Důležité termíny enzymologie

Pavel Jirásek

Charakteristika enzymů

• biokatalyzátory umožňující průběh chemických reakcí v živých organismech – tj. za mírných podmínek – poměrně nízké teploty,

atmosférický tlak, hodnoty pH blízké 7 – bez enzymů by reakce probíhaly stokrát až milionkrát

pomaleji – při reakcích se nespotřebovávají

• snižují hodnotu aktivační energie reakce – Ea = minimální energie potřebná k převedení látky do

stavu schopného chemické reakce (přiblížení molekul, zeslabení starých vazeb a vytvoření předpokladu pro vznik nových)

Charakteristika enzymů II

– vytvoření jednoho nebo několika přechodných stavů mezi substrátem a enzymem, z nichž každý má podstatně nižší hodnotu aktivační energie (dosažitelnou i za mírných podmínek)

Charakteristika enzymů III

• zvyšují rychlost reakce

– v = úbytek koncentrace reaktantů nebo přírůstek koncentrace produktů za jednotku času (mol/l/s)

• neovlivňují chemickou rovnováhu

– pouze zkracují čas nutný k jejímu dosažení

• snadno regulovatelné – viz dále

Struktura enzymů • globulární bílkoviny, často obsahující ještě

nebílkovinnou složku – výjimku tvoří některé druhy RNA s katalytickou funkcí

(ribozymy)

• dělení – jednoduché

• čisté bílkoviny – např. hydrolázy (pepsin, trypsin…)

– složené • bílkovinná část (apoenzym) • nebílkovinná část (kofaktor)

– koenzym » vázán pouze slabými vazebnými interakcemi – větš. deriváty

vitaminů – prostetická skupina

» kovalentní vazba – ionty kovů, hem, FAD…

• aktivní komplex apoenzym + kofaktor = holoenzym

Aktivní místo (centrum) enzymu • místo na enzymu, do kterého se váže substrát

– téměř vždy pouze slabými vazebnými interakcemi (kovalentní vazba vzácná)

– vazebné skupiny – spojení se substrátem – obvykle nepolární – katalytické skupiny – vlastní katalýza – obvykle polární

• teorie zámku a klíče – substrát je klíč, který zapadne jen do správného zámku (enzymu s

vhodným tvarem aktivního centra)

• teorie indukovaného přizpůsobení – novější – substrát je do jisté míry schopen měnit konformaci enzymu – tvar substrátu se někdy přizpůsobuje enzymu

Enzymy s kvarterní strukturou

• enzymy složené z několika podjednotek spojených slabými vazebnými interakcemi – podjednotky se mohou vzájemně ovlivňovat

• různá specifičnost podjednotek – mohou vázat rozdílné substráty – katalytické podjednotky

• zajišťují samotnou katalýzu

– regulační podjednotky • vazba aktivátorů, inhibitorů

• např. synthasa mastných kyselin – jeden polypeptidický řetězec složený ze 2 podjednotek

schopný katalyzovat všechny kroky syntézy MK

Specifita enzymů • substrátová

– závisí hlavně na bílkovinné části – absolutní – jen jeden substrát – vzácná - např. ureasa – relativní – častější – více substrátů s různou afinitou

• substráty s podobnou strukturou – např. členové jedné homologické řady

• např. alkoholdehydrogenasa

• kinetická – závisí hlavně na koenzymu, některé parametry však

ovlivňuje i bílkovinná část (např. redoxní potenciál enzymu)

– určuje typ reakce • u aminokyseliny může podle typu koenzymu dojít k oxidační

deaminaci, transaminaci, dekarboxylaci… • skupina proteas štěpí vždy peptidovou vazbu, ale na různém

místě

• stereospecifita – enzym napadá pouze jeden určitý stereoizomer – D-

monosacharidy, L-aminokyseliny… – substrát se musí specificky vázat alespoň na tři různá

místa, druhý stereoizomer toho schopen není

Izoenzymy • katalyzují stejnou reakci, ale liší se svými fyzikálně-

chemickými vlastnostmi – rozdílná afinita k substrátu – odlišné pH optimum, citlivost k denaturaci, citlivost k

inhibitorům…

• nacházejí se v různých kompartmentech nebo tkáních • pravé izoenzymy

– kódované různými geny

• izoformy – vznikají různou posttranslační modifikací

Druhy enzymů

• intracelulární – pro vlastní potřebu buňky

• extracelulární – pro katalýzu reakcí probíhajících mimo buňku, kterou

byly vytvořeny

– často syntetizovány v neaktivní formě jako proenzymy (zymogeny) • faktory krevního srážení se aktivují až parciální proteolýzou

• pepsin se aktivuje až při nízkém pH (HCl v žaludeční šťávě)

• trypsin aktivuje až enteropeptidáza na kartáčovém lemu tenkého střeva

Názvosloví enzymů

• systematický název – přesný popis katalyzované reakce

• doporučený název – jednodušší než systematický, obvykle označení substrátu a

typu reakce + koncovka –áza - např. alaninaminotransferáza)

• triviální název – některé historické názvy – koncovka –in – např. pepsin

EC klasifikace

• každý enzym má svůj čtyřciferný číselný kód – třída, podtřída, podpodtřída, pořadové číslo v

oficiálním seznamu

• 6 tříd podle typu katalyzované reakce – EC1.x.x.x – oxidoreduktázy

– EC2.x.x.x – transferázy

– EC3.x.x.x – hydrolázy

– EC4.x.x.x – lyázy (syntázy)

– EC5.x.x.x – izomerázy

– EC6.x.x.x – ligázy (syntetázy)

Oxidoreduktázy • katalyzují redoxní reakce • přenášejí vodík nebo kyslík nebo pouze elektrony z jedné

látky na druhou – dehydrogenáza

• katalyzuje odebrání vodíku ze substrátu (H nebo H-), který je tak oxidován

• desaturáza – HC2-CH2- → -CH=CH- (metabolismus MK)

– reduktáza • katalyzuje přenos vodíku na substrát, tj. redukci substrátu

– oxidáza • katalyzují přenos elektronů ze substrátu na kyslík

– peroxidáza • oxidace různých látek za přítomnosti H2O2, který funguje jako akceptor

vodíku, resp. jako zdroj kyslíku a mění se tak na vodu

– oxygenáza • zabudovává atom (monooxygenáza = hydroxyláza) nebo molekulu

kyslíku (dioxygenáza) do substrátu

Kofaktory oxidoreduktáz • NAD+/NADH+H+

NADP+/NADPH+H+ – koenzym, přenos H++2e- – prekurzorem je vit. B3 (niacin) – NADH+H+ přenáší redukční ekvivalenty z katabolických

metabolických drah do dýchacího řetězce; NADPH+H+

funguje jako redukční činidlo při biosyntézách

Pi

Kofaktory oxidoreduktáz II • FMN/FMNH2 (flavinmononukleotid) FAD/FADH2 (flavinadenindinukleotid)

– prostetická skupina, přenos 2H+ + 2e- – prekurzorem je vit. B2 (riboflavin) – funkčně srovnatelné, součást tzv. flavoproteinů - přenos

redukčních ekvivalentů z katabolických drah do dýchacího řetězce a další redoxní procesy (FADH2), dýchací řetězec (FMNH2)

Kofaktory oxidoreduktáz III

• ubichinon/ubichinol (CoQ/CoQH2)

– koenzym, přenos 2H+ + 2e-

– z části syntetizován, z části přijímán potravou

– přenašeč redukčních ekvivalentů v dýchacím řetězci

Kofaktory oxidoreduktáz IV • kyselina lipoová

– prostetická skupina, přenos 2H+ + 2e-

– vnitromolekulový disulfidický můstek → redukce na dithiol

– účastní se hlavně oxidativní dekarboxylace α-ketokyselin (součást např. pyruvátdehydrogenázového komplexu)

Kofaktory oxidoreduktáz V

• hem

– prostetická skupina, přenos e- (Fe2+↔Fe3+)

– několik tříd hemů (a,b,c) lišící se substituenty

– dýchací řetězec, monooxygenázy, peroxidázy

Transferázy

• katalyzují přenos funkčních skupin mezi donory a akceptory – skupinatransferáza (např. aminotransferáza) – kináza = fosfotransferáza

• přenáší fosfátovou skupinu z makroergní molekuly (např. ATP) na substrát

– fosforyláza • přenáší fosfátovou skupinu na organickou látku – obvykle se

fosforylázou myslí glykogenfosforyláza, která využívá volný fosfát k štěpení vazeb v glykogenu (→Glc-1-P)

– transketoláza • přenášejí dvouuhlíkaté zbytky, pentózový cyklus

– transaldoláza • přenášejí tříuhlíkaté zbytky, pentózový cyklus

Kofaktory transferáz

• koenzym A (CoA)

– přenáší acylové zbytky, thioesterová vazba

– prekurzorem je vit. B5 (kyselina pantothenová)

– metabolismus živin

Kofaktory transferáz II

• thiamindifosfát (TPP)

– přenáší hydroxyalkylové zbytky

– prekurzorem je vit.B1 (thiamin)

– účastní se oxidativní dekarboxylace α-ketokyselin , součást transketoláz

Kofaktory transferáz III

• pyridoxalfosfát

– přenáší aminoskupiny

– prekurzorem je vit. B6 (pyridoxin)

– metabolismus aminokyselin (transaminace, dekarboxylace…); glykogenfosforyláza

Kofaktory transferáz IV

• biotin

– přenáší CO2

– vit. H (B7)

– kofaktor všech karboxyláz

Kofaktory transferáz V

• S-adenosylmethionin (SAM)

– přenáší methylové zbytky

– methylační reakce

Kofaktory transferáz VI

• tetrahydrofolát – přenos jednouhlíkatých zbytků v různých oxidačních

stavech

– prekurzorem je kyselina listová

– syntéza nukleotidů, metabolismus některých aminokyselin

Kofaktory transferáz VII

• nukleosidfosfáty (ATP, GTP…)

– přenos fosfátu (Pi)

– endergonické reakce

• 3-fosfoadenosin-5-fosfosulfát (PAPS)

– přenos sulfátu (SO42-)

– syntéza GAG, biotransformační reakce

Hydrolázy

• katalyzují hydrolytické reakce – štěpí substráty za vstupu vody – esteráza

• štěpí esterovou vazbu • R1-CO-O-R2 → R1-COOH + HO-R2

– fosfodiesteráza • štěpí fosfodiesterovou vazbu

→ R1OH + Pi-R2

– fosfatáza • odštěpuje fosfát • Pi-O-R → Pi + HO-R

– peptidázy, glykosidázy, lipázy…

Lyázy

• katalyzují nehydrolytické štěpení vazeb v substrátu

• jestliže lyasa katalyzuje reakce ve smyslu syntézy, nazývá se syntáza

• přidávají nebo odebírají malou molekulu do/ze substrátu – hydratázy

• adice vody • -CH=CH- + H2O → -CH(OH)-CH2-

– dehydratázy • eliminace vody

– dekarboxylázy • koenzymem dekarboxyláz bývá pyridoxalfosfát

Izomerázy

• katalyzují izomerační reakce

– cis-trans izomerázy

– epimerázy

• epimerizace monosaridů (epimer se liší konfigurací na jednom uhlíku )

– mutázy

• změna polohy fosfátové skupiny v molekule

Ligázy

• katalyzují silně endergonní slučování dvou molekul za současné spotřeby energie (hydrolýza ATP)

– příklady:

• pyruvátkarboxyláza

• acetyl-CoA karboxyláza

– koenzymem obou karboxyláz biotin

• glutaminsyntetáza

Určete třídu enzymu

• aspartátaminotransferáza (AST) – transferáza

• alkalická fosfatáza (ALP) – hydroláza

• kreatinkináza (CK) – transferáza

• laktátdehydrogenáza (LD) – oxidoreduktáza

• alaninaminotransferáza (ALT) – transferáza

• lipáza (LPS) – hydroláza

Rychlost enzymově katalyzovaných reakcí – aktivita enzymu

• udává schopnost enzymu přeměnit substrát za jednotku času

• katal(kat) = přeměna 1 mol substrátu za 1 s

– v medicíně se běžně používají μkat a nkat

• mezinárodní jednotka: U = přeměna 1 μmol substrátu za 1 min

• 1 katal = 6.107 U

Faktory ovlivňující rychlost enzymatických reakcí

• teplota

– zvyšuje počet molekul schopných reakce

• vyšší kinetická energie částic

• vyšší počet srážek

• více molekul překoná Ea

– pro každý enzym však existuje teplotní limit, pak nastává denaturace bílkovinné složky a ztráta katalytické aktivity

Faktory ovlivňující rychlost enzymatických reakcí II

• pH – závisí na něm disociace funkčních skupin enzymu a

substrátu – každý enzym má svoje pH optimum

• většinou v rozmezí pH 5-9

– extrémní hodnoty pH způsobí denaturaci enzymu a ztrátu jeho katalytické aktivity

Faktory ovlivňující rychlost enzymatických reakcí III

• množství substrátu a afinita enzymu k substrátu

– S + E ↔ ES ↔ P + E

– s rostoucí koncentrací substrátu roste rychlost reakce k maximální hodnotě (vmax), dokud není enzym substrátem plně nasycen

Rovnice Michaelis-Mentenové

• v – rychlost reakce

• vmax – maximální rychlost reakce při úplném nasycení enzymu substrátem

• [S] – koncentrace substrátu

• KM – Michaelisova konstanta – koncentrace substrátu, při které je rychlost rovna ½ vmax

– informuje o afinitě substrátu k enzymu (jak snadno se substrát váže do aktivního místa enzymu) • nepřímá úměra

– běžné enzymy mají hodnotu KM v rozmezí 10-3-10-7 mol/l

• enzym č.2 má nižší hodnotu KM a tedy vyšší afinitu k substrátu

Faktory ovlivňující rychlost enzymatických reakcí IV

• počet molekul enzymu – s rostoucí koncentrací enzymu se rychlost reakce

zvyšuje • pro počáteční rychlosti platí přímá úměra (dokud je rychlost

zpětné přeměny P na ES zanedbatelná)

– regulace • kompartmentace

– v různých kompartmentech odlišný počet molekul enzymu

• změna absolutní koncentrace enzymu – indukce nebo represe exprese genu kódujícího daný enzym –

transkripční faktor

– trvá déle než se projeví (hodiny, dny)

• modulace aktivity již nesyntetizovaného enzymu – aktivace /inhibice např. fosforylací/defosforylací; odbourání

enzymu…

Faktory ovlivňující rychlost enzymatických reakcí V

• přítomnost aktivátoru – aktivuje neaktivní proenzymy

– parciální proteolýza • odštěpí se část molekuly proenzymu → aktivní enzym

– alosterická aktivace • nutná přítomnost alosterického centra

• navázání aktivátoru do alosterického centra způsobí příznivou deformaci aktivního centra → umožní navázání substrátu

• křivka alosterických enzymů je sigmoidální

• přítomnost inhibitoru

Inhibice enzymů

• kompetitivní – inhibitor má podobnou strukturu

jako přirozený substrát, váže se do aktivního centra enzymu

– inhibitor „soutěží“ se substrátem o aktivní centrum

– přítomnost kompetitivního inhibitoru zvyšuje KM → snižuje afinitu enzymu k substrátu

– zvýšenou koncentrací substrátu lze inhibitor vytěsnit (rychlost vmax se nemění)

– např. inhibice alkoholdehydrogenázy methanolem

Inhibice enzymů

• nekompetitivní – inhibitor není strukturně podobný

substrátu, váže se mimo aktivní místo

– navázání inhibitoru deformuje aktivní centrum enzymu

– dochází ke snížení vmax (snížila se koncentrace molekul enzymu schopných katalýzy)

– nelze potlačit zvýšenou koncentrací substrátu (KM se nemění)

– vratná pouze pokud se inhibitor neváže na enzym kovalentně

– např. sarin (nervový jed) nevratně inhibuje acetylcholinesterázu

Principy regulace enzymové aktivity v metabolických drahách

• regulace zpětnou vazbou – meziprodukt nebo konečný produkt metabolické dráhy

inhibuje jednu z prvních reakcí • např. palmitoyl-CoA inhibuje Ac-CoA karboxylázu

• zkřížená regulace – meziprodukt jedné metabolické dráhy ovlivňuje jinou

metabolickou dráhu • např. malonyl-CoA inhibuje karnitinový přenašeč a tím i degradaci

MK – zabezpečuje, aby současně neprobíhala degradace i syntéza

• regulace krokem vpřed – meziprodukt ovlivňuje jeden z následujících enzymů

metabolické dráhy • např. jeden z prvních produktů v syntéze nukleotidů aktivuje

následující enzymy – zajišťuje, aby dráha proběhla celá

Enzymy jako markery poškození určité tkáně

• při poškození tkáně se enzymy uvolní do extracelulárního prostředí

• jejich aktivitu lze měřit v krvi

• aktivita je mírou poškození tkáně, která je pro enzym specifická

• játra a žlučové cesty – ALT (alaninaminotransferáza)

• katalyzuje přenos aminoskupiny z alaninu na 2-oxoglutarát

• cytosolický enzym

• zvýšená hladina při poškození buněčné membrány (při malém poškození) - např. u akutní virové hepatitidy, akutním toxickém poškození jater nebo po předávkování alkoholem

Enzymy jako markery poškození určité tkáně II

– AST (aspartátaminotransferáza) • katalyzuje přenos aminoskupiny z aspartátu na 2-oxoglutarát • převážně mitochondriální enzym • signalizuje vážnější poškození, AST vyšší než ALT svědčí o nekróze

buněk

– GMT (gamaglutamyltransferáza) • katalyzuje přenos γ-glutamylu z glutathionu na AMK a umožňuje

transport AMK přes buněčnou membránu do cytosolu • indikátor hepatobiliárního poškození, zvláště u chronických stavů a při

cholestase (nejvyšší hodnoty při obstrukci žlučových cest) • je nejcitlivějším ukazatelem poškození jater alkoholem, značí také

metastatické procesy v játrech, u virové hepatitidy v rekonvalescenci (hodnocení průběhu)

– ALP (alkalická fosfatáza) • katalyzuje hydrolýzu fosfátových esterů při alkalickém pH • zvýšená při hepatobiliárních onemocněních (obstrukce, abscesy,

metastázy)

Enzymy jako markery poškození určité tkáně II

• srdeční sval

– CK (kreatinkináza) - izoenzym CK-MB - cytoplazmatický enzym, katalyzuje fosforylaci kreatinu na kreatinfosfát pomocí ATP

– AST, LDH (laktátdehydrogenáza) – pouze historický význam

• pankreas: pankreatická amyláza (stoupá při akutní pankreatitidě) a lipáza

• kosterní sval: CK - izoenzym CK-MM

Otázky k procvičení

• Fosfatáza katalyzuje hydrolýzu esterové vazby – ANO

• KM se udává v jednotkách rychlosti reakce (mol.s-1) – NE

• O kompetitivní inhibici jde, pokud substrát s inhibitorem soutěží o aktivní centrum enzymu – ANO

• Nekompetitivní inhibici lze snížit zvýšením koncentrace substrátu – NE