diagn inf virale
TRANSCRIPT
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
1/118
DIAGNOSTICUL DEDIAGNOSTICUL DE
LABORATOR ALLABORATOR ALINFECINFECŢIILOR VIRALEŢIILOR VIRALE
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
2/118
DIAGNOSTICUL INFECŢIILOR
VIRALE
Argumente:• clinice (sdr. clinic, debut, evoluţie, patologia asociată)• epidemiologice (vârsta, sex etc.)• laborator
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
3/118
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR
AL INFECŢIILOR VIRALE
Indicaţii:
• Alegerea terapiei etiotrope• Monitoriarea e!icienţei terapiei• Adoptarea măsurilor de pro!ilaxie "i
combatere #n !ocar a unor boli contagioase• $upraveg%erea epidemiologică a unor boliin!ecţioase
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
4/118
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR
AL INFECŢIILOR VIRALE
• &e'usti!icat (tardiv, !ără consecinţeterapeutice)
• Inaccesibil (in!rastructură complexă,personal #nalt cali!icat)
• ostisitor
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
5/118
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR
AL INFECŢIILOR VIRALE
*n preent:• +usti!icat "i necesar (metode de diagnostic
rapid, antivirale e!iciente)
• Accesibil (cel puţin pentru anumite metode)• ost e!icienţă
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
6/118
DIAGNOSTICUL DE LABORATORAL INFECŢIILOR VIRALE
Indicaţii:
• Iniţierea "i monitoriarea terapiei antivirale(v. gripale, -$/, -$0, M, -I, -1,-)
•$tabilirea conduitei terapeutice saupro!ilactice (%erpes genital prepartum,in!ecţie cu v. rubeolic, -I la gravidă)
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
7/118
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR
AL INFECŢIILOR VIRALE• Adoptarea măsurilor de pro!ilaxie "i
combatere #n !ocar a unor boli contagioase
(-A)• $upraveg%erea epidemiologică "i adoptareamăsurilor de sănătate publică (tria'uldonatorilor de sânge "i organe,
supraveg%erea epidemiilor gripale, $A2$)• 3videnţierea unor in!ecţii noi, virusuri noi sau
a unor noi asocieri virus4boală
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
8/118
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR
AL INFECŢIILOR VIRALE
5ipuri de laboratoare:• 6aboratoare clinice• Institute de $ănătate 7ublică
• entre de re!erinţă
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
9/118
DIAGNOSTICUL DE LABORATORAL INFECŢIILOR VIRALE
METODE NESPECIFICE METODE SPECIFICE
Metode directe
• ex microscopic (ME, IF)• evidenţierea antigenelor virale
• evidenţierea secvenţelor ac.
nucleic• izolarea - identificarea
• ex. citologic (M)
Metode indirecte
• evidenţiereaanticorpilor specifici
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
10/118
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL
INFECŢIILOR VIRALE - ETAPE
• ooperarea clinician 8 medic de laborator9• Alegerea celui mai potrivit test (contextul clinico4
epidemiologic)• Alegerea produsului patologic
5ipul (sdr. clinic, stadiul bolii)Momentul prelevării
Metoda de recoltare "i transport
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
11/118
PRODUSE PATOLOGICE UTILIZATE
ÎN DIAGNOSTICUL VIROLOGIC• Sdr respiratriiSdr respiratrii: exsudat naal, exsudat !aringian,
lic%id de spălătură naală, spută
• Sdr di!esti"eSdr di!esti"e: materii !ecale, tampon rectal• Ras# "e$i%&'ar Ras# "e$i%&'ar : lic%id veicular, produs de racla'• I()e%*ii &ri(areI()e%*ii &ri(are: urină• I()e%*ii %&'areI()e%*ii %&'are: raclat con'unctival sau corneean,
exsudat !aringian• Sdr +e(i(!ia(, e(%e)a'iti%Sdr +e(i(!ia(, e(%e)a'iti%: 62, biopsie
cerebrală, materii !ecale, salivă, ţesuturi
• $ânge
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
12/118
MOMENTUL PRELEVRII ÎN
DIAGNOSTICUL VIROLOGIC
OPTIM . pri+e'e / . 0 $i'e de 'ade1&t&' 1'ii (diagnostic direct)2
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
13/118
PRELEVAREA ÎN DIAGNOSTICUL
VIROLOGIC
• 5ipul produsului patologic• 3xpediere imediată• Mediu de transport
• 2e!rigerare (; < =), nu congelare(4/> 40? =)
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
14/118
• Lichid amniotic! se aspira lic"idul cu seringa sise in#ecteaza apoi intr-un tu$ steril.
• %cop! cultivare virusuri• Sange periferic! se decontamineaza tegumentul.%e folosesc tu$uri cu "eparina sodic&
• %cop! cultivare virusuri
• Biopsie cerebrala! pro$ele se transporta in mediude transport M'
• %cop! cultivare, * pentru +%
• Bronhoscopie! se recomanda aspirarea secretiilor prin camera interioara a $ron"oscopului intr-unrecipient steril cu ml solutie salina. %e transportaimediat la la$orator.
• %cop! cultivare virusuri
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
15/118
• Cervix! se foloseste speculum fara lu$rifiant.• %e indeparteaza excesul de mucus si puroi cu a#utorul
tampoanelor de descarcare.
• %e introduce un tampon mic in endocervix si se roteste pentru / 01 secunde.• %e evita atingerea peretilor vaginali cu tamponul. %e
comprima usor cervixul intre lamele speculului si seexprima puroiul eventual existent.
• %e introduce tamponul intr-un tu$ de colectie.• 2aca sunt prezente leziuni, acestea se comprima cu un alt
tampon, care se introduce intr-un mediu de transport M'.• %cop! cultivare virusuri si *
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
16/118
• Cornee! racla#ul corneean este realizat de catre medic.Este indicat a se introduce raclatul in mediu de transportM'
• ultivare +%• LCR: se decontamineaza pielea. %e realizeaza punctie
lom$ara, ventriculara sau su$occipitala. %e strimite 3*intr-un tu$ steril cu capac insuru$at. 4u se foloseste mediuM'. %e transporta in la$orator imediat dupa prelevare.
• ultivare virus si * pentru erpes %implex +irus• Ureche interna! se curata canalul extern cu antiseptic cu
actiune medie. %e preleva puroiul aseptic.• ultivare virus
• Ochi (extern): se indeparteaza mac"ia#ul. %eantiseptizeaza tegumentul din #urul oc"ilor cu antisepticsla$. %e trece de 5 ori un tampon umed la nivelulcon#unctivei. Evitati atingerea pleoapelor. %e folosestemediu de transport M'.
• ultivare virus
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
17/118
• Lezini herpetice: se sterge viguros $aza unei veziculedesc"ise cu un tampon, se trimite produsul in mediu de
transport M'.• ultivare +%, * • Biopsie plmonara! se decontamineaza tegumentul. %e
efectueaza doar de catre specialist. %e trimite produsul lala$orator in mediu de transport M'.
• ultivare virus• Spalatra nasala ! aspirat nasal! capul pacientului este
indicat a fi inclinat su$ un ung"i de 617. %e aspira in seringa ml solutie salina. %e introduce lic"idul in narine. %e
colecteaza lic"idul si se reintroduce de cateva ori. 3a finalse colecteaza lic"idul de spalatura intr-un tu$ sterilinsuru$at. %e trimite imediat la la$orator. 2etectarea rapidade virus gripal este posi$ila in sezon epidemic.
• ultivare virus gripal, virus respirator sincitial.
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
18/118
• "asofaringe! se introduce un tampon su$tire, innasofaringe, in cavitatea nasala. %e tine tamponul aproape
de septul nasal. %e roteste tamponul si se retrage. %etransporta imediat la la$orator. %e foloseste mediu detransport M'.
• ultivare virus8 detectare +*%• Lichid pericardic# pleral# peritoneal! se decontami-
neaza tegumentul.• %e recomanda aspirarea sterila a cativa ml intr-o seringa.%e introduce lic"idul intr-un recipient steril, cu capac.
• ultivare virus• Rash! se curata suprafata cu alcool 619. %e instileaza o
cantitate mica de solutie salina si apoi se aspira intr-un tu$steril. %e foloseste mediu de transport M'.
• entru ras" vezicular se cur&ţ& viguros cu un tampon $azaveziculelor proaspete.
• ultivare virus si IF directa pentru + +aricella :oster
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
19/118
• $ampon rectal! in timpul proctoscopiei sausigmoidoscopiei se ating cu tamponul leziunile de la acestnivel. %e introduce tamponul in mediu de transport M'.
• ultivare virus• Lichid %nt! se decontamineaza tegumentul si cateterul.
%e aspira steril de la nivelul ;untului si se conditioneazaintr-un recipient steril.
• ultivare virus• &aterii fecale! se colecteaza in recipiente curate, uscate,cu capac. 2aca se recolteaza in plosca, se evita contamina-rea cu urina sau dezinfectante.
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
20/118
• 'aringe! tampon de la nivelul exudaului faringiansau al mem$ranelor formate. %e sterg viguroscriptele amigdaliene. 4u se atinge mucoasa $ucalasau lim$a>
• ultivare virus• est! se recolteaza de catre medic• ultivare virus• spirat traheal! secretiile se transporta in
container steril.• ultivare virus
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
21/118
• Secretie retrala: se recolteaza la o ora dupa
ultima mictiune. %e introduc tampoane su$tiri de 5 / ' cm in uretra si se rotesc timp de 0 / secunde.%e depune tamponul intr-un tu$ colector. entru+% se foloseste mediu de transport M'.
• * pentru +%58 ultivare +%• Urina de la nivell cateterli! se dezinfecteazatu$ul cu alcool. %e aspira urina cu o seringa sterila.%e transporta in container steril. %e refrige-reazaimediat.
• ultivare virus• Urina sprapbiana ! citoscopie! se realizeaza
recoltarea de catre medic intr-un recipient steril8 serefrigereaza imediat.
• ultivare virus
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
22/118
• *agin! se foloseste speculum cu lu$rifiant. %eintroduce un tampon steril in vagin. Mediu M'
pentru +%.• ultivare +%, * • *lva! nu se foloseste alcool pentru mem$ranele
mucoase.
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
23/118
2iagnosticul direct
• +xaminarea direct, a prodselor patologice / -etectarea de antigene!
/ Evidentiere de virus ? ME si IEM / imunofluorescenţ& (IF),
/ teste imunenozimatice (E3I%= / enzime linkedimmunosorbent assay)8
/ latex aglutinarea (3=)8 / -etectarea genomli
/ * si *
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
24/118
2iagnosticul direct
• In examinarea direct&, produsele patologicesunt examinate pentru evidenţierea!
• virusului8• antigenelor virale8
• a genomului8
• modific&rilor "istopatologice induse dec&tre infecţia viral&.
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
25/118
2iagnosticul direct• Avantaje!• examinarea direct& este rapid&,• rezultatele fiind o$ţinute @n aceea;i zi, mai ales @n
scopul instituirii c"imioterapiei.• Dezavantaje: • costul ridicat al te"nicilor,• personalul de la$orator @nalt calificat, fac din aceste
metode apana#ul la$oratoarelor de cercetare sau specialec"ipate.
•
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
26/118
2iagnosticul direct
• %c&derea preţului de cost per determinarereprezint& soluţia de viitor pentru extinderea
lor pe scar& mai larg&.• rin dezvoltarea te"nologiilor tip DNA chip
se vor putea detecta virusuri direct @n
produsul patologic (), cu posi$ilitateacuantific&rii lor, @n vederea monitoriz&riiterapiei antivirale.
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
27/118
Metode / &icroscopia electronic, (ME) pentru evidenţierea
morfologiei ;i dimensiunilor virusurilor ;iidentificarea acestora utilizAnd imnoelectron.
microscopia (IME). / &icroscopia optic,! modific&ri "istopatolgice ;i
evidenţierea de incluzii.
/ -etectarea genomli viral! "i$ridizarea ;i reacţiade amplificare genic& (* / polymerase chainreaction).
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
28/118
/zolarea virsrilor
• Culturi de celule! evidenţierea efectului citopatic (E) produs de c&tre virusuri citopatogene8 identificareavirusului izolat prin IF, reacţia de neutralizare (*4), testul
de "emadsor$ţie, *I=, etc.• Izolarea pe ouă embrionate 0n dezvoltare! evidenţierea de pocBsuri la nivelul mem$ranei c"orioalantoidiene (M=),urmat& de identificarea prin *I.
• Izolarea pe animale de laborator determin& decesul sau
reproducerea $olii la animal, urmat& de o$ţinerea desecţiuni "istologice ;i examinarea lor prin M pentruevidenţierea unor leziuni caracteristice ;i identificarea deantigene prin *4, *I, etc.
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
29/118
METODE DIRECTE DE DIAGNOSTICVIROLOGIC
Mi%rs%pia e'e%tr(i%3Mi%rs%pia e'e%tr(i%3 4ME5 sensibilitate redusă (/?@4A virioniml) personal specialiat "i in!rastructură
complexă cost ridicat utiliare limitată
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
30/118
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
31/118
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
32/118
&icroscopia electronic, (ME)
• presupune un la$orator dotat cu ME cu putere dem&rire @ntre 51111-'1111C sau 1111-D1111C.
• e lAng& dezavanta#ele legate de ec"ipamentulscump, al necesit&ţii de personal @nalt calificat ;i alcosturilor ridicate pentru reactivi ;i @ntreţinerea ME,te"nica are ;i dezavanta#ul unei sensi$ilit&ţi reduse,
deoarece limita de detecţie presupune prezenţavirusului @n @n cantitate de aproximativ 1D
particule virale?ml.
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
33/118
&icroscopia electronic, (ME)• Avantaje:
• rapiditatea detect&rii virusurilor ;i utilitatea descrierii morfologieivirusurilor8
• uneori reprezint& singura metod& de diagnostic, a;a cum s-a@ntAmplat @n cazul descrierii coronavirusului recunoscut, ulterior,
ca agent etiologic al %=*% (sindromul acut respirator sever).• Dezavantaje!
• sensi$ilitatea redus&,
• cost ridicat,
• similitudini morfologice @ntre diferite virusuri,
• imposi$ilitatea identific&rii serotipului.
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
34/118
&icroscopia electronic, (ME)
• Produse patologice utile pentru detecţia devirus!
• materii fecale (MF) pentru rotavirusuri,adenovirusuri, virusul 4oralB ;i virusurile 4oralB-like, astrovirusuri, calicivirusuri8
• lichid veziclar pentru +% ;i ++:8
• prods din lezinile ctanate pentru papillomavirusuri, virusul orf , moluscumcontagiosum.
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
35/118
icornavirusuri
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
36/118
IME
• Creste sensibilitatea si specificitatea &+• *ariante ale /&+:• /+& clasic,: pro$a este tratat&, anterior examin&rii la
ME cu un ser specific cu =c monoclonali, anti-virus
presupus prezent @n .• articulele virale, prezente @n pro$e vor aglutina ;i @n
final, se vor agrega, datorit& specificit&ţii reacţiei =g-=c8
• /+& 0n faz, solid,! grila ME, (sau alt suport), va ficoafat&G cu =c monoclonali8 particulele virale,
prezente @n vor fi adsor$ite la suprafaţa grilei prinintermediul =c-lor.
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
37/118
&icroscopia optic,!
+videntiaza modific,ri histopatolgice %ieviden1ierea de inclzii
• Incluziile cu diferite localiz&ri!• intranucleare ;i?sau intracitoplasmatice,• eozinofile sau $azofile,
• cu variate forme / rotunde, alungite, piriforme, etc.• reprezint& doar un reper orientativ ;i nu unul
patognomonic.
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
38/118
Infectii cu +% (incluzii I4)
http://www.medvet.umontreal.ca/pathologie_microbiologie/beluga/images/Herpes_micro.jpeg
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
39/118
3eziuni determinate de +%. %ageata verde indica incluzii I4, cea al$astra ,celule Beratinizate, iar cea rosie, celule $inucleate, cu incluzii i4.
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
40/118
%ageata rosie - incluzii I4, al$astra, degenerarea celulelor cu $alonizare(aspect generat de +%, Beratinocite, multinucleate).
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
41/118
**2 3 inclzii /"
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
42/118
*4 rabic 3 inclzii /C (bazofile)
Coloratie 5+
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
43/118
/nclzii Babes."egri
granle albastr.inchis la nivell
inclziilor (coloratie Sellers)
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
44/118
*RS 3 sincitii si inclzii eozinofile i4c4
/nfectie 5/* 3 celle nervoase
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
45/118
/nfectie 5/* celle nervoase
/nclzii Co6dr7 # /" si /C 3 eozinofile
(coloratie 5+)
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
46/118
#oi
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
47/118
METODE DIRECTE DE DIAGNOSTICVIROLOGIC
Dete%*ia 6i ide(ti)i%area a(ti!e(e'r "ira'eDete%*ia 6i ide(ti)i%area a(ti!e(e'r "ira'e
imuno!luorescenţă imuno%istoc%imie metode imunoenimatice
latexaglutinare reacţii de neutraliare, !ixare a complementului,
in%ibare a %emaglutinării
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
48/118
METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC
VIROLOGIC - IMUNOFLUORESCENŢA
• =nticorpi marcaţi cu fluorocrom• 2etecţia ;i identificarea antigenelor de la
nivelul celulelor infectate (produs patologic,
culturi de celule)
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
49/118
METODE DIRECTE DE DIAGNOSTICVIROLOGIC - IMUNOFLUORESCENŢA
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
50/118
METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC
VIROLOGIC - IMUNO7ISTOC7IMIE
• 2etecţia ;i identificarea antigenelor virale de la
nivelul celulelor infectate (produs patologic, culturide celule)
• =nticorpi marcaţi cu peroxidaz&
•Examinare la microscopul optic• 2ezavanta# / peroxidaza endogen&, prezent& @nnumeroase ţesuturi, poate genera reactii fals pozitive
O C G OS C
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
51/118
METODE DIRECTE DE DIAGNOSTICVIROLOGIC - IMUNO7ISTOC7IMIE
METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
52/118
METODE DIRECTE DE DIAGNOSTICVIROLOGIC - IMUNO7ISTOC7IMIE
METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
53/118
METODE DIRECTE DE DIAGNOSTICVIROLOGIC - IMUNO7ISTOC7IMIE
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
54/118
*a$ie - imuno"istoc"imie
http://www.fujita-hu.ac.jp/~tsutsumi/photo/photo141-3.htm
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
55/118
Incluzii I4 odrH = / se vad uneori8 Imuno"istoc"imie, utilizand=c monoclonali anti- +%! semnal () I4 si I (stanga coloratie
apanicolau si dreapta! I, dupa recolorare)
http://www.fujita-hu.ac.jp/~tsutsumi/photo/photo141-3.htm
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
56/118
METODE INDIRECTE DE DIAGNOSTIC
VIROLOGIC• 3videnţierea anticorpilor speci!ici metode imunoenimatice (36I$A) latexaglutinare (6A)
reacţia de !ixare a complementului (2B) evidentiaa Ac speci!ici de grup (exceptii $2,paragripal tip C)
reacţia de in%ibare a %emaglutinării (2I-)
• $ensibilitate, speci!icitate, complexitate "i costuri 8 !uncţie de metoda utiliată• riterii de semni!icaţie a preenţei Ac
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
57/118
riterii de semni!icaţie a
preenţei Ac• 8 probe de ser (ideal)
- dinamica semnificativ&
- seroconversia• 9 prob, nic,
- titrul semnificativ
- clasa de =c (IgM versus IgJ)
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
58/118
METODE IMUNOENZIMATICE ÎN
DIAGNOSTICUL VIROLOGIC• Aplicaţii extrem de variate• Diverse variante (directe, indirecte, competitive,
sandwich)• Detecţia "i identi!icarea antigenelor (virioni,antigene virale solubile, celule in!ectate) si aanticorpilor
• $ensibilitate !oarte bună• $peci!icitate 8 !uncţie de a!initatea anticorpilor • Accesibilitate• ost redus
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
59/118
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
60/118
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
61/118
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
62/118
E3I%=- principiu
• Evidenţierea complexului =g-=c cu a#utorulunui element cunoscut (=c sau =g) marcat
cu o enzim&• *eacţia de culoare, prin ad&ugarea unui
su$strat specific (pentru enzima utilizat&)
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
63/118
laca E3I%= (5?)
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
64/118
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
65/118
E3I%= - metoda
• =g partial purificat, inactivat este adsor$it pesuport
• %e adauga ser (poate contine =c / secupleaza de =g)
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
66/118
E3I%= - metoda
• =c anti Ig umana, cuplati cu enzima(con#ugat)
• romogenul (su$stratul) va sc"im$a
culoarea reactiei daca se formeazacomplexul =g-=c-on#ugat
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
67/118
E3I%= / ser reactiv
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
68/118
E3I%= / ser nereactiv
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
69/118
E3I%=
ositive Control "egative Control atient atient B atient C ssa7 Control
94;49?@ O4>?? >4A98 94=== >498@
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
70/118
E3I%=
indirect
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
71/118
E3I%=
indirect
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
72/118
E3I%=
http://www.apotech.ch/?id=12
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
73/118
E3I%= / direct (detectare de =g)
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
74/118
E3I%=
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
75/118
E3I%= / competitiv
• competiţia se realizeaz& direct @n prezenţade =c diri#aţi @mpotriva =g insolu$ilizat,
prin adsor$ţia pe faza solid&.• este posi$il s& ad&ug&m reactivii @n etape! @n
prima etap&, =g-ul de dozat se adaug& peste
=c insolu$ilizaţi pe faza
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
76/118
E3I%= / competitiv
E3I%=
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
77/118
E3I%=
• 4u se lucreaza pro$e "emolizate, contaminate>• astrarea serului cel mult zile la frigider (ideal,
maxim 0 zile).
• 4u se ing"eata pro$a repetat>
• Rezltate fals pozitive! impun repetarea pro$ei pe5 godeuri (mai ales in cazul pro$elor indeterminate8
=% N ).
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
78/118
Srse de eroare 0n dozarea
antigenelor! rezltatele fals pozitive pot fi determinate de!
O fixarea nespecfic& a imunoglo$ulinelor de c&trereceptori Fc mem$ranari sau de c&tre factorulreumatoid (F*) prezenţi @n ser sau alte lic"ide
$iologice8
O reacţii "eterospecifice determinate de utilizareaanticorpilor anti-antigene "eterologe, anti-gazd&sau anti-mem$rane ale gazdei sau de prezenţa deantigene @n pro$& ($acterii, levuri, ciuperci,
proteine)8
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
79/118
Srse de eroare 0n dozarea
antigenelor!O proasta conservare a serurilor ce duce la
alterarea imunoglo$ulinelor @n pro$&8
O folosirea unui con#ugat la titru sau cu oaviditate insuficient&.
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
80/118
Srse de eroare 0n dozarea
antigenelor!• Rezltate fals negative• =viditate scazuta a =c adsor$iti pe suport
• on#ugat nelegat (incu$are insuficienta,spalare in exces, etc)
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
81/118
E3I%=
• Condita! repetarea pe aceeasi pro$a sau?si pe o noua pro$a de ser (recoltat imediat sau?si
la 5-0 luni interval).• %e prefera repetarea pe truse de la producatori
diferiti.
• =tentie! pacienti cu $oli autoimune, su$tratament cu cortosterioizi, "emodializati, etc.
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
82/118
E3I%=
• Rezltate fals negative:• ser recoltat anterior perioadei de
seroconversie• =c complexati?legaţi cu =g• sensi$ilitate redusa a trusei
• =c antiI+5 nu sunt recunoscuti de truse pentru I+• imunsupresie
E"'&*ia r3sp&(s&'&i i+&( 8( i()e%*ia %&
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
83/118
E"'&*ia r3sp&(s&'&i i+&( 8( i()e%*ia %&7IV
E3I%= / sc"ematic (indirect)
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
84/118
E3I%= sc"ematic (indirect)
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
85/118
E3I%= / =g p 5' (I+)
Sa(d9i%# ELISA 4A%-A!-A%5
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
86/118
IgJ-apture EI=
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
87/118
IgJ-apture EI=
Serm (9!9>>)
Biotin-Labeled g
Strepavidin-eroxidase
$&B
Sbstrate
oat-anti-5man-/gCaptre ntibod7
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
88/118
E3I%=
• Rezltate fals pozitive
• Confirmarea printr.n test principial
diferit (B# /')4
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
89/118
I+ PL
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
90/118
PL - principiu
• =g virale fixate pe un suport (mem$ran&),reacţioneaz& specific cu =c din ser
• Marca# imunoenzimatic• 3egarea reactivilor ca in E3I%= de tip
indirect
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
91/118
PL
• vantaDe:
• evidentiaza categorii de =c
• este mai specifica• permite aprecieri prognostice (ex.
aparitia?versus disparitia =nti- p5').
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
92/118
PL
• -ezavantaDe:
• timp mai mare de executie
• presupune dotari suplimentare• personal super-calificat
• uneori presupune interpretari su$iectiveG
• cost ridicat
METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
93/118
METODE DIRECTE DE DIAGNOSTICVIROLOGIC . LATE: AGLUTINARE
• =nticorpi fixaţi pe particule de latex /identific& antigene (reciproca estevala$il&, pentru evidenţierea de =c)
• Metod& simpl&, rapida ;i accesi$il&
• %ensi$ilitate ;i specificitate relativreduse
• Ex! antigenul rotaviral in materii fecale
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
94/118
L
METODE DE BIOLOGIE MOLECULAR
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
95/118
METODE DE BIOLOGIE MOLECULAR ÎN DIAGNOSTICUL VIROLOGIC
• Detecţia "i identi!icarea unor secvenţe speci!icede acii nucleici
• Diverse variante-ibridiarea aciilor nucleici neampli!icaţi Ampli!icarea semnalului (bD&A) Ampli!icarea secvenţei (72, 25472, &A$1A)
• $ensibilitate "i speci!icitate !oarte bune• Accesibilitate restrânsă• ost ridicat, dar cu raport costbene!icii !avorabil
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
96/118
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
97/118
CR
* id ţi f t l i
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
98/118
* / evidenţierea fragmentului
amplificat
D li i ă i il l i i i li
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
99/118
Detectarea calitativă a acizilor nucleici virali
• and metodele convenţionale sunt greu de utilizat!• virusurile care se cltiv, dificil (+L, +,
papillomavirusul uman, I+ ;i parvovirusul LQ)8
• datorit& riscli cresct de infec1iozitate (I+)8• cAnd serologia n este evident, (ex. @n cazul pacienţilor
imunocompromi;i- virusul citomegalic)8• diagnosticul infec1iilor virale congenitale şi perinatale
(I+, +)8• virusul este prezent @n concentra1ii foarte Doase!
screening /ul sAngelui ;i al produselor sanguine (+L,+, I+)8
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
100/118
roduse patologice
• testarea fluidelor organismelor care @n modnormal sunt sterile
- 3* (+%, ++:, +M)8- lic"idul amniotic (++:, +M, parvovirusul
LQ, virusul ru$eolei)8
- fluidele oculare (++:, +M).
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
101/118
*
- =u fost folosite variate metode pentruaceste scopuri, inclusiv * ;i "i$ridizarea,
cu scopul de a putea evidenţia concentraţiisc&zute de genom viral @n pro$e.
Secvenţierea acidului nucleic viral
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
102/118
Secvenţierea acidului nucleic viral
• dat& ce genomul viral a fost detectat, secvenţiereagenomului poate evalua relaţiile dintre dou& sau mai multeizolate virale, @n cazurile @n care este posi$il& coinfecţia(+L / +) sau poate g"ida terapia antiviral&.
• Rn testarea rezistenţei la antitretrovirale a I+ se determin&secvenţierea *< ;i a proteazelor ;i se compar& expresiasc"im$&rilor aminoacizilor cu tulpina iniţial& de virus.
•
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
103/118
Secvenţierea acidului nucleic viral
• plica1ii: • alegerea terapiei de prim& intenţie, adaptarea terapiei,• profilaxia post / expunere ;i prevenţia transmiterii
verticale.• Ex. terapia I+ ;i +.• r&spunsul la IF4 @n infecţiile cu + depinde de
genotipul viral! genotipurile 5 ;i 0 r&spund mai $ine decAtgenotipul 8
• cAteva variante de +L cu sensi$ilitate redus& la3amivudin& sunt asociate cu prezenţa unui singur nucleotidla nivelul genei care codifica sinteza polimerazei.
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
104/118
Cuantificarea acidului nucleic viral
• uantificarea @nc&rc&turii virale este
important& @n virusologia clinic& datorit&utilit&ţii sale ca!
- indicator al prognosticului8
- al r&spunsului la terapia antiviral&8- al riscului transmiterii infecţiei.
Evaluarea prognosticului:
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
105/118
Evaluarea prognosticului:
• = fost $ine sta$ilit pentru I+.• %/a demonstrat c& nivelul plasmatic al =*4/
ului viral corelat cu stagiul $olii ;i cu un nivel
sc&zut al I+ @n plasm& se asociaz& cu olung& perioad& asimptomatic&.
• Inc&rc&tura viral& crescut& dup& seroconversie
poate preceda progresia spre %I2=.
Evaluarea prognosticului:
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
106/118
Evaluarea prognosticului:
• M&surarea @nc&rc&turii virale pentru +M este util&@n cazurile post / transplant, aceast& metod&dovedindu/se mult mai eficient& decAt determi-
narea calitativ&.• Inc&rc&tura viral& pentru +M este un factor
predictiv independent @n supravieţuire, @n cazul%I2= avansat.
• re;terea +EL @n plasm& ;i @n limfocitele dinsAngele periferic poate precede apariţia unortul$ur&ri limfoproliferative post / transplant.
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
107/118
Evaluarea răspunsului terapeutic:
• este cel mai $ine cunoscut& @n cazul infecţiei cu I+, caz @ncare scopul terapiei este de a reduce nivelul plasmatic al I+
cAt mai mult posi$il• exist& controverse @n acest sens8- s-a sugerat c& pacienţii cu nivelul plasmatic al I+ @ntre
01.111 ;i 1.111 cSpii ? ml ar tre$ui s& primeasc& terapieantiretroviral& indiferent de stadiul clinic,
- @n timp ce pentru pacienţii care au concentraţii @ntre 111 /01111 cSpii ? ml tre$uie s& se ai$& @n vedere ;i stadiul clinic ;inum&rul 2' pentru iniţierea terapiei antiretrovirale.
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
108/118
Evaluarea răspunsului terapeutic:
•
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
109/118
Evaluarea răspunsului terapeutic:
• Rn cazul +L, @n care un nivel crescut de =24 @nainte deiniţierea tratamentului este asociat cu un r&spuns sla$ laIF4, cuantificarea =24? +L a fost utilizat& pentru a
preconiza r&spunsul terapeutic ;i pentru a monitorizar&spunsul la terapia antiviral&.
• 3a fel ;i @n cazul infecţiilor cu +, nivelul ridicat alviremiei, @naintea iniţierii terapiei antivirale este asociat cuun r&spuns terapeutic redus (s-a demonstrat c& acesta apare
indiferent de genotip).• Este @nc& neclar care este raportul dintre genotipul + ;inivelul viremiei.
Evaluarea riscului transmiterii virale:
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
110/118
Evaluarea riscului transmiterii virale:
• cuantificarea genomului viral pentru a evalua riscultransmiterii virale nu este frecvent utilizat& @n prezent, dar
poate deveni mult mai important& @n viitor8• este general acceptat c& riscul transmiterii virale este corelat
cu nivelurile crescute de virus @n diverse fluide aleorganismului8• transmiterea + de la mam& la copil este mai frecvent&
atunci cAnd nivelul =*4 ? + al mamei @n sAnge este maimare decAt 1 cSpii ? ml (practic risc N 1 la 10 cSpii ? ml ).
•
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
111/118
Evaluarea riscului transmiterii virale:
• Rn ceea ce prive;te transmiterea mama-fat @n cazulI+, s-a demonstrat, de;i inconstant, c& nivelurileridicate ale =*4 ? I+ @n plasma mamei cresc risculinfecţiilor fetale.
• %c&derea riscului transmiterilor se poate face eficient prin :idovudin&.
• meta / analiz& recent& ce a inclus studii deco"ort& sugereaz& c& na;terea prin cezarian& reduce
riscul transmiterii I+ pe cale vertical&, indiferent deutilizarea :idovudinei.• 4ivelurile crescute de I+ apar mai frecvent @n timpul
relaţiilor "eterosexuale.
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
112/118
&etode cantitative
• *eal
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
113/118
METODE DIRECTE DE DIAGNOSTICVIROLOGIC - CULTIVARE
• Metodă standard 8 permite
stabilirea semni!icaţiei iolatului testarea sensibilităţii la antivirale iolarea unor virusuri noi
• laborioasă, necesită in!rastructură complexă"i personal cali!icat• accesibilitate redusă "i costuri mari
METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
114/118
METODE DIRECTE DE DIAGNOSTICVIROLOGIC - CULTIVARE
• 7relucrarea produsului patologic
• Medii de cultură %e'&'are%e'&'are culturi de celule (primare, diploide, linii celulare) ouă embrionate
animale de laborator
METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
115/118
METODE DIRECTE DE DIAGNOSTICVIROLOGIC - CULTIVARE
• 3videnţierea replicării virale e!ect citopatic incluii %emadsorbţie %emaglutinare
imuno!luorescenţă, metode imunoenimatice trans!ormare malignă inter!erenţă
E65IA23A I2E$E2I6F2 83B35 I5F7A5I i itii
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
116/118
3B35 I5F7A5I 4 sincitii
+irus urlian ! - sincitii (se confunda cu cele
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
117/118
ale +*% / diferentiere prin testul de
"emadso$tie)
CULTIVAREA VIRUSURILOR . INCLUZIIVIRALE
-
8/18/2019 Diagn Inf Virale
118/118
VIRALE