostra simulada: [KNO3]=100 µmol/L,

Fluido transportador=Água deionizada, φ=1,0 mL/min, Volume da alça de amostragem =400 µL.

0 2 4 6 8 10 12 14

-0,7

-0,6

-0,5

-0,4

-0,3

-0,2

-0,1

0,0

0,1Tempo de Carga da Alça = 60s

Co

nd

utiv

ida

de

(u

.a.)

Tempo (min)

36

Na figura 27 é possível observar o patamar, região do plugue onde a

concentração de amostra não varia, ideal para transferência de amostra sem

perda de sensibilidade para o equipamento CE. A alça de amostragem de 400 µL

assegura longo patamar de 18 s , permitindo acomodar variações, p. ex., troca de

tubos fatigados da bomba peristáltica. Com alças menores, o sincronismo precisa

ser conferido periodicamente.

7 0 7 5 8 0 8 5 9 0 9 5 1 0 0 1 0 5 1 1 0

- 0 , 6

- 0 , 4

- 0 , 2

0 , 0

0 , 2T e m p o d e c a r g a d a a l ç a = 5 0 s

L a r g u r a d o p a t a m a r = 1 8 s

T e m p o a t é o c e n t r o d o p a t a m a r = 2 2 s

Co

nd

uti

vid

ad

e (

u.a

.)

T e m p o ( s )

Figura 27 – Fiagrama de uma injeção de uma amostra sintética: [KNO3]=100 µmol/L;

Fluido transportador = Água deionizada; φ=1,0 mL/min; Volume da alça de amostragem =400 µL.

Na tabela 1 são apresentados os resultados obtidos com as diferentes

alças de amostragens. Para os testes com a interface FIA-CE a alça escolhida foi

a de 400 µL, por proporcionar estabilização mais longa no patamar (admitindo

erros de até 9 s no sincronismo).

Tabela1 – Resultado do estudo de tempos para sincronismo do sistema FIA-CE.

Volume da alça de amostragem (µL)

Tempo de Patamar (segundos)

Tempo gasto até a metade do patamar

Tempo de Limpeza (segundos)

200 5 13 12

300 12 18 18

400 18 22 21

500 24 26 30

37

Resultados FIA-CE

Na figura 28 apresenta-se registro completo de todas as fases de 2

injeções consecutivas de amostra sintética contendo os cátions K+, Na+, Ca2+,

Mg2+, Li+. A região útil dos eletroferogramas vai de 13 a15 min e 22 a 24 min.

Figura 28 – Resultado de duas injeções sucessivas de uma amostra sintética: [K+]=100 µmol/L; [Na+]=40 µmol/L; [Ca2+]=80 µmol/L; [Mg2+]=60 µmol/L; [Li+]=40 µmol/L; Tampão

[HLac/His]=20 mmol/L; Potencial de Corrida=22 kV; Injeção Hidrodinâmica - ∆P=11 cm de coluna d'água (Pamb-1080 Pascal); Tempo de injeção=20 s; φ FIA=1,00 mL/min;

Volume da alça de amostragem=400 µL.

Na figura 29 é apresentado o resultado das corridas obtidas para

separação dos cátions acima mencionados efetuando-se descarga acelarada do

capilar (flush) mediante a aplicação de vácuo na extremidade final do capilar, de

modo a remover mais rapidamente resíduo da amostra injetada juntamente com o

plugue de água, possibilitando assim um ganho em freqüência analítica.

12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26

-0,6

-0,5

-0,4

-0,3

-0,2

-0,1

0,0

0,1

0,2

0,3 C o n d u t i v i d a d e

(u.a.)

Tempo (min)

38

Figura 29 – Resultado de três injeções sucessivas de uma amostra sintética efetuando-se descarga acelerada do capilar após ao termino da saída dos cátions: [K+]=100 µmol/L;

[Na+]=40 µmol/L; [Ca2+]=80 µmol/L; [Mg2+]=60 µmol/L; [Li+]=40 µmol/L; Tampão [HLac/His]=20 mmol/L; Potencial de Corrida=22 kV; Injeção Hidrodinâmica - ∆P=11 cm de

coluna d'água (Pamb-1080 Pascal); Tempo de injeção=20 s; φ FIA=1,00 mL/min; Volume da alça de amostragem=400 µL.

Para não ocorrer muita variação na força iônica dos diversos padrões

injetados, a soluções que serviram de amostra foram feitas seguindo a tabela 2.

Tabela 2: Concentração dos cátions componentes de cada amostra sintética.

Amostras K+ (µmol/L) Na+ (µmol/L) Mg2+ (µmol/L) Ca2+ (µmol/L) Li+ (µmol/L)

Amostra 1 40 60 80 100 40

Amostra 2 100 40 60 80 40

Amostra 3 80 100 40 60 40

Amostra 4 60 80 100 40 40

4 6 8 10 12 14 16

-0,6

-0,4

-0,2

0,0

Co

nd

utiv

ida

de

(u

.a.)

Tempo (min)

39

Cada amostra foi injetada 5 vezes e o cátion Li+ foi utilizado como padrão

interno. Os resultados das razões entre a altura dos picos dos cátions com o Lítio

são apresentados na tabela 3.

Tabela 3: Razões entre as alturas dos picos dos cátions frente ao Lítio, com desvio

padrão, N=5.

Concentração µmol/L

K+ / Li+ Na+ / Li+ Ca2+ / Li+ Mg2+ / Li+ Li+ / Li+

0 0 0 0 0 1,00 40 (1,90 ± 0,03) (1,35 ± 0,02) (1,51 ± 0,03) (1,42 ± 0,02) 1,00 60 (2,84 ± 0,05) (1,89 ± 0,03) (2,27 ± 0,04) (2,01 ± 0,04) 1,00 80 (3,65 ± 0,07) (2,61 ± 0,05) (2,92 ± 0,05) (2,61 ± 0,05) 1,00 100 (4,48 ± 0,09) (3,21 ± 0,08) (3,50 ± 0,07) (3,26 ± 0,06) 1,00

Com isso podemos avaliar também a linearidade de resposta do sistema

para a faixa de concentração escolhida para os cátions, na figura 30.

y = 0,0449x + 0,0608

R2 = 0,9985

y = 0,0321x + 0,0162

R2 = 0,9990

y = 0,0353x + 0,0630

R2 = 0,9969

y = 0,0323x + 0,0495

R2 = 0,9984

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

0 20 40 60 80 100 120

Concentração (µµmol.L-1)

Raz

ões

de

Altu

ras

de

pic

o fr

ente

ao

Li (

u.a

.)

K

Na

Ca

Mg

Figura 30 – Curvas de Calibração: Tampão [HLac/His]=20 mmol/L; Potencial de Corrida =22 kV; Injeção Hidrodinâmica - ∆P=11 cm de coluna d'água (Pamb-1080 Pascal); Tempo de injeção =20 s; Volume da alça de amostragem =400 µL; φ FIA=1,00 mL/min

Os coeficientes de correlação linear para cada curva de calibração, são

apresentados na tabela 4.

40

Tabela 4: Coeficientes de correlação das curvas de calibração de cada cátion.

R, K+ R, Na+ R, Ca2+ R, Mg2+

0,9992 0,9995 0,9984 0,9992

Para efeito de comparação, avaliou-se também a área dos picos dos

mesmos eletroferogramas. Os resultados das razões entre as áreas dos picos dos

cátions com o Lítio são apresentados na tabela 5.

Tabela 5: Razões entre as áreas dos picos dos cátions frente ao Lítio, com desvio

padrão, N=5.

Concentração (µmol/L)

K+ / Li+ Na+ / Li+ Ca2+ / Li+ Mg2+ / Li+ Li+ / Li+

0 0 0 0 0 1,00 40 (3,15 ± 0,03) (1,61 ± 0,02) (2,31 ± 0,03) (1,73 ± 0,02) 1,00 60 (4,31 ± 0,05) (2,51 ± 0,03) (3,34 ± 0,04) (2,59 ± 0,04) 1,00 80 (5,52 ± 0,07) (3,32 ± 0,05) (4,22 ± 0,05) (3,47 ± 0,05) 1,00 100 (6,98 ± 0,09) (4,27 ± 0,08) (5,70 ± 0,07) (4,51 ± 0,06) 1,00

Com isso podemos avaliar também a linearidade de resposta do sistema

para a faixa de concentração escolhida para os cátions, ilustrada na figura 31.

y = 0,0425x - 0,0403

R2 = 0,9991

y = 0,0447x - 0,0411

R2 = 0,9987

y = 0,0555x + 0,0068

R2 = 0,9957

y = 0,0687x + 0,1473

R2 = 0,9963

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 20 40 60 80 100 120

Concentração (µµmol.L-1)

Raz

ões

de

Áre

as d

os

pic

os

fren

te a

o L

i (u

.a.)

K

Na

Ca

Mg

Figura 31 – Curva de Calibração com base na razão da área Mn+/Li+: Tampão

[HLac/His]=20 mmol/L; Potencial de Corrida=22 kV; Injeção Hidrodinâmica - ∆P=11 cm de coluna d'água; Tempo de injeção = 20 s; Volume da alça de amostragem =400 µL; φ

FIA=1,00 mL/min.

41

Os coeficientes de correlação linear para cada curva de calibração de

áreas, são apresentados na tabela 6.

Tabela 6: Coeficientes de correlação das curvas de calibração de cada cátion,

com base na avaliação pela razão das áreas.

R, K+ R, Na+ R, Ca2+ R, Mg2+

0,9981 0,9995 0,9978 0,9993

Comparação dos resultados obtidos com base nas razões de alturas e de

áreas dos picos mostram que ambos os procedimentos evidenciam alta

repetibilidade das medidas, sendo que o DPR das quintuplicatas ficou,

tipicamente, entre 1,5 e 2% para a avaliação das alturas dos picos e entre 1 e

1,5% para a avaliação das áreas, favorecendo o segundo procedimento. Os

coeficientes de correlação foram igualmente bons por ambos os procedimentos

mas, no caso particular do potássio, a avaliação com base na área resultou em

reta de regressão com intersecção que se afastou um pouco mais de zero.

Com relação à repetibilidade da posição dos picos dos analitos, esta foi

avaliada efetuando 20 injeções automáticas consecutivas, com aquisição dos

eletroferogramas. Os resultados foram plenamente satisfatórios, como pode ser

verificado na tabela 7, observando a estabilidade da diferença do tempo de

migração tm dos cátions mais lentos frente ao mais rápido, o K+.

Tabela 7: Tempos de migração dos cátions, N=20.

K+ Na+ Ca2+ Mg2+ Li+ tm (s) 39,9 63,7 67,7 72,7 82,4 s (s) 0,3 0,4 0,4 0,5 0,6

dpr (%) 0,8 0,6 0,6 0,7 0,7

Verifica-se, pois, que os dois parâmetros mais importantes extraídos dos

eletroferogramas, a posição e a altura ou área (relativa) dos picos, podem ser

obtidos com alta precisão com o sistema FIA-CE proposto. Este resultado

favorável em relação à operação manual se deve, principalmente, à melhor

repetibilidade de todas as etapas (do condicionamento à detecção), vez que são

rigorosamente controladas pelo microcomputador.

42

Por último, cabe mencionar que os aspectos mais essenciais do sistema

foram testados trabalhando somente com injeção hidrodinâmica, por ser esta

mais complexa e difícil de implementar. Não se prevê, contudo, dificuldades ou

impedimentos para operação no modo de transferência eletrocinética mediante

simples modificação do programa, consistindo em suprimir a aplicação de pressão

reduzida pelo pressiostato e, em seu lugar, aplicar tensão apropriada durante

período selecionável pelo operador.

Igualmente, há portas disponíveis na interface para comandar dispositivos

adicionais do sistema FIA, selecionados do amplo repertório registrado na

literatura internacional, sendo particularmente atraentes os que visam separação

e/o pré-concentração de analitos.

43

CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS

O sistema se mostrou robusto, flexível e preciso. Diferentemente dos

equipamentos comerciais de eletroforese capilar e/ou FIA, (que não permitem

alterações de software ou hardware afora eventual escolha de opções dadas pelo

fabricante), o acesso completo aos componentes mecânicos e eletrônicos,

circuitos e programas do sistema construído permite não só a reprogramação de

qualquer etapa como a expansões, reconfiguração e implementação dos

procedimentos FIA que se fizerem necessários para diferentes aplicações.

O sistema apresentou uma excelente relação custo/beneficio em

decorrência da escolha, em sua construção, de materiais econômicos e

acessíveis com desempenho adequado. No caso de aplicações que exijam

freqüente alternância entre a determinação de cátions e de ânions, resulta

justificável a aquisição de fonte de alta tensão bipolar, de custo mais elevado, se

bem que, para elevada demanda, possa ser preferível contar com dois sistemas

FIA-CE independentes.

A freqüência analítica de 12 injeções por hora é bastante elevada, pois

abrange não só a separação eletroforética de cátions de alta mobilidade iônica

como todas as etapas acessórias, inclusive a descarga acelerada do capilar.

Naturalmente, separações envolvendo espécies mais lentas ou por cromatografia

capilar micelar eletrocinética (MEKC) poderão reduzir esta freqüência.

Pode-se observar também, limites de detecção similares e melhor

repetibilidade da área, altura e posição dos picos (DPR< 2,0%) em comparação a

CE praticada em equipamento de operação manual.

A implementação no sistema FIA-CE das duas formas de transferência

(injeção) de amostra mais populares em CE – eletrocinética e hidrodinâmica –, a

segunda com auxílio de um pressiostato, oferece nítida vantagem sobre sistemas

mais simples, que dispõe somente de injeção eletrocinética.

O sistema automático de FIA-CE desenvolvido tem grande potencialidade e

abre novas possibilidades de pesquisa, dada sua boa performance e facilidade de

reconfiguração. Ao lado de procedimentos em fluxo usuais ou novos,

44

conveniências como a adição em fluxo de padrão interno às amostras poderão vir

a ser implementadas com facilidade. Na determinação de componentes diferindo

largamente quanto à concentração, também pode ser explorado o perfil

reprodutível de dispersão em torno do pico de amostra emergente do circuito FIA,

para selecionar a diluição adequada na transferência à CE.

Visando funcionamento com menor supervisão, caberia adicionar um

intercambiador de amostras a serem admitidas pelo circuito FIA, ou uma

tubulação derivada do processo (em escala piloto ou industrial) que se deseja

monitorar. Outro aperfeiçoamento consiste em implementar funções de

diagnóstico de anormalidades, aproveitando-se sinais já disponíveis como

temperatura no gabinete ou corrente que flui pelo capilar (permite, inclusive,

detectar bolhas), comparação de eletroferogramas consecutivos quanto variações

de linha base ou de posição do pico do padrão interno, adição de sensores de

nível para os reservatórios, entre outros.

A adição de um segundo detector condutométrico sobreposto à interface

FIA-CE facilitaria o acerto do sincronismo das operações durante a

implementação de novos métodos. Seu uso rotineiro permitiria também

compensar pequenas variações de vazão por acomodação dos tubos das bombas

peristálticas e alertar quando estas se tornam excessivas.

45

REFERÊNCIAS

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http://www.flowinjection.com/search.html.

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The Analyst, 122 (1997) 843.

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10. Tavares, Marina F.M., Quim. Nova, 19 (1996), 173.

11. Harris, D.C.; Análise Química Quantitativa; 5 ed. LTC Editora, Rio de

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13. Bard, A.J.; Faulkner, L.R.; Electrochemical Methods – Fundamentals and

Applications; John Wiley; New York, 1980.

14. Zagatto, E. A. G.; Oliveira, C. C.; Collins, C. H., Quim. Nova, 22 (1999),

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B., Anal. Chim. Acta, 337 (1997), 117.

16. Fang, Z, Anal. Chim. Acta, 400 (1999), 233.

17. Valcarcel, M.; Arce, L.; Rios, A.; J. Chromatogr. A., 924 (2001), 3.

18. Miranda, C. E. S.; Carrilho, E. et al., Quim. Nova, 25(2002),412.

19. Hogan, B.L.; Lunte, S.M.; Stobaugh, J.F.; Lunte, C.E.; Anal. Chem.,

66(1994), 596.

46

20. Chen, H.W.; Fang, Z.L., Anal. Chim. Acta, 355 (1997), 135.

21. Arce, L.; Ríos, A.; Valcárcel, M.; J. Chomatogr. A, 791 (1997) 279.

22. Kuban, P.; Arce, L.; Ríos, A.; Valcárcel, M.; Karlberg, B., Anal. Chim. Acta,

390 (1999), 39.

23. Chen, H.W.; Fang, Z.L., Anal. Chim. Acta, 376 (1998), 209.

24. Kuban, P.; Karlberg, B., Talanta, 45 (1998), 477.

25. Arce, L.; Ríos, A.; Valcárcel, M.; J. Chomatogr. A, 827 (1998) 113.

26. Lista, A.G.; Arce, L.; Rios, A. et al. Anal. Chim. Acta, 438 (2001) 315.

27. Tsuda, T. and Zare, R.N.; J. Chromatogr. A, 559 (1991), 103.

28. Kuban, P.; Pirmohammadi, R.; Karlberg, B., Anal. Chim. Acta, 378 (1999),

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29. Fracassi, J.A.; Lago, C., Anal. Chem., 70 (1998), 4339.

30. Fracassi, J.A.; Determinação Condutométrica Sem Contato (Oscilométrica)

Para Eletroforese Capilar De Zona e Cromatografia Micelar Eletrocinética,

Tese de doutoramento, IQ-USP, 2000.

31. Palgrossi, F.S.; Pedrotti, J.J.; Gutz, I.G.R., Quim. Nova, 24 (2001), 689.

47

ANEXO 1

Software

Program EletroforeseCapilar_Praia;

- Ultima modificacao em 29/04/2002 - Uses DOS, CRT, EC, Graficos; Var Equip : CE; W1, W2, W3, W4, W5, W6, W7, W8 : Janela; Arq : Text; Nome : String; s,AuxNome : String[10]; Cont : Integer; TempoMin, ATDouble, AtInj,TMaximo, ITelaMax,DetTelaMax, i, v, temp, FundoEscala, VDouble : Double ; v0, t, ta, tb, tc : Word; tempo0, tempoesp : LongInt; Acao, ModoInjecao, Canal, Tecla,Tecla2 : Char; Polaridade, G, GCorrente : Byte; Function GetTempo2 : LongInt; var hora, minuto, segundo, seg100 : Word; Begin GetTime(hora,minuto,segundo,seg100); GetTempo2 := LongInt(hora) * 360000 + 3600 * 100 LongInt(minuto) * 6000 + 60 * 100 LongInt(segundo) * 100 + LongInt(seg100) - tempoesp; End; Procedure ZeraCronometro2; Begin tempoesp := GetTempo2; End; Function GetTempo : LongInt; var hora, minuto, segundo, seg100 : Word; Begin GetTime(hora,minuto,segundo,seg100); GetTempo := LongInt(hora) * 360000 + 3600 * 100 LongInt(minuto) * 6000 + 60 * 100 LongInt(segundo) * 100 + LongInt(seg100) - tempo0; End; Procedure ZeraCronometro; Begin tempo0 := GetTempo; End;

BEGIN G := 3; Ganho do conversor A/D GCorrente := 4; Ganho leitura de corrente TMaximo := 20.0;Tempo Max. de tela em min. ITelaMax := 20.0; Fundo de escala - janela de corente DetTelaMax := 4095.0; Fundo de escala - janela do detector Case G of 0 : FundoEscala := 5.0; 1 : FundoEscala := 2.5; 2 : FundoEscala := 1.25; 3 : FundoEscala := 0.625; 4 : FundoEscala := 0.3125; end; Repeat ClrScr; TextColor(LightRed); WriteLn(' ***** Programa de Aquisicao de Dados Para FIA-CE de Praia ***** '); WriteLn; WriteLn('Escolha a Opcao : '); WriteLn; TextColor(10);Write('I');TextColor(LightRed);WriteLn('niciar Aquisicao'); TextColor(10);Write('P');TextColor(LightRed);WriteLn('arametros'); TextColor(10);Write('L');TextColor(LightRed);WriteLn('impar Capilar'); TextColor(10);Write('S');TextColor(LightRed);WriteLn('air'); NormVideo; Tecla := UpCase(ReadKey); Case Tecla of 'P' : Begin Repeat ClrScr; TextColor(LightRed); WriteLn(' *** Parametros *** '); WriteLn;WriteLn; TextColor(10);Write('G');TextColor(LightRed);WriteLn('anho',' ',G,''); TextColor(10);Write('T');TextColor(LightRed);WriteLn('empo de tela maximo',' ',TMaximo:2:0,''); TextColor(10);Write('C');TextColor(LightRed);WriteLn('orrente maxima (tela)');

48

TextColor(10);Write('R');TextColor(LightRed); WriteLn('esposta maxima do detector'); TextColor(10);Write('V');TextColor(LightRed);WriteLn('oltar'); Tecla2 := UpCase(ReadKey); Case Tecla2 of 'G' : Begin WriteLn('Entre com o valor do ganho (0 a 4)'); ReadLn(G); End; 'T' : Begin WriteLn('Entre com o valor do tempo de tela maximo'); ReadLn(TMaximo); End; 'C' : Begin WriteLn('Entre com o valor da corrente maxima (em microamperes)'); ReadLn(ITelaMax); End; 'R' : Begin WriteLn('Entre com o valor maximo de resposta do detector (4095 maximo)'); ReadLn(DetTelaMax); End; 'V' : ; end; Until Tecla2 = 'V'; NormVideo; End; 'L' : Begin ClrScr; WriteLn('Espere confortavelmente enquanto o progama realiza a limpeza do sistema'); WriteLn; Equip.Iniciar; With Equip do WriteLn('Tempo estimado para o Termino: 35 minutos'); WriteLn('Aguarde'); WriteLn; Equip.BombaLig('C'); WriteLn('Limpando Sistema FIA com NaOH'); TempoMin := 0; tempoesp := 0; ZeraCronometro2; Repeat TempoMin := 1.0*(GetTempo2/(100*60)); Until (TempoMin >= 2); Equip.BombaDes; Equip.VacuoLig; WriteLn('Limpando Capilar com NaOH'); TempoMin := 0; tempoesp := 0;

ZeraCronometro2; Repeat TempoMin := 1.0*(GetTempo2/(100*60)); Until (TempoMin >= 5); Equip.VacuoDes; Equip.BombaLig('B'); WriteLn('Limpando Sistema FIA com H2O'); TempoMin := 0; tempoesp := 0; ZeraCronometro2; Repeat TempoMin := 1.0*(GetTempo2/(100*60)); Until (TempoMin >= 2); Equip.BombaDes; Equip.VacuoLig; WriteLn('Limpando Capilar com H2O'); TempoMin := 0; tempoesp := 0; ZeraCronometro2; Repeat TempoMin := 1.0*(GetTempo2/(100*60)); Until (TempoMin >= 12); Equip.VacuoDes; Equip.BombaLig('A'); WriteLn('Condicionando Sistema FIA com Tampao'); TempoMin := 0; tempoesp := 0; ZeraCronometro2; Repeat TempoMin := 1.0*(GetTempo2/(100*60)); Until (TempoMin >= 2); Equip.BombaDes; Equip.VacuoLig; WriteLn('Condicionando Capilar com Tampao'); TempoMin := 0; tempoesp := 0; ZeraCronometro2; Repeat TempoMin := 1.0*(GetTempo2/(100*60)); Until (TempoMin >= 12); Equip.VacuoDes; Equip.Finalizar; End; 'S' : Begin End; 'I' : Begin tempo0 := 0; ----------Inicia Interface PCL----------- Equip.Iniciar; ClrScr; ---------Entrada de Dados---------------- Write('Nome do arquivo: '); Readln(Nome); AuxNome := Nome; AuxNome := Concat(AuxNome,'.dat');

49

Nome := Concat('c:\BP\dados\',Nome,'.dat'); Assign(arq,Nome); Rewrite(Arq); WriteLn; WriteLn('Alta Tensao aplicada ? (Maximo de 29.0 kV) : '); ReadLn(ATDouble);WriteLn; WriteLn('Polaridade :'); WriteLn('(0) - Negativa'); WriteLn('(1) - Positiva'); ReadLn(Polaridade); WriteLn; WriteLn('Escolha a opcao de injecao :'); WriteLn; WriteLn('G - Gravidade'); WriteLn('E - Eletrocinetica'); WriteLn('N - Sem injecao'); Repeat ModoInjecao := Upcase(ReadKey); Case ModoInjecao of 'G' : Begin WriteLn; Write('Tempo de Injecao ? (em segundos) : '); ReadLn(t); end; 'E' : Begin WriteLn; Write('Tempo de Injecao ? (em segundos) : '); ReadLn(t); Write('Alta tensao de injecao ? (em kV) : '); ReadLn(AtInj); end; 'N' : WriteLn; end; Until (ModoInjecao = 'G') or (ModoInjecao = 'E') or (ModoInjecao = 'N'); WriteLn; Write('Tempo de Preenchimento da alca de amostragem? (em segundos): '); ReadLn(ta); Write('Tempo para amostra chegar a interface FIA-CE ? (em segundos) : '); ReadLn(tb); Write('Tempo para limpeza do percurso FIA ? (em segundos): '); ReadLn(tc); WriteLn; WriteLn('Tecle <ENTER> para iniciar aquisicao'); ReadLn; tempo0 := 0; TempoMin := 0; tempoesp := 0;

Equip.BombaDes; ------------Inicia Modo Grafico------------------ ModoGrafico; Cor(10); W1.Init(1, 1, 479, 256, 0.0, 0.0, TMaximo, 4095.0, 4); W1.TextoXY(410,5,'Detector'); W2.Init(1, 276, 479, 478, 0, 0.0, TMaximo, 50.0, 4); W2.TextoXY(410,5,'Corrente'); With W3 do Begin Init(501, 1, 638, 478, 0.0, 0.0, 10.0, 10.0, 4); TextoXY(50, 5, 'Parametros'); TextoXY(5, 50, 'i :'); TextoXY(100, 50, 'uA'); TextoXY(5, 100, 'v:'); TextoXY(100, 100, 'kV'); TextoXY(5, 150, 'T:'); TextoXY(100, 150, 'oC'); TextoXY(5, 200, 't:'); TextoXY(100, 200, 'min'); TextoXY(5, 250, 'Det:'); TextoXY(5, 450, AuxNome); Case ModoInjecao of 'N' : TextoXY(5,300,'Sem Injecao'); 'E' : Begin TextoXY(5,300,'Eletro'); Str(t:2,s); TextoXY(5,315,s);TextoXY(50,315,'s'); Str(ATInj:2:1,s); TextoXY(5,330,s);TextoXY(50,330,'kV'); End; 'G' : Begin TextoXY(5,300,'Gravidade'); Str(t:2,s); TextoXY(5,315,s);TextoXY(50,315,'s'); TextoXY(5,330,'Pressao'); End; End; End; Equip.SetAT(ATDouble,Polaridade); Equip.EnableAT; ZeraCronometro; ZeraCronometro2; Acao := 'N'; Canal := 'A'; --------- Inicia Aquisicao de dados -------------- With Equip do Repeat LeDetector(v0,G);

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TempoMin :=1.0*(GetTemp o/(100*60)); TempoSeg := 1.0*(GetTempo2/100); LeCorrente(GCorrente,i,Polaridade); LeTemp(temp); LeAT(v); If KeyPressed Then Begin Acao := UpCase(ReadKey); tempoesp := 0; TempoSeg := 0; ZeraCronometro2; end; If Acao = 'A' Then Begin Canal := 'A'; Equip.AmosLig(Canal); TempoSeg := 0; tempoesp := 0; ZeraCronometro2; Acao := 'B'; end; If (Acao = 'B') and (TempoSeg >= ta) Then Begin Equip.DisableAT; Canal := 'A'; Equip.AmosDes(Canal); TempoSeg := 0; tempoesp := 0; ZeraCronometro2; Acao := 'C'; end; If (Acao = 'C') and (TempoSeg >= tb) Then Begin Equip.BombaDes; TempoSeg := 0; tempoesp := 0; ZeraCronometro2; Acao := 'D'; end; If (Acao = 'D') and (TempoSeg >= 2) Then Case ModoInjecao of 'G' : Begin TempoSeg := 0; tempoesp := 0; ZeraCronometro2; Equip.InGravLig; Acao := 'E'; end; 'E' : Begin TempoSeg := 0; tempoesp := 0; ZeraCronometro2; Equip.InEletroLig(AtInj,Polaridade); Acao := 'E'; end;

'N' : Begin TempoSeg := 0; tempoesp := 0; ZeraCronometro2;; Acao := 'E'; end; end; If (Acao = 'E') and (TempoSeg >= t) Then Case ModoInjecao of 'G' : Begin Equip.InGravDes; TempoSeg := 0; tempoesp := 0; ZeraCronometro2; Acao := 'F'; end; 'E' : Begin Equip.InEletroDes; TempoSeg := 0; tempoesp := 0; ZeraCronometro2; Acao := 'F'; end; 'N' : Begin TempoSeg := 0; tempoesp := 0; ZeraCronometro2; Acao := 'F'; end; end; If (Acao = 'F') Then Begin Canal := 'A'; Equip.BombaLig(Canal); Acao := 'G'; end; If (Acao = 'G') and (TempoSeg >= tc) Then Begin Equip.BombaDes; Equip.SetAT(ATDouble,Polaridade); Equip.EnableAT; TempoSeg := 0; tempoesp := 0; Acao := 'N'; end;

VDouble := (2*v0*FundoEscala/4095)-FundoEscala; WriteLn(arq,TempoMin:6:4,' ',VDouble); With W1 do Begin Init(1, 1, 479, 256, 0.0, 0.0, TMaximo, DetTelaMax, 4); Ponto(TempoMin,v0,15); Done; End; With W2 do

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Begin Init(1, 276, 479, 478, 0.0, 0.0, Tmaximo, ITelaMax, 4); If i < ITelaMax Then Ponto(TempoMin,i,15) Else Ponto(Tempomin,ItelaMax,15); Done; End; With W4 do Begin Init(536, 45, 590, 60, 0.0, 0.0, 1.0, 1.0, 4); LimpaJanela; Str(i:4:3,s); TextoXY(5,5,s); End; Cor(11); With W5 do Begin Init(536, 95, 590, 110, 0.0, 0.0, 1.0, 1.0, 4); LimpaJanela; Str(v:3:0,s); TextoXY(5,5,s); End; With W6 do Begin Init(536, 145, 590, 160, 0.0, 0.0, 1.0, 1.0, 4); LimpaJanela; Str(temp:4:1,s); TextoXY(5,5,s); End; With W7 do Begin Init(536, 195, 590, 210, 0.0, 0.0, 1.0, 1.0, 4); LimpaJanela; Str(TempoMin:4:2,s); TextoXY(5,5,s); End; With W8 do Begin Init(550, 245, 604, 260, 0.0, 0.0, 1.0, 1.0, 4); LimpaJanela; Str(V0,s); TextoXY(10,5,s); End; Until (TempoMin >= TMaximo) or (Acao = 'W'); Close(arq); FinalizaModoGrafico; Equip.Finalizar; end; 'S' : ; end; Until Tecla = 'S'; END.

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Unit EC;

Interface Uses Dos, Crt, Printer, PCL; Type CE = Object Cartao : PCL711; Indice : Byte; Constructor Iniciar; Destructor Finalizar; Procedure VacuoLig; Procedure VacuoDes; Procedure AmosLig(Canal : Char); Procedure AmosDes(Canal : Char); Procedure BombaLig(Canal : Char); Procedure BombaDes; Procedure InGravLig; Procedure InGravDes; Procedure InEletroLig(AT : Double; Pol : Byte); AT UltraVolt Procedure InEletroDes; AT UltraVolt Procedure LeTemp(var t : Double); Procedure LeDetector(var Det : Word; Ganho : Byte); Procedure SetAT(Tensao : Double; Polaridade : Byte); AT UltraVolt Procedure LeAT(var AT : Double); AT UltraVolt Procedure LeCorrente(Ganho : byte; var i : Double; Polaridade : byte); AT UltraVolt Function LeCanal7(Ganho : Byte) : Word; Procedure EnableAT; Procedure DisableAT; Private end; Procedure Espera(TEspera : Real); TEspera em segundos type Vetor = array[1..8] of Integer; const DOutPut: Vetor = ((1),(5),(4),(6),(2),(10),(8),(9)); implementation Constructor CE.Iniciar; Begin Cartao.Init(0); Indice := 1; Cartao.DigOut(0,'L'); Cartao.DigOut(0,'M'); End; Destructor CE.Finalizar; Begin Cartao.Done; End;

Procedure CE.VacuoLig; --------------------------------------------------------- - Liga a Bomba De Vacuo - - (10000000) - --------------------------------------------------------- Begin Cartao.DigOut(128,'M'); End; Procedure CE.VacuoDes; --------------------------------------------------------- - Desliga a Bomba De Vacuo - - (00000000) - --------------------------------------------------------- Begin Cartao.DigOut(0,'M'); End; Procedure CE.AmosLig(Canal : Char); --------------------------------------------------------- - Liga o Injetor para Preenchimento - - da alca de amostragem - - e liga Bomba e abre o canal 1(A) - - ou 2(B) ou 3(C) ou 4(D) - - (00001110) ou (00010110) - - ou (00100110) ou (01000110) - --------------------------------------------------------- Begin Case Canal of 'A' : Begin Cartao.DigOut(14,'M'); end; 'B' : Begin Cartao.DigOut(22,'M'); end; 'C' : Begin Cartao.DigOut(38,'M'); end; 'D' : Begin Cartao.DigOut(70,'M'); end; End; End; Procedure CE.AmosDes(Canal : Char); -------------------------------------------------------- - Desliga o Injetor para Injecao - - da amostra no percurso FIA - - e Liga Bomba - - e abre o canal 1(A) ou 2(B) - - ou 3(C) ou 4(D) - - (00001010) ou (00010010) - - ou (00100010) ou (01000010) - ------------------------------------------------------- Begin Case Canal of 'A' : Begin

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Cartao.DigOut(10,'M'); end; 'B' : Begin Cartao.DigOut(18,'M'); end; 'C' : Begin Cartao.DigOut(34,'M'); end; 'D' : Begin Cartao.DigOut(66,'M'); end; End; End; Procedure CE.BombaLig(Canal : Char); -------------------------------------------------------- - Liga a Bomba Peristaltica e - - e abre o canal 1(A) ou 2(B) - - ou 3(C) ou 4(D) - - (00001010) ou (00010010) - - ou (00100010) ou (01000010) - --------------------------------------------------------- Begin Case Canal of 'A' : Begin Cartao.DigOut(10,'M'); end; 'B' : Begin Cartao.DigOut(18,'M'); end; 'C' : Begin Cartao.DigOut(34,'M'); end; 'D' : Begin Cartao.DigOut(66,'M'); end; End; End; Procedure CE.BombaDes; --------------------------------------------------------- - Desliga a Bomba Peristaltica - - Deixando todos canais fechados (00000000) - --------------------------------------------------------- Begin Cartao.DigOut(0,'M'); End; Procedure CE.InGravLig; ------------------------------------------------------ - Desliga a Bomba Peristaltica e - - Liga a valvula de Injecao Gravitacional - - (00000001) - ------------------------------------------------------- Begin Cartao.DigOut(1,'M'); End; Procedure CE.InGravDes;

------------------------------------------------------- - Desliga a valvula de Injecao Gravitacional - - (00000000) - -------------------------------------------------------- Begin Cartao.DigOut(0,'M'); End; Procedure CE.InEletroLig(AT : Double; Pol : Byte); --------------------------------------------------------- - Procedure InEletro reescrito - - para operar com a fonte de AT UltraVolt. - - AT : Potencial aplicado; - - Pol : Polaridade da fonte : 0-Neg, 1-Pos; - - - --------------------------------------------------------- Begin SetAT(AT,Pol); EnableAT; End; Procedure CE.InEletroDes; --------------------------------------------------------- - Procedure InEletroDes reescrito - - para desligar a fonte de AT UltraVolt. - --------------------------------------------------------- Begin DisableAT; End; Procedure CE.LeTemp(var t : Double); t em oC Begin Cartao.SetCanal(3); Cartao.SetGanho(3); t := 0.0305*Cartao.ADAvg(5000) - 62.5; Com curva de calibracao em 31/01/01 T = 0.0305*W - 62.5 Ajuste antigo t := 25.0*(ADAvg(50)-2047)/1024.5; End; Procedure CE.LeDetector(var Det : Word; ganho : Byte); Begin Cartao.SetCanal(6); Cartao.SetGanho(Ganho); Delay(1); Det := Cartao.ADAVg(5000); End; Procedure CE.SetAT(Tensao : Double; Polaridade : Byte); --------------------------------------------------------- - Procedure SetAT reescrito - - para operar com a fonte AT UltraVolt. - - AT : Potencial aplicado; - - Polaridade da fonte (fixa) : 0- Neg, 1- Pos; - - -

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--------------------------------------------------------- Begin With Cartao do Begin If Tensao > 29.0 Then Tensao := 29.0; If Polaridade = 1 Then DA(Round(136.5*Tensao)) Else DA(Round(136.5*(30 - Tensao))); end End; Procedure CE.LeAT(var AT : Double); --------------------------------------------------------- - Procedure LeAT reescrito - - para operar com a fonte UltraVolt - --------------------------------------------------------- Begin Cartao.SetCanal(2); Cartao.SetGanho(4); AT := 0.01960*(Cartao.ADAvg(100)) - 39.6; AT em kV Com curva de Calibracao em 12/07/2001 AT := 128.4*V - 0.5 End; Procedure CE.LeCorrente(Ganho : byte; var i : Double; Polaridade : byte); --------------------------------------------------------- - Procedure LeCorrente reescrito - - para operar com a fonte UltraVolt. - --------------------------------------------------------- Begin Cartao.SetCanal(5); Cartao.SetGanho(Ganho); Case Ganho of 0 : i := 0.17462*(Cartao.ADAvg(100)-2047.5); 1 : i := 0.08731*(Cartao.ADAvg(100)-2047.5); 2 : i := 0.04366*(Cartao.ADAvg(100)-2047.5); 3 : i := 0.02183*(Cartao.ADAvg(100)-2047.5); 4 : i := 0.01091*(Cartao.ADAvg(100)-2047.5); end; If Polaridade = 1 Then i := i Else i := -i; End; Function CE.LeCanal7(Ganho : Byte) : Word; Begin Cartao.SetCanal(7); Cartao.SetGanho(Ganho); LeCanal7 := Cartao.ADAVg(200); End; Procedure CE.EnableAT; Begin Cartao.DigOut(1,'L'); End; Procedure CE.DisableAT;

Begin Cartao.DigOut(0,'L'); End; Procedure Espera(TEspera : Real); TEspera em segundos var t1, t2 : LongInt; Hours, Minutes, Seconds, HundredSeconds : Word; Dt : Real; Begin TEspera := TEspera * 100; GetTime(Hours, Minutes, Seconds, HundredSeconds); t1 := LongInt(Hours) * 360000 + 3600 * 100 LongInt(Minutes) * 6000 + 60 * 100 LongInt(Seconds) * 100 + LongInt(HundredSeconds); Repeat GetTime(Hours, Minutes, Seconds, HundredSeconds); t2 := LongInt(Hours) * 360000 + 3600 * 100 LongInt(Minutes) * 6000 + 60 * 100 LongInt(Seconds) * 100 + LongInt(HundredSeconds); Dt := 1.0 * (t2 - t1); Until Dt >= TEspera; End; var regs : Registers; Begin regs.dx := 0; regs.ah := 1; intr (23, regs); End.

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Unit PCL;

---------------------------------------------------------- Esta Unit possui os procedimentos para controle da Placa A–8111 Placa multifuncional 12-bit Entrada e Saída Digitais Conversor Analógico/Digital Conversor Digital /Analógico ---------------------------------------------------------- interface Type PCL711 = Object base : Word; canal, ganho : Byte; constructor Init(endereco : Word); destructor Done; procedure DA(valor : Word); procedure SetGanho(g : Byte); procedure SetCanal(c : Byte); Function GetGanho : Byte; Function GetCanal : Byte; Function AD : Word; Function ADAvg(n : Word) : Word; Procedure DigOut(valor : Byte; xSB : Char); Private end; implementation Constructor PCL711.Init(endereco : Word); Begin If endereco <> 0 then base := endereco else base := $220; SetGanho(0); SetCanal(0); End; Destructor PCL711.Done; Begin DA(0); DigOut(0,'L'); DigOut(0,'M'); End; Procedure PCL711.DA(valor : Word); Begin PortW[base + 4] := valor; End; Procedure PCL711.SetGanho(g : Byte); Begin

ganho := g; Port[base + 9] := ganho; End; Function PCL711.GetGanho : Byte; Begin GetGanho := ganho; End; Procedure PCL711.SetCanal(c : Byte); Begin canal := c; Port[base + 10] := canal; End; Function PCL711.GetCanal : Byte; Begin GetCanal := canal; End; Function PCL711.AD : Word; var lixo : Word; Begin Port[base + 12] := 0; lixo := lixo + 0; While ((Port[base + 5] and $10) = $10) do; AD := PortW[base + 4] and $0FFF; End; Function PCL711.ADAvg(n : Word) : Word; var i : Word; soma : LongInt; Begin soma := 0; For i := 1 to n do soma := soma + AD; ADAvg := soma div n; End; Procedure PCL711.DigOut(Valor : Byte; xSB : Char); --------------------------------------------------------- - Coloca um valor na saida digital. - - xSB se refere aos bytes LSB e MSB. - - se xSB = L, o LSB sera atualizado, - - se xSB=M o MSB sera atualizado. - --------------------------------------------------------- Begin If (xSB = 'L')or(xSB = 'l') then Port[Base + 13] := Valor; LSB If (xSB = 'M')or(xSB = 'm') then Port[Base + 14] := Valor; MSB End; End.

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Unit Graficos;

---------------------------------------------------------- Esta Unit possui os procedimentos graficos. ---------------------------------------------------------- Interface Uses Graph; Type Janela = Object X1, X2, Y1, Y2 : Word; FatorX, FatorY, RX1, RX2, RY1, RY2 : Double; Constructor Init(TelaX1, TelaY1, TelaX2, TelaY2 : Word; RealX1, RealY1, RealX2, RealY2 : Double; cor : Byte); Destructor Done; Procedure SetRangeX(RealX1, RealX2 : Double); Procedure SetRangeY(RealY1, RealY2 : Double); Procedure Ponto(RealX, RealY : Double; Cor : Byte); Procedure Linha(RealX1, RealY1, RealX2, RealY2 : Double; Cor : Byte); Procedure LinhaPara(RealX, RealY : Double; Cor : Byte); Procedure MovePara(RealX, RealY : Double); Procedure SetCor(Cor : Byte); Procedure TextoXY(TelaX, TelaY : Word; s : String); Procedure TextoRealXY(RealX,RealY : Double ; s : String); Procedure LimpaJanela; Private End; Procedure ModoGrafico; Procedure FinalizaModoGrafico; Procedure Cor(Cor : Word); Implementation Procedure ModoGrafico; Var GD,GM : Integer; Begin GD := Detect; InitGraph(GD,GM,'c:\tp\'); if GraphResult <> grOk then Halt(1); End; Procedure FinalizaModoGrafico; Begin CloseGraph; End;

Procedure Cor(Cor : Word); Begin SetColor(Cor); End; Constructor Janela.Init(TelaX1, TelaY1, TelaX2, TelaY2 : Word; RealX1, RealY1, RealX2, RealY2 : Double; cor : Byte); ------------------------------------------------------ - Constructor Init - - - - Define um ViewPort com as coordenadas - - de tela de entrada, ajusta as - - coordenadas a um range X e Y definido - - por parametros de entrada e - - desenha uma moldura em torno da janela - - com cor definida pelo parametro - - de entrada. Clip : ClipOn. - - - - Parametros - TelaX1, TelaX2 : X inicial - - e final, coordenadas de tela - - TelaY1, TelaY2 : Y inicial e final, '' '' '' - - RealX1, RealX2 : Range X - - RealY1, RealY2 : Range Y - - Cor : Cor da moldura da janela - -------------------------------------------------------- Var CorAntiga : Byte; Begin CorAntiga := GetColor; X1 := TelaX1; X2 := TelaX2; Y1 := TelaY1; Y2 := TelaY2; RX1 := RealX1; RX2 := RealX2; RY1 := RealY1; RY2 := RealY2; FatorX := (X2-X1)/(RX2-RX1); FatorY := (0-(Y2-Y1)/(RY2-RY1)); SetViewPort(0,0,GetMaxX,GetMaxY,ClipOn); SetColor(Cor); Rectangle(Pred(TelaX1), Pred(TelaY1), Succ(TelaX2), Succ(TelaY2)); SetViewPort(TelaX1, TelaY1, TelaX2, TelaY2, ClipOn); SetColor(CorAntiga); End; Destructor Janela.Done; ---------------------------------------------------- - Destructor Done - - - - Direciona o ViewPort para a tela total. - - Clip : ClipOn. - ----------------------------------------------------- Begin SetViewPort(0, 0, GetMaxX, GetMaxY, ClipOn); End;

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Procedure Janela.SetRangeX(RealX1, RealX2 : Double); ---------------------------------------------------- - Procedure SetRangeX - - - - Ajusta o Range X para as coordenadas - - de tela da janela. - - - - Parametros - RealX1 e RealX2 : Double - ----------------------------------------------------- Begin RX1 := RealX1; RX2 := RealX2; FatorX := (X2-X1)/(RX2-RX1); end; Procedure Janela.SetRangeY(RealY1, RealY2 : Double); -------------------------------------------- ------------ - Procedure SetRangeY - - - - Ajusta o Range Y para as coordenadas - - de tela da janela. - - - - Parametros - RealY1 e RealY2 : Double - ---------------------------------------------------------- Begin RY1 := RealY1; RY2 := RealY2; FatorY := (0-(Y2-Y1)/(RY2-RY1)); End; Procedure Janela.Ponto(RealX, RealY : Double; Cor : Byte); Var Px, Py : Word; Begin SetViewPort(X1 , Y1, X2, Y2, ClipOn); Px := Round(FatorX*(RealX-RX1) + 0); Py := Round(FatorY*(RealY-RY1) + (Y2-Y1)); PutPixel(Px,Py,Cor); MoveTo(Px,Py); End; Procedure Janela.Linha(RealX1, RealY1, RealX2, RealY2 : Double; Cor : Byte); Var Px1,Py1, Px2,Py2 : Word; Begin Px1 := Round(FatorX*(RealX1-RX1) + 0); Py1 := Round(FatorY*(RealY1-RY1) + (Y2-Y1)); Px2 := Round(FatorX*(RealX2-RX1) + 0); Py2 := Round(FatorY*(RealY2-RY1) + (Y2-Y1)); SetColor(Cor);

Line(Px1,Py1,Px2,Py2); MoveTo(Px2,Py2); End; Procedure Janela.LinhaPara(RealX, RealY : Double; Cor : Byte); Var Px, Py : Word; Begin Px := Round(FatorX*(RealX-RX1) + 0); Py := Round(FatorY*(RealY-RY1) + (Y2-Y1)); SetColor(Cor); LineTo(Px,Py); End; Procedure Janela.MovePara(RealX, RealY : Double); Var Px, Py : Word; Begin Px := Round(FatorX*(RealX-RX1) + 0); Py := Round(FatorY*(RealY-RY1) + (Y2-Y1)); MoveTo(Px,Py); End; Procedure Janela.SetCor(Cor : Byte); Begin SetColor(Cor); End; Procedure Janela.TextoXY(TelaX, TelaY : Word; s : String); Begin OutTextXY(TelaX,TelaY,s); End; Procedure Janela.TextoRealXY(RealX, RealY : Double ; s : String); Var Px, Py : Word; Begin Px := Round(FatorX*(RealX-RX1) + 0); Py := Round(FatorY*(RealY-RY1) + (Y2-Y1)); OutTextXY(Px,Py,s); End; Procedure Janela.LimpaJanela; Begin SetViewPort(X1,Y1,X2,Y2,ClipOn); ClearViewPort; End; End.

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ANEXO 2

Currículum vitae

FABIANO SOUZA PALGROSSI Rua Izabel Ocaso n º. 30 - Jardim Silveira

Barueri - SP CEP: 06433-240 Brasileiro, Solteiro, 26 anos CRQ: 4145877 – 4ª região

beirut6@yahoo.com Tel: (11) 9199 - 3899

(11) 4162 - 1341 I – FORMAÇÃO

Bacharelado em Química Instituto de Química – Universidade de São Paulo Ano de Conclusão: 2000 Licenciatura em Química Faculdade de Educação – Universidade de São Paulo Ano de Conclusão: 2000 Mestrado em Química Analítica Instrumental Instituto de Química – Universidade de São Paulo Ano de Conclusão: 2002 II - EXPERIÊNCIA PROFISSIONAL

Cargo: Químico Responsável Local: Coalhobrás I. C. de Prod. Químicos Ltda. – Carapicuíba / Tel. 4187-3470 Período: Outubro de 2002 até a presente data. Cargo: Professor de Ensino Médio Local: E.E. Jardim Paulista - Barueri / Tel. 4194-0430 Período: Fevereiro de 1999 – Fevereiro de 2000 Cargo: Professor de Ensino Médio Local: E.E. Prof ª Alayde D. C. Macedo - Barueri / Tel. 4194-0002 Período: Fevereiro de 1996 – Fevereiro de 2000 Cargo: Estagiário Local: Laboratório de Automação e Instrumentação Analítica Instituto de Química – USP / Tel. 3091-3781 Período: Agosto de 1996 – Julho de 2000 Cargo: Técnico Eletrônico de Manutenção Local: Eletrônica Tele-Video / Barueri - SP Período: Janeiro de 1992 - Dezembro de 1995

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III – HABILIDADES

Análises clássicas (Titulações, Gravimetria) e Análises instrumentais:

IV – INFORMÁTICA

Bons conhecimentos em informática (Windows 3.11 e 95/8, Dos, LINUX, Internet Explorer, Netscape Navegator e Comunicator, HTML, Word, Access, PowerPoint, Excel, Origin, MathCad, Corel Draw, Gimp, Photoshop, Paint, Turbo C++, Pascal, Quick-Basic, Hp-VEE, Chemwin, Hiperchem e Matemathica). V – ELETRÔNICA

Conhecimentos em elétrica, eletrônica e microeletrônica: planejamento, desenvolvimento, construção e manutenção de circuitos analógicos, circuitos digitais, automação de sistemas eletro-mecânicos, circuitos A/D e D/A, portas lógicas, montagem SMD, corrosão química de placas de circuito impresso. VI – MECÂNICA

Conhecimentos em Qualidade Total (ISO NBR 9000), Mecânica de Precisão e Hidráulica: Torno, Fresadora, Furadeira de Bancada, Lixadeira, Relógio Apalpador, Paquímetro, Micrômetro, Mesa XY, Soprador Térmico, Maçarico, Serra circular, Fita e Tico-tico. VII – CURSOS EXTRACURRICULARES

“Técnicas Básicas de Vendas” IPEB – São Paulo “Preparo de Amostras” Departamento de Química – UFSCar. “Tópicos Especiais em Biogeoquímica” Departamento de Química – UFSCar. “Metodologia de Análise de Plantas” Congresso Brasileiro de Química – UFMA. “Fundamentos e Aplicações em Química Forense” Congresso Brasileiro de Química, CBQ – UFMA, São Luís/MA. “Introdução à análise por injeção em fluxo” CBQ – USP – SP. “IX Curso de Primeiros Socorros” Escola de Enfermagem – USP.

CE, FIA. Construção de equipamentos e desenvolvimento de métodos.

IC, HPLC, CG, MS, Espectrofotometria UV-Vis, Calorimetria, Refratometria,

Polarimetria e Análises Eletroquímicas (Polarografia, Eletrogravimetria,

Condutometria, Potenciometria,Voltametria, Amperometria e Coulometria).

Desenvolvimento de métodos, assistência técnica.

Absorção Atômica, Fotometria de Chama, Análise Térmica(TG e DTG), Colorimetria,

Fluorimetria e IMS.

Conhecimentos.

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VIII – LÍNGUAS

Inglês Instrumental – Centro de Línguas da Faculdade de Filosofia, Letras e Ciências Humanas da Universidade de São Paulo(FFLCH-USP). IX – PARTICIPAÇÕES EM CONGRESSOS

- Flow Analysis 9, Australia, 2003. - 8.o SIICUSP, Campus São Carlos, USP, São Carlos, 2000. - XVI SQ, IQ, USP, São Paulo, 1999. - 7.o SICUSP, Poli, USP, São Paulo, 1999. - 4th. Latin-American Synposium on Biomedical, Biopharmaceutical and Industrial

Aplications of Capillary Eletrophoresis, IQ - USP, São Paulo,1998. - XXXVIII CBQ, ABQ / UFMA, São Luís, 1998. - XIV SQ, IQ, USP, São Paulo, 1997. - XXXVI CBQ, ABQ / IQ / IEA - USP, 1996. X – PUBLICAÇÕES

- “Injetor Multicanal com Válvulas de Estrangulamento para Análise em Fluxo” Palgrossi,

F.S.; Pedrotti, J.J.; Gutz, I.G.R., Química Nova, 24 (2001), 689. XI - OUTROS

Trabalho Voluntário: Chefe de Tropa Escoteira no Grupo Escoteiro Bandeirantes, 31oGE, Rua Recanto Infantil, 120 – Jd. Reginalice – Barueri – SP Período: Fevereiro de 2001 até a presente data.