DNA 重组技术刘湘帆

DNA 重组技术前言

一、重组 DNA 技术的诞生

（一）重组 DNA 技术诞生的理论基础

1.40 年代明确了遗传的物质基础是 DNA

肺炎链球菌

22 、、 5050 年代揭示了年代揭示了 DNADNA 分子的双螺旋分子的双螺旋结构模型和半保留复制结构模型和半保留复制

3 、 50 年代末和 60 年代提出了“中心法则”和操纵子学说，并成功地破译了遗传密码。中心法则

遗传密码遗传密码 6464 个密码子个密码子 6161 个代表各种氨基酸（个代表各种氨基酸（ AUGAUG 起始密码）起始密码） 33 个密码子为终止子个密码子为终止子（（ UAAUAA 、、 UAGUAG 、、 UGAUGA ））

操纵子 用基因表达调控的原理解释了酶诱导的本质。

（二）关键性实验技术问世为重组 DNA 技术奠定基础

1.DNA 分子的切割与连接技术

2. 载体构建和大肠杆菌转化体系的建立

3.Southern 杂交、 DNA 序列分析和聚合酶链式

反应

二 . 重组 DNA 技术的定义及步骤

（一）重组 DNA 技术

1 、重组 DNA 技术（ recombinant DNA

technology):

按照人的意愿，在体外对 DNA 分子进行重组，

再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和

繁殖，以获得该 DNA 分子的大量拷贝，表达相关

基因的产物，是进行基因功能研究的基本方法。

2.2. 克隆（克隆（ clone):clone):

指由一个细胞通过无性繁殖以后形成的与亲代指由一个细胞通过无性繁殖以后形成的与亲代完全相同的子代群体。完全相同的子代群体。

分子克隆（分子克隆（ molecular cloningmolecular cloning ）：）：

构建构建 DNADNA 重组体并导入宿主细胞建立无重组体并导入宿主细胞建立无 性繁殖体系。性繁殖体系。

（二）重组 DNA 技术的重大意义

1. 填平了生物种属间不可逾越的鸿沟。 2. 缩短了进化时间。 3. 使人能对生物体进行定向构造。

第一节 常用的工具酶

工具酶：

DNA重组技术，需要利用一些酶在体外对

DNA进行切割、连接等基因操作，这些酶常被

称

为工具酶。

主要工具酶限制性核酸内切酶DNA连接酶逆转录酶DNA聚合酶Ⅰ碱性磷酸酶末端转移酶Taq DNA聚合酶

第一节 常用的工具酶

是一类能识别和切割双链 DNA 分子中特定碱基顺序的核酸水解酶。

一、限制性内切酶

1. 简称限制酶，是 DNA重组技术的基本工具

2. 能识别和切割双链 DNA分子特异序列的核酸水解

酶

3. 在细菌体内与相伴存在的修饰酶（甲基化酶）共

同构成细菌的限制－修饰体系，起限制外来 DNA、

保护自身 DNA的作用

二 . 命名※第一个字母（大写、斜体） 该酶的微生物属名※第二、三个字母（小写、斜体） 代表微生物种名※第四个字母（斜体） 代表寄主菌的株或型※用罗马数码 I 、 II 、 III 等区分同一株具

有不同特异性的酶

例 流感嗜血杆菌中三个酶的命名：Haemophilus influenzae d

属名 种名 株系 H in d I II III Hind I Hind II Hind III

三 . 分类 根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为： I型 II 型 III 型

1.I 型限制酶属于复合功能酶，兼有修饰和切割 DNA两种特性。

功能功能

核酸内切酶核酸内切酶甲基化酶甲基化酶ATPATP 酶酶DNADNA 解旋酶解旋酶

特点：特点：

识别和切割位点不一致 识别和切割位点不一致

没有固定的切割位点 没有固定的切割位点

随机切割 随机切割

不产生特异片段 不产生特异片段

2.III型酶

与 I 型酶特性类似，也有甲基化功能，但

无 ATP酶和 DNA解旋酶活力。

在 DNA链上有特异位点切割，其切割位

点在识别位点以外。

3. II型酶（ 1 ） II型酶的识别 识别序列一般为 4-6 个碱基对，通常是反转重复顺序，具有 180º 的旋转对称性。（ 2 ） II型酶的切割功能★平末端（ blunt end) 在识别顺序的对称轴上，对双链 DNA同时切割。

★5’端粘性末端（ cohesive end) 在识别顺序的双侧末端切割 DNA双链，于对称轴的 5’末端切割。

★ 3’端粘性末端 在识别顺序的双侧末端切割 DNA双链，于对称轴的 3’末端切割。

4. 少数有特殊性质的 II型酶<1> 异源同工酶（ isoschizomer ） 定义： 来源不同但能识别和切割同一位点的酶。

5’ 5’ CC C G G C G G 3’3’

3’ G G C 3’ G G C CC 5’5’

5’ 5’ CC C G G C G G 3’3’

3’ G G C 3’ G G C CC 5’ 5’

HpaHpaIIII 、、 MspMspII

<2> 同尾酶（ isocaudarner) 为识别与切割顺序相互有关的酶。 有些限制酶的识别序列包含在另一些限制酶的识别顺序之中 酶来源不同，但它们作用后能产生相同的粘性末端。

5’ 5’ GG G A T C C G A T C C 3’3’

3’ C C T A G 3’ C C T A G G G 5’5’

5’ 5’ AA G A T C C G A T C C 3’3’

3’ C C T A G 3’ C C T A G A A 5’5’

BamH IBamH I Bag IIBag II

5’5’ G G G A T CG A T C C 3’C 3’

3’ C3’ C C T A GC T A G G G 5’5’

特点：

两个同尾酶消化的 DNA片段，可以相互连接，

连接后的重组 DNA分子，可以被其中一种酶识

别，也可能原来的任何一个同尾酶均不能识别。

（ 1）酶活力单位

限制性内切酶活力单位规定如下：在合适温度、pH值和离子强度等条件下， 1小时内完全消化1μg特异 DNA底物所需的酶量，定义为一个活力单位。

5. 限制性内切酶活力单位和星号活力

（ 2 ） 星号活性 • 限制性内切酶在非标准反应条件下，对识别序列的特异性下降，能切割一些与特异识别顺序类似的序列，一般在酶的右上角加 *表示。

• 如克隆过程中需同时进行双酶切，应选用二种酶都能接受的反应缓冲体系（可查阅试剂供应商手册获得），否则可能出现星号活性。

（ 3 ）特点：星号活力的识别形式常对标准识别顺序中两侧的碱基没有特异性。

GACTAGCGACTAGCNNAATTAATTNNTACGCTACGCAATTAATTTT

CTGATCGCTGATCGNNTTAATTAANNATGCGATGCGTTAATTAAAA

EcoEcoRI*RI*

EcoRI*EcoRI*

（ 4 ）产生的原因 a.高甘油含量（ >5%V/V) b.内切酶用量过大，一般为 > 100U/g DNA c.低离子强度 <25mmol/L d. 高 pH值 pH8.0 e.含有机溶剂： DMSO 、乙醇、乙烯二乙醇 Mn2+ 、 Cu2+ 、 Co2+ 、 Zn2+ 等非Mg2+

的离子存在

（ 5 ）常见容量发生星号活力的酶有：

EcoRI 、 HindIII 、 KpnI 、 PstI 、 Sc

aI 、 SalI 、 XmnI 、 HinfI 、 BssHII

、 EcoRV

（ 6 ）其他注意事项 ：

• 底物 DNA不能含有痕量的酚、氯仿和乙醚

• 溶液不能含大于 10mmol/L的 EDTA、 SDS和过

量的盐

• 反应缓冲体系中一般加入 2-巯基乙醇或二硫苏

糖醇防止含巯基酶的氧化失活

• 加入牛血清白蛋白稳定酶活性

• 操作时应注意混匀反应体系，这也是常见的酶

切失败原因之一

6. 甲基化酶

许多细菌有限制－修饰系统

限制（降解）外来 DNA，并通过对自身

DNA的修饰而起保护作用

Ⅱ类限制－修饰系统

• 由两种酶分子组成的二元系统• 一种为限制性内切酶，另一种为独立的甲基化酶• 这两种酶识别序列相同• 如 PstⅠ甲基化酶使 A 甲基化形成 5′-CTGCmAG-

3′

大肠杆菌株一般有 dam甲基化酶和 dcm甲基化酶

甲基化酶的应用

甲基化酶亦是分子克隆的重要工具酶

当制备克隆用双链 cDNA时，外源 DNA片段可用

M.EcoR Ⅰ甲基化酶处理，使双链 cDNA内部

EcoR Ⅰ位点则因甲基化受到保护而不被切割

7.II 型限制酶的用途（ 1 ） DNA 重组克隆及亚克隆（ 2 ） DNA 杂交与序列分析（ 3 ）改建质粒（ 4 ）构建基因组 DNA 物理图谱和文库等

二、 DNA 聚合酶1 、大肠杆菌 DNA 聚合酶 I及其大片段（ Klenow片段）（ 1 ）大肠杆菌 DNA 聚合酶 I

特性：具有 3 种酶活性

5’ 3’5’ 3’ 外切功能外切功能

3’ 5’ 3’ 5’ 外切功能 外切功能

聚合聚合酶功能酶功能

5’ 5’ CCGCCG

3’ GGCTATCGA5’3’ GGCTATCGA5’

聚合酶聚合酶dATPdATP

dTTPdTTP

dGTPdGTP

dCTPdCTP

5’ 5’ CCGCCGATAGCTATAGCT3’3’

3’ GGCTATCGA5’3’ GGCTATCGA5’

a.5’a.5’3’DNA3’DNA 聚合酶活性聚合酶活性 底物：单链 底物：单链 DNADNA 模板及带模板及带 3’3’羟基的羟基的 DNADNA 引物引物

5’ 5’ CCG3’CCG3’

3’ GGC5’3’ GGC5’

聚合酶聚合酶5’ 5’ CCGCCGATAGCTATAGCT3’3’

3’ GGC5’3’ GGC5’

A T A G C TA T A G C T

b.3’b.3’5’5’ 外切酶活性外切酶活性 底物： 底物：带带 3’3’羟基的双链羟基的双链 DNADNA 或单链或单链 DNADNA 、、从从 3’3’羟羟基端降解基端降解 DNADNA 。。对双链对双链 DNADNA 链的外切核酸酶活链的外切核酸酶活性可被性可被 5’5’3’3’DNADNA 聚合酶活性所封闭。聚合酶活性所封闭。

c. 5’3’ 外切酶活性： 能从游离的 5’末端降解 DNA 成为单核苷酸。

5’ 5’ CCGCCGATAGCTATAGCT3’3’

3’ GGCTATCGA3’ GGCTATCGAATAT5’5’

聚合酶聚合酶

5’ 5’ CCGCCGATAGCTATAGCT3’3’

3’ GGCTATCGA5’3’ GGCTATCGA5’

5’ 5’ CCGCCGATAGCTATAGCT3’3’

3’ GGCTATCGA5’3’ GGCTATCGA5’

TT

AA

TATA

（ 2 ） Klenow片段 从大肠杆菌 DNA 聚合酶 I中去除 5’3’外切酶活性，即得 Klenow片段。 其只具有 5’3’聚合酶活性 3’5’外切酶活性

35kD 76kD

苦草杆菌蛋白酶裂解全酶

5’ 3’ 外切酶 5’ 3’ 聚合酶 3’ 5’ 外切酶

5’ 3’ 聚合酶 3’ 5’ 外切酶

Klenow片段

DNA 聚合酶 I全酶

应用1. 催化 DNA 切口平移反应，置备高比活DNA探针。 (大肠杆菌 DNA 聚合酶 I ）

DNaseIDNaseI

DNADNA 聚合酶聚合酶 II

dNTPdNTP

3232P-dNTPP-dNTP

2. 对 DNA 分子进行末端标记（ Klenow ）

2 .Taq DNA 聚合酶(1)特性： ①耐热的 DNA 聚合酶来自于嗜热的栖热水生菌 Thermus aquaticus 中纯化而来的。 ② 5’3’聚合酶活性 ③ 5’3’外切酶活性 ④最佳作用温度为 75-80C （（ 22 ）用途）用途①通过①通过 PCRPCR 对对 DNADNA 分子的特定序列进行体外分子的特定序列进行体外扩增扩增 ②对②对 DNADNA 进行测序进行测序

3. 反转录酶（依赖于 RNA 的 DNA 聚合酶， RDDP ）（ 1 ）特性①催化从 RNA 为模板的 DNA 聚合反应 ②具 3’5’RNA 外切酶活性，能特异性降解RNA— DNA 杂交分子中的 RNA部分 ③具 DNA 指导的 DNA 聚合酶（ DDDP ）的功能 ④能以 mRNA 为模板催化合成出互补的DNA （ cDNA ）

（ 2 ）分类 ①禽源反转录酶 来自禽或骨髓细胞瘤病毒（ AMV ）

具有聚合酶活性及强的 RNA 酶 H 活性 无 3’5’外切酶活性。

温度 42C

pH8.6 时活性较高

②鼠源反转录酶 来自Moloney鼠白血病病毒（ M-MLV ）

具有聚合酶活性及相对较弱的 RNA 酶 H 活性 无 3’5’外切酶活性 温度 37C pH7.6 时活性较高

4. 末端脱氧核糖核酸转移酶（末端转移酶） 催化 dNTP加到DNA 分子的 3’羟基端

3’3’末端标记末端标记

添加多聚体尾添加多聚体尾

三、 DNA 连接酶1. 定义： DNA Ligases are primarily responsible for joining the gaps that form in DNA during replication(i.e., the joining of Okazaki fragments formed by discontinuous or lagging strand replication), DNA repair, and recombination. 催化双链 DNA 一端的3’OH 与另一双链DNA5’ 的磷酸根形成 3’，5’-磷酸二酯键，使具有相同粘性末端或平末端的DNA 末端连接起来。

三、 DNA连接酶

注意： DNA连接酶只能作用于双链 DNA分子而不

能将二个单链 DNA分子连接。

DNA连接酶是重要的基因重组的工具酶

应用 DNA连接酶将具有相同粘性末端或平端的

DNA分子连接起来。

DNA连接酶的特点：T4噬菌体 DNA连接酶和大肠杆菌 DNA连接酶T4噬菌体 DNA连接酶能连接带粘性末端或平末端 的 DNA分子大肠杆菌 DNA连接酶不能连接平末端 DNA分子DNA重组技术常用 T4噬菌体 DNA连接酶

T4噬菌体 DNA连接酶连接带粘性末端 DNA分子的

效率远高于连接平末端的 DNA分子

连接反应需要 ATP、 Mg2+和二硫苏糖醇，最适 pH

为 7.2~7.4 ， ATP为连接反应提供能量，二硫苏

糖醇可提高连接效率

3.3. 特点：特点： 催化催化 DNA 5’DNA 5’磷酸基与磷酸基与 3’3’羟基之间（切羟基之间（切口）形成磷酸二酯键。口）形成磷酸二酯键。切口切口 ((nick)nick) ：： DNADNA 分子糖分子糖 -- 磷酸主键的破坏。磷酸主键的破坏。

缺口缺口 ((gap)gap) ：： DNADNA 分子中核苷酸缺失。分子中核苷酸缺失。

2.2. 分类：分类： TT44 噬菌体噬菌体 DNADNA 连接酶连接酶 大肠杆菌 大肠杆菌 DNADNA 连接酶 连接酶

4. 用途：①连接带匹配粘端的 DNA 分子。②使平端的双链 DNA 分子互相连接或与合成 接头相连接。

5. 反应例解：（ 1 ）互补粘端DNA( 或切口间的连接 ) 5’ ACGOH pAATTCGT 3’ 3’ TGCTTAAp HOGCA 5’

ATP 、 Mg2+ T4 连接酶 5’ ACGAATTCGT 3’ 3’ TGCTTAAGCA 5’

（ 2 ）平端连接5’ C G AOG pC G T A 3’3’ G C Tp OHG C A T 5’

ATP 、 Mg2+ T4 连接酶

5’ CGACGTA 3’ 3’ GCTGCAT 5’

四、 T4 多核苷酸激酶 T4 polynucleotide kinase (T4 PNK) 催化将 ATP 的 - 磷酸转移到DNA 链的 5’末端

1.1. 反应分类反应分类（（ 11 ）前向反应）前向反应 将 将 ATPATP 的的 -- 磷酸转移到脱磷酸的磷酸转移到脱磷酸的 DNADNA 链的链的 5’5’末端末端

（ 2 ）交换反应过量的 ADP 使 T4 多核苷酸激酶将 5’-末端磷酸从磷酸化的 DNA 链中转移到 ADP上生成 ATP ，然后再从 [ -32P]dATP上将标记的磷酸转移到DNA 链上，使其重新磷酸化。

用途

①标记DNA 链的 5’末端

②连接反应

五、碱性磷酸酶 alkaline phosphatase (CIAP)1. 特性： 催化去除DNA 、 RNA 和 dNTP 的 5’磷酸的反应。2. 分类（ 1 ）细菌碱性磷酸酶（ BAP)（ 2 ）牛小肠碱性磷酸酶（ CIP)3. 用途（ 1 ）在用 T4 多核苷酸激酶和 32P 标记 5’末端前，去除DNA 或 RNA 的 5’磷酸。（ 2 ）去除DNA片段 5’磷酸以防止自身环化。

CIAP is most commonly used to remove 5-CIAP is most commonly used to remove 5-phosphates from vector DNA to prevent phosphates from vector DNA to prevent selfligation during cloningselfligation during cloning

AAGCTTAAGCTT

TTCGAATTCGAA

AAGCTTAAGCTT

TTCGAATTCGAA

ppAGCTTAGCTT

AA

AA

TTCGATTCGApp

AGCTTTCGAA

AAGCTTAAGCTT

TTCGAATTCGAA

AAGCTTAAGCTT

TTCGAATTCGAA

AGCTTAGCTT

AA

AA

TTCGATTCGA

不能形成环化不能形成环化

CIPCIP

第二节 常用载体

　二、噬菌体载体

　三、穿梭载体

　四、人工染色体

一、质粒载体

一、质粒载体

1. 质粒载体是应用最广的载体

2. 质粒载体大多是在天然松驰型质粒的基础上经人工改造拼接而成

3. 这类质粒在宿主蛋白质合成及染色体复制停止后尚能继续复制。质粒扩增时，通过加入氯霉素抑制大肠杆菌蛋白质合成，达到进一步提高质粒拷贝数的目的

理想质粒载体应具备特点 1. 松驰型复制子（如 ColE1）

复制子（ replicon）是质粒自我增殖所必需

2. 几个单一的酶切位点（或多克隆位点）

以便目的 DNA片段插入

一、质粒载体

一、质粒载体

3. 插入失活的筛选标记• 一般应具有两种抗菌素抗性标志• 如氨苄青霉素抗性基因（ Ampr）和四环素抗性基因（ Tetr）等

4.分子量相对较小和较高的拷贝数

5.缺点：容量较小，一般只能接受小于 15kb的

DNA

一、质粒载体

（一） pBR322质粒载体

（二） pUC质粒载体系列

（一） pBR322质粒载体pBR322载体是最早被广泛应用克隆的载体之一，至今尚在使用。

pBR322载体的组成• 源于 ColE1的派生质粒 pMB1的复制起始位点

（ ori）

• 来源于 pSF2124质粒易位子 Tn3的 Ampr

• 来源于 pSC101质粒的 Tetr

一、质粒载体

pBR322质粒载体和特点1. 带有一个复制起始点（ ori ）

2. 抗生素抗性基因（ Ampr和 Tetr）作选择标记

3. 数个单一的限制性酶切位点

当外源基因插入这些抗性位点时，就分别成为 Amp

敏感（ Amps）或 Tet敏感（ Tets），即插入失活

一、质粒载体

4. 较小的分子量 易于自身 DNA的纯化，而且能有效地克隆 6kb大小的外源 DNA片段。

5. 较高的拷贝数经氯霉素扩增后，每个细胞达 1000~3000 个拷贝。

一、质粒载体

一、质粒载体

rr

pBR332 质粒结构示意图

（二） pUC质粒载体系列

在 pBR322基础上改建而成

一、质粒载体

典型的 pUC质粒载体有 4个组成部分• 来自 pBR322 质粒的复制起始点• Ampr基因• 大肠杆菌 β-半乳糖苷酶基因（ LacZ）的启动子及其编码 α-肽链的 DNA序列，称为 LacZ′基因

• 位于 LacZ′基因中靠近 5′- 端的一段多克隆位点区段，但并未破坏该基因的功能

pUC系列的优越性最通用的大肠杆菌克隆载体之一优点

• 具有更小的分子量和更高的拷贝数• 构建 pUC系列时仅保留了 pBR322的复制子

和 Ampr

• 具有来自大肠杆菌 LacZ操纵子的 LacZ′基因，适应于组织化学筛选重组体

一、质粒载体

一、质粒载体

r

pUC18/pUC19 质粒载体结构

二、噬菌体载体

λ 噬菌体载体

粘粒载体称柯斯质粒（ cosmid）

单链丝状噬菌体载体

二、噬菌体载体

λgt10 （插入型）结构

二、噬菌体载体

Charon 40 （替换型）结构

75%~105%

COS位点 :γ噬菌体两端存在 12bp 的互补序列 .

γ噬菌体载体可以存在两种生长方式 :

溶菌性生长 : γ噬菌体感染宿主后环化成并大量复

制装配成 γ噬菌体颗粒 ,最终导致宿主裂解 .

溶源性生长 : γDNA整合到宿主染色体基因组中 ,

复制遗传给子代 , 宿主细胞不破坏 .

二、噬菌体载体

r

粘粒载体 pJB8 结构

粘粒载体组成 :

质粒 + γ 噬菌体

连接位点 : 通过COS 位点形成

二、噬菌体载体

M13mp18/M13mp19 结构

典型丝状噬菌体 :

M13噬菌体

主要特点 :单链闭环 DNA 分子

主要优点 : 可以获得和分离大量单链形式的 DNA 分子

三、穿梭载体（ shuttle vector）

带有原核和真核细胞的复制起始点

常将真核生物的克隆载体构建成穿梭载体，使其先

在大肠杆菌中扩增，将目的基因与之构成合适的重

组体后，再转入真核细胞

若加上适当的真核启动子等元件，则成为真核表达

载体，能在真核细胞中表达插入载体中的外源基因

三、穿梭载体（ shuttle vector）

真核系统载体还必需具备适当的筛选标记• 一种筛选标记是，使用遗传缺陷型细胞株与载体的基因产物互补（如 TK基因产物）。

• 另一种普遍使用的是抗新霉素基因。因此，真核克隆载体的构成一般由来自噬菌体、质粒和病毒的 DNA元件构建而成。

三、穿梭载体（ shuttle vector）

（二）逆转录病毒载体

（一） SV40（猿猴病毒）载体

（一） SV40（猿猴病毒）载体 真核表达载体中的调控元件大都来源于 SV40

的调控顺序和复制信号 用 SV40作为载体有两种方式

• 用 SV40 DNA与外源 DNA构建重组子，转染细胞后允许细胞形成含外源 DNA的病毒颗粒；

• 重组子不包装成病毒颗粒，而象质粒一样在细胞中复制或整合到染色体组中。

三、穿梭载体（ shuttle vector）

例： PSVK3质粒

PSVK3是一类广泛适用于哺乳动物细胞系表达外源

基因的穿梭载体。

三、穿梭载体（ shuttle vector）

PSVK3具有下列构件：• 原核系统构件：①复制子和丝状噬菌体复制起始位点fl;②筛选标志（ Ampr）；③启动子（ T7启动子）。

• 真核系统构件：① SV40复制起始点；② SV40早期启动子

• RNA修饰信号：① SV40小 T 抗原拼接信号；② SV40早期区 mRNA polyA加尾信号。

• 多克隆位点： SV40启动子下游有 8个酶切位点。

三、穿梭载体（ shuttle vector）

pSVK3 质粒

（二）逆转录病毒载体

逆转录病毒载体具有几个特点

• 具有广泛的哺乳动物细胞宿主

• 较大的容量，能插入 7kb大小甚至更大的外源

基因

三、穿梭载体（ shuttle vector）

• 病毒基因组自身含有完整高效的调控元件

• 病毒可通过主动感染方式进入宿主细胞，并能有效地整合到宿主染色体基因组中，与染色体一起复制、长期存在

• 逆转录病毒作为载体需要相应的外包装，以形成完整的体系

逆转录病毒载体的局限性：• 逆转录病毒载体进入细胞依赖于细胞表面的受体，并且只能感染并整合到分裂增殖期的细胞；

• 装载容量较小，仅 8kb左右，不适用于较大的基因；

• 安性问题，最大的危险是制剂过程中可能存在具有复制能力的野生型病毒

三、穿梭载体（ shuttle vector）

常用外源 DNA片段取代病毒中的癌基因，即卸去

其致癌性，称为卸甲载体（ disarmed

vector ）。

四、人工染色体

酵母人工染色体（ YAC）

细菌人工染色体（ BAC）

噬菌体 P1衍生的人工染色体（ PAC）

哺乳动物人工染色体（ MAC）

YAC主要调控元件

着丝粒 保证染色体细胞分裂过程中正确分配到

子代细胞

端粒 防止染色体被核酸外切酶降解的功能

复制起始点和限制性酶切位点

四、人工染色体

筛选标记 YAC载体的两臂均带有选择标记，在酵

母中选择标记一般为色氨酸、亮氨酸、组氨酸或

尿嘧啶的合成基因产物插入失活而进行筛选

原核序列及调控元件 包括大肠杆菌复制起始点、

Ampr基因等，以便于在大肠杆菌中操作

YAC作为载体的主要特点酵母是单细胞真核生物，培养方便；

酵母的真核细胞转录系统，有利于表达真核生物基因；

装载容量巨大，可达 Mbp水平；

四、人工染色体

YAC的克隆程序相似于基因组 DNA的常规克隆；

DNA在片段连接到 YAC载体的（两）臂上形成

重组体，随后该重组体可通过常规方法导入酵

母；

已广泛应用于各种生物基因组计划。

DNADNA 重组技术重组技术

重组 DNA 技术的基本步骤

1.目的基因的获得和载体的选择

2.目的基因与载体的连接

3. 重组 DNA 分子导入受体细胞

4.筛选出含重组 DNA 基因分子的受体细胞克隆

5. 克隆基因的表达及表达产物的检测和分离纯化

（一）目的基因的分离

分离目的基因的方法及原理 目的基因分离方法的选择原则 目的基因的序列测定

目的基因的定义： 目的基因的定义： target genetarget gene

对基因组中某一基因成分或该基因片段进行研究对基因组中某一基因成分或该基因片段进行研究 或应用，首先需要通过克隆、扩增以获得该基因，或应用，首先需要通过克隆、扩增以获得该基因， 此基因（或片段）称为目的基因。此基因（或片段）称为目的基因。

外源性基因（或外源性基因（或 DNADNA ）：）： cloned DNA in vitro

插入至载体、并导入宿主细胞内复制的基因。插入至载体、并导入宿主细胞内复制的基因。

分离目的基因的方法及原理

目的基因的来源 从庞大的基因群中获得某一目的基因的从庞大的基因群中获得某一目的基因的 DNA DNA

片段要求 ①纯度高；②数量多片段要求 ①纯度高；②数量多

原核细胞（较易获得目的基因）原核细胞（较易获得目的基因） 基因组较小，可直接分离获得 基因组较小，可直接分离获得 基因组 限制性内切酶 水解成若干基因组 限制性内切酶 水解成若干 片段 探针筛选 提纯 扩增片段 探针筛选 提纯 扩增

真核细胞目的基因的来源根据不同要求选择真核细胞目的基因的来源根据不同要求选择

1. 1. 构建 构建 cDNAcDNA文库文库

2. 2. 构建基因组文库构建基因组文库

3. 3. 人工合成 人工合成 Synthesize DNA in vitroSynthesize DNA in vitro

4. PCR4. PCR 扩增扩增

DNADNA 文库：文库：

通过重组、克隆保存在宿主细胞中的各种通过重组、克隆保存在宿主细胞中的各种

DNADNA 分子的集合体。文库保存了该种生物分子的集合体。文库保存了该种生物

的全部遗传信息，需要时可从中分离获得。的全部遗传信息，需要时可从中分离获得。

1. 1. cDNAcDNA文库 ——只包括表达成蛋白质的文库 ——只包括表达成蛋白质的 DNADNA序列序列

2. 2. 基因组文库——代表该种生物体所有的基因组文库——代表该种生物体所有的 DNADNA 序序列列

cDNA cDNA

(( 互补互补 DNA,complementary DNA,complementary DNA)DNA)

区域特异性区域特异性 cDNAcDNA 文库 文库

从特定位点的基因组从特定位点的基因组

DNADNA 出发寻找转录序列出发寻找转录序列

即以含有某种人染色体或即以含有某种人染色体或

其区段的杂交细胞株分离其区段的杂交细胞株分离

RNA,RNA, 反转录合成反转录合成 cDNAcDNA

分类分类 ::用人特异性用人特异性 AluAlu 序列序列扩增，寻找外显子，可扩增，寻找外显子，可以得到染色体段内表达以得到染色体段内表达基因的分布图基因的分布图

组织特异性组织特异性 cDNAcDNA文库文库 从 从 cDNAcDNA 出发寻找转出发寻找转录序列，将其定位于遗录序列，将其定位于遗传图谱或物理图谱上。传图谱或物理图谱上。

即以不同发育阶段的人即以不同发育阶段的人组织细胞为材料，提取组织细胞为材料，提取RNARNA ，，构成构成 cDNAcDNA文文库。库。

可得到特定细胞的外可得到特定细胞的外显子图谱显子图谱

一、构建一、构建 cDNAcDNA 文库文库

cDNAcDNA 以以 mRNAmRNA 为模板经逆转录而为模板经逆转录而成，成，

故须选择故须选择mRNAmRNA 丰富、较易获得的、目丰富、较易获得的、目的的

基因表达活跃的组织细胞为材料。基因表达活跃的组织细胞为材料。

1.1.真核细胞真核细胞 mRNAmRNA 的分离和纯化的分离和纯化

提取细胞内总提取细胞内总 RNARNA

分离和纯化分离和纯化 mRNAmRNA

mRNA 3’mRNA 3’ 端有端有 polyApolyA 尾，用尾，用 oligo-oligo-dTdT纤维纤维

素亲和柱分离纯化素亲和柱分离纯化 mRNAmRNA 。。

2. 2. 逆转录合成逆转录合成 cDNAcDNAcDNAcDNA 第一链合成第一链合成

方法Ⅰ：①合成 cDNA 第一链

5’~~~~~~~~~~~~~~~~~~AAAAAA 3’ mRNA

TTTTTTT 5’ cDNA 1

Oligo(dT) ，反转录酶

　　　　　　　　　　 d NTP,

② 合成 cDNA 第二链 ~~~ ~~~ ~~~ AAAAAA 3’ cDNA 2

TTTTTTT 5’

RNase H ， DNA 聚合酶 , dNTP

5’ AAAAAA 3’ 双链 cDNA

3’ TTTTTTT 5’

PCRPCR 法法

二、构建基因组文库二、构建基因组文库

1. 1. 分离纯化基因组分离纯化基因组 DNADNA

条件应温和，以保证得到较长的条件应温和，以保证得到较长的 DNADNA 链链

2. 2. DNADNA 片段与载体连接片段与载体连接 基因组基因组 DNA DNA 酶水解 具一定长度的片酶水解 具一定长度的片段（粘性末端）段（粘性末端）

载体（噬菌体等） 酶解 与目的基因连接载体（噬菌体等） 酶解 与目的基因连接

导入宿主细胞，携带基因组导入宿主细胞，携带基因组 DNADNA片段的噬菌片段的噬菌

体或粘粒经包装后转入宿主细胞内培养扩增。体或粘粒经包装后转入宿主细胞内培养扩增。

插入基因组片段的集合体即基因组文库。插入基因组片段的集合体即基因组文库。

三、人工合成目的基因三、人工合成目的基因 DNADNA 片段片段

1. 1. DNADNA 的化学合成的化学合成2. 2. DNADNA 的酶促合成（首先需要有目的基因 的酶促合成（首先需要有目的基因

DNADNA 或与之互补的或与之互补的 RNARNA 链作为模板）链作为模板）

四、聚合酶链反应合成四、聚合酶链反应合成 DNADNA 片段片段

（见 PCR 章）

4

目的基因分离方法的选择原则目的基因分离方法的选择原则

一、根据获得目的基因的目的选择方法

基因组文库基因组文库 基因组全部测序、结构分析、基因识别，需基因组全部测序、结构分析、基因识别，需

构建基因组文库，从中获得基因构建基因组文库，从中获得基因（（ HGPHGP ）。）。

cDNAcDNA 文库文库 研究基因表达或大量合成多肽、蛋白质用于研究基因表达或大量合成多肽、蛋白质用于

生物制药等。生物制药等。

二、根据目的基因的特点选择方法

基因组文库：基因组文库：

cDNAcDNA 文库：文库：

P C RP C R ：：

包括某种生物的全部遗传信息，任何包括某种生物的全部遗传信息，任何信息都可从中筛选，但某一个基因在信息都可从中筛选，但某一个基因在其中所占比例很小，筛选难度大。其中所占比例很小，筛选难度大。

包含所有正在表达的包含所有正在表达的 mRNAmRNA 基因，基因，不包含基因中的内含子和不包含基因中的内含子和rRNArRNA 、、 tRNAtRNA 等基因及所有不转等基因及所有不转录部分。录部分。

须知与目的基因特异互补的二端的引物。须知与目的基因特异互补的二端的引物。

目的基因序列测定

目的基因序列测定目的基因序列测定精确研究该基因结构和功能的前提精确研究该基因结构和功能的前提发现异常基因的依据。发现异常基因的依据。

一、双脱氧链终止法（ Sanger 法）

原理原理 DNADNA 链中的戊糖在链中的戊糖在 3’3’位碳原子上有位碳原子上有 --OHOH 基团，基团，在 在

DNADNA 合成、链的延长过程中，新掺入的脱氧核苷合成、链的延长过程中，新掺入的脱氧核苷

酸酸 5’-5’-pp 与前一核苷酸的戊糖与前一核苷酸的戊糖 3’-3’-OHOH 以磷酸二以磷酸二酯酯

键相连。 键相连。

SangerSanger 法是在反应体系中加入 法是在反应体系中加入 2’, 3’ -2’, 3’ -ddNTPddNTP ，，由于其没有 由于其没有 3’-3’-OH OH 而不能与下一个而不能与下一个核苷酸相连，于是核苷酸相连，于是 DNADNA 链的合成便终止。链的合成便终止。

5′GAGTCACACTTGAC—— 3′待测单链 DNA

3′CTG— 5′ 引物、 Klenow 酶、dATP 、 dGTP 、dCTP 、 dTTP和少量 α-32P-dATP

加 ddATP 反应3'ACTG— 5'3'AACTG— 5'3'AGTGTGAACTG 5'

加 ddCTP 反应3'CAGTGTGAACTG— 5'3'CTCAGTGTGAACTG5'

加 ddTTP 反应3'TGAACTG— 5'3'TGTGAACTG— 5'3'TCAGTGTGAACTG5'

加 ddGTP 反应3'GAACTG— 5'3'GTGAACTG— 5'3'GTGTGAACTG5'

GAGTCACACTT

变性凝胶电泳、放射自显影

A C T G

5

自动测序仪测序法 自动测序仪测序法 ((ABI)ABI)

自动测序仪基于 2 ， 3-双脱氧末端终止法的原理，标记系统由放射性核素改为发特定荧光信号的荧光染料，预先将四种荧光染料与四种双脱氧核苷三磷酸共价相连，使其带有不同的荧光标记。当某一种 ddNTP掺入到正在合成的 DNA单链分子中时，该链的延伸便终止并带有相应的荧光染料。

自动测序系统包括电泳分离系统、荧光检测装置、计算机成像系统及分析软件组合。

序 列 图 谱(ABI PRISM 377)

（二）目的 DNA片段与载体的连接

DNA 连接酶 酶促生化反应外源目的基因装入载体的过程 ,即基因重组

3`5`磷酸二酯键

T4DNA 连接酶：ATP 是辅助因子；

大肠杆菌 DNA 连接酶 NAD+ 是辅助因子。

粘性末端的 DNA 分子最容易相互连接，

连接效率也是最高的。

连接反应的最适合温度是 12~16度

DNA Ligase

克隆载体具备的特征：

1 载体必须具有自我复制和表达的能力

2 载体不能过大

3 载体与宿主细胞容易分离和纯化

4 具有两个以上的遗传选择标记，便于区别阳性和阴性克隆

特征 功能

在宿主细胞内稳定 允许复制 能控制自身复制 在细胞内复制高拷贝数 大小较小 容易转化，进入宿主细胞 存在限制性内切酶单一 允许供体 DNA插入和质粒环化 酶切位点 不能通过接合转移 阻止重组 DNA 进入菌群 易于检测的特性，具有 可以区分转化和未转化细胞 两个以上的检测位点 容易从细胞中分离 容易得到高产量重组体

（一）（一） DNADNA 重组的方法重组的方法11 、分类：、分类： 粘端连接法粘端连接法 平端连接法 平端连接法

依据外源依据外源 DNADNA 片段末端的性质，以及质粒片段末端的性质，以及质粒载体与外源载体与外源 DNADNA 上限制酶酶切位点的性质上限制酶酶切位点的性质来做选择。来做选择。

1 粘性末端连接法（（ cohesive end ligationcohesive end ligation ））

最主要的连接方法

单一限制性内切酶——粘性末端

两个限制性内切酶——互补粘性末端

目的基因或目的基因或 DNADNA插入片段与适当的载体存在同源粘性末端，通过插入片段与适当的载体存在同源粘性末端，通过连接酶将其连接。连接酶将其连接。

◇◇同源粘性末端：同源粘性末端：相同一种内切酶产生的粘性末端或不同的内相同一种内切酶产生的粘性末端或不同的内切酶产生的互补粘性末端。切酶产生的互补粘性末端。

◇特点：◇特点：得到的重组质粒能够保留结合处的限制酶切得到的重组质粒能够保留结合处的限制酶切位点，原切割内切酶，重新将插入片段从重位点，原切割内切酶，重新将插入片段从重组体上完整地切割下来。组体上完整地切割下来。

kpnI pstI

除了重组体以外，还有质粒分子的自身

环化，重新形成完整质粒，这是基因重

组中产生了假阳性。

自身环化

如何提高连接的效率，防止假阳性的产生？

1 连接前使用碱性磷酸酶，去除载体 5`端的

磷酸抑制质粒的重新环化。

2 调节外源DNA 和克隆载体的比例

3 定向克隆，使用两个限制性内切酶

缺口

11 ）一定数量的载体自身环化分子，产生较高的）一定数量的载体自身环化分子，产生较高的假阳性在连接前，用牛小肠碱性磷酸酶去除载体假阳性在连接前，用牛小肠碱性磷酸酶去除载体的的 5’5’磷酸以抑制质粒磷酸以抑制质粒 DNADNA 的自身环化。的自身环化。

22 ）用一种限制性内切酶切割载体和外源）用一种限制性内切酶切割载体和外源DNADNA ，，连接时插入片段可以两个方向插入载体连接时插入片段可以两个方向插入载体中。中。

33 ）片段的多拷贝插入 ）片段的多拷贝插入 适当的插入片段与载体分子比率能减少多拷贝插适当的插入片段与载体分子比率能减少多拷贝插入片段的形成，一般采用插入片段摩尔数：载体入片段的形成，一般采用插入片段摩尔数：载体摩尔数为摩尔数为 33 ：： 11

2 同聚体加尾部连接法：

（（ homopolymeric tails homopolymeric tails

ligationligation ）） 针对平性末端或者不匹配的末端

利用末端核酸转移酶在一个分子的末 端加上 poly(A);另一个分子 3`末端加上 poly(T), 在通过 DNA 连接酶形成重组 DNA 分子。

（（ 11 ））限制性内切酶酶切获得的是平齐末端；或限制性内切酶酶切获得的是平齐末端；或者外源者外源 DNADNA片段和载体是两个不相配的片段和载体是两个不相配的 DNADNA片片段；段；（（ 22 ）用末端转移酶使其中的一个）用末端转移酶使其中的一个 DNADNA 分子分子 3’3’端上接上多聚端上接上多聚 A,A,另一个另一个 DNADNA片段片段 3’3’端上接上端上接上多聚多聚 TT 。。

（（ 33 ））使两个使两个 DNADNA 分子的尾部可按分子的尾部可按 A-TA-T配对原配对原则相联 则相联 （（ 44 ）） DNADNA 聚合酶填补空隙聚合酶填补空隙（（ 55 ）） DNADNA 连接酶封口成重组连接酶封口成重组 DNADNA 分子分子

3 人工合成接头连接法

人为的在目的基因的两端加上酶切位点，

使得限制性内切酶酶切后与载体形成相

同的粘性末端

（（ 11 ））目的基因或目的基因或 DNADNA 片段的两端接上能够被片段的两端接上能够被

某一 某一

限制性内切酶识别的 限制性内切酶识别的 DNADNA 序列（接头）序列（接头）

（（ 22 ）在该内切酶的酶解作用下，与载体获得）在该内切酶的酶解作用下，与载体获得

相同的粘性末端 相同的粘性末端

（（ 33 ）连接）连接

（二）重组 DNA 分子转入宿主细胞

什么是转化（ transformation ）？

将重组 DNA 分子引入细菌（原核细胞），使其在细菌体内扩增及表达的过程。

什么是转染（ transfection ） ?

将噬菌体、病毒或以它们为载体构建的DNA 重组体导入真核细胞的过程。

宿主细胞宿主细胞 原核细胞：大肠杆菌 原核细胞：大肠杆菌

真核细胞：哺乳类动物细胞、酵母和昆虫细胞 真核细胞：哺乳类动物细胞、酵母和昆虫细胞

1 重组体分子导入原核细胞

感受态细菌：细菌表面正电荷增加，细

胞壁和膜的通透性增加，利于DNA 分

子的吸附和吸收

（ 1 ） CaCl2 转化：

[[原理原理 ]]：： 当细菌处于当细菌处于 0℃0℃、二价阳离子（如、二价阳离子（如 CaCa2+2+ 、、 MgMg2+2+

等）低渗溶液中时，细菌细胞膨胀成球形，处于感等）低渗溶液中时，细菌细胞膨胀成球形，处于感受态；此时转化混合物中的受态；此时转化混合物中的 DNADNA 形成抗形成抗 DNADNA 酶酶的羟基的羟基 --钙磷酸复合物粘附于细胞表面，重组钙磷酸复合物粘附于细胞表面，重组DNADNA 在在 42℃42℃短时间热冲击后吸附在细胞表面，在短时间热冲击后吸附在细胞表面，在丰富培养基中生长数小时后，球状细胞恢复原状并丰富培养基中生长数小时后，球状细胞恢复原状并繁殖。繁殖。

细菌处于 0度，二价阳离子存在的低渗

溶液中，细菌膨胀成球形，处于感受态。

此时加热在 42度的热冲击下进入细胞，

在培养基上生长数小时后球形细胞恢复

原状并繁殖。

转化效率为 105~106/ug

细菌细菌

0℃0℃二价阳离子二价阳离子 CaCa2+2+ 、、 MgMg2+2+

42℃42℃

[[关键点关键点 ]]：：

细菌必须处于生长对数期 细菌必须处于生长对数期

实验操作必须在低温下 实验操作必须在低温下

设立已知质粒载体的阳性对照 设立已知质粒载体的阳性对照

不加任何质粒的空白感受态细菌阴性对照 不加任何质粒的空白感受态细菌阴性对照

2 电击法（ electroporation ）：

在高压脉冲下，细菌细胞表面形成暂时性微孔，

重组 DNA 进入微孔后，脉冲结束，细胞恢复。

实验简单，不需要制备感受态菌，转化效率高

109~1010/ug

[[ 原理原理 ]] 利用高压脉冲，在细菌细胞表面形成暂时性的利用高压脉冲，在细菌细胞表面形成暂时性的微孔，重组微孔，重组 DNADNA从微孔中进入，脉冲过后，微从微孔中进入，脉冲过后，微孔复原，在丰富培养基中生长数小时后，细胞增孔复原，在丰富培养基中生长数小时后，细胞增殖，重组殖，重组 DNADNA 得到大量复制。得到大量复制。

2 重组体导入真核细胞 （ 1 ） CaCl2 转化 （ 2 ）电击法 （ 3 ）磷酸钙 -DNA共沉淀法 （ 4 ） DEAE-葡聚糖介导转染 （ 5 ）脂质体法 （ 6 ）显微注射法

（（ 11 ）） CaClCaCl22 处理以后的转染：处理以后的转染： 真核细胞一定要经一定浓度的冰冷的真核细胞一定要经一定浓度的冰冷的CaClCaCl22 （（ 5050 ～～ 100mmol/L100mmol/L ））溶液处理以后溶液处理以后成为感受态细胞，感受态细胞有摄取各种外源成为感受态细胞，感受态细胞有摄取各种外源DNADNA 的能力。的能力。

（（ 22 ）电击法：）电击法：利用脉冲电场将利用脉冲电场将 DNADNA 导入受体细胞。导入受体细胞。

（（ 33 ）聚乙二醇介导的转染法：）聚乙二醇介导的转染法：用于转染酵母细胞以及其他真菌细胞。细胞用消用于转染酵母细胞以及其他真菌细胞。细胞用消化细胞壁的酶处理以后变成球形体，在适当浓度化细胞壁的酶处理以后变成球形体，在适当浓度的的 PEG 6000PEG 6000 的介导下，将外源的介导下，将外源 DNADNA 导入受导入受体细胞。体细胞。

（（ 44 ）磷酸钙）磷酸钙 --DNADNA共沉淀法共沉淀法：：将被转染的将被转染的 DNADNA 和正在溶液中形成的磷酸钙微和正在溶液中形成的磷酸钙微粒共沉淀后，磷酸钙和外源性粒共沉淀后，磷酸钙和外源性 DNADNA 形成沉淀颗形成沉淀颗粒附着在细胞表面，通过细胞脂相收缩时裂开的粒附着在细胞表面，通过细胞脂相收缩时裂开的空隙进入或在钙、磷的诱导下被细胞摄取，通过空隙进入或在钙、磷的诱导下被细胞摄取，通过内吞作用进入受体细胞。内吞作用进入受体细胞。

（（ 55 ）二乙胺乙基）二乙胺乙基（（ diethyl-aminoethyl, diethyl-aminoethyl, DEAEDEAE ） ） -- 葡聚糖介导的转染：葡聚糖介导的转染：可能是可能是 DEAE-DEAE-葡聚糖与葡聚糖与 DNADNA 结合后抑制核酸结合后抑制核酸酶的作用或与细胞结合后促进细胞对酶的作用或与细胞结合后促进细胞对 DNADNA 的内的内吞作用。吞作用。

（（ 66 ）原生质体融合：）原生质体融合： 外源性 外源性 DNADNA片段与噬菌体片段与噬菌体 DNADNA 载体连接后成为重组载体连接后成为重组噬菌体噬菌体 DNADNA ，，经噬菌体外壳蛋白包装完毕以后，成为有经噬菌体外壳蛋白包装完毕以后，成为有感染能力的噬菌体颗粒。感染能力的噬菌体颗粒。

（（ 77）脂质体法（）脂质体法（ liposomesliposomes ） ： ） ： 带正电荷的带正电荷的 N-[1-N-[1- （（ 22 ，， 3-3- 二油酰氧）丙基二油酰氧）丙基 ]-]-NN ，， NN ，， N-N- 三甲铵硫酸二甲酯和二油酰磷脂酰乙胺，与三甲铵硫酸二甲酯和二油酰磷脂酰乙胺，与DNADNA 或或 RNARNA上带负电的磷酸基团结合，形成由阳离子上带负电的磷酸基团结合，形成由阳离子脂质包裹脂质包裹 DNADNA 的颗粒，随后脂质体上剩余的正电荷与细的颗粒，随后脂质体上剩余的正电荷与细胞膜上的唾液酸残基的负电荷结合，通过二者的融合将外胞膜上的唾液酸残基的负电荷结合，通过二者的融合将外源基因导入细胞。源基因导入细胞。

（（ 88）细胞核的显微注射法：）细胞核的显微注射法：

磷酸钙与DNA 形成共沉淀，附着细胞表面

DNADNA

--

-- --

--脂质体脂质体

++ ++++++

++++

++

++++++++

细 胞细 胞

——

——

——

————

————

——

——

—

重组子的筛选和鉴定

（一）根据载体的性状变化进行筛选

1 根据载体的抗药性标记进行筛选

载体上的抗药基因：

抗氨苄青霉素基因

抗四环素基因

抗卡那霉素基因等

凡是转入了载体的细胞都获得了这种

抗药性，可以在平板上生长菌落。

当带有完整抗药性基因的载体转化无当带有完整抗药性基因的载体转化无抗药性细胞后，凡转入载体的细胞都获得抗药性细胞后，凡转入载体的细胞都获得了抗药性，能在含有相应药物的琼脂平板了抗药性，能在含有相应药物的琼脂平板上生长成菌落，而未被转化的宿主细胞不上生长成菌落，而未被转化的宿主细胞不能生长。只带有一种抗药基因的载体组成能生长。只带有一种抗药基因的载体组成的重组的重组 DNADNA ，，在琼脂平板上生长成菌落在琼脂平板上生长成菌落是不能被区分是否是真正含有重组是不能被区分是否是真正含有重组 DNADNA

的抑或是空载体，需要进一步的鉴定。的抑或是空载体，需要进一步的鉴定。

2 根据载体抗药性插入失活选择

根据载体抗药性标志插入失活选择 根据载体抗药性标志插入失活选择

含有两个以上的抗药基因的载体，外源 含有两个以上的抗药基因的载体，外源 DNADNA

片段插入其中一个基因，并导致这个基因的失活，片段插入其中一个基因，并导致这个基因的失活，

就可用两个含不同药物的平板，互相对照，筛选就可用两个含不同药物的平板，互相对照，筛选

含重组含重组 DNADNA 的菌落，这就是插入失活效应。的菌落，这就是插入失活效应。

外源基因

抗 Amp 抗Tet

抗 Amp 抗 Amp抗Tet

抗Tet

重组 DNA 空载体 不含有载体或重组 DNA

3 -半乳糖苷酶系统

β-β- 半乳糖苷酶系统 半乳糖苷酶系统 载体： 载体： pUCpUC 、、 pGEMpGEM 系列载体等系列载体等 带有一个来自大肠杆菌 带有一个来自大肠杆菌 DNADNA 的短序列，的短序列，其中含有编码其中含有编码 β-β- 半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（ β- β-

galatosidasegalatosidase ））基因（基因（ LacZLacZ 基因）的基因）的调控序列和调控序列和 NN 端端 146146 个氨基酸的编码序列，个氨基酸的编码序列，在编码序列中插入了一个多克隆位点，但在编码序列中插入了一个多克隆位点，但不破坏阅读框架，不影响功能。不破坏阅读框架，不影响功能。

当这种载体转入的宿主细胞是含有当这种载体转入的宿主细胞是含有 β-β- 半乳半乳糖苷酶糖苷酶 CC 端编码序列时，此酶的端编码序列时，此酶的 NN 端序列和端序列和 CC端序列可以互补（成为端序列可以互补（成为 αα 互补），产生具有酶活互补），产生具有酶活性的蛋白质（性的蛋白质（ β-β- 半乳糖苷酶），从而使宿主细半乳糖苷酶），从而使宿主细菌在含有菌在含有 IPTG,X-galIPTG,X-gal 的培养基上呈的培养基上呈蓝色蓝色。 。

当多克隆位点有外源 当多克隆位点有外源 DNADNA片段插入时，破坏片段插入时，破坏此酶的此酶的 NN 端阅读框架，产生无端阅读框架，产生无 αα 互补功能的互补功能的 NN端片段，因此在带有外源端片段，因此在带有外源 DNADNA片段的细菌在含片段的细菌在含有有 IPTG/X-galIPTG/X-gal 的培养基上呈的培养基上呈白色白色。。

LacZ 基因

-半乳糖苷酶

在 X/gal培养基上呈现兰色

X-gal X(发色底物 )+gal( 半乳糖 )

- 半乳糖苷酶

4 根据外源性 DNA片段性状进行筛选

根据外源基因可能表达的蛋白质对缺

乏该蛋白的细菌的影响

如果外源性如果外源性 DNADNA片段可编码产生蛋白质，片段可编码产生蛋白质，并且该蛋白质为细菌生命活动所必需，可利用该并且该蛋白质为细菌生命活动所必需，可利用该蛋白质的性状进行筛选。蛋白质的性状进行筛选。

如亮氨酸是细菌生命活动所必需的，当外源性 如亮氨酸是细菌生命活动所必需的，当外源性DNADNA片段含有合成亮氨酸的基因时，将该外源片段含有合成亮氨酸的基因时，将该外源性性 DNADNA片段转入亮氨酸缺陷的细菌中，放入仅片段转入亮氨酸缺陷的细菌中，放入仅含亮氨酸的培养基中，只有能利用亮氨酸的细菌含亮氨酸的培养基中，只有能利用亮氨酸的细菌才能生长，因此，能生长的细菌即为含有外源性才能生长，因此，能生长的细菌即为含有外源性DNADNA片段。片段。

（二）根据重组（二）根据重组 DNADNA 的结构特征进行筛选 的结构特征进行筛选 11 、重组、重组 DNADNA 的快速裂解、鉴定 的快速裂解、鉴定 初步筛选方法，根据重组 初步筛选方法，根据重组 DNADNA 大小和载体大小和载体DNADNA 大小之间的差别来区分的。大小之间的差别来区分的。 琼脂糖凝胶中进行电泳分离 琼脂糖凝胶中进行电泳分离，紫外灯下观察并比较与载体，紫外灯下观察并比较与载体DNADNA片段迁移率，初步判断是片段迁移率，初步判断是否有外源否有外源 DNADNA插入。插入。

22 、限制性内切酶图谱进行分析 、限制性内切酶图谱进行分析

限制性内切酶进行酶切， 限制性内切酶进行酶切，

凝胶电泳分析是否有外源凝胶电泳分析是否有外源 DNADNA

的插入。的插入。

33 、核酸分子杂交方法进行鉴定 、核酸分子杂交方法进行鉴定 核酸分子杂交是核酸分析的重要方法，是鉴定重组 核酸分子杂交是核酸分析的重要方法，是鉴定重组DNADNA 的最通用方法，的最通用方法， 杂交方法 适用范围杂交方法 适用范围菌落印迹杂交 检测细菌体固定在膜上后，菌落印迹杂交 检测细菌体固定在膜上后， 经裂解释放的 经裂解释放的 DNADNA斑点杂交 检测未经凝胶电泳分离的，斑点杂交 检测未经凝胶电泳分离的， 固定在膜上的 固定在膜上的 DNADNA 或或 RNARNA原位杂交 直接检测细胞或组织中的原位杂交 直接检测细胞或组织中的 DNADNA 或或 RNARNASouthern Southern 印迹杂交 检测经酶切、凝胶电泳分离的，印迹杂交 检测经酶切、凝胶电泳分离的， 已转移到膜上的 已转移到膜上的 DNA DNA NorthernNorthern印迹杂交 检测经凝胶电泳分离的，印迹杂交 检测经凝胶电泳分离的， 已转移到膜上的 已转移到膜上的 RNARNA

4 PCR 反应进行鉴定

利用引物直接扩增外源基因进行检测

肺腺癌 β-cat mRNA 原位杂交法×400

Smad2 mRNA 在系膜增生型 IgA肾病肾小球的表达 原位杂交×200

复习思考题名词解释

重组 DNA 技术克隆限制性内切酶限制性内切酶的星号活力切口缺口DNA 连接酶同工异源酶同尾酶

简答题1 、限制性内切酶对双链 DNA 进行切割后可能产生的类型2 、产生限制性内切酶星号活力的原因3 、重组 DNA 技术中可能应用到的工具酶有哪些？

4 、 CaCl2 转化法的原理 5 、重组子如何进行鉴定与筛选？