![Page 1: НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ Кафедра біотехнології мікробного синтезу](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062314/56813043550346895d95e66f/html5/thumbnails/1.jpg)
11
НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ Кафедра біотехнології мікробного синтезу
Розробка технології інтерферонів І типу з використанням конструктивно оформленої індукторної системи багаторазової дії
к.т.н., доц. Пенчук Ю.М.,
Київ 2007
![Page 2: НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ Кафедра біотехнології мікробного синтезу](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062314/56813043550346895d95e66f/html5/thumbnails/2.jpg)
22
Мета дослідження Метою роботи є розробка нової технології отримання препаратів ІФН І типу з використанням комплексної індукторної системи дріжджова РНК-гідрохлорид тилорону, іммобілізованої на нерозчинному носії.
Задачі дослідження:
1.конструювання штучних конструкцій для здійснення процесу індукції ІФН І типу (α/β-ІФН) в умовах in vitro на основі молекулярних комплексів дріжджової РНК, яка ковалентно приєднана до нерозчинних гранулярних матриць, з гідрохлоридом тилорону (ІММК);
2.дослідне визначення кількісних та часових параметрів синтезу ІФН клітинами-продуцентами під дією контактів з гранулами ІММК в середовищі культивування;
3.розробка та конструювання установки для отримання ІФН в умовах in vitro з використанням моношарових та суспензійних клітинних культур, індукованих за допомогою ІММК;
4.експериментальна оцінка ефективності інтерфероногенезу в культурах обох типів під дією ІММК за різних технологічних умов, оптимізація параметрів біосинтезу ІФН в дослідній установці, як прототипі промислової апаратури, з застосуванням ІММК у якості інтерфероногену.
![Page 3: НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ Кафедра біотехнології мікробного синтезу](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062314/56813043550346895d95e66f/html5/thumbnails/3.jpg)
33
СХЕМА КОНСТРУЮВАННЯ ІНТЕРФЕРОНІНДУКУЮЧИХ МОЛЕКУЛЯРНИХ КОМПЛЕКСІВ
А - утворення інтерфероногенних дволанцюгових ділянок у складі одноланцюгової РНК під дією зв’язування з тилороном;
Б - конструювання часток ІММК
А
Б
А
Б
![Page 4: НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ Кафедра біотехнології мікробного синтезу](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062314/56813043550346895d95e66f/html5/thumbnails/4.jpg)
44
ВМІСТ РИБОПОЛІНУКЛЕОТИДІВ У ПРЕПАРАТАХ ІММК,
СТВОРЕНИХ НА ОСНОВІ РІЗНИХ ГРАНУЛЯРНИХ НОСІЇВ
НосійРозмір часток (мкм)
Ридостинмкг/г
poly(I)-poly(С)мкг/г
Дріжджова РНК,мкг/г
Сефадекс G-50
50-150 22,2 21,7 24,6
Сефароза 4В 60-140 27,1 26,8 29,3
Сферон 300 63-100 30,0 28,7 31,8
![Page 5: НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ Кафедра біотехнології мікробного синтезу](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062314/56813043550346895d95e66f/html5/thumbnails/5.jpg)
55
0
3,5
7
Сферон дріжджоваРНК
РНК-сферон РНК-сферон+ тилорон(ІММК)
РНК-тилорон
Тилорон Інтактнілейкоцити
Титр
ІФН,
log
2
ІНТЕРФЕРОНОГЕННА ДІЯ ІММК НА ОСНОВІ СФЕРОНУ, А ТАКОЖ ЙОГО ОКРЕМИХ КОМПОНЕНТІВ, НА ЛЕЙКОЦИТИ КРОВІ ЛЮДИНИ
![Page 6: НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ Кафедра біотехнології мікробного синтезу](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062314/56813043550346895d95e66f/html5/thumbnails/6.jpg)
66
ІНТЕРФЕРОНОГЕННА ДІЯ РІЗНИХ ІММК НА МОНОШАРОВІ КУЛЬТУРИ КЛІТИН
Тип ІММКТитри індукованого ІФН, МО/106
клітин
ПТП L-41 L-929
Сефадекс G-50+ РНК-тилорон 195 143 100
Сефадекс G-50+ ридостин 195 50 5
Сефадекс G-50+ poly(I)-poly(С) 300 200 125
Сефароза 4В+ РНК-тилорон 195 100 97
Сефароза 4В+ ридостин 26 17 20
Сефароза 4В+ poly(I)-poly(С) 250 136 130
Сферон 300+ РНК-тилорон 550 317 390
Сферон 300+ ридостин 275 234 170
Сферон 300+ poly(I)-poly(С) 456 290 230
![Page 7: НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ Кафедра біотехнології мікробного синтезу](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062314/56813043550346895d95e66f/html5/thumbnails/7.jpg)
77
РІВНІ ІНТЕРФЕРОНОГЕНЕЗУ В МОНОШАРОВИХ КУЛЬТУРАХ КЛІТИН ПІД ДІЄЮ РОЗЧИННИХ ТА ІММОБІЛІЗОВАНИХ ІНДУКТОРІВ
Індуктори
Титри індукованого ІФН, (log2)
L929 L41 ПТП
Ридостин 3,8 3,3 4,8
poly(I)-poly(С) 3,7 4,6 3,5
Дріжджова РНК-тилорон
4,0 3,6 3,6
Ридостин іммоб. 4,8 3,5 4,9
рoly(I)-poly(С) іммоб. 2,8 3,2 3,8
Дріжджова РНК-тилорон іммоб.
2,23 2,7 3,5
Контроль 0,16 0,15 0,17
![Page 8: НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ Кафедра біотехнології мікробного синтезу](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062314/56813043550346895d95e66f/html5/thumbnails/8.jpg)
88
0
1
2
3
4
0 3 6 9 12 15 18
Час культивування, год
Ти
тр і
нте
рфер
ону,
log
2
1
2
3
КІНЕТИКА НАКОПИЧЕННЯ ІФН ПІД ІНДУКТОРНОЮ ДІЄЮ ІММК МОНОШАРОВИМИ КЛІТИННИМИ КУЛЬТУРАМИ: 1 – ПТП; 2 – L41; 3 – L929
![Page 9: НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ Кафедра біотехнології мікробного синтезу](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062314/56813043550346895d95e66f/html5/thumbnails/9.jpg)
99
0
20
40
60
80
100
0 1 2 3 4
Цикли регенерації
Інд
укто
рн
а ак
тивн
ість
(%
)
0
20
40
60
80
100
Вм
іст
РН
К (
%)1
2
ЗМІНА ПАРАМЕТРІВ ІММК НА БАЗІ СФЕРОНУ У ЗАЛЕЖНОСТІ ВІД КІЛЬКОСТІ ЦИКЛІВ РЕГЕНЕРАЦІЇ.
1 – ІНДУКТОРНА АКТИВНІСТЬ ІММК; 2 – ВМІСТ РНК
![Page 10: НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ Кафедра біотехнології мікробного синтезу](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062314/56813043550346895d95e66f/html5/thumbnails/10.jpg)
1010
ІНТЕРФЕРОНОГЕННА ДІЯ РІЗНИХ ІММК В УМОВАХ СУСПЕНЗІЙНОГО КУЛЬТИВУВАННЯ ЛЕЙКОЦИТІВ КРОВІ ЛЮДИНИ
Тип ІММККількість індукованого
ІФН, МО/мл
Лейкоцити
Сефадекс G-50 + РНК-тилорон 677
Сефадекс G-50 + ридостин 540
Сефадекс G-50 + poly(I)-poly(С) 989
Сефароза 4В + РНК-тилорон 344
Сефароза 4В + ридостин 100
Сефароза 4В + poly(I)-poly(С) 550
Сферон 300 + РНК-тилорон 1800
Сферон 300 + ридостин 780
Сферон 300 + poly(I)-poly(С) 2000
![Page 11: НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ Кафедра біотехнології мікробного синтезу](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062314/56813043550346895d95e66f/html5/thumbnails/11.jpg)
1111
РІВНІ ІНТЕРФЕРОНОГЕНЕЗУ В СУСПЕНЗІЙНІЙ КУЛЬТУРІ ЛЕЙКОЦИТІВ КРОВІ ЛЮДИНИ ПІД ДІЄЮ РОЗЧИННИХ ТА
ІММОБІЛІЗОВАНИХ НА СФЕРОНІ 300 ІНДУКТОРІВ ПОЛІНУКЛЕОТИДНОЇ ПРИРОДИ
ІндукториТитри індукованого ІФН,
(log2)
Ридостин 3,7
poly(I)-poly(С) 5,7
Дріжджова РНК-тилорон 6,4
Ридостин іммоб. 3,4
рoly(I)-poly(С) іммоб. 5,9
Дріжджова РНК-тилорон іммоб.
5,25
Контроль 0,17
![Page 12: НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ Кафедра біотехнології мікробного синтезу](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062314/56813043550346895d95e66f/html5/thumbnails/12.jpg)
1212
0
1000
2000
0 6 12 18
Час культивування, год
Кіл
ькіс
ть ін
терф
ерон
а, М
О/м
л
КІНЕТИКА НАКОПИЧЕННЯ ІФН СУСПЕНЗІЙНОЮ КУЛЬТУРОЮ
ЛЕЙКОЦИТІВ КРОВІ ЛЮДИНИ ЗА ІНДУКТОРНОЇ ДІЇ ІММК
![Page 13: НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ Кафедра біотехнології мікробного синтезу](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062314/56813043550346895d95e66f/html5/thumbnails/13.jpg)
1313
ЗАГАЛЬНИЙ ВИГЛЯД УСТАНОВКИ ДЛЯ КУЛЬТИВУВАННЯ
![Page 14: НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ Кафедра біотехнології мікробного синтезу](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062314/56813043550346895d95e66f/html5/thumbnails/14.jpg)
1414
ємність для культивування клітин
фіксаторгумова кришка
КРІПЛЕННЯ ЄМНОСТІ ДЛЯ КУЛЬТИВУВАННЯ
СХЕМА ДОСЛІДНОЇ УСТАНОВКИ ДЛЯ КУЛЬТИВУВАННЯ КЛІТИН ТА БІОСИНТЕЗУ ІНТЕРФЕРОНУ
![Page 15: НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ Кафедра біотехнології мікробного синтезу](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062314/56813043550346895d95e66f/html5/thumbnails/15.jpg)
1515
0
0,5
1
0 4 8
Час культивування, год
Кіл
ькіс
ть ж
ивих
клі
тин,
мл
н./м
л 2
1
ВПЛИВ УМОВ КУЛЬТИВУВАННЯ НА ЖИТТЄЗДАТНІСТЬ КЛІТИН В
СУСПЕНЗІЙНІЙ КУЛЬТУРІ
0
0,5
1
1,5
2
0 4 8
Час культивування, год
Кіл
ькіс
ть ж
ивих
клі
тин,
мл
н./ м
л
1
2
ВПЛИВ УМОВ КУЛЬТИВУВАННЯ НА ЖИТТЄЗДАТНІСТЬ КЛІТИН В МОНОШАРОВІЙ КУЛЬТУРІ ПТП
1 – стаціонарні умови2 – культивування в дослідній установці
![Page 16: НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ Кафедра біотехнології мікробного синтезу](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062314/56813043550346895d95e66f/html5/thumbnails/16.jpg)
1616
0
900
1800
Cуспензійнакультура
МоношаровакультураК
ільк
ість
інте
рфер
ону,
МО
/мл
ВПЛИВ УМОВ КУЛЬТИВУВАННЯ КЛІТИН-ПРОДУЦЕНТІВ ІФН З ІММК КІЛЬКІСТЬ СИНТЕЗОВАНОГО ІФН
- культивування в дослідній установці;
- стаціонарні умови культивування
![Page 17: НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ Кафедра біотехнології мікробного синтезу](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062314/56813043550346895d95e66f/html5/thumbnails/17.jpg)
1717
– ПТП; – L41; – L929.
ЗАЛЕЖНІСТЬ РІВНІВ ІНТЕРФЕРОНОГЕНЕЗУ МОНОШАРОВИМИ
КУЛЬТУРАМИ ВІД ПОЧАТКОВОЇ КОНЦЕНТРАЦІЇ КЛІТИН
0
350
700
10^5 5×10 10^6 5×10^6 10^7 5×10^7
Концентрація клітин-продуцентів, кл/мл
Кіл
ькіс
ть ін
терф
ерон
у, М
О/м
л
105 5×105 106 5×106 107 5×107
![Page 18: НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ Кафедра біотехнології мікробного синтезу](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062314/56813043550346895d95e66f/html5/thumbnails/18.jpg)
1818
0
1000
2000
3000
10^5 5×10^5 10^6 5×10^6 10^7 5×10^7
Концентрація клітин-продуцентів, кл/мл
Кіль
кіст
ь інт
ерфе
рону
, МО/
мл
5×105105 106 5×106 107 5×107
ЗАЛЕЖНІСТЬ РІВНІВ ІНТЕРФЕРОНОГЕНЕЗУ ЛЕЙКОЦИТАМИ
ВІД ПОЧАТКОВОЇ КОНЦЕНТРАЦІЇ КЛІТИН
![Page 19: НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ Кафедра біотехнології мікробного синтезу](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062314/56813043550346895d95e66f/html5/thumbnails/19.jpg)
1919
0
50
100
10/1 1/1 1/10 1/100 1/1000
Відношення часточок індуктору до клітин
Вижи
ваєм
ість к
літи
н, %
ЗАЛЕЖНІСТЬ ЖИТТЄЗДАТНОСТІ КЛІТИН ВІД СПІВВІДНОШЕННЯ ЧАСТОК ІММК ДО КЛІТИН
0
5
10
10/1 1/1 1/10 1/100 1/1000
Відношення часточок ІММК до клітин
Титр
ІФН,
log
2
ЗАЛЕЖНІСТЬ ВИХОДУ СИНТЕЗОВАНОГО ІФН ВІД СПІВВІДНОШЕННЯ ЧАСТОК ІММК
ДО КЛІТИН
– суспензійна культура,
– моношарова культура (ПТП)
![Page 20: НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ Кафедра біотехнології мікробного синтезу](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062314/56813043550346895d95e66f/html5/thumbnails/20.jpg)
2020
АПАРАТУРНА СХЕМА ОТРИМАННЯ ІНТЕРФЕРОНУ І ТИПУ З ВИКОРИСТАННЯМ ІММОБІЛІЗОВАНОЇ ІНДУКТОРНОЇ СИСТЕМИ
БАГАТОРАЗОВОЇ ДІЇ
1 - З ЛЕЙКОЦИТІВ 2 - З КУЛЬТУР КЛІТИН
![Page 21: НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ Кафедра біотехнології мікробного синтезу](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062314/56813043550346895d95e66f/html5/thumbnails/21.jpg)
2121
ВИСНОВКИ1.Розроблено технологію одержання препаратів інтерферону І типу з використанням імобілізованого
молекулярного комплексу (ІММК) у якості індуктору, яка дає змогу використовувати ІММК впродовж шести циклів інтерфероногенезу.
2.Сконструйовано штучні конструкції для здійснення процесу індукції ІФН І типу (α/β-ІФН) в умовах in vitro на основі молекулярних комплексів дріжджової РНК, яка ковалентно приєднана до нерозчинних гранулярних матриць, з гідрохлоридом тилорону. Показана інтерфероногенна здатність таких конструкцій, вивчена динаміка синтезу індукованого ними ІФН і доведена його належить до ІФН І типу (α/β-ІФН).
3.Досліджено значення величин ζ-потенціалів індукторних систем на основі Сферону 300 та лейкоцитів: (-3,9 mV) – Сферон 300-РНК; (-4,6 mV) – Сферон 300-ридостин; (-5,2 mV) – Сферон 300-poli(I)-poli(C); лейкоцити (-13,5 mV)
4.Встановлено, що вміст іммобілізованих рибополінуклеотидів в отриманих індукторних системах становить (мкг/г): на основі Сферону 300 (РНК – 31,8±2,6, ридостин – 30±2, poli(I)-poli(C) – 28,7±3); на основі Сефадексу G-50 (РНК – 24,6±1,2, ридостин – 22,2±1,6, poli(I)-poli(C) – 21,7±3,9); на основі Сефарози 4В (РНК – 29,3±2, ридостин – 27,1±3, poli(I)-poli(C) – 26,8±3,9).
5.Визначено кількісні та часові параметри синтезу ІФН клітинами-продуцентами суспензійної та моношарових культур під дією контактів з гранулами ІММК в середовищі культивування. Встановлено, що найвищого рівня продукція ІФН лейкоцитами крові людини досягає на 10 год, ПТП – через 4 год, L-41 – через 3 год, а L-929 – через 5 год.
6.Розроблено і сконструйовано дослідну установку, яка може слугувати прототипом промислової апаратури при одержанні ІФН в умовах in vitro індукованого за допомогою ІММК з застосуванням моношарових та суспензійних клітинних культур.
7.Експериментально оцінено ефективність та проведено підбір технологічних параметрів інтерфероногенезу в культурах обох типів під дією ІММК. Встановлено, що оптимальними параметрами інтерфероногенезу є швидкість обертів валу 5 об/год, вміст сироватки великої рогатої худоби 17 %, співвідношення клітин-продудентів до часточок індуктору 100 до 1.
8.Розроблено апаратурно-технологічну схему отримання інтерферону І типу для обох типів досліджених культур з використанням іммобілізованої індукторної системи багаторазової дії.
![Page 22: НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ Кафедра біотехнології мікробного синтезу](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062314/56813043550346895d95e66f/html5/thumbnails/22.jpg)
2222
ДякуюДякую за увагу!за увагу!