Diferenciacion y deteccion de microorganismos usando espectroscopía fotoacústica infrarroja con transformada de Fourier

La espectroscopia fotoacustica infrarroja con transformada de Fourier (FTIR-PAS) fue usada para diferenciar e identificar microorganismos en la superficie de algún alimento (manzana). Los microorganismos considerados van desde bacterias (Lactobacillus casei, Basillus cereus y Escherichia coli), levaduras (Saccharomyces cerevisiae) y hasta hongos (Aspergillus niger y Fusarium verticilliodes). Un análisis discriminador servía para diferenciar a las manzanas contaminadas con microorganismos de las que no lo están. Se calcularon las distancias de Mahalanobis para cuantificar las diferencias. Cuanto mayor sea el valor métrico de Mahalanobis entre los diferentes microorganismo, mayores son sus diferencias. Adicionalmente fue posible diferenciar la E. coli patogénica de las cepas no patógenas. Resultados demuestran que la espectroscopía FTIR-PAS tiene el potencial para llegar a ser una herramienta de análisis no destructiva en la investigación relacionada con la seguridad alimentaria.

1. Introducción

La determinación microbial es una consideración primaria con respecto a la seguridad y calidad del alimento en el proceso, venta por menor, o en el entorno de producción. Metodos convencionales de diferenciación dependen de ensayos serológicos o bioquímicos que involucran realizar un cultivo en un agar especial, o un caldo, por varios días y luego realizar un test especial para determinar la presencia de ciertos tipos de bacteria. El riesgo que tiene tal retraso de la determinación puede posiblemente disuadir la intervención oportuna y la medida correctora apropiada para contrarrestar la contaminación en el alimento. Por lo tanto, una proyección rápida de microorganismo en los productos alimenticios podría ser una esencial y valiosa herramienta para la industria de la comida.

Con la mejora de la instrumentación analítica, la Espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier (FTIR), ha sido aplicada para diferenciar químicamente células microbianas sin destruirlas, con procesos complejos, podemos obtener las distintas huellas digitales bioquímicas de bacterias diferentes, de manera reproducible. FTIR ha sido usada por Naumann y sus colaboradores para clasificar microorganismos. Los autores han demostrado su capacidad de discriminar y clasificar células microbiales a nivel de cepa. Naumann caracterizó el espectro infrarrojo de bacterias en 5 areas espectrales o ventanas (W1-W5), las que son potencialmente informativas para la identificación bacteriana. Estas ventanas espectrales están asociadas a grupos químicos específicos de los diferentes campos bacterianos. Los factores críticos en el FTIR microbial de acuerdo a los autores es el pre tratamiento de los datos, selección de la longitud de onda por una extracción

algorítmica característica, tipo de red y la función de aprendizaje utilizada para la formación de ANN.

FTIR-PAS ha sido usada para obtener huellas digitales químicas de la superficie de la comida y de las capas que subsiguientes con mínima o ninguna preparación de la muestra. FTIR-PAS se basa en el efecto fotoacustico que es causado cuando un haz infrarrojo modulado incide sobre la superficie de una muestra en un ambiente sellado. La señales fotoacustica proporcionales a la presión de oscilación, debido a un proceso de desexcitacion no radioactivo correspondiente del haz infrarrojo modulado, pueden ser detectadas por un micrófono selectivo y tranferido a un espectro adecuado por una conversión A/D. FTIR-PAS espectroscopia ha sido utilizada para determinar directamente la contaminación fungica en la superficie del maíz. El espectro FTIR-PAS del maíz con o sin hongos fueron divididos en 2 areas distintivas para identificación. Las regiones del espectro fueron identificadas y comparadas con la composición química relativa del maíz y de los hongos. Un modelo ANN fue entrenado para distinguir un maíz contaminado de otro no contaminado con un patrón de reconocimiento. Los resultados demostraron que FTIR-PAS con su capacidad de análisis multicomponente era más confiable que el método del brillo fluorescente amarillo verdoso. En otro experimento, la biomasa de proteínas de E. coli y S. cerevisiae fueron medidas con FTIR-PAS desde microorganismos secos puestos sobre un filtro. El incremento de la biomasa proteica, en el periodo de crecimiento de los microorganismos, fue detectada gracias a la espectrografía FTIR-PAS.

El trabajo propuesto es una de las primeras aplicaciones de FTIR-PAS para distinguir y caracterizar microorganismos en la superficie de los alimentos. El enfoque global de la investigación era explorar el concepto de exanimación directa de la piel de la manzana para comprobar contaminación por microorganismos con FTIR-PAS. El objetivo especifico era (1) caracterizar y discriminar la piel de la manzana con diferentes contaminaciones por microorganismos, (2) caracterizar superficies de la fruta con diferentes cepas de E. coli, y (3) diferenciar cepas patógenas (OH157:H7) de las no patógenas (JM101, JM107, HB101, K12, y DH5α).

2. Experimental2.1. Preparación de las muestras.

Los microorganismos en estudio fueron S. cerevisiae (ATCC 24859), Lactobacillus casei (ATC 11443), Bacillus cereus (NRRLB-3711), Escherichia coli (JM101, JM107, HB101, K12, DH5α y OH157:H7), Aspergillus niger (NRRL 326) y Fusarium verticilliodes (NRRL 13586).

Cultivos congelados se descongelaron para que los microorganismos crecieran en su respectiva media (Tabla 1). Los cultivos crecidos se centrifugaron a 5000rpm por 15 minutos, y lavados dos veces con agua destilada. Las muestras de F. verticillioides fueron cosechadas desde 10 dias en un cultivo inclinado de un plato con agar dextrosa patata que fueron incubados a 25°C, suspendidos en agua destilada esteril. La concentración de microorganismos fue presentada como densidad óptica celular medida con un espectometro Bausch and Lomb 20, espectrofotómetro de 620nm (tabla 2). La piel de manzana fue seccionada desde una manzana a temperatura ambiente en la misma habitación y los microorganismos fueron suavemente untados y usados para medidas.

2.2. Medición FTIR-PAS

Un espectrómetro FTIR-PAS Bio-Rad 6000 FTS (Cambridge, MA) con un demodulador Bio-Rad y una celda fotoacustica helio-purgada (Modelo MTEC 100 PA Ames, IA) fue usado. El espectrómetro contiene una fuente cerámica enfriada de Mid-IR y un divisor del haz de KBr. Un modelo de generador purgado con gas modelo 75-52 (Whatmann, Inc., Haverhill, MA) fue usado para proveer CO2 y H2O

libre en aire seco al interferómetro. El interferómetro puede actuar de formade escaneo rápida o a paso. Un carbono negro de referencia fue usado para recoger el respectivo espectro de referencia para la intensidad de espectro normalizado. Alicuotas de suspensiones microbiales resuspendidas fueron igualmente puestas en la superficie de la fruta, mantenidas a la temperatura de la habitación para equilibrar, y luego usadas para análisis espectroscópico. Las celdas de acero inoxidable PA con secciones pequeñas de muestra (3x3mm) fue purgada con helio por 5 minutos para proveer CO2 y humedad al ambiente libre. El espectro fue recogido a una alta velocidad de escaneo de 5KHz, una resolución de 16cm-1, a 256 scans/muestra. El experimento fue realizado 10 veces.

2.3. Analisis quimiometrico

Analisis de componente principal (CP) y variable canonica aleatoria (CV) fueron aplicados a los espectros obtenidos de los experimentos de caracterización microbial. Software WINDAS (Wiley, CHichester, UK) fue usado para un análisis discriminante. En general, las combinaciones de líneas pesadas del espectro están estructuradas para maximizar las diferencias entre los grupos supuestos, relativo a sus varianzas. Las combinaciones lineares de varianzas, conocidas como variantes canonicas, se trazan para agrupar los datos en diferentes grupos basados en similitudes espectrales. La distancia Mahalanobis (DM) definida por la matiz Eq 1 fue usada para un análisis discriminante. En

notación vectorial la distancia Mahalanobis, DM entre la observacion “jth” “xj” y el grupo central “kth” “µk” está dada por:

Donde xj y µk son ambos vectores de fila (1xr) y W es el promedio “dentro del grupo” de la matriz de convarianza, calculado separadamente para cada grupo, y T es el transpuesto. Por lo tanto, si hay “g” grupos entonces W esta dado por:

Aquí nk es el número de observaciones y sk es la matriz de covarianza de grupo kth.

3. Resultados y discusión

En el primer paso, las manzanas untadas con hongos y bacterias, fueron analizadas para demostras si el FTRI-PAS podía diferenciar entre los distintos tipos de microorganismos. FTRI-PAS de la superficie pura de la manzana junto a los diferentes tipos de microorganismos son mostrados en la figura 1. Los peaks mas alto que representan la piel de la manzana pueden observarse a 3372cm-1 (extensión OH) 2928 y 2856 cm-1 (extensión CH) 1732cm-1 (Extension CO) 1557 cm-1 (extensión CO y CH anillos) 1466 cm-1 (flexión CH). La asignación de peak en FTRI-PAS fue consistente con las asignaciones dadas por Silverstain y Webster. La apariencia visual del espectro de las manzanas con microorganismo es similar a la de las manzanas sin ellos. Sin embargo, en una inspecion más cercana se divisan pequeñas diferencias de los espectros de los diferentes microorganismos. Por lo tanto, una interpretación más de la complejidad, aún, cuando espectros similares usualmente requieren la aplicación de técnicas de multivariables estadística.

Cuando el análisis discriminador fue aplicado para analizas espectros FTRI-PAS de diferentes microorganismos, las elipses de los grupos en la figura 2 muestra el 95% de región de confianza para cada grupo. En este estudio, el 100% de las clasificaciones fueron logradas sin considerar las regiones de superposición. La figura 2 gráfica el resultado obtenido luego de un análisis discriminante basado en los dos primeros valores de variantes canonicas (CV) mientras que la distancia Mahalanobis (DM) entre los medios de diferentes tipos de microorganismos están puestas en la tabla 3. El valor DM mas grande es la diferencia mayor entre los diferentes grupos. De DM métrico indica la extensión de las similitudes o disimilitudes de los diferentes grupos de microorganismos. Consecuentemente, menor distancia mayor similitud y mayor distancia mayor disimilitud. Comparando la figura dos y la tabla 3 se puede notar que L. casei y la superficie pura están muy lejanos y por consecuencia tienen los valores DM mayores de 11.25. La segunda distancia mas grande es entre E. coli HB101 y la superficie pura de 9.15. La S. cerevisiae y E. coli HB101 estan muy cercas con la DM más baja, 4.36, por lo tanto se sobreponen significativamente. DM entre E. coli HB101 y L. casei es de 4.69.

El análisis demostró que la piel de las manzanas puras puede ser diferenciada de la que se encontraba contaminada con microorganismos. (Figura 2 y Tabla 3). Esta clasificación de datos FTRI-PAS usando grupos puede ser usada no solo puede ser una herramienta útil no solo para cuantificar diferencias sino que también similitudes entre materiales biológicos. La técnica FTRI-PAS con un apropiado técnica de análisis puede ser utilizada para diferencias una amplia variedad de microorganismos y contaminación en la superficie del alimento siempre y cuando esté bien calibrada. Sin embargo, es necesario

realizar una gran formación de test con diferentes superficies de alimentos y microorganismos.

En el segundo paso, FTRI fue usado para examinar diferentes tipos de cepas de E. coli incluyendo la patogenica OH157:H7 JM101 y las no patogenicas JM107, HB101, K12 y DH5α. Fig. 3 muestra el espectro de diferentes cepas de E. coli en la superficie de las manzanas junto con el de una manzana pura junto con los peaks claves discutidos en la figura 1 .

Figura 4 muestra la clasificación de las cepas de E. coli no patógenas y la figura 5 la clasificación de las patogénicas junto a las no patógenas. Los peaks en la figura 4 son similares a los de la figura 1, sin embargo, se observaron ligeros cambios en la región indicada. Evaluaciones adicionales requieren el uso de métodos estadísticos. La DM métrica en la tabla 4 cuantifica las diferencias entre las diferentes cepas bacterianas. Es de notar que la separación más grande fue obtenida entre E. coli O157:H7 patogenica y las cepas no patogénicas consideradas (indicado por las DM altas en la columna 6 de la tabla 4). La figura 5 muestra clarmente la separación de los grupos. Las similitudes entre las E. coli no patogénicas (JM107, HB101, K12 y DH5α) se observa en los grupos e la figura 4. DM entre las diferente E. coli no patogénicas (columna 5 tabla 4) es mucho mas pequeña comparada con la distancia de E. coli O157:H7 patogenica (columna 6 tabla 4). Los resultados mostrados, muestran un novedoso y único enfoque para diferenciar diferentes cepas de microorganismo incluyendo patogénicas y no patogénicas, en la superficie de los

alimentos con pruebas directas usando espectroscopia FRTI-PAS. Los resultados se muestran prometedores y con un potencial excelente en la seguridad de los alimentos y estudios de calidad.

4. Conclusión

Hemos demostrados que FRTI-PAS con análisis multivariado puede ser usado para discriminar los microorganismos que contaminan la superficie de una manzana. Discriminación de E. coli patogénica y no patogénica con pruebas no destructivas fue exitosamente demostrado con FRTI-PAS y quimometrica. Con pruebas y análisis extensivos, el procedimiento tiene el potencial de convertirse en una herramienta rápida, no destructiva, para la identificación y clasificación de bacterias en un sistema alimentario.