die mikrochromatographie in der lebensmittelchemie

Fortschrittsbericht

Ans dem Institut ftir biochemische Technologie, Lebensmittelchemie und Mikrochemie der Technischen Hochschule, Graz

(Vorstand : Prof. Dr. Ing. G. GORBACH)

Die Mikrochromatographie in der Lebensmittelchemiel

G. GORBACH

I)K 664.543.544 Lebensmittel-Analytik Mikrochromatographie

.\ufbauend auf den Arbeiten der Grazer hlikrochemischen Schule unter EMICH und PREGL entwickelten wir Mikrogerate und -methoden fur die vcrschiedensten Anwendungsgebiete. So cntstand z. B. mein Mikroextraktor, der gegcniiber der herkommlichen SoXHLETmethode wesentliche Vorteile bietet, wenn man das Rohfett extrahieren will, eine Aufgabe, die mich beim Stndium der Lipide der Bakterien zur Entwicklung dicses Gerates anregte. Nach und nach entstand ein Instrumentarium [I], das der Anwendung der Mikrochemie auf allen Ge- bieten der chemischen Analyse und der praparativen Chcmie zum Durchbruch verhalf. Ein besonderer l'orteil der GerBte liegt in ihrcr Standardisierung; die Standardisierung der Me- thoden erleichtert auch fachlich nicht ausgebildeten Kraften z. B. den vielen Anlernkriiften der chemischen Industrie, die Erlangung brauchbarer Ergebnisse. Als vorteilhaft sind weiter- hin der geringe Materialaufwand sowie erheblichc Zcitersparnis zu nennen. Der Einwand, die Mikrochemie sei weniger zuverl&ig, la& sich durch die cinfach und schnell erziclbaren guten Resultate entkraften. Dartiber hinaus kann man statt der in der hlakrochemie iiblichen Doppelanalysen ohne Zeitverlust mehrere Proben ansetzcn. Die Mittelwerte dieser sog. ,,sta- tistischen Analyse" stellen weit zuverlassigere lycrtc dar, als sic mit makrochemischen Mittein erzielt werden kbnnen.

Ich glaube, daO selbst im Zeitalter der clektronisch gcstcuerten Analysenapparate die Mikro- chemie ihre Daseinsberechtigung hat ; miissen doch die Proben praparativ vorbereitet werden, bevor sie in den automatisch arbeitenden Apparaturen gute Ergebnisse liefern. Den Bewcis fur diese Behauptungen konnten mir fur die Arbeitsgebietc der Spektral-, Emtnissions- und Absorptionsanalyse erbringen ; haben wir tloch selbst auf dicsen Gebicten die praparative Mikrochemie nutzbringend angewandt.

I. Dic Vorteile der hfikrochemic wcrden auf dem Gcbiet dcr Chromatographie besonders deut-

lich. Werden in tler herkdmmlichcn Papier- und Diinnschichtchromatographie Standkovetten und Zylinder als Chromatographicrraume verwendct, so benotigcn wir fur die in den letzten Jahren entwickclte Mikrochromatographie [2] Eprouvetten. Dicse kleinen Chrornatographier- raume sparen nicht nur Zeit. sondcrn ermoglichen aiich den Einsatz von wesentlich kleineren Probenmengen, als dies sonst moglich ist. Lange unci Breite der verwendeten Proberohren sind standardisiert, ebenso Lange und Breitc der Papier- bzw. Glasstreifen. Die F'roberohreu

Nach einem Vortrag am 12. 12. 1967 z u m 75. Geburtstag von Prof. Dr. Dr. h. c . li . TAUFEL.

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haben Schliffstopfen mit Glashakchen zum Einhihgcn der Streifcn (Abb. I). Durch Einstcllen dcr Proberiihren wahrend des Chromatographierens in einen Thermostaten - arbeiten bei Teniperaturen bis zu efwa 40 OC - la& sich die Laufzeit wesentlich verkurzen. Durch die envahnten Maonahmen sind ohne Schwierigkeit konstante Bedingungen einzuhalten ; dadurch erhalten die Rf-Werte den Charakter physikalischer Konstanten.

Ftir das Dhnnschichtverfahren wcrden Glasstrcifen verwendet. dercn Breite man entsprechend der aufzubringenden Probenmenge variieren untl his auf wenige film herabsetzen kann, so daB dcr Ausbreitung der Substanz a priori eine Grenze gesetzt ist; die lctzte Konsequenz dieses Gcdankengangcs sind Glasfaden.

Abb. I. Mikrochromatographie-GefaOe Abb. z . Glasstreifen und -stabe zur Dunnschichtchromatographic

Vorteilhaft enveist sich die Verwendung von 3-4 mm breiten Vierkantstaben, wcnn man je z Proben auf den jcweils gcgeniiberliegenden Seitenilachen in derselben Proberohre chromatographieren will (Abb. 2). Die Eprouvetten werden vertikal in einem Gestell untergebracht (Abb. I).

E. STAHL [3] empfiehlt fur seine Diinnschichtchromatographie besondere Streichgerate. Eincm Vorschlag von J. PEIPER [4] folgend, bedienen wir uns des Tauchverfahrens; die Glas- streifen werden in eine Mischung von 30 g Kieselgel und IIO g Cloroform getaucht und erhalten so die Kieselschicht. Das Chloroform vcrdampft schon wahrend des Herausziehens. Da beide Seiten des Glasstrcifens mit der Diinnschicht belegt sind, kann man z. B. leicht die Identitat bzw. Nichtjdentitat zweier Proben feststellen. Bei Gleichheit befinden sich die Chromato- graphierflecken auf beiden Seiten an der glcichen Stelle - gleiche Rf-Werte - , da die Ent- wicklung unter streng gleichen Bedingungen crfolgt ist.

Neben der Schichtdicke der Kieselgelschicht beeinflurjt das FlieOmit.te1 die Lautzeit. S O konnten wir z. B. fur ein FlieDmittelsystem bei den diinnsten Schichten von 0,07 nim eine Laufzcit von nur 40 min, bei der dicksten Schicht von o,14 mm hingegen eine solche von 60 min feststellen.

Urn die Standardisierung zu vervollkommnen, legten wir auch die Laufhohen der Losungs- mittelfront fest, namlich auf IZO, 140 und 160 mm. Die jewcils gewahlte Hohe richtet sich nach der Anzahl der in der Probe aufzutrennenden Substanzen, aber auch nach der Lauf- geschwindigkeit. Fur die vie1 schneller laufenden anorganischen Trennungen kann man rnit IZO mm Laufmittelfront auskommen.

Fur die Erzielung runder Flecken und einwandfreier Trennungen ist die punktformige Auf- tragung der Probe wesentlich [ 5 ] . Wir verwenden hierzu unseren auf dem Universalstativ fixierten Heizblock, der mit einer zentralen Bohrung versehen ist, durch die erwarmte Luft geblasen werden kann (Abb. 3). Der Startpunkt des Papierstreifens lie@ auf der Bohrung. Wird nun die Probe aufgebracht, so schlieOt die aus der Bohrung rings um den Startpunkt austretende warme Luft die Ausbreitung der Probe aus. Ein in der Bohrung zentral angc-

hfikrochromatographie in der Lebcnsniittclchemie 86 1

brachtes Metalltrichterchen verhindert das Eindringen dcr Luft in die Kapillare der Auf- bringungsvorrichtung. Fur groBere Probenmengen verwendcn wir die Hebereinrichtung ge- mat3 .4bb. 4, fur kleinere eine Membranbiirette eigener Konstruktion [I], an dcr die aufge- brachte Blenge abgelescn werden kann. Fur ganz gcringe Probenmengen eignen sich Wage- pipetten und -kapillaren (Abb. 5 ) : zur Fiillung und Entleerung wcrden sic in eine geeigncte Maltevorrichtung gebracht und vor und nach der Ftillung auf der Mikrowaage gewogen. Die Mikropipetten sind fur 100, 50 und 20 ml geeicht: die Benetzungsfehlcr sind sehr gering.

Abb. 3. Auftraggerat zur Papierchromatographie

&f&winiumbImtdes U t t i m W -Heir - gtrutez nach Gurhcb

Ahh. 4. Heheeinrichtung zum Auftragcn gr6Berer Probemengen

11.

Auf Grund der nach unserer Mcthode exakt reproduzicrharen Rf-m’ertc bietet sich fur die quantitative Auswcrtung der Chromatogranime dichfoglichkeit, die Substanzffeckcn auf einem noch nicht behandelten Chromatographierstreifen rnit Hilfe bereits behandelter Leitchromato- grammc festzulegen. Die Flecken konncn ausgeschnitten und mit einem geeigneten Losungs- mittel eluiert bzw. extrahiert werden. Der geloste Stoff mird rnit Hilfe einer geeigneten Farb- reaktion kolorimetrisch, spektrophotometrisch, fluoreszenzphotometrisch oder gaschromato- graphisch bestimmt. Die bereits auf dem Papier angefarbte Substanz kann hingegen direkt photometrisch ermittelt werden. Dies kann rnit eincm photoelektrischen Densitometer mit oder ohne Transparentmachen geschehen. Auf Grund vieler Erfahrungen mit anderen Me- thoden bevorzugen wir die Extraktion der Substanzflecken im angcfarbten wie auch im un- gefarbten Zustand rnit einem geeigneten LosungsmitteI, was rnit Hilfe der durch die Standar- disierung exakt gegebenen Rf-Werte leicht moglich ist.

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Die ausgeschnittencn bzw. im Fall der Dtinnschichtchromatographie abgekratzten Flecken werden entweder im Schliffspitzbecher (Abb. 6) oder im Mikroextraktor (Abb. 7) extrahiert. Der Extrakt wird vorsichtig auf ein bestimmtes Volumen eingeengt, mit einer Kapillare auf- genommen und am Startpunkt eines neuen Chromatographierstreifens aufgetragen. So kann man mehrere Substanzen urspriinglich gleichen Rf-Wertes neuerlich trenncn und quantitativ bcstimmen, wenn man ein anderes FlieDmittel venvendet.

Abb. 6. Schliffspitzbecher

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I !k I

Abb. 8. Papierfaltstreifen zur Anreicherung chromato-

graphierter Substanzen

Abb. 7. Mikrocxtraktor.

Abb. 9. Anreicherung chromatographierter Substanzen

Die Extraktion ist, besonders wenn sie ofters wiederholt wird, naturgema0 rnit Verlustcn vcrbundcn, sie kBnncn niit Hilfe von Testsubstanzen lcicht ermittelt und in Rechnung ge- setzi: wrrdcn. Eine Extraktionsmethode, die gleichzeitig der Anreicherung dient, beruht auf dcr Vcrwendung des ,,Papierfaltstreifens". In diescn Faltstrcifen, der doppclt so breit ist wie rler Chrotiiatographierstrcifen und mit einer Schere im gefaltcten Zustand zugespitzt wurde (Abb. S ) , aerden ein oder mehrere ausgeschnittcne Flecken der chromatographierten Substanz cingelcgt, der Streifcn wird zusammengefaltct und zwischen z Glasplattchen so eing'espannt, rlaW nur wenige mm der Spitze hervorragen (Abb. 9). Das untere freie Endc taucht in das zum Chromatographieren vcnvendete Laufmittcl cin ; indem cs auisteigt, lBst es auf seinc.m l\\'eg dic Substanzcn aus dcn Flecken und nimmt sic zur Spitze mit. Mit Hilfe eines warnwn

Mikrochromatographie in der Lebensmittelchemie 863

Luftstromes wird das Liisungsmittel verdampft und die Substanz auf diese Weise in der Spitze angereichert. Eine Einrichtung fur mehrere Faltstreifen zeigt Abb. 10. Sol1 die Anreicherung weiter fortgefiihrt werden, so kann man mehrere Spitzen abschneiden, neuerlich in einen Falt- streifen einlegen und so die Anreicherung praktisch unbegrenzt fortsetzen. So kann man Sub- stanzen nachweisen und quantitativ bestimmen, die auf dem Chromatogramm zunachst gar- niclit erscheinen, nach mehrfacher Anreicherung jedoch sichtbar werden.

Abb. 10. Einrichtung fur mehrere Faltstreifen Abb. I I. Kapillarphotometer

hbb. 12. Kapillarphotometer der Fa. LANGE, Berlin

Handelt es sich bei der in der Spitze des Faltstreifens angereicherten Probe um mehrcre Substanzen. kann man weiter auftrennen, indem man die Spitze des Faitstreifens an einen neuen ebenfalls zugespitzten Faltstreifen mit einer Clasklammer anklammert, sodal3 die Spitze zum Startpunkt eines neuen Chromatogrammes wird. Mit einem geeigneten Laufmittel wird so eine weitere Auftrennung erzielt. Auch diese Technik lal3t sich beliebig niederholen.

Fur die quantitative Bestimmung der aufgetrennten und extrahierten Substanzen verwenden wir neben einem einfachcn Kapillarphotometer [6] (Abb. I I) ein solches eigener Konstruk- tion (hbb. IZ), das von der Fa. LANCE, Berlin, in den Handel gebracht wird [7]. Als Kiivetten dienen dickwandige Kapillaren von 100 mm Lange, einem Lumen von z mm und einem Yo- lumen von 0.7 ml. Die grol3e Schichtdicke ermoglicht eine hohe Nachweisgenauigkeit, wie sic die sonbt bekannten hlikrophotometer u. W. nicht besitzen. Eine hohere Genauigkeit ird auch dadurch erzielt, dal3 man durch Verwendung von Interferenzfiltern in einem Bereich eines konzentrationsempfindlichen Absorptionsbandcs der nachzuweisenden Substanz arbeiten kann.

311. Auf anorganischem Gebiet haben wir diese Methodik zur Bestimmung der Spurenelemente

verwendet ; sie stellt eine wertvolle Erganzung der Emissionsspektralanalyse dar [R], die far

5 7 Die Nahrung, I?. Jhg., Heft S

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die einzelnen Spurenelemente eine sehr variable Nachweisempfindlichkeit besitzt. Sic erwcist sich z. B. fur die besonders interessierenden Elemente Kobalt und Zink fur quantitative Zwecke wenig geeignet. Wir befafiten uns mit der individuellen Bestimmung der nebenein- ander vorliegenden 8 Elemente Nickel, Mangan, Kobalt, Kupfer. Eisen, Zink, hfolybdln und Vanadium. Als Laufmittel wurde mit Erfolg eine von BURSTALL u. a. [g] angegebene Aceton/ Salzsaure/Wasser-Mischung venvendet. Hierbei ist ein Wassergehalt von 7 - I 0% optimal fur die Trennwirkung. Zur Sichtbarmachung findet Na-Diathyldithiocarbamat (Na-Dithion) allgemein Venvendung; es gibt niit Nickel gelbe, rnit Kupfer braune, mit Eisen graubraune, mit Mangan schokoladebraune, mit Kobalt grune und rnit Molybdan (VI1I)oxid rosa Farbung.

Abb. I 3. Papierchromatographische Trennung einiger anorganischer Elemente

(Fliefimittel= Aceton/Salzsaure/Wasser) uu 20°C 35°C

Xuch Kaliumrhodanid-Aceton ist gut brauchbar; es liefert mit Eisen rotbraune, rnit Molybdan- (VII1)oxid nach Reduktion rnit Zinn(I1)chlorid blutrote und mit Kobalt hellblaue Farbung. Als weitere spezielle Reagenzien sind Xaliumhexacyanoferrat(I1) fur Eisen, Dithizon fiir Zink und Dimethylglyoxim fur Nickel zu erwahnen. Eine Trennung von Nickel, Mangan, Kobalt, Kupfer und Zink gibt Abb. 13 wieder; der Streifen links zeigt die Trennung bei Zimnier- temperatur, der Streifen rechts bei 35 OC. Die Laufzeit betragt jeweils 50 min ; die Trennung bei hoherer Temperatur ist deutlich besser. Bei diesem Versuch wurden 5 wg aufgetragen ; die Trennung ist noch rnit I pg durchfiihrbar und - bedient man sich des oben beschriebenen .\nreicherungsverfahrens - natiirlich auch noch rnit weit kleineren Mengen.

IV.

Unserem Arbeitsgebiet entsprechend haben wir uns rnit der Analyse von EiweiBkorpern und der Bestimmung der konstituierenden Aminosauren befaBt, besonders im Hinblick auf die essentiellen Bausteine. Interessant war auch der bei der Samenolgewinnung anfallende ciweiDhaltige PreDkuchen, der bisher als Viehfutter Venvendung findet, desgleichen die Zu- sammensetzung von PilzeiweiO, das bei der Antibiotikaerzeugung anfallt. Konnten dicse Produkte fur Ernahrungszwecke herangezogen werden, so bestande die Moglichkeit, durch Zuchtung der entsprechenden Mikroorganismen auf einfachsten Nahrmaterialien den in den dicht bevolkerten Entwicklungslandern bestehenden EiweiOmangel in der Zukunft wenigstens zum Teil zu beheben [IO].

In der ersten Nachkriegszeit haben wir in der Steiermark aus den PreSkuchen des steirischen olkiirbis rnit Fett und selbst erzeugtem unraffiniertem Riibenzuckersirup in grofien Mengen Nahrblocks erzeugt, die den damaligen EiweiBmangel wenigstens teilweise zu beheben geholfen haben. Hinsichtlich seines Aminosauregehaltes kann man das Kiirbiskerneiweil3 als das hoch- wertigste unter allen bckannten Pflanzeneiweifien bezeichnen, das dariiber hinaus durch leichte Verdaulichkeit ausgezeichnet ist. Ahnlich wertvoll ist das ErdnuS-EiweiB, uber das in1 folgenden kurz berichtet wird. Erwahnt sei, daB wir das EiweiD aus den Prcfikuchen bzw. aus den Mycelien der Pilze nach Zerkleinerung rnit Natronlauge isolieren; auf diese Weise ist das EiweiB durch mehrmalige Extraktion fast .vollstandig gewinnbar. Zur Bestimmung der

Mikrochromatographie in der Lebensmittelchemie 865

__.__-__-._ - . __.____

.\minosaure I % Zersetzungl Zers.-Faktor ;\minoslure _____.

Tryptophan 100 ~ - Arginin 1,101 Cystein 1,035 Leucin 1,052 Lysin

! Lysin

Cystin

"4 Zersetzung Zen.-Faktor 1 I00 -

5.2 1,056 ' $9 1,019 5 3 1,061

Abb. 14. Papierchromatographische Trennung von Aminosauren

Die Bestimmung wird auf papierchromatographischem Wege durchgeftihrt. Hierzu werden die Hydrolysate neutralisiert und auf ein bestimmtes Volumen gebracht ; davon werdcn 3,5 p1 der beschriebenen Pipette auf den Startpunkt des Papierstreifens gebracht. Da die zahlreichen .\minosauren nicht auf einem cinzigen Streifen zu trennen sind, werden mehrere beschickte Streifen mit dein optimalen Laufmittel Propanol/Wasser angesetzt. Diese Trennung fuhrt zu 0 Zonen, die jede fur sich mehrere Aminosauren enthalten. Nach Beendigung des Chromato- graphierens und der Trocknung wird ein Streifen cntwickelt. wahrend man auf den ubrigen Streifen die 6 Zonen der Aminosaurcgruppen markiert. Diese markierten Zonen werden ausgeschnitten und, wic bereits beschricben, ini Faltstreifen angereichert. Die angereicherten Zonen werden weiter aufgetrennt. Aus dem sauren Hydrolysat erhalt man in Zone 1 rnit Phe- nol/\Vasser unter Phosphat-Citrat-Pufferung die Aminosauren Asparagin, Cystin, Glutamin- same und Histidin, in Zone I1 Serin, Lysin, Glycin und Arginin, in Zone 111 - mit Butanol/ Methanol/Wasser - Thrconin und Alanin, wahrend in Zone IV als einzige Aminosaure Tyrosin auftritt. In Zone V findet man rnit dem Laufmittcl Butanol/Methanol/Wasser die Amino- sauren Prolin, Methionin. Wenylalanin und Valin, in Zone \'I Leucin und Isoleucin, die iuit Butanol/aIethylathylketon/Wasser erhalten xerden (Abb. 14). Die Ergebnisse stimmen rnit denen aus den alkalischen Hydrolysaten weitgehend ubcrein, nur erhalt man dort in Zonr 11

57'

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die Aminosauren Serin, Lysin und Glycin; in Zone IV findet sich das im Saurehydrolysat nicht vorhandene Tryptophan. Mit dieser Methode konnten im ErdnuDeiweiD Valin, Leucin, Iso- leucin, Threonin, Tyrosin, Arginin, Histidin, Lysin, Cystin und Phenylalanin aus dem sauren und Tryptophan aus dem alkalischen Hydrolysat bestimmt werden. Mit Hilfe des Mikrophoto- meters konnten die in Tab. 2 angefiihrten Aminosauren auch quantitativ bestimmt werden ; in dem untersuchten ErdnuDschrot sind samtliche lebenswichtigen Aminosauren - rnit Aus- nahme des Methionins, dessen Gehalt unter I % liegt - in ausreichender Menge vorhanden.

T a b e l l e 2 Quantitative Bestimrnung der Aminosauren in ErdnuDeiweiD

Aminosaure

Leucin Isoleucin Valin Threonin Methionin Tryptophan Cystin Phenylalanin Lysin Arginin Histidin Tyrosin

Extinkt. pg Amino%/ % A. im 5 p1 Hydr. Schrot

V.

Schon seit llngerer Zeit beschaftigt uns die Frage der Biosynthese der Aminosauren in Pilz- mycelen. Bei solchen 'L'ersuchen fand vor allem der EinfluD der Kulturbedingungen, der Niihr- stoffe und ihrer Konzeiitration sowie der Zusatzstoffe, insbesondere der Spurenelemente, Reachtung. Der interessante Befund, daD Schweine bei Fiitterung mit Pilzabfallen aus der Intibiotika-Erzeugung einen Fleischzuwachs bis zu 20% zeigten, legte die Vermutung nahe, cia8 dies auf das Vorkommen von Vitamin B,,, von Resten an Antibiotika und suf cine evtl. Sunstige Beeinflussung der Darmflora zuriickzufiihren ist. Untersuchungen meines Disser- tanten AKYURT [ 101 an dem zur Penicillinerzeugung verwendeten Penicillinm chrysogenzrm haben iiberraschenderweise ergeben, daB dieser Pilz - auch bei Kultur auf einfachster Nahr- losung mit .4mmoniumnitrat als Stickstoff- und Glucose als Kohlenstoffquelle - nicht weniger als 18 Aminosauren - darunter die in Tab. 3 unter I - 8 aufgefiihrten essentiellen Vertreter - im EiweiD enthalt. Verglichen mit dem von meinem Mitarbeiter STELZL untersuchten ErdnuD- schrot [ I I ] , enthalt dieses PilzeiweiD ein Mehr von 47qb Methionin, 31% Histidin, 44% Tyro- sin und 40% Cystin.

VI. Auch in der Fettanalyse laDt sich die Mikrochromatographie anwenden; als Beispiel sei der

Nachweis von Verfalschungen von Speiseolen angefiihrt. Von altersher ist in der Steiermark das Kiirbiskernol (Cucurbita fiefio) sehr beliebt, der in

seiner Placenta bis zu 300 Samen enthiilt. Neben Species mit beschalten Samen gibt es solche mit unbeschalten, und dieser olkiirbis wird in der Steiermark als Zwischenfrucht in den Mais- feidern oder an Wegrandern gepflanzt. 1st im Herbst der Mais abgeerntet, so liegen die Kur- bisse mit ihrer gelb und griin gefladerten Farbung auf den Feldern. Das Kiirbisfleisch dient als Futtermittel, wahrend die von der Placenta abgetrennten Kerne getrocknet und vor der Pressung bei go- I 10 O C gerostet, manchmal auch gesalzen werden. Nach dem Vermahlen werden sie entweder vom Bauern selbst in primitiven Pressen oder in 6lmiihlen kalt geprel3t.

Ftlikrochromatographie in dcr Lebensmittelchrmie 867

Der hohe Chlorophyllgehalt der auOeren Haut der unbeschaltcn Samen verleiht dem 81 eine ticfgriine, in der Aufsicht rot fluoreszierende Farbe. Durch die Rostung erzielt man nicht nur einen leicht nuDkernahnlichen Geschmack. sondcrn auch gute Haltbarkeit des oles; dadurch eriibrigt sich die Raffination und der volle biologische Wcrt bleibt erhalten. Der Preis des Kurbiskernoles liegt etwa 6mal so hoch nie der der landlaufigen Speiseole; nur etwa 500 t pro Jahr konnen aufgebracht werden, und zur Deckung des Bedarfes miissen auch auslan- dische Produkte, z. B. ungarische, jugoslawische und chinesische Kernc eingefiihrt und ver-

T a b e l l e 3 Konstituierende Aminosaurcn des Proteins

van Penicillium chrysogenum

I) Lysin 10) Asparaginsaure 2 ) Threonin I I ) Glutaminsaure 3) Valin 12) Cystin 4) Methionin 13) Glycin 5) Tryptophan 14) Alanin 6) Phenylalanin 15) Serin 7) Leucin 16) Arginin 8) Iso-Leucin 17) Prolin 9) Histidin 18) Tyrosin

arbeitet werden. Der hohe Preisunterschicd ist Ursache dafiir, daO sogar hochangesehcnc 01- miihlen auf raffinierteste Weise Verfalschungen durchgefiihrt haben. Sie kauften von den Bauern PreOkuchen, die noch etwa 17-207& Kiirbiskernol enthielten, vermahlten sie und versetzten das Pulver rnit Speiseol; dann wurde erneut gerostet und gepreBt. Das auf diesc Weise gewonnene Produkt ist in Farbe und Geschmack den unverfalschten 8len tauschend ahnlich. Der Nachweis der Verfalschungen ist mit den itblichen Kennzahlen nicht ausreichend beweiskriiftig. Wir venvendeten hier neben der Gaschromatographie unser Mikroverfahren. rnit dem es uns moglich ist, kleinste Mengen 81 rasch zu vcrseifen, die Fettsiluren freizulegen

Abb. 15. Papierchromatogramm der Fettsauren von Kiirbiskernol

und mit der besprochenen Technik auch anzurcichern. So gelang es, sogar Fettsauren in Mikrochromatogrammen festzustellen [IZ~, die bislang in Olen noch nicht bekannt waren. Bei diesen Untersuchungen kamen uns die von KAUFMANN u. a. [13] ausgearbeiteten, von uns gering abgewandelten Verfahrcn sehr zustatten ; wir hydrophobieren das Papier rnit Undecan. das rnit 96y6 Essigsaure gesattigt ist. Die Fettsauren des Kurbisdles licfern auf dem Papier- chromatogramm 3 Flecken (.4bb. 15) ; der oberste stellt die rnit 40,4- ~5,674~ vorkommende Linolsaure, der mittlere das kritische Paar 61-/Palmitins&ure und der unterste die Stearinsaure

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dar. Nach Anreicherung konnten wir dariiber hinaus mit Hilfe der Quecksilberseifen, die besonders auf ungesattigte Fettsauren ansprechen, noch die bislang nicht nachgewiesene Linolen- saure ermitteln und die in sehr geringer Menge vorkommende, von KAUFMANN u. a. [r4] auf- gefundene Arachinsaure mittels der Kupferseifen feststellen. Dies ist jedoch fur den Nacbweis von Verfalschungen ohne Relang.

Nachdem die isolierten Fettsauren des Ktirbiskernoles nur 3 Flecken ergaben, weist jeder weitere Fleck auf eine Verfalschung hin. Das Diagramm (Abb. 16) gibt die Moglichkeit zum qualitativen Nachweis von Fremdolen wieder. Rub- bzw. Rapsolzusatz l a B t sich durch das Auftreten eines weiteren Fleckes nachweisen, der der Erucasaure zuzuordnen ist. die bis zu 64% in diesem 61 vorhanden ist. So konnen rnit wenigen pg der Probe noch weniger als 2%

Erucnsaurc nachgewiesen werden.

Abb. 16. Vorkommen von Fettsauren in verschiedenen Olsamen

Schwieriger gestaltet sich die Erkennung von b i n - und Sojaol, da in beiden die Linolen- saure als einziges Kriterium vorliegt; sie kommt im Kurbiskernol allerdings nur in kleinen Mengen vor. Eine sichere Entscheidung wird hier durch die quantitative Messung der Flecken moglich. Sonnenblumen- und ErdnuDol lassen sich durch die Behen- und Lignocerinsaure- flecken, das ErdnuDol zusatzlich durch die Arachinsaureflecken nachueiscn. Dariiber hinaus kann man Baumwollsaatol durch die Myristinsaure erkennen. Hierbei ist allerdings erforder- lich, die mit ilir gemeinsam als kritisches Paar auftretende Linolsaufe zuvor auf dem Papier- streifen zu Stearinsaure zu oxydieren. Palmol unterscheidet sich einwandfrei durch die vorhandene Laurinsaure, die bis zu einem Zusatz von 5% nachweisbar ist.

VII.

W e schon verschiedentlich gezeigt wurde. lassen sich mit der Papierchromatographie auch Vitamine leicht isolieren und bestimmen. Arbeitet man mihochromatographisch, so kann man die interessierenden Vitamine mit geeignetcm Laufmittel innerhalb weniger Stunden isolieren und frei von storenden Substanzen quantitativ bestimmen. Fur die oft in sehr geringen AIengen vorliegenden Vertreter erwies sich die Anreicherungsmethode als besonders vorteilhaft; sie kann beliebig lange fortgesetzt werden, bis schlieDlich die quantitative Bestimmung mit dein Mikrophotometer oder auf titrimetrischem Wege moglich ist. So war es ein Leichtee, das so auflerordentlich stark auf Oxydation durch den Luftsauerstoff und auf hohere Tempc- raturen reagierende Vitamin C unter AusschluW aller storenden Faktorcn in Citrusfruchten, Paprika, Bananen usw. mit den in denLiteratur bekannten Laufmitteln zu isolieren und quantitativ zu bestimmen. Besonders bewahrt hat sich das Laufmittel n-Butanol/Wasser mit rinem Zusatz von a%iger Oxalsaure und einer Spur Kaliumcyanid. Die Oxalsaurc wird wirk- sa.m durch Verschiebung des pH-Wertes ins saure Gebiet, das Kaliumcyanid durch IComplex- bildung mit Metallspuren (Kupfer, Eisen usw.) wodurch der Zerstorung des Vitamin C uahrend des Chromatographierens begegnc', wird. Um Luft und Licht auszusclilieDen bedientcn wir uns gceigneter, zum Teil von uns konstruierter Zerkleinerungs- und Extraktionseinrichtungen [15]. So gelang es. ein zuverl2ssiges Mikroverfahren auszuarbeiten, bei dem wenigcr als 0.5 g der Probe ausreichen. Fur das Aultragcn auf d v n i Startpunkt des Chromatogrammes benotigt

Mi krochromatographie in der Lebensmittelchemie 869

nian jeweils 5 - 10 pg, zum Anreichern auf mehrercn Papierstreifen je nach Gehalt entsprechend mehr.

Wahrend die Extrakte aus Fruchten mit VitaminC direkt fiir das Chromatographieren und die Anreicherungstechnik verwendet werden kiinnen, ist dies bei Losungen mit vie1 EiweiD, Lipoid und auch Zucker nicht moglich. Dafiir hat mein Mitarbeiter SCHANDROCH [16] eine hfikrotrennshle entwickelt, rnit deren Hilfe nur die wasserloslichen Stoffe abgetrennt werden. Abb. I 7 gibt den Aufbau einer solchen Apparatur wieder, mit der man aus Rohhydrolysaten

Abb. I 7. Mikrotrennsaule zur Anreicherung wasserloslicher Stoffe

Abb. 18. Test-Tube-Chromatographie \-on Testsubstanzen cler Vitaminc B,, B,, B, und 1’-l’

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Vitamine abtrennen und an der Spitze anreichern kann. Auf diese Weise haben wir den Vitamin-B-Komplex aus OlpreBkuchen und aus Leber isoliert und qualitativ wie quantitativ papierchromatographisch rnit den aus der Literatur bekannten Spruhreagenzien im sicht- baren und ultravioletten Licht bestimmt. Abb. 18 zeigt die Chromatogramme von 4 Test- vitaminen ; hierbei wurde das von RADHAKRISHNAMURTHY [17] angegebene Laufmittel n-Butanol/Methanol/Benzol/Wasser (2 : I : I : I) verwendet; die Laufzeit betrug 2 h.

VIII .

Zum SchlnB sei auf die Moglichkeit der Abtrennung von Nikotin bzw. Coffein, Theophyllin und Theobromin aus Naturprodukten hingewiesen. Fur die Nikotinbestimmung in Tabaken entwickelten wir eine sehr einfache Mikromethodik[18], fur die nur 10 mg Substanz erforder- lich sind. Der Tabak wird pulverisiert, mit 50 p1 Ioyoiger Natronlauge angefeuchtet und schlieSlich mit einem mit Wasser gesattigten Ather-Petrolather-Gemisch im verschlossenen Schliffspitzbecher unter ofterem Umschiitteln extrahiert. Dieser Auszug wird auf ein bestimmtes Volumen gebracht; er kann direkt mit kalter Luft am Startpunkt auf dem An- reicherungsblock konzentriert werden, ohne daB man einen Verlust an Nikotin befurchtcn muS.

Als Laufmittel hat sich nach Angaben des Schrifttums sowie nach eigener Erfahrung ein Gemisch von Butanol/Eisessig/Wasser (go: 10: 20) bewiihrt. Fur das auf diese Weise isolierte Nikotin konnte ein konstanter Rf-Wert von 0,47 bestimmt werden. Fur die Markierung des Nikotins auf dem Chromatogramm venvendeten wir Benzidin, das nach dem Besprtihen rnit Bromcyan aufgedampft wird. Es entsteht ein roter Fleck hoher Bestandigkeit. Die Er- fassungsgrenze lie@ mit 0,05 pg erstaunlich niedrig. Zur quantitativen Bestimmung verwendeten wir wie iiblich mehrere Streifen; die Abschnitte werden wieder rnit Petrolather/ Ather extrahiert, der Extrakt nach WERLE u. a. [IS] rnit Anilin-Bromcyan, einem Gemisch, das bei Einhaltung eines pH-Wertes von 6,1 eine fur die Photometrierung gentigend konstante Farbung ergibt, versetzt und im Mikrophotometer photometriert. Diese Methodik ermoglicht auch die Verwendung vie1 kleinerer Probenmengen, so daB auf diese Weise topographische Analysen durchgefuhrt werden konnen, um bei Zuchtnngsversuchen den Nikotingehalt winzig kleiner Blattabschnitte zu ermitteln.

Fur die Bestimmung der Alkaloide in Kaffee. Tee und Coca Cola stehen etliche FlieSmittel zur Verfiigung, von denen die Mischung Butanol/Athanol/Wasser (45 : 5 : 50) gtinstige Rf- Werte ergibt und so die einwandfreic Trennung von Coffein (Rf = 0,72), Theophyllin (Rf = 0,63) und Theobromin (Rf = o&) ermoglicht [zo]. Zur Markierung der Flecken werden in der Literatur mehrere Reagenzien vorgeschlagen, von denen das modifizierte DRAGENDORFF- Reagens nach R. OTT [ZI] die besten Ergebnisse lieferte; es ergibt auf dem Chromatogramm orangerote Flecke auf dunkelgelbem Grund. Die quantitative Bestimmung des Coffeins haben wir rnit unseren Mikroeinrichtungen titrimetrisch rnit Nitromethan-Acetanhydrid vorge- nommen. Dabei konnten wir 10 pg Coffein, das nach unserem Verfahren aus Kaffee-, Tee-, Coca Cola-Extrakten bzw. -aufgussen isoliert und angereichert wurde, rnit einem Fehler von 3 -5% bestimmen.

L i t e r a t u r

[I] GORBACH, G. : ,Mikrochemisches Praktikum' ; Springer-Verlag, Berlin-Gottingen-Heidel- berg 1956.

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Gottingen-Heidelberg ~ 9 5 8 .

Prof. Dr. Ing. G. GORBACH, Institut ft\r biochemische Technologic, Lebensmittelchemie und Mikrochemie, So10 Graz, Schl6gelgasse 9, Osterreich.

Eingegangen 8. 6. 1968.

die mikrochromatographie in der lebensmittelchemie

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