UniversidadComplutensedeMadrid
FacultaddeCienciasQuímicas
DepartamentodeIngenieríaQuímica
*530986438XUNIVERSIDAD COMPLUTENSE
¼5 1
DesarrollodeModelosCinéticospara
Bioprocesos:Aplicacióna la Producción
deXantano
MEMORIAqueparaoptaral
GRADO deDOCTORpresenta:
AlmudenaLeónMartín
Madrid, 19994
A la memoriademi padre,siempreconmigoA mi madre
La Tesis doctoral que presentaDfla. Alniudena Alcón Martín,titulada: “Desarrollo de Modelos Cinéticos para Bioprocesos:Aplicación a la Producción de Xantano”,es un completoestudio delos diferentes modelos cinéticos que pueden ser aplicados a unprocesode interésindustrial, como es la producciónde xantanoy, ennuestraopinión, reune los requisitos necesariosde originalidad yseriedadcientífica para ser defmidacomo TesisDoctoral. El trabajoha sido realizado en los laboratorios de Ingeniería Química de laFsacultad de C.C. Químicas, bajo nuestra dirección y ha sidosubvencionadopordiversasinstitucionespúblicas.
ProfesorDr. Félix García-OchoaSoria
Dra. Victoria E. SantosMazorra
El presentetrabajo de Investigaciónha sido realizado en elDepartamentode IngenieríaQuímicade la Facultadde CienciasQuímicasde la UniversidadComplutensede Madrid, bajo laDirección del Profesor Dr. D. FELIX GARCIA-OCHOASORIA y de laDra. Dita. VICTORIA E. SANTOS MAZORRA,a los que quieroexpresarmi agradecimientopor su enseñanza,confianzay apoyodurantetodo el tiempo que me ha llevado larealizacióndel trabajoplasmadoen estaMemoria.
AGRADECIMIENTOS
Deseoagradecerla ayuda directa o indirecta en el desarrollo de esta TesisDoctoral a una serie de personas cuya inestimableayuda me ha hechomásfácil ygrat~ficantemi trabajo duranteestosaños:
En primer lugar, mi agradecimientoespecial al Prof Felix García-Ochoa,tanto por la aportación cientWcacomopor su estímulo,y enormepaciencia. Deseoagradecerleel gran esfuerzorealizado, especialmenteen la última etapa de estetrabajoy por todo lo quehe aprendidode él en estosúltimos meses.
A Vickv,por su enseñanzay amistad,por los buenosy malosmomentos.
Al Centro de Citometría de Flujo de la Facultadde Farmacia, especialmenteaAlberto Alvarez, quien siempreestuvo dispuestoa echarmeuna mano y a darmeconsejoen lo que necesité.
Al Centro de MicroscopiaElectrónicaLuis Bru, de la UniversidadComplutensede Madrid, especialmentea Agustín,por su ayuda buenosconsejospara observaryfotografiar a “mis bichitos
Al Departamentode Bioquímicay BiologíaMolecular, especialmentea la Dra.Pilar Castillón y a la Dra. CarmenAcebalpor poner a mi alcancela utilización delespectrofluorímetro,necesariopara la realización de estetrabajo.
Al ProfesorD. Pedro Luísy Luis, por su categoríacient{flea y humana,por susbuenosconsejosy ánimosdesdeel princz~iode estaTesisDoctoral.
A la Dra. Aurora Santosy al Dr. Jose Antonio Casaspor estar siempredispuestosa echarmeunamanoyfacilitar mi trabajo.
A José Timón, siempredispuestoa arreglar lo que dábamospor perdido ysuponíaperdero retrasarel trabajo.
A Inma,porsu amabilidady ayudaprestadaen todo momento
Quiero agradecer el apoyo, y siempreprácticos consejos, de mi compañeroMiguelLadero, con quien he compartidodurante los añosde realización de esta Tesistrabajoy amistad
A mi compañeroEmilio Gómez,por su inestimableayudaprofesionaly apoyopersonal durantela realizaciónde estetrabajo.
A JoseCarlosy a David, con quieneshe compartido estosdos últimos añosdetesis,graciaspor su sinceraamistady la ayuda que me han brindado. Graciaspor elbuenhumory las risas de cadadía.
Al resto de compañerosde laboratorio Virginia, David, Alexy Pedropor suinterésy aportacióndirecta o indirecta en estetrabajo.
A misamigas “del otro lado delAtlántico “, Liliana, Verónicay Miriam, con lasque compartítrabajo, consejos,y sin duda, amistad.
Quiero agradecer también a mis alumnos de la Academia,especialmenteaKhjad¿¡a, Besmay Monia, quienesmehan dadograndesánimosparaterminar.
Por supuestono puedoolvidarme de mis amigoscon quieneshe compartidomomentosfelicesy otros no tan felices. Gracias a todos por los ánimos, por lasllamadas,por las visitasy por elgran apoyoque mehabéisdado, especialmenteen losúltimosmeses.Mi máscariñosoagradecimientoa Sangeey a NPJosé,y por supuestoaEva,Samaria,Bea,Raví,Gisella,JuanMa, Pepe,Alberto, Raquel,...
A migranamigoFernandode la Paz,porsusinceraamistady su apoyo.
A Rodrigo,por su amistad, fuerzay cariño para la redacciónde la mayorpartede estaMemoria.
Quiero reservar las últimas líneaspara agradecer a mi familia su cariño ygrandesdosisde paciencia.A mis hermanospor su ayuday buen humor, por estarsiempreahí cuandoha sido necesario.Tambiéna Maria, Gema,Aurora yAlbertoporsusánimosconstantesy gran apoyo.
A mi madrepor susmimos, pacienciay gran impulso,para continuargraciaspor todo.
Y, por supuesto,a mi padre, quefue el que más meanimó para empezarconestaTesis, casi con más ilusión queyo. Gracias por tu sacr¼cio,por tu enseñanzaypor tu cariño.
INDICEPágina
1.- INTRODUCCIÓN 1
1.1.-OBJETO Y ALCANCE DEL TRABAJO 10
1.2.-MODELOS CINETICOS 12
1.2.1.-ModelosCinéticos No Estructurados, No Segregados 12
1.2.1.1.-ModelosNo Estructurados del Crecimiento 13
1.2.1.2.-Modelosde Consumo de Sustratosy Formación de 18
Productos.
t.2.1.3.-Influencia de las Variables en los Parámetros /9
1.2.2.- Modelos Metabólicos 24
1.2.3.-Modelos Estructurados o de Célula 30
1.2.3.1.-ModelosCompartimentados 30
1.2.3.2.-Modelosde Célula 35
1.2.4.-Modelos QuímicamenteEstructurados 38
1.2.5.-Modelos Segregados 39
1.2.6.-In2eniería Metabólica 43
1.3.- GOMA DE XANTANO 47
1.3.1.-Xanthomonas campestris 56
1.3.2.-ProduccióndeXantano 59
1.3.3.-Transporte de Oxígeno 67
1.3.4.-Aislamiento y Purificación 74
1.3.5.-Propiedadesdel Xantano 78
2.-PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL 85
2.1.-EQUIPOS 85
2.2.-MATERIALES EMPLEADOS 101
2.2.1.-Microorganismo 101
2.2.2.-ReactivosUtilizados 103
2.2.3.-Composiciónde los Medios Empleados /06
2.2.4.-Composiciónde las DisolucionesTampón y Preparacionespara
análisis /07
i
Página
2.3.-REALIZACIÓN DE UN EXPERIMENTO /08
2.4.-MEDIDA DE COMPONENTES EXTRACELULARES 110
2.4.1.-Análisisde Biomasa líO
2.4.2.-Medida de la Concentraciónde Sustrato Carbonado /1/
2.4.3.-Medida de la Concentarciónde Sustrato Nitrogenado /13
2.4.4.-Análisis de Xantano 114
2.5~ ANÁLISIS DE COMPONENTES INTRACELULARES lId
2.5.1.-Análisis de ComponentesIntracelulares por
Espectrofotometría de Absorción /18
2.5.1.1.-Análisis de Proteínas /18
2.5.1.2.-Análisis de ÁcidosNucleicos /21
2.5.2.-Técnicasdc Fluorescencia /25
2.6.-MÉTODOS MATEMÁTICOS 135
2.6.1.-Técnicasde Estimación de Parámetros 135
2.6.2.-Simulación con los Modelos Cinéticos 137
3.- RESULTADOS EXPERIMENTALES 141
4.- MODELO CINETICO NO ESTRUCTURADO 153
4.1.- FORMULACIÓN DEL MODELO 159
4.2.-AJUSTE DE LOS DATOS EXPERIMENTALES 161
4.3.- DISCUSIÓN 181
4.3.1.-Estudio de la Variación del Valor de los Parámetroscon las
Variables 181
4.3.1.1.-Influencia de la Temperatura 181
4.3.1.2.-Influencia dc la Cocentraciónde Amonio Inicial 189
4.3.2.-Simulación con el Modelo Cinético No Estructurado 191
4.3.2.1.-Influenciade la Biomasa Inicial 193
4.3.2.2.-Influencia de la Concentraciónde Azúcar Inicial /97
4.3.2.3.-Influencia de la Agitación 199
4.3.3.-Validez del Modelo Cinético No Estructurado 201
Páizina
5.- MODELO CINÉTICO METABÓLICO 203
5.1.-FORMULACIÓN DEL MODELO 2/2
5.2.-AJUSTE DE LOS DATOS EXPERIMENTALES 2/6
5.3.-DISCUSIÓN 231
5.3.1.- Variación del Valor de los Parámetros con las Variables 231
5.3.1.1.-Influencia de la Temperatura 231
5.3.1.2.-Influencia del Amonio Inicial 237
5.3.2.-Simulacióncon elModelo Cinético Metabólico 239
5.3.2.1.-Influenciade la BiomasaInicial 241
5.3.2.2.-Influencia de la Concentración de Azúcar Inic¡al 244
5.3.2.3.-Influencia de la Agitación y el Caudal del Aire 246
5.3.3.-Validez del Modelo Cinético Metabólico 249
6.-MODELO CINÉTICO DE CÉLULA 251
6.1.-ETAPAS EN EL PLANTEAMIENTO DEL MODELO 254
6.2.-MODELO CINETICO DEL CRECIMIENTO DE Xanthomonas
campestris 261
6.2.1.-Determinación de las EspeciesQuímicasy Formulación del
Esquemade Reacción 261
6.2.2.-Propuestade las EcuacionesCinéticas 281
6.2.3.-Obtención de Parámetrospor Ajuste en Múltiple Respuesta 306
6.2.4.-Discriminación de Modelos Cinéticos 350
6.2.4.1.-Criterios Estadísticos 350
6.2.4.2.-Discriminación por Criterios Físicos: Variación de los
Parámetroscon las Variables 353
6.2.5.-Mejora de las Deficienciasdel Modelo Cinético de Célula 366
7.-MODELO CINÉTICO QUÍMICAMENTE ESTRUCTURADO 377
7.1.-PLANTEAMIENTO DEL MODELO 381
7.2.-APLICACIÓN DEL MODELO CON DATOS
EXPERIMENTALES 383
7.2.1.- Mejora del Modelo QuímicamenteEstructurado 393
iii
Pá2ina
7.3.-SIMULACIÓN CON EL MODELO CINÉTICO QUÍMICAMENTE
ESTRUCTURADO
8.- RESUMEN Y CONCLUSIONES
8.1.- RESUMEN
8.2.-CONCLUSIONES
9.- NOMENCLATURA
10.- BIBLIOGRAFÍA
404
41/
4/1
419
431
437
iv
1.- INTRODUCCIÓN
Introducción
1.- INTRODUCCIÓN
Los procesosllevadosa cabo con microorganismoshan llegado a ser una fuente
importante de numerosos productos comerciales, principalmente en la industria
farmacéuticay alimentaria,pero tambiénen otras industrias,tales como la cosmética,el
análisisclínicoy químico,en la biorremediacióncon fines ambientales,etc.
Desdeque hacevariasdécadasseempezarona producir antibióticos,el cambio de
escalade los procesosdesarrolladosen laboratorioha sido consideradoun problemade gran
complejidad,dondela metodologíaempleadaen los procesosquímicospuedeseraplicada.
Los modelos fenomenológicos,basadosen fenómenos de transponeacopladosa las
reaccionesquímicas,puedenserdesarrolladosy aplicadosparael diseñodel biorreactor.La
dificultad que seplanteaen el estudiode estetipo de sistemassedebea sunaturaleza:son
sistemastrifásicosgas-líquido-sólido.La peculiaridadde estossistemasradicaen que en la
fasesólidaserealizanlas transformacionesque llevan tanto al desarrollodel propio sólido o
cultivo microbiano (crecimiento)como a la síntesisde los productosde interés. Dichas
transformacionesnecesitanla presenciade gran cantidadde nutrientesque se encuentran
principalmenteen la fase líquida, siendo de especialimportancia la llegadadel oxígeno,
desdeel aire, en sistemasaerobios.
1
Jntroduccwn
En el cambio de escalade este tipo de procesos,la importancia relativa de los
diferentes fenómenos involucrados va cambiando. Así, se deben considerar varios
fenómenosque hay que estudiarde formaaisladapara,una vezque el conocimientode los
mismoses suficiente,seracopladoscon vistas a la descripcióndel procesoglobal. Durante
el procesode cambiode escalalo que va variandoesla velocidadrelativade los diferentes
fenómenosy, quizás,la etapacontrolantede la velocidadglobal del proceso.Debido a la
complejidadde estossistemasmicrobianos,el cambiode escala no se realizaen un solo
pasodesdela escalade laboratorioa la escalade producción.En el laboratoriogeneralmente
se opera con Erlenmeyers,donde se buscannuevosproductos, mecanismosde control,
mediosde produccióny se mejoranlas cepas.Despuésse pasaa un biorreactor, de 1 a 2
litros de volumen, donde el contacto gas-líquido es muy distinto de la etapa anterior,
despuésa un tamañomayor, entre 10 y 20 litros. A estaescala,que de forma generalse
llama PlantaPiloto, seestudian o secompruebanlos efectosde diferentesvariables,tales
como la velocidadde agitación,el caudal de aire, la temperatura,el control del pH, etc.,
buscándosela simplificaciónde los problemas.En la primeraetapa,a escalade laboratorio,
tambiénseabordael estudiode los diferentesfenómenosy variablesde forma aislada,para
facilitar tanto el estudio como la comprensión.Cuando todos estos fenómenossean
suficientementeconocidosdeben ser acoplados,y el conjunto debedescribir el proceso
global. Así, se puedeprocederal diseñodel biorreactordondellevar a cabola producción,
para Jo que se deben conjugartodos los factoresde modo que la productividadsea la
máximaalcanzable.Por tanto, esnecesariorealizarun cambiode escalateniendoen cuenta
que el comportamientodel microorganismo,en cadanivel de producción,puedeno serel
mismo; las diferencias pueden ser debidas a que las cantidadesde energía y materia
involucradasson distintasparaproducir la transformación.La complejidadde los sistemas
que usanmicroorganismoslleva, en la práctica,a utilizar varias etapasde comprobaciónen
el cambiode escala,y no solo una -de plantapiloto- como ya es habitual en la Industria
Química.
Entre los fenómenosbásicos a teneren cuenta en el caso de transformaciones
microbianasson destacablesla transferenciade materia entre las fasesdel sistema, la
descripciónde la compleja red de reaccionesque tiene lugar en el interior de las células y
el posibledañoo “stress” que sufren las células debido a las condicioneshidrodinámicas
necesariasen el sistemaparaque el primerode los fenómenoscomentadosno seala etapa
limitante del proceso.
2
Introducción
• Transferencia de materia entre fases
El mecanismoglobal de transportede nutrientesa las células,su utilización y la
produccióny eliminaciónde metabolitos, se puedendividir en una serie de etapas
(Figura 1.1), cadauna de las cualesofreceuna resistencia.Estasetapassepueden
resumir de la formasiguiente(Quintero, 1981; Moo-Youngy Blanch,1987):
- Transportede nutrienteso productosdesdeel senodel gas hastala interfasegas-
líquido.
- Intercambioen la interfasegas-líquido.
- Transportedesdela interfaseal senode la fase líquida.
- Transponea travésde la faselíquida.
- Transportea travésde la películade líquido querodeala célula.
- Transporteatravésde la membranao paredcelular.
- Transporteen el interior de la célula,hastael lugardonde se producela reacción
bioquímica.
Estesistemapuedegeneralizarsea otros donde la fase continuano sea un líquido
sino un gas,e incluso,en casosespeciales,puedeserun sólido (fermentacionesen
estadosólido, de compostaje,por ejemplo) y la fase dispersauna o más de las
siguientes:
- Sólidos,talescomo células,partículascon enzimassoportadasy sustratossólidos.
- Líquidos,talescomosustanciasinsolubles.
- Gases,como aire,dióxido de carbonoy metano.
En la mayoríade los biorreactores,la resistenciaen la faselíquida suponeel control
global de la transferenciade materia, siendo una de las siguientes la etapa
controlantedelproceso(Moo-Youngy Blanch, 1987):
- La combinaciónde la resistenciaen la películadel líquido y la interfasegas-
liquido. Estas resistencias son frecuentementela etapa controlante en la
transferenciade oxigeno,debidoa labajasolubilidadde estecompuestoen agua.
3
Introducción
- Resistenciaen la faselíquida en la separacióndel medio acuosocontinuoy la fase
dispersa.Suimportanciapuedeserminimizadamedianteunabuenamezcla.
- Resistenciade la faselíquida en laproximidadde la interfasesólido-liquido. Esta
resistenciapuedesersignificativa debido a la pocadiferenciade densidadentreel
medio acuosocontinuo y la fase dispersa(microorganismos,células vegetalesy
animales).
- Resistenciade la faseliquida en la carade la fasesólidadispersa.Estaresistencia
puedesersignificativaen procesoscon célulasfloculadasy enzimasinmovilizadas.
Comoya se ha comentado,los sistemasmicrobianossonheterogéneos,normalmente
gas-líquido-sólido.Es por tanto imprescindibleprestaratenciónal transportede los
nutrientesen el sistema,ya que su disponibilidadpor partedel microorganismoes
totalmente necesariapara el conecto desarrollodel proceso de producción. De
especialimportanciaesel transportegas-líquidoen los sistemasaerobios,ya que el
oxígenoesnecesarioparaun grannúmerode reacciones.
La máxima productividady concentracióndel productoalcanzableen un proceso
microbiológicoaerobio,en la obtenciónde biomasao producto,puedeestarlimitada
por la velocidadde transportede oxigeno, la cual a suvez estádeterminadapor el
valor del coeficientevolumétricode transferenciade materia,kLav. El valor de este
coeficiente dependede muchasvariables,como el tipo de biorreactorempleado,el
sistema de aireación y mezcla y de las propiedadesfisicas del fluido (Yagi y
Yoshida, 1975; Gómez, 1995). Dentro de las propiedadesfisicas, la viscosidades
una de las propiedadesmás significativas en los procesosde producción de
polisacáridosmicrobianos,ya que la reología del cultivo esuno de los factoresque
determinala capacidadcte transportede materiay calor en los biorreactores(Pacey
Righelato, 1980: Gómez, 1995).Un descensode la concentración de oxigeno por
debajodel valor critico puedeprovocarun descensoacusadoen la produccióndel
metabolito (Yang y Wang, 1992; Santos 1993), la producciónde otro metabolito
distinto al deseado(Moesy col,, 1985;Galindoy Herrera,1989; Zhou y col., 1992)
e inclusodañosirreversiblesen las células(Meijer, 1989;Meijer y col., 1994).
4
Introducción
El mantenimientode las condicioneshidrodinámicasnecesariaspara el correcto
aporte de nutrientes a los microorganismospuede resultar perjudicial para el
proceso,sometiendoa los microorganismosal denominadostresshidrodinámicoo
daño celular. Este efecto lo puedensufrir las células cuandose sometena unas
condicionesque favorecenel transportede oxigeno —o de nutrientesen general-,
pero que sus estructuras,tanto internascomo externas,no son capacesde soportar,
afectandoa sumetabolismo,y por tanto a sucomportamientogeneral.Sin embargo,
estefenómenono ha sido todavíasistemáticamenteestudiadoni descritoparapoder
ser incorporadoen la descripciónglobal de un sistemamicrobiano(Meijer. 1989;
Merchuk, 1991).
Resistenciasenel TransponedeMateria
Figura 1.1.-Esquemade las resistenciasen el transportede oxígenodesdeel gashastaelmicroorganismo,o la fasesólidacon enzimao célulasinmovilizadas.
Po2‘¡tG
lA8
Gr
oGfl
InterfaseGas-Líquido
Membrana
Co2
0
4
ni
ni o:o’— ¡
o’:4
4
4:
u— ¡4’
o:
4
4:
o‘o
Gr
5
Introducción
• Transformación dentro del Microorganismo
Se trata siempre de una transformación compleja, es una red de reacciones
enzimáticas de varios tipos, de óxido-reducción, oxidativas, de síntesis, de
producción de energía, etc. El microorganismodurante su crecimiento produce
numerosasmacromoléculascomplejasa partir de 100 unidadesde monómeros.En
las rutas bioquímicas, para llevar a cabo estas transformaciones, intervienen
alrededorde 1000enzimasdiferentes.El metabolismobioquímicoes dividido en dos
rutas generales:rutas anabólicas,para la síntesis de moléculascomplejas y los
precursoresde los intermedios,y rutascatabólicas,que aportanla energianecesaria
paralos procesosanabólicos.Estasdosactividadesdivergentesestánestrechamente
ligadas,tal como se muestraen la Figura 1.2, la cual esun esquemadel entramado
de red de reaccionesque ocurrenduranteuna transformaciónmicrobiana.En esta
figura se muestran solo las principales rutas de biosíntesisy sus principales
conexionescon las rutascatabólicas,de unaforma muy simplificada.
Esta enormecomplejidadse podría solventarsi se consideraseal microorganismo
como un catalizador,que por un complejo mecanismoproduce un servicio o un
producto. Peroesteplanteamientono resultaválido, puesestasreaccionestienenun
cierto carácterautocatalítico,debido al crecimientodel microorganismo,y paraello
seutiliza reactantes(nutrientes),con lo que el procesose complicanotablemente,no
siendoevidenteslas relacionesestequiométricas,o en otraspalabras,el “catalizador”
intervieneen laestequiometríade la(s) reacción(es).
Esto implica medir un mayornúmerode componentesparadescribir el sistema,lo
que a su vez lleva implícito un número elevadode parámetrosen las ecuaciones
cinéticas,que hay que determinar,y que no esfácil llegar a valorespor ajustede
datosexperimentales.Portanto, el abordajedelproblemaesenormementecomplejo,
comoya seha indicado,ya queocurrencientosde transformacionesen el interior de
cada microorganismo.El metabolismo incluye sustratos -frente de carbono y
nitrógeno-y otros nutrientes(fósforo, azufre,metales,etc) y, dependiendodel caso,
la producción de energía, síntesis de proteínas,ácidos nucleicos, enzimas que
conllevanel crecimientodcl microorganismo,etc,
6
Introducción
ANABOLISMO CA TABOLISMO ANABOLISMO
MXNADA
DNAA TPRNA
ANudeátidosDesoxinucleñtidos
Acido Fólico
p-aminobenwatop-hidroxibenzoato
hexosa
41Pentosa
Nucleátidos Glicósidos
Triosa Glicerol
Tetrosa P-Gticerato
Fosfoenolpiruvate
¿Piruvato
Quit,J respiratoria
Aspartato
}sI!Porjirinas
Acetil-CeA
4
Serbia fr01¿cina
$Cisteina
Glutamina
Ácidos grasos, Lípidos,Poliquétidos
Meya/en ato, Esteroides,Carotenoides, Terpenos
Oxalacetato —.—~. Citrato
ArgininaPretina
Succinato < 2-Oxoglutarato
Figura 1.2.-Esquemageneralde las rutasanabólicasy del catabolismocentral
Histidina
TirosinaTripto’fano
TriglicéridosU,iidos membrana
PurinasPirbnidinas
+Porfirinas,etc.
Purinas
Treonina¡so/encina1’!etioninaLisina
¡ Giutamato
—1——fr GlutaminaTransferenciaNH
4t
-7
Introducción
Esta red de reaccioneses complicadade describir, por un lado se cuenta con el
apoyo de los métodosmatemáticospara la resolucióndel problemade cálculo de
parámetros~no obstante,con el actualdesarrolloy facilidaddel cálculonumérico, la
principal dificultad sigue siendo la medida de un elevado número de especies
químicas, cuyo análisis permitiráconocerla evolución de las concentracionesque
podránser descritasa través de un modelo cinético de mayor o menor grado de
dificultad.
Níelsen y Villadsen (1994) dan como definición de modelo cinético para la
descripción de un proceso microbiano la siguiente: ‘.. la correlación verbal o
matemáticaentre velocidadesy concentraciónde reactantes/productos,los cuales
son insertados en balances de materia y permiten la predicción del grado de
conversión de sustratos y el rendimiento de productos individuales en otras
condicionesde operacion
La complejidadde los modeloscinéticosparadescribirel cambioproducidodentro
de la célula duranteuna transformaciónmicrobianapuedeser muy amplia. Se han
propuestonumerososmodeloscinéticos, los cualesse puedenclasificar segúnse
recogeen la Tabla 1.1 (García-Ochoay col., 1999a).
Los modeloscinéticosmássimplesson los modeloscinéticosno estructurados-no
segregadosque consideran al microorganismo como un único componenteque, de
formagenérica,denominanbiomasa(expresadacomo masade microorganismoseco
porvolumen de sistema,pero esto solo por la forma habitualde realizarla medida).
Los modelosdenominadosmetabólicosconsideranrutas metabólicassimplificadas
dentro del microorganismoen las que únicamenteestá involucrado el sustrato
carbonado.En un modelo estructuradoo de célula se considerael metabolismodel
sustratonitrogenado,describiendoel crecimientomedianteesquemassimplificados
de reacción.Cuandose unen los esquemassimplificadosde reacciónprocedentesde
modelosmetabólicosy de modelosde célula seobtienenlos modelosquímicamente
estructurados,en los que sedescribeel metabolismomicrobiano global de forma
simplificada,considerandoal microorganismoformadopormultitud de componentes
internosque reaccionanentresí. Un modelo segregadoesaquelque consideraque
8
Introducción
una población está formada por microorganismosdiferentes. En el caso de los
microorganismospresentesen un cultivo puro, en el que se presentandistribuciones
de algunapropiedadcomo edad,tamaño,etc. Se puedendenominartambiéncomo
modelos morfológicamente estructurados. En el caso de los cultivos mixtos, la
segregaciónpuedereferirseúnicamentea la consideraciónde diferentes“biomasas”
empleandoparala descripciónde cadauna de ellas modelosno estructurados-no
segregados(García-Ochoay col., 1999b).
Los modelosmás sencillos o no estructuradosno-segregadosson empleadospara
numerosasaplicacionesen la solución de problemasde ingeniería,pero para una
mejor descripcióndel sistemaes necesarioutilizar modelosque tenganen cuenta
esquemasde reaccióncomplejos, es decir que tenganen cuenta las rutas del
metabolismode cadamicroorganismo.
Tabla 1.1.- Clasificaciónde ModelosCinéticos.
Modelo Cinético Concepto
NO ESTRUCTURADO--NO SEGREGADO
La biomasaseconsideracomoun único componenteSeconsiderauna célula media comorepresentativadelcultivo.
METABÓLICONormalmenteno estructurado-nosegregado.Se describenlas rutas metabólicascomo una red dereacciones empleando un esquema simplWcado dereacción,con relacionesestenimétricasde midas.
ESTRUCTURADO(o de CÉLULA)
La descripciónde la biomasase realiza considerándolaformada por varias especies.Se tienen en cuenta loscomponentesintracelulares.
QUÍMICAMENTEESTRUCTURADO
Se consideraa la biomasaformadapor varias especiesytambién un metabolismo simplWcado (una red dereacciones).
SEGREGADOEn la descripcióndel microorganismose considera ladistribución de alguna propiedadNo se considera unmicroor anismomedio.
9
Introducción
1.1.-OBJETO Y ALCANCE DEL TRABAJO
El presentetrabajo de investigación trata de conseguirla aplicación de diferentes
modelos cinéticos de diferente grado de complejidad a un proceso microbiano,
comprobandola mejora en la descripcióndel sistema. Es decir, pretenderealizar una
aplicación de la metodología de la Ingenieria Química en un sistema de producción
llevado a cabopor un microorganismo,el cualsintetiza un productode interésindustrial.
El sistemaa modelizares la producciónde xantano,un sistemabien conocido.
Esteprocesoya ha sido estudiadoy desarrolladoen un trabajoprevio (Santos, 1 993) y se
tiene el conocimientosuficientede las variablesque influyen en el procesode producción,
concretamentela temperatura,la composicióndel medio y la velocidadde transportede
oxigenojueganun papelrelevanteen el procesode producción.
Los modeloscinéticosque se plantearántratan de conseguirla descripciónde la
influencia de ciertas variables en dicho proceso de producción, considerando
posteriormentetodos los diferentesfenómenos involucrados, de forma que el conjunto
sirva como modelopredictivo de la evolucióndel sistemay surespuestaa perturbacionesen
el medio,variablesde operación,etc.
Los modelosque se van a proponera lo largo de estaTesisDoctoralsonde diferente
gradode complejidad.El primerpasoescomenzarpor un modelo sencillo,de los conocidos
como no estructurados, puesdesde un punto de vista técnico tiene sentido iniciar un
estudiode estetipo con los modeloscinéticosmás sencillos.Además,el abordaje,tanto
experimentalcomo matemático,es relativamenteasequible, lo que hace que el primer
planteamientoal comenzara modelizar un sistema sea con modelos de este tipo. Se
determinarási estemodelo es suficientepara la descripcióndel sistema,para lo cual se
estudiarála influencia de dos variables sobrela evoluciónde los parámetrosdel modelo
(temperaturay concentraciónde nitrógenoinicial). En casode queno existaunarelaciónde
parámetroscon las variablesa estudiar, semodificaráel modeloplanteado de modo que
sea capazde teneren cuenta la evoluciónde los parámetroscon la variable,y así poder
obteneruna relación en función de la variableestudiada.En casode no sersuficienteeste
modelo se irá complicandohasta [legar a modelos estructurados,que, si bien más
complejos,se acercanmás a la realidad,es decirtienenmássentidofisiológico.
10
Introducción
La progresivacomplicaciónen el planteamientode modelosparala descripcióndel
sistemamicrobianodebellevar consigounamejoraen la consideraciónde algún aspectoen
la propia descripcióndel sistema, es decir, debe de ser capaz de subsanardeficiencias
encontradas en los modelos más simples desarrolladosy aplicados a los datos
experimentalesenlas primerasetapasdcl presentetrabajo.
En definitiva, el objetivo final de estaTesisDoctorales llegar a aplicar un modelo
cinético de los denominadosquímicamenteestructurados,puesprobablementesean los
únicoscapacesde teneren cuentalos cambiosen la composicióndel medio, especialmente
en lo referenteal sustratonitrogenado,tan ligado al crecimientodel microorganismo.Para
llevar a cabo la aplicación de estetipo de modelosseráprecisoun conocimientoprofundo,
tanto bioquímico y microbiológico,de la bacteria Xanthomonascampestris.Además,se
hace necesariorealizarun estudioexhaustivoy puestaa puntode métodosrápidosy fiables
para el análisisde compuestosintracelulares de forma cuantitativa.Para ello, se van a
comparardiferentestipos de técnicasde análisisde estoscomponentes,desdelas técnicas
bioquímicasconvencionales,pasandopor técnicasespectrofluorimétricas.hastallegara una
técnicacadavezmásutilizadaen microbiologíacomoesla citometriade flujo.
Finalmenteseránecesariodesarrollaruna metodologíapara hacerfrentea la dificil
tarea de proponery aplicarmodeloscinéticosestructurados.Hay que teneren cuentaque
apenashayantecedentesen la literaturaen cuantoa la propuestade estetipo de modelos,y
no seencuentraajustede datos experimentales,y el consiguientecálculo del valor de los
parámetros,ni, desdeluego, la relación de los valores de los parámetrosen diferentes
experimentosrealizadosen condicionesdiversas.
11
introduccion
1.2.-MODELOS CINÉTICOS
A continuación se realiza una breve revisión sobre los diferentestipos de modelos
cinéticosplanteadosen la literaturade acuerdoa la clasificacióncomentadaen la Tabla1.1.
1.2.1.-ModelosCinéticosNo Estructurados- No Segregados
Los modelos más sencillos del crecimiento -modelos no estructurados-están
expresadosen términosde unidadesabstractasde vida, generalmentese empleael término
poblaciónmicrobianao “biomasa”, ignorandocompletamentela estructurainterna de las
célulasque componendicha biomasa,ya que considerana la población como una unidad
homogéneamentedistribuida. Aunque los modelos no estructuradosson una gran
simplificación del problema real, suelen ser útiles para ser empleados con fines
tecnológicos,ya queproporcionanecuacionessencillascon sentidofisico, en las que setrata
al microorganismocomo una especiereactantesencilla.El esquemamáscomplicadoal que
podría responderestetipo de modeloses el que se representaen la Figura 1.3, donde
apareceel consumode sustratospor las células,tanto paracrecer como paraproducir, así
como los conceptosde respiración endógenay energía de mantenimiento, que serán
comentadosmásadelante.
Los modelos no estructuradosrecogidos en la literatura incorporan parte del
esquemarepresentadoen la Figura 1.3. Parapoderrealizaruna revisión de este tipo de
modelossehan dividido en dosgrupos:modelosde crecimientoy modelosde consumode
sustratosy formaciónde productos.
12
Introducción
Energia deMantenimiento
Lisis celular
CELULAS NOVIABLES
PRODUCTOS
Figura 1.3.- Esquemade reacciónsimplificadode los ModelosNoEstructurados
1.2.1.1.-Modelos No Estructurados de Crecimiento
Dentro de este tipo se encuentran modelos que relacionan el crecimiento del
microorganismo únicamente con la propia concentración de biomasa y otros que hacen
dependerel crecimiento de la concentraciónde un sustrato, que suelendenominar “sustrato
limitante”.
En el primer grupo de estaclasificaciónseencuentrala Ley de Malthus, que está
planteada para describir el crecimiento “balanceado”,es decir, las actividadesde síntesis
celular estáncoordinadasde manera que la composicióncelular media no seve afectadapor
la proliferación de la población. Por ello, escapaz de representar la fase exponencial de
crecimiento en fermentacionesen discontinuo o “batch” y las fermentacionesen continuo,
ya que al mantenerseel valor de las variablesen estadoestacionario,se obtiene un valor
constantede la velocidad de crecimiento (ji), lo que se aproxima mucho a lo que se
consideraun crecimientobalanceado.
RespiraciónEndógena
/3
Introduccwn
La Ley de Maithus seempleade forma ampliaen estudiosmicrobiológicossobreel
crecimiento,debido a la gran simplicidad del modelo, puessolo es necesarioconocerla
evoluciónexperimentaJde la biomasacon el tiempo. La citadaexpresiónde Malthus viene
dadapor la siguienteecuación:
dC~ [1.1]
dt
Este modelo es incapaz de predecir la concentraciónde biomasa en la fase
estacionaria,ya que su tendenciaes al crecimiento infinito. Esto es debido a que, en
realidad,la velocidadespecíficade crecimientono esconstantedurantetodo el procesodel
crecimientoen discontinuoy, por tanto, no escapazde predecirtodaslas fasesdel ciclo de
crecimiento.En consecuencia,cuandoseplanteala representaciónde un sistemamicrobiano
en discontinuo, teniendoen cuentano solo su crecimiento, sino también el consumode
sustratosy la formación de productos,la ecuación[1.1] no se puedeempleardentrodel
conjunto de ecuacionesnecesarias,ya que llevaríaal absurdodel crecimientoinfinito. Sin
embargo,puedeproporcionarresultadosaceptablesen sistemasen continuo, aunquenunca
con sentidofisico.
La segundaexpresiónempleadapararepresentarel crecimiento,y que esúnicamente
dependientede la concentraciónde biomasa,es la conocidacomo ecuaciónlogística, que
resultade la integraciónde la siguienteecuacion:
____ cxdC~ = ¡¡C~. 1 [1.2]
di’ C~.
La ecuación[1.2] presenta,parauna concentracióninicial de biomasadeterminada,
dos parámetros:ji y C~,,. La ecuaciónlogísticaescapazde proporcionaruna curva con las
tres fasesde crecimientodel microorganismo:latencia, exponencialy estacionaria.Esta
ecuaciónfue propuestade formaempírica,como modeloparael estudiodel crecimientode
microorganismos,debidoaque la formade la funciónmatemáticaerasimilar a la observada
para el crecimientode microorganismosen discontinuo,posteriormentefue deducidade
formamecanística(Santos,1993).
14
Introducción
Las expresionesque hacendependerel crecimientode microorganismos,tantode la
concentraciónde biomasa como del “sustratolimitante”, hacenque estadependenciade la
concentracióndel citado sustrato esté incluida dentro de la velocidad específica de
crecimiento(ji), siendola ecuacióngeneral:
dC~ _
dt y(C5).Q~ [1.3]
La primeraexpresiónde estetipo fue la propuestaporBlackman(1905):
4Cs)11m.iCs>It,nB[1.4]
Cs
B
dondeB es unaconstante.Estemodelo planteaque hastaque la concentraciónde sustrato
no haya llegado a cierto valor no influye en el crecimientoy se puedeaplicar la ley de
Malthus.
Posteriormente,M’Kendrick y Pai (1910) eliminaron la primera parte de la
expresiónde Blackman (1905), planteandopara todo el intervalo de concentraciónde
sustratola siguienteexpresión:
di’ —
proponiendo,porprimeravez, una relaciónestequiométricaentre la velocidadde consumo
del sustratoy la de producciónde biomasa:
dÉ?5 _ 1 dC~ [1.6]dt Y~ ch’
A partir de estasexpresiones(ecuaciones[1.5] y [1.6J), se deducela ecuación
logística:
— Cx0 expQu.t) [1.7]c~i~A~- — exp[u .41
15
fu trod;tccwjj
siendo:
= ~t,,, c~ = . (ci. -4-C8j [1.8]Y tI’
AS \YS 1
C~ =C~ ±Y~ C8 [1.9]
Otra ecuación que relaciona la velocidad específica de crecimiento con la
concentraciónde un sustratolimitante esla propuestaporTiesser(1942):
dC1 Líex~KE±)j.c [1.10]
Posteriormente,NIonod (1949 y 1950) propuso otra expresión del tipo de [a
ecuación[1.3], de forma empírica, y similar a la ecuaciónya propuestapor Michaelis-
Mentenparalas reaccionesenzimáticas.El planteamientose basabaen que, en realidad,las
reaccionesquetienenlugaren el interior del microorganismosonenzimáticas:
dC~ [1.11]
di’
El modelopropuestoporMonodestáformadopor las ecuaciones[1.7] y [1.11]. Este
modelosesimplifica en las siguientescondicionesparticulares:
dC~ _K5 «C5 ~. ____ — p 45 [1.12]
di’
K ~ d~i% — Mm c .cj’ [1.13]
La simplificación que lleva a la ecuación[1.12] correspondea la Ley de Malthus,
mientrasque cuando K5 es mucho mayor que la concentraciónde sustrato,la ecuación
[1.13] se simplifica a la expresiónpropuestapor M’Kendrick y Pai (1910). Estasmismas
condicionesparticularessecorrespondencon el modelo propuesto por Blackman(1905)
(ecuación[1.4]).
16
Introducción
A partir de los diferentesmodeloscomentadoshastael momento,se observaque la
expresiónfundamentalde la cinéticamicrobianaes el modelopropuestopor Monod (1949 y
1950)(ecuaciones[1.7] y [1.11]), ya queexceptolapropuestaporTiesser(1942) -que no
parece tener explicación mecanística-el resto de las expresionescomentadaspueden
entendersecomo simplificacionesdel citado modelo, segúnla concentraciónde “riutriente
limitante” presenteen el medio; ya que la concentracióndel citadonutrientevariadurantela
fermentación,el modelo propuestopor Monod se puede simplificar a unas u otras
expresionesduranteel transcursode la misma. Estehechoes corroboradode forma patente
en el trabajode Esenery col. (1982)sobremodelosno estructurados,en el que se ajustanlos
mismos datos experimentalescon diferentesmodelos,no siendo capacesde discriminar
entreellos.
Un concepto importante,que fue tenido en cuentaposteriormenteen los modelos
cinéticosno estructurados,es la respiraciónendógena,introducido por Herbert (1958),
que planteaque partede la propiamasacelularseempleaen mantenerlas célulasen estado
viable, dándoseesteprocesoa velocidad constante,independientementedel valor de la
velocidadespecíficadel crecimiento:
dC~ = (p(q)—,ue).É?x [1.14]
dr
Esto conlíevaun descensoen la cantidadde biomasa,unavez agotadoel nutrienteo
sustratoque aportaenergía.
Tambiénsehanpropuestoexpresionesparael crecimientobajo la suposiciónde que
el microorganismose ve inhibido por la presenciade alguna sustancia-que puede ser
sustratoo producto-en ciertacantidad.Las expresionesmáscomunesson:
• Inhibición por sustrato,fue propuestopor Waymany Tseng(1976);estosautores
consideranque existeuna concentracióncríticade sustrato,pordebajode la cual no
se produce inhibición del crecimiento.
• Inhibición por producto, propuesto por Hinshelwood (1946) plantea que la
inhibición del crecimiento,porpartedel producto,dependede la concentracióndel
mismo.
‘7
introducción
1.2.1.2.- Modelos dc Consumo de Sustratosy Formación de Productos
La primera relación propuestapara el consumo de sustratoses la comentada
anteriormente, que relaciona la velocidad de crecimiento de la población con la de consumo
del sustrato mediante un “rendimiento macroscópico” (Y5j, representado en la ecuación
[1.4].
Posteriormente, Pirt (1965) obsevóque el citado rendimiento macroscópicono
presentaba valores constantes a lo largo de la transformación, por lo que consideró que el
sustrato se emplea para funciones asociadas y no asociadas al crecimiento, proponiendo la
siguienterelación:
1 — 1 .4-21- [1.15]
r~ ‘ir
Introdujo así el coeficientede mantenimiento (ms), el cual trata de explicar el
consumo de sustratopara el mantenimientode la biomasaen estado viable. Esto es
normalmenteaplicable sólo al sustratoempleadocomo frente energética(generalmente
azúcares).Sustituyendola expresión[1.15] en la [1.7), seobtienela siguienteecuacion:
dÉ?8 _ ( 1 dÉ?7 _ m8 dC~j [1.16]
di’ Y~ dt y di)
Estaexpresiónproporcionael consumode sustrato,cuandoseempleatanto parael
crecimientocomoparael mantenimientocelulardel microorganismo.
Cuandoel sustratoenergéticose empleatambiénpara la producción,se define un
nuevo “rendimiento macroscópico” de sustrato en producto (Ypsmt, incorporándoseel
término de consumodel sustratopara la producción en la ecuación[1.16), de la siguiente
forma:
dÉ?5 — (__1 dC7 ¡ dc,. m5 [1.17]
di di J$7 di’ y 4
18
Introducción
En cualquiercaso,sehacenecesariodisponerde una expresiónde la evolucióndel
producto con el tiempo que se pudiera sustituir en la ecuaciónanterior.El planteamientode
las ecuaciones de la velocidad de formación de productos depende del tipo de producto de
que se trate. Así, según RÉleis y Kossen (1978), basándose en la terminología propuesta por
Gaden (1959), clasifica los productos en las siguientes categorías:
• Productos no asociados al crecimiento
• Productos asociados al crecimiento
• Productos parcialmente asociados al crecimiento
La velocidad de producción del producto en cuestión puede expresarse de acuerdo a
la ecuación denominada de Luedeking-Piret (1959):
___ dÉ?~
di’ di
El primer término de esta expresión representa la producción no asociada al
crecimiento y el segundo la producción asociada al crecimiento, por lo que para los
primeros tipos de productos, se debe emplear únicamente uno de los términos de esta
ecuacion.
1.2.1.3.- Influencia de las Variables en los Parámetros
Las variablesmás estudiadasque influyen en la velocidadde cambiode los sistemas
microbianos son: temperatura, pH y, en sistemas aerobios, la concentración de oxigeno
disuelto.
Debido a la existencia de una temperatura óptima de crecimiento, la variable más
estudiada en este tipo de sistemas ha sido la temperatura (Esenery col., 1983;Ratkowskyy
col., 1983; Bailey y Ollis, 1986); en panicular, su influencia en la velocidadespecífica
máxima de crecimiento. Así, Esenery col. (1983)y Bailey y Ollis (1986)expresanla citada
variación de la siguienteforma:
19
lníroducc tau
iHík0, exp(— RT
AH2 [1.19]¡ + . exp(—----)
RT
mientras que Sinclair (1987) y Shu y Yang (1991) plantean:
E2= k~ exp(——)—k1>,•exp(—RT~ [1.20]
y, por último Ratkowskyy col. (1983)empleanla expresión:
,aJT) / C1 (7’- 7’,»,») /1 - exp(’c2 . (7’ Trnat))j}2 [1.21]
La influencia de la temperatura en el resto de parámetros ha sido menos estudiada:
Esener y col. (1983) plantean la variación del rendimiento macroscópicodel sustrato
carbonado en biomasa (Yxs) y del coeficiente de mantenimiento (ms), mientras Shu y Yang
(1991) lo hacen para los parámetros de [aecuación de Luedekíng-Piret (m y n). Apenas hay
datos en la literatura sobre estos aspectos.
La influencia del pH en los parámetros cinéticos de este tipo de modelos,apenasha
sido estudiada, únicamente Sinclair (1987) propone una expresión de su influencia en la
velocidad específica máxima de crecimiento, como la siguiente:
P,n(PH) = [1.22]
El máximo proporcionadopor estafunción estarámás o menos desplazadoen la
escalade PH dependiendodel tipo demicroorganismode que setrate(basófilo, acidófilo o
neutrófilo).
En los procesosaerobios, se le está dando gran importancia al estudio de la
evolución de oxígeno disuelto en el sistema (Cho y Wang, 1990; Hoojimans y col., 1991).
En un proceso fermentativo, la evolución de oxigeno disuelto respondea la siguiente
ecuación(Moo-Youngy Blanch, 1987):
20
Introducción
dC0
di’ — k~a~ (C0 — É?<> ) — É?~ [1.23]
El segundo sumando del segundo miembro indica la velocidad total de consumo de
oxígenodebidaal microorganismo,que se correspondecon la sumadel oxígenonecesario
para mantenimientocelular y para el crecimiento(Pinches y Pallent, 1986; Cho y Wang,
1990):
1q<> É?~ =m<> ~É?~<+ .dc~ [1.24]%‘~ di’
sustituyendola ecuación[1.3] en la [1.24],seobtiene:
+ 1’ [1.25]
que en ocasiones puede ser reducida a (Cho y Wang, 1990):
qQ — [1.26]
En el caso de que sea el oxigeno el nutriente limitante del crecimiento,se pueden
emplearlas ecuacionescinéticastipo Monod,tanto parala velocidadespecíficade crecimiento,
como parael consumode oxigeno(Cho y Wang, 1990),de acuerdo,respectivamente,a las
siguientes expresiones:
[1.27]/1=
K ±É?0, 02
q¿7X
.
= K-i-É? [1.28]OQ Q
Parapoder plantearun modelo cinéticono estructurado,dondese tengaen cuentano
sólo el crecimiento,sino tambiénel consumode sustratos y la formaciónde productos,es
imprescindible tener datos experimentales en los que se analicen los sustratos, productos y
biomasaa lo largodeltiempo. En definitiva, setratade observarsilos sustratos influyen en el
crecimiento y en la producciónpara incluir o no los términos correspondientesen las
2/
Introducción
velocidadesde producción de cadauno de los compuestosque intervienen.En el casode que
la expresiónde velocidadde produccióndel sustratolimitante del crecimientosevea afectada
por la producción,se tendránque repasarlas suposicionesrealizadasparael planteamientode
la expresiónparadescribirel crecimiento.Esto esparticularmenteimportanteen el casode
adoptarla ecuaciónlogística,ya queestaecuaciónpartede la suposiciónde queel crecimiento
y el consumodel sustrato limitante están relacionadosúnicamentepor un “rendimiento
macroscópico”o coeficienteestequiométricoconstantea lo largode la transformacion.
En definitiva, para el planteamientode un modelo cinético no estructuradono
segregado,que sea capaz de describir el crecimiento, el consumo de los sustratosy la
producción, se deben de obtener datos experimentales a partir de los cuales se pueda saber, en
principio, quétérminossedebenincluir en las expresionesde las velocidadesde producciónde
los diferentescompuestos.Es decir,hay queplantearel esquemade reacciónsimplificadoentre
los compuestoscomentados,a partir de los datosobtenidos.De otraforma, siemprese pueden
ajustar los datos experimentalescon diferentesexpresionesque tomen en cuenta distintas
posibilidades,y elegir el mejor ajuste,esdecir, un ajusterazonablecon el menornúmerode
parámetrosposible.Seriaentoncesaplicable,en amboscasos,la metodologíaestablecidapara
la discriminaciónentremodeloscinéticosde reaccionesmúltiples (Kittrell, 1970; Froment,
1975:García-Ochoay Romero,1993).
Los modelosdescritoshastaahora, esto es, los modelosno estructuradosserán
buenos cuando los microorganismos posean una composición celular que esté
aproximadamenteen estadoestacionario.No obstante,cuandotienenlugar cambiosen la
composicióncelular, los modelosno estructuradosproporcionan,en la mayoríade los casos,
una pobre aproximacióna la realidad. Es también lógico pensarque los modelosno
estructurados no sean capaces de reflejar la influencia de ciertas variables,
fundamentalmentela composicióndel medio. Para estoscasossehan propuestoun tipo de
modelosque tienenen cuentacambiosen la estructurainterna del microorganismoy, en
casos muy complejos, únicamentemodelos de este tipo serán capacesde explicar la
evolucióndel cultivo.
Estetipo de modelos,máscomplejos,se correspondencon la clasificación que fue
mostradaen laTabla 1.1 y puedenresumirsede la siguienteforma:
22
Introducción
• Modelos metabólicos,son modelos que podrían englobarsedentro de tos no
estructurados,pero empleanun esquemasimplificado de reacciónpara describir las
rutasmetabólicasde consumode sustratoy formaciónde productoscomo unared de
reacciones.Describenel crecimientocomoen los modelosno estructurados.
• Modelos de célula, describenla biomasaconsiderándolaformadapor varias
especies, teniendoen cuentalos componentesintracelularesy proponiendoparasu
descripción un esquema de reacción simplificado.
• Modelos químicamenteestructurados, sepueden considerar como la suma de los
dostipos de modelosanteriores,
• Modelos segregados,en la descripción del microorganismose considera la
distribución de algunapropiedad.Estos modelosno consideranun microorganismo
medio, como en tos casos anteriores.
El problema de plantear este tipo de modelos es relativamente parecido al abordado
en estudios de ciertos sistemasquímicos reaccionantesextraordinariamentecomplejos,
aunquemenos que la mayoría de las transformacionesbiológicas, es decir, del uso de
microorganismospara obtenerproductos de interés. Así como para la descripciónde
procesosquímicos complejos,tales como el craqueode hidrocarburoso la oxidación de
hidrocarburosse ha desarrolladoy aplicado una metodologíaque ha cubierto distintas
etapas,o al menoshaconsideradodistintasposibilidades;el caminoy posibilidadestomados
en cuenta han sido, conceptualmente,bastanteparecidosa lo hecho,en las tres últimas
décadas, en el análisis de sistemas microbianos. Por ejemplo, en el craqueo y oxidación de
hidrocarburos, primero se describió el sistema como si se tratara de una reacciónsimple,
añadiendo una distribución de productos,en función de ciertas variables, normalmente
condiciones de operación (García-Ochoa y col., 1990a); se intentó también describir el
sistema con toda su complejidad, analizando cientos de reacciones con decenasde especies
químicas, incorporando los valores de los coeficientescinéticos calculadosde forma
individualporotrosautores,o suponiendovaloressimilaresa los calculadosparareacciones
o etapasparecidas(Sundaramy Froment,1978; Milhail y col., 1983; Navarro, 1986).Estos
dosextremostienensu correspondenciaen el estudiode las transformacionesmicrobianas,
en la simple reproducciónde la biomasacon el tiempo, de acuerdoa ecuacionessimples,sin23
Introducción
justificación mecanística(ecuaciónde Malthus,por ejemplo), y en la recientepropuestade
modelosde célula concientosde reaccionesy decenasde especiesquímicasparticipando
en el esquema(simplificado) del metabolismocelular (Jeongy col., 1990). El camino
adecuado parece ser intermedio, con la utilización de esquemasde reacciónsimplificados,
pero realistas, utilizando iumping o una asociación de especies químicas para simplificarlo,
y una metodologíaparala discriminaciónentremodelosposiblespasandopor el cálculo de
parámetros (Sundaram y Froment, 1977; García-Ochoa y col., 1990b). En los sistemas
biológicos,estametodologíase correspondecon la propuestade modelos estructuradosen
Compartimentos,capacesde describir las transformacionesde forma simplificada, pero
mucho más cercanaa la realidadque los modelossencillos, siempreque su grado de
complejidadno seaexagerado.SegúnShuler(1985),en surevisiónsobremodeloscinéticos
estructurados,paraqueun modelo cumplaesasituaciónde compromiso ... debepresentar
un mínimo deparámetrosajustabíes, la mayoríade los parámetros debenser determinados
a partir de experimentos independienteso estimadospor una serie objetivade reglas. Debe
ser tratable matemáticamente y debe tener alta fidelidad en los procesos biológicos,
teniendoque ser posiblela verWcaciónexperimentaldelmodelo
1.2.2.-ModelosMetabólicos
Estetipo de modelosplanteaestructurasólo parael metabolismodel o de los sustratos
carbonados,sin diferenciarpanesen la biomasa,ya que la siguen considerandocomo en los
modelos no estructurados;es por ello que se pueden considerar como modelos no
estructurados-nosegregados.Dentro de este tipo, existenmodelosmuy diferentes,muchas
veces propuestos para problemas muy específicos de forma teórica (Van Dedem y Moo-
Young, 1973; Geraatsy col., 1990; Bibila y Flickinger, 1991), realizandouna simulacióna
partir de unosparámetrosestimadosde unamaneraqueno siemprequedaclara.
Otrosautoresplanteanestudiosmetabólicosmásgenerales,comoesel casode Kogay
col. (1969)y de Barford y col. (Barford, 1990; Hall y Barford, 1981; Barford y Hall, 1981;
Barford y col. 1 992ay 1 992b; Montes y col., 1998),aunqueen todoslos casosseplanteapara
ej casoespecíficode la levadurafermentativaSaccharomycescerevisiae.
24
introducción
Los modelos metabólicosplanteadosen la literatura, están todos realizados con la
levadura Saccharomycescerevisie.Estos modelos responden, de forma general, al esquema
planteadoen la Figura 1.4, dondeel sustratocarbonadoes introducidoen la célulamedianteun
sistemade transporte.La célula puedeutilizar estesustratocomo “esqueleto”para sintetizar
nuevascélulas(crecimiento),o bien transformarestesustratocarbonadoen un intermediario
reducido (IR), el cual puede ser fermentado a etanol o bien ser introducido en la mitocondria
para, a través del ciclo TCAy la respiración obtener energía en forma de ATP.
s
Figura 1.4.- Esquemageneralde los modelosmetabólicosparala levaduraSacchoromycescerevisie, existentes en la literatura.
25
Introducción
El modelo de Koga y col. (1969)planteaseis reaccionesdentrodel metabolismode la
levaduraSaccharomyces cerevisi,y queresponderíanal esquemaplanteadoen la Figura 1 .4.:
- Glicolisis (rj:
5’ + YÁTPO . ADP -e~YÁTP.G ATP + Y/RO . IR [1.29]
- Metabolismoanabólico(rA):
[1.30]¡N.A N+yÁT,.Á A TP —* YATP.Á ADP + X
- Metabolismocatabólico(rc)
ATP —* ADP + Pi [1.31]
-Ciclo TCA(r1’):
IR + NADH ~ Ysúrnx . NAD [1.32]
Respiración(rR):
YYID.R NADH + YITPR ADP+ ~2 >YVADR. NAD4 +r~i~,.>~ . ATP±r.up. M [1.33]
Fermentación (rF):
IR—> YP,F P [1.341
Los autoresproponenecuacionescinéticasglobales—tipo Monod-paracadaunadedichas
reacciones:
- Glicolisis:
csr¡rcma
• ~ • Cx
KATP + CATP
- Metabolismoanabólico:
[1.35]
r2rA~.,~ Kv +É?\;Cx CÁTPCX [1.36]
26
Introducción
- Metabolismocatabólico:
r§k0C ÁTP C [1.37]
- Ciclo TCA:
C PvCx [1.38]
KNAD+CrvAn Ka +Cp
- Respiración~
rsrp~; CNADHCX [1.39]
- Fermentación:
u6 ‘k FC ~ ,~. [1.40]
El conjunto de las velocidadesde producciónsepuedeescribiren función de una matriz
de coeficientesestequiométricos(yij), como en el tratamientocinético clásico de reacciones
múltiples(García-Ochoay Romero,1993):
dé’ 6 [1.41]
‘It ‘4/
Koga y col. (1969), no estiman los parámetrosdel modelo por ajuste de datos
experimentales sino que toman estos parámetros de la bibliografia, realizando de esta forma
simulaciones con el modelo.
El equipo de Barford propone un modelo algo sencillo. Comienza su planteamiento en
1981 (Barford y Hall, 1981) y se completa en 1990 (Barford, 1990), siendo ampliado al caso de
múltiplessustratosen 1992 (Barford y col., 1992ay 1992b).
El esquema de reacción que plantean viene dado por el siguiente grupo de ecuaciones:
- Paraeltransponedel sustratocarbonadoatravésde la membranaplasmática,(ri):
[1.42]
- Transformacióndel sustratoen el IR (r2):
S*~~>7p IR+y~ ATP [1.43]
27
Intro¿l,.¡cc¡on -
Formaciónde etanolpor fermentaciónde IR (r3):
IR —~ P + (‘O.
Ciclo de TCA (r4):
IR + 30,—>JCO,+SH,0+(473+!)ATP
-Parael crecimiento(r5):
Y + • 5’ + . íR+ YA J4TP - 2X
Las ecuaciones cinéticas que proponen estos autores también son tipo Monod:
Cr~k ~
¡ !K»+C/ x
rskj <yKw + Cm
r4ÑC4 Cii
?
CxKm + Cii?
rs kv C»i Cx
r2, la obtienena partir de la suposiciónde estadopseudoestacionariopara
dC5~—
0—rl-r2-vs
Por lo tanto el
¿Itrs r¡ri-v~rs [1.51]
modelo final viene dado por el siguiente grupo de ecuaciones
diferenciales(velocidadesde producción):
- Sustratocarbonado:
dC5___ :t-I,I
dt
Biomasa:
dC~dt
[1.53]5
((.44]
[1.45]
[1.46]
[1.47]
[1.48]
[1.49]
[1.50]
La velocidad
[1.52]
28
Introducción
- ffitermediarioreducido:
dC15 =r~ .r, —r3 —r4 —~y, r5 [1.54]
di’
- Oxígeno disuelto:
dC<, =—3r, [1.55]
¿It
- ParaelATP:
dCÁTP =(~>~ +1)r4 +y~ .y~, ~~YÁ •r5 [1.56]
dt
Como puedeobservarseel planteamientodel modeloesmuy similar al de Kogay col.
(1969),peroestemodeloes mássencillopuesel númerode componentesclaveseha reducido
a cinco , en lugarde teneroncecomoen el casoanterior.
Los parámetrosdelmodelo de Barford se estiman,en todoslos casos,apartir dedatosen
bibliografíao tomandoen consideracióndatosexperimentales,pero por métodosparticulares,
no por regresion.
Un modelometabólicomásreciente,tambiénrealizadosobreSaccharomycescerevisieesel propuestopor Montesy col. (t998), basadoen el modelo de Bardford, el cual,a suvez,
estábasadoen el conceptode que el metabolismoaerobiode las levadurases determinado
mediante el transporte de azúcar al interior celular y la velocidad de transporte de piruvato
dentro de la mitocondria. Los parámetros de este modelo son obtenidos de forma experimental,
por ajuste de datos con el modelo propuesto.
De los modelosmetabólicosplanteadosen la literaturase puedeconcluir queestetipo de
modelossonabordablestantodesdeel puntode vistamatemáticocomodesdeel puntode vista
experimental,pues,como seha visto, el númerode parámetrosquepresentanno es elevadoy
los productos o componentesclave quesonnecesariosanalizar no suelenprecisardemétodos
de análisiscomplicados.
29
Introduccion
1.2.3.-Modelos Estructurados o de Célula
Como seha comentadopreviamente, este tipo de modelos secaracteriza por que la
descripción de la denominada biomasa se realiza de forma estructurada,es decir, se
consideraque está formada por componentesque reaccionanentre sí. Los modelos
encontradosen la literaturaclasificablesdentro de estetipo se puedendividir a su vez en
dos:
- Modelos Compartimentados, en los que la consideraciónde los componentesinternos
de la biomasano serealizade forma explícita. Se divide la biomasaen subunidadeso
compartimentosa las que se le asigna una función, pero que no representana
compuestosintracelularesespecíficos.
- Modelos de Célula: estos modelos proponen esquemas simplificados de reacción en los
que los compuestosintracelulares aparecenexplícitamente.
1.2.3.1.-Modelos Compartimentados
Los modeloscompartimentadosagrupandetallesdel metabolismomicrobianoen
grupos. estandoel metabolismototal tratadoen términos de un númerode componentes-
bloques o compartimentos-más o menos limitados que, a veces,tienen una definición
bioquímicaaproximada.Estosmodelossuelenpresentarpocosparámetros(entre5 y 15). Es
un concepto parecido al lumping empleado en reaccionesmúltiples (García-Ochoay col.,
1 990b).
El modelocompartimentadomás sencillo es el formado por dos bloques; este tipo de
modelosse comenzóa desarrollara mediadosde los 60 y se siguen empleandoen la
actualidad.Dentrode estetipo de modelosde doscompartimentosse encuadranlos debidos
a : Deany Hinshelwood(1966); Williams (1967); Ramkrishnay col. (1967): Verhoffy col.
(1972);Bijkerk y Hall (1977); Esenery col. (1982); Bleecken(1984);Nielseny col. (1991a
y 1991b)y Nikolajseny col. (1991). Todos estosmodelos,exceptoel primero,identifican
los compartimentoscon partes de la biomasa(DNA, proteínas,etc.), denominandoa las
partesen que dividen a la biomasade diferentesformas, como por ejemplo: componente
sintético,genéticoo estructural.
30
Introducción
El modelo planteadopor Ramkrisnay col. (1967), divide el citoplasmaen dos
componentesestructurales,cuya interacción entre sí y con el ambiente que les rodea,
produceel crecimiento.DenominanmasaO al gnipo formadoporácidosnucleicos(DNA y
RNA) y masaD a las proteínas;proponiendoel esquemasimplificado formadopor cuatro
reaccionesen el que la formaciónde un inhibidor del crecimientopuededar lugar a formas
muertasde las masasG y D (N0 y ND).
C+75,<S —*2G [1.57]
O + y> 5’—> 0+ D±y,,. T [1.58]
0+ T —* + (1±7,,)T [1.59]
D±T-4 ND [1.60]
El citado modelo proporcionacurvasde crecimientocon todaslas fasesobservadas
experimentalmente,incluyendo la fase de latencia. La concentracióntotal de protoplasma
viable es la suma de las concentracionesde los dos compartimentos.El modelo predice
fenómenosobservadosen el crecimiento en discontinuo, ya que las curvas obtenidas
dependen de las siguientes variables (Tsuchiya y col., 1966):
i) La proporción relativa entre O y D en el inóculo, lo queinfluye en la longitud de la
fase de latencía.
u) El tamaño del inóculo, cuyo aumentoproporcionauna disminución de la fase de
latencía.
Como planteamiento teórico, parece coherente, el problema está en determinar la
sustancia inhibidora del crecimiento y en analizar la cantidad de la misma presente en las
células; para poder obtener los parámetros del modelo por regresión de datos
experimentales.
De los modelos de dos compartimentos citados, el que ha tenido mayor repercusión
posterior ha sido el modelo de W¡ll¡ams (1967). En este modelo se distinguen dos
compartimentos: la sección sintética (K) y la seccióngenético-estructural(O). Se supone
que las células sedividen tan pronto como el compartimentoO seha dobladoen tamano.
Williams sugirió que el compartimento O está formado por DNA y proteínas, y el K por
RNAy moléculas pequeñas. El esquema de reacción planteado es el siguiente:
31
Introducción
S—*K +G [1.61]
Con las siguientes ecuaciones cinéticas:
(C~ + C0)
= k,, C5 C~ .
[1.62]
[1.63]
Sin embargo,R6els y Kossen (1978) modifican el modelo incluyendo diferentes
cambios:
a) Se dan dostipos de reacciones:
i) Reaccionesgobernadaspor las concentracionespor unidadde biomasa(fase
biótica).
u) Reaccionesen las que son de importancia las concentracionesreferidasa
unidadde cultivo (faseabiótica).
b) Incluyencoeficientesestequiométricosenel esquemade reacción.
c) Proponenecuacionescinéticaspotenciales,deltipo:
[1.64]1sI( flCJCY= fI 4-1
donde i está referido al cultivo y el indice j a la biomasa.Por lo tanto, al
aumentar la velocidad r~ aumentalabiomasaen la mismaproporción.
Estos autores calculan los parámetros del modelo por regresión no lineal y
reproducendatosexperimentales.
Las últimas modificacionesdel modelo de Williams (1967)son las realizadaspor
Nielseny col. (1991a y 1991b);Nikolajseny col. (1991). En estosmodelosse incluyen los
doscompartimentos,aunquecambiala nomenclaturaempleada,denominancompartimento
A o parteactiva de la célula(proteínasy RNA) y compartimentoG o parteinactiva(DNA e
hidratosde carbono).El modelo desarrolladopor el equipo de Villadsen (Nielseny col.,
1990a y 1991b; Nikolajsen y col., 1991) incluye dos tipos de sustratos(carbonadoy
nitrogenado)y la formación de productos,suponiendoque el sustratonitrogenadosólo
32
Introducción
interviene en la formación de biomasa,mientrasque el sustratocarbonadose empleatanto
parael crecimientocomo parala producción.El esquemageneralse da en la Figura 1.5.
Este modelo debido a que incluye la formación de dos productos , podría ser clasificado
dentro de los modelosQuímicamenteEstructurados,en el que el metabolismose considera
de forma compartimentada.
Estosautores(Nielseny col., 199 la y 199lb) calculanlos valoresde los parámetros
a partir de los experimentos realizados, pero no por regresión, y comprueban la
reproducción de datos experimentales (Nielsen y col., 1991) donde aumentan el número de
sustratos carbonados a tres reproduciendo posteriormente a datos experimentales.
s
N
P
Figura 1.5.-Esquemageneraldel Modelo de Nielseny col. (1991a y 199 Ib).
33
Introducción
Dentro de los modelos compartimentadoshay modelos con más de dos
compartimentos, como el propuesto por Harder y Rdels (1982), que está formado por tres
compartimentossegúnel esquemade la Figura 1.6. El compartimentoK representael RNA,
el compartimentoU las proteínasy el compartimentoR la biomasarestante,principalmente
hidratosde carbonoy precursores.talescomo ácidosnucleicosy aminoácidos.Se supone
que los tres compartimentosse sintetizana partir de un sustrato interno y hay sólo una
frentede carbonoque seempleatanto parala síntesisde ATP como paraprecursores.Se
supone que el sustrato limitante entra en la poblacióncelular y se incorporadirectamenteal
compartimentoR; los compartimentosK y G se forman a partir de precursoresque hay en
R; K y U se puedendegradardando lugar de nuevo a precursores,que retornanal
compartimento R; esto último se puede identificar con el mantenimiento. Las expresiones
cinéticas sugeridas por Harder y Róels (1982) están basadas en la suposición del estado
pseudoestacionario para el ATP y los precursores. La justificación de esta hipótesis es que
los tiempos de relajación para la adaptación del ATP y los precursores son mucho menores
que para los otros componentes (R, G y K). Shuler (1985)criticó la aplicaciónque hicieron
los autores del modelo a un lodo activado, partiendo de parámetros obtenidos para E.coli,
sin tener en cuenta las posibles iteraccionesentrelas diferentesespeciespresentes.
¡
R
4
Figura 1.6.-Esquemadelmodelo de Hardery Róels(1982).
34
Introducción
1.2.3.2-Modelos de Célula
Como ya se ha comentadoanteriormente,la principal característicade estetipo de
modelosesqueconsiderala biomasaformadapor componentesintracelulares,identificandoa
estoscompuestosno comoun compartimento,como sucedeen los modeloscompartimentados,
sino teniendoen cuentaal compuestoen sí en un entramadode reaccionesquepuedesermáso
menoscomplejo.Paradesarrollarun modelode célulase debetenerun conocimientodetallado
del microorganismo,por lo que los modelosencontradosen la literatura estándesarrollados
para microorganismos muy conocidos, como Escherichia coli, Bacillus subtilis o
Sacharomvcescerevisiae. Este tipo de modelosse caracterizapor un elevadonúmerode
parámetros(entre74 y 200) quelos autoresgeneralmenteestimanapartir de datosqueexisten
en bibliografia.Estosmodelosestándesarrolladosúnicamentedeforma teóricay explicansólo
el crecimientodel microorganismo.
Dentro de estosmodeloscomplejosde crecimiento,se incluye el trabajopionerodel
grupode Shuler, en el que sedesarrollael modelo de ComelíparaE. coil. Un esquemadel
modelo inicial (Shuler, 1985)se representaen la Figura 1.7. En estemodelo se consideraa la
célulacomo un reactorqueeslibreparacambiarde forma y volumeny respondera cambiosen
las concentracionesde glucosay amonio, que se incorporana la célula paradar lugar a las
reaccionesen suinterior. Se emplealumpingen el planteamientodel esquemade reacción—es
decir, seagrupan,por ejemplo las proteinascitoplasmáticasy de pareden un solo compuesto,
se agrupantodoslos aminoácidosen otro, se agrupanribonucleótidosy deoxirribonucleótidos,
etc-, en total, consideran 18 componentes, para los que plantean sus velocidadesde
producción, con expresionescinéticasgeneralmentetipo Monod. El modelo presenta88
parámetrosque estimande forma independienterealizandoexperimentosespecíficos,en los
quepareceaislarseciertaspartesdel modelo paraobtenerlos valoresdeseados.El modelo lo
planteancomouna buenaherramientaparatestarcuantitativamentelos mecanismosde control
celular.
El modelo de Cornell, propuestopor el grupo de Shuler, fue evolucionandocon el
tiempo, siendoconsideradosdiferentesaspectos:en 1984(Domachy col., 1984),se aplicó a
35
Introducción
poblaciones:en 1985, fue ampliado(Shuler, 1985)paraincluir situacionesde anaerobiosis,
alterandolos mecanismosde generaciónde energíaen la célula; en 1986 fue modificadopor
Perettiy Bailey (1986)examinandolas interaccioneshuesped-plásmido.
Otro ejemplode estetipo de modeJosesel propuestopor Jeongy col. (1990).Estos
autores desarrollan un modelo muy complejo para la descripción del crecimiento y la
esporulaciónde Bacillus subtilis. El esquemade reacciónconsideradose recogeen la Figura
1.8. Este modelo tiene en cuenta 35 componentesintracelulares,en los que se incluyen
intermediosmetabólicosde la glicolisis, gluconeogénesis,ciclo TCA, y una representación
detalladadel metabolismode los nucleótidos.En total estáformado por 39 ecuacIones
diferencialesquecontienen200 parámetros.
El modelose empleaparasimularel crecimientoen un bioreactortanqueoperandoen
discontinuo,empleandovaloresde los parámetrosobtenidosde bibliografía, con los que los
autoresobtienen una buena reproducciónde los datos que observanexperimentalmente.
Simulan la evoluciónde los 35 componentes,pero no analizanlos citadoscomponentes,de
hecho,en el trabajopublicado, no aparecendatosexperimentales.
En ninguno de los modelosde célula encontradosen la literatura se obtienenlos
valoresde los parámetrosdel modelomedianteajustede datosexperimentales,debidoaqueel
análisisde muchosde esoscomponentesno serealiza, dadala complejidadde dichosanálisis.
Por lo tanto, y como se ha indicadoanteriormente,estosmodelostan complicadosno parecen
los más adecuados,al menosdesdeel punto de vista técnico(Esenery col., 1983).De hecho,
parala simulaciónde una transformaciónmicrobiana,y la eleccióny diseñodel reactormás
conveniente,no esnecesarioir al nivel de complejidadqueexigenestosmodelos.Sin embargo,
puedeque en el futuro hayaque emplearlos,ya que, en la actualidad,los modeloscinéticos
más sencillos, ajustadosa datos experimentalesconseguidosen diferentesexperimentos,
proporcionanunos parámetros,en general, no relacionables.Es decir, no se consiguen
ecuacionescinéticascon los parámetrosen funciónde las variablesde operación(temperatura,
pH, composicióndel medio empleado,velocidad de transportede oxigeno, etc.) que sean
capacesde predecirlos resultadosen experimentosllevadosa caboen variedadde las citadas
condicionesde operación.Esto debeser el gran logro de los modeloscinéticosestructurados,
36
Introducción
frentea la simplicidadde los modelosno estructurados.En cualquiercaso,aunquelos modelos
de célula seannecesarios,esde suponerque seránmodelosmássencillosque los propuestos
hasta ahora, con menos componentesclave, y, por tanto, con necesidadde medir menos
compuestos,de tal forma que el cálculo de parámetrospor regresiónsea abordable.Esto
implica hablarde modeloscon no másde 7 a 10 componentesclave, el mismo númerode
etapasen el esquemade reacción,y no másde 20 parámetros.
Figura 1.7- Esquemadel modelode Domachy col. (1984),siendo:
A1= amonioA2= glucosa(componentesasociadosen lacélula)W= productosresiduales(CO2, H20)P1= aminoácidosP2~ribonucleótidosP3=desoxiribonucleótidosP4=precursoresenvueltacelularM1= proteína(citoplasmáticay de envueltacelular)M2R-¡1 RNA inmaduroestableM2RTM= RNA maduroestableM2~ RNA mensajeroM3= DNAM4= porciónno proteicade la envolturacelularM5 glicogenoPG= ppUppE2,E3=moléculasimplicadasdirectamenteenla formaciónde la paredcelularGLN= glutaminaE1= glutaminasintetasa* - materialpresenteenel medioexterno
37
Introducción
Figura 1.8.-Esquemadel modelode Jeongy col. (1990)
1.2.4.-ModelosQuímicamenteEstructurados
Ya se ha comentadoque estetipo de modelosconsiderala biomasaformadapor
variasespecies,de la mismaformaque en los modelosde célulapero, además,los modelos
químicamenteestructuradosdescriben el metabolismo como una red de reacciones
empleando esquemassimplificadosde reacción,como en los modelosmetabólicosya
descritos.En definitiva, un modeloquímicamenteestructuradose formulapor la unión de
un modelometabólico-en el que sedescribela produccióndel productode interésteniendoen
cuentael sustratocarbonadodentrode la red simplificadade rutasmetabólicas-,junto con el
modelode célula— quedescribeel crecimientodelmicroorganismoproductor-.
Los modelosmáscomplejosempleadoshastaahorahansido los modelosde célulacon
los cualesera posible realizaruna buenadescripcióndel crecimientoteniendoen cuentala
38
co; NH
Introducción
evolución de componentesintracelularesduranteel mismo. Estos modeloseran realizados
sobresistemasde sobraconocidoscomo Ecolí o Bacillus subtilis y no con microorganismos
empleados con un interés industrial. En consecuencia no es posible observar la aplicación de
tales modelos desde este punto de vista, ni poder predecir el comportamiento del
microorganismocuandose realizaun cambiode escala.
Porestarazón,esnecesariala propuestade los modelosquímicamenteestructurados,es
decir, los que tienenen cuentalos principios del modelo de célula pero ademásdel modelo
metabólicocon lo que,en principio seráposiblemodelizarunaproducciónde interésindustrial,
permitiendorealizarsimulacionesen el cambiode escaladel proceso.Ademáspodríapermitir
la relación de parámetrosdel modelo en función de las variables del proceso, como
temperatura,oxígenodisuelto,composicióndel medio,etc.
Aunque teóricamenteestos modelos presentangrandes ventajas respecto a los
comentadosanteriormente,no existe en la literatura ningún modelo de este tipo. La
modelizaciónmáscomplejavistahastaahora seha quedadoen el nivel de modelosde célula,
donde se realiza un estimaciónde parámetrossin ajuste de datos experimentalesy sin
aplicaciónen un sistemadeproducciónde interésindustrial.
1.2.5.-ModelosSegre2ados
El desarrollo de modelos segregadosse comenzó en la décadade los años 60,
planteándosemodelosde escasaaplicaciónpráctica(Tsuchiyay col., 1966; Matsumuray col.,
1973; Kobasyashi,1966), debidoa que estos primerosmodelossegregadospertenecena la
clasede modelosde balancede población,que se basaen la defmición de una función de
distribución de propiedadque expresala probabilidadde que la citadapropiedadpresente
cierto valor y, en el casode los modelosdesarrolladosen la décadacomentada,la propiedad
elegidaera la edadcelular, siendo difícil de medir e incluso de definir la edadcelular en un
cultivo microbiano:esdificil enlazarel conceptode edadcon la teoríabioquímicaexistentey
no essatisfactoriosuponerquelo quetieneinfluenciaenel procesoseala edaden sí mismaen
lugarde los cambiosen la composición.
39
Introducción
En la literatura inicial sobremodelossegregadosse encuentraun grupode modelosque
usael tamaño o masacelular como propiedada consideraren la función de distribución
(Eakmany col., 1966).Estetipo de modelosbasadosen el tamañoo la masacelularhansido
los precursoresde los modelossegregadosque sedesarrollany empleanen la actualidaden la
descripciónde sistemasmicrobianos,en los que el microorganismoes de tipo filamentoso
(hongos,principalmente).Los hongosfilamentososforman partede un subgrupode hongos
muy importantea nivel industrial, ya que se empleanen la síntesisde metabolitos, tanto
primarioscomosecundarios.
El metabolismoprimariode los hongosfilamentososes muy similaral de las levaduras.
El mecanismode crecimientode los hongos filamentososes, sin embargo,completamente
diferentedel de los microorganismosunicelulares.Los modelosdescritoshastaestepunto son
válidos únicamenteparamicroorganismosunicelulares,ya que en ellos secombinael modelo
celular con un modelo de poblaciónno segregadoque consideraa todaslas célulasidénticas.
En el casode microorganismosfilamentosos,el modelo quedescribala evolucióndel sistema
debe tener en cuentalos cambiosmorfológicosque allí se producen,es decir, debe ser un
modelo segregado.Estetipo de modelosesdenominadopor algunosautorescomo modelos
morfológicamenteestructuradosfNielseny Villadsen,1992;Nielsen,1993).
Los modelosparamicroorganismosfilamentososse puedende nuevo dividir en dos
grandesgrupos:
- Modelosde crecimiento
- Modelosde crecimientoy producción
Modelosdecrecimientodehongosfilamentosos
Las célulasde los hongosfilamentososestánunidasen estructurasdenominadashifas,
estos elementoshifales crecen sólo en las células situadasen los extremosde las hifas,
denominadaspuntaso yemas,produciéndosenuevasyemasen célulasintermediasde la hifa
por un mecanismodenominadoramificacion.
40
Introducción
El crecimientode las yemaso puntasseproducegeneralmentea cierta velocidadde
extensiónconstante,queestácondicionadapor la composiciónintracelulary el entornoque la
rodea;por lo tanto, el crecimientoexponencialde un cultivo de hongosfilamentosossedeberá
sólo a la existenciade una frecuencia de ramificación de la hifa. Así, mientras que el
crecimientode un microorganismounicelularse caracterizapor una velocidadespecíficade
crecimiento,para caracterizarel crecimientode hongos filamentososse necesitantanto la
frecuenciade ramificación como la velocidadde extensiónde la yema(Nielsen y Villadsen,
1992). Sin embargo,estasvariablesson dificiles de evaluary, debido a la falta de mejores
medidas, la velocidad específicade crecimiento se emplea también para caracterizarel
crecimientode hongosfilamentosos.
Nielseny col. (Nielsen, 1992; Nielseny Villadsen, 1992; Nielsen 1993) refieren el
índicede crecimientode la hifa que se empleageneralmentees la unidadde crecimientohifal,
a la masade la hifa (miigi3:
lbgu [1.56]
= [1.57]n
Mb [1.58]
Nielsen (1993)plantea la relación entre ellos:
~ [1.59]4
Esteautor (Nielsen, 1992)comprobóque la unidadde crecimientohifal referidaa la
masade la hifa es aproximadamenteconstanteen diferentescondicionesy para diferentes
especiesde hongosfilamentosos;sin embargo,el diámetrode la hifa varía, lo queimplica que
launidadde crecimientohifal referidaa la longitud de lahifa tambiénserávariable.
41
Introducción
Según Nielsen y Villadsen (1992), si la citadaunidad de crecimientohifal (ecuación
[1.65]) es constante,tanto la velocidadde extensiónde las yemascomo la frecuenciade
ramificaciónson proporcionalesa la velocidadespecíficade crecimientode la biomasa,y para
ambasvariablesla constantede proporcionalidades la unidadde crecimientohifal.
Segúnel valorde estaconstantese obtieneun tipo u otrode estructuramacroscópica:
- Si m~g¡¡ presentaun valor elevado:hifas Largascon pocospuntosde ramificación.
- Si mí,gu presentaun valor bajo: densaestructurahifal con muchos puntosde ramifícacion.
Estasestructurassedenominan pdllets’.
Esta estructuramacroscópicapresentagran importancia, ya que en el caso de un
tamañode pellet elevadose puedenpresentarproblemasrespectoa la difusión del sustrato
hastala zonainternade la hifa.
Los modelos empleadosen la literatura para describir el crecimiento de hongos
filamentosos son generalmentemodelos no estructurados,ya que siguen expresandola
cantidadde microorganismopresenteen el cultivo en términosde biomasa(Yangy col., 1992;
Nielsen, 1993; Viniegra-Gonzálezy col., 1993; Patankar y col., 1993>, empleando,
generalmente,expresionescomo la ecuaciónlogística o la ecuaciónde Monod, para su
descripción.
Entre los modelospropuestospara el crecimientode microorganismosfilamentosos
existeunoespecialmentecurioso,el propuestopor Aynsleyy col. (1990)en el queseidentifica
a la hifa con un reactortubularautoextensibleparasimular su crecimiento.
Modelosdecrecimientoy producciónen hon2osfilamentosos
Nielsen y Villadsen (1992) incluyen en su revisión tres modelos sobre hongos
filamentosos(Matsumuray col., 1981) tambiénsegregados,ya que consideranreaccionesde
metamorfosiso diferentesformasmorfológicas,pero con la particularidadde serestructurados
de tipo metabólico, ya que, debido a que prestanespecial atencióna la producción (de
42
Introducción
antibióticos, enzimas, etc.) desarrollan ligeramente el metabolismo del sustrato en el interior
del hongo. En el modelo de Matsumuray col. (1981), seconsiderantres tipos de reacciones:
toma de sustratos,reaccionesde metamorfosisy reaccionesde los sustratosen el interior del
microorganismo,enfocadasa la producción.Los citadosautoresplanteanecuacionescinéticas
para los dos últimos tipos de reacciones,siendo, generalmente,expresionestipo Monod o
potenciales.
1.2.6.-La In2enieriaMetabólica
Diversosautores(Esenery col., 1983; Nielseny Nikolajsen, 1992; García-Ochoay
Romero, 1993) coincidenen la idea de que los modeloscinéticospara transformaciones
microbianas,que van a desarrollarsey aplicarseen la(s) próxima(s)década(s),son modelos
estructurados,pero simplificados, con un número reducidode componentesintracelulares
(dos,tres o cuatro),que sepuedanmedir, y, por lo tanto,obtenerlos parámetrospor regresión
de datosexperimentales.Perodichosmodelostienenunatareapendiente,debensercapacesde
explicar o de relacionarvariables,observacioneso fenómenos,que no sean capacesde
explicarlos modelosno estructurados,mássencillos.
La grandificultad de desarrollary aplicarmodelosestructuradoses,fundamentalmente,
de análisis. La metodologíaes en todo similar a la desarrolladapara determinarmodelos
cinéticos de redes de reacciones(García-Ochoay Romero, 1993), siendo las principales
herramientasmatemáticasa utilizar la regresión múltiple no lineal (Marquardt, 1963),
aplicandounasoluciónde multirrespuestaaun problemade dichanaturaleza.Perocomo seha
indicado,el modelotienequesersimplificado, con un númerode componentesclavereducido,
de cuatro a ocho parece un número razonable,que hay que medir. Algunos de estos
compuestosson intracelulares:DNA, RNA, proteínas,ATP, etc, son los más frecuentesa
determinar.Porello, es necesariomedir éstos y otros componentes,calcularparámetrospor
ajustede datosexperimentales,y reproducirdichosdatos.
Los modelossegregadosestánespecialmenteindicadosy quizássólo en esoscasos,
para describir el crecimiento de microorganismosfilamentosos de los que se obtienen
productosde graninterés.
43
lutroduccion
La necesidad de aumentar la complejidad de los modelos cinéticos para describir
la evolución de procesos microbianos es clara, sin embargo el propósito de los modelos
metabólicosy, especialmentede los modelosquímicamenteestructurados,entradentro
del desarrollode la denominadaIngenieríaMetabólica(Bailey, 1991: Stephanopoulos,
1991). La utilización de microorganismoscomo fábricas de productos sumamente
específicas ha llevado al desarrollo de herramientaspara conseguir mejorar el
rendimientodel compuestodeseado.Durantebastantetiempo, la citada mejora se ha
realizadopor mutagénesisal azarde cepasmicrobianaso por cambioen las condiciones
del cultivo. Estetipo de trabajo se llevaba a caboporquemuchoscambiosgenéticosdel
microorganismopotencialmentebeneficiososno eran evidentes,Incluso, los sistemas
enzimáticosque gobiernanlos “cuellos de botella” del metabolismocelularpuedenestar
situadoslejos del sistemaenzimáticoque finalmente sintetizael compuestobioquimico
deseado.En muchoscasos,las reaccionesenergéticasdel metabolismoprimario deben
serreconducidasparaaumentarlaproductividad(Vallino y Stephanopoulos,1993).
Durante las dosúltimas décadas,seha ido desarrollandouna técnicamás racional
paraconseguirla producciónóptima del productodeseado(Bailey , 1991), tratandopor un
lado de identificar la reaccióncríticao cueiio de botella del metabolismoen la producción
del compuestodeseadoy porotro, minimizaresfuerzosen la optimizacióndel proceso.Esta
técnicaesladenominadaIngenieríaMetabólica.
En los años70 (Heinrichy Rapoport,1974),comenzóel estudiode la identificación
de los citadoscuellosde botella,a partir de la definiciónde ciertoscoeficientes(de control
y ciertas relacionesentre ellos (teoremas).En realidad, se trataba de un análisis de
sensibilidaddel sistema que proporcionauna base cuantitativa para el estudio de la
regulación de sistemas metabólicos. El desarrollo de estos estudios se realizó,
principalmente,durantela segundamitad de la décadade los años 80 (Felí y Sauro. 1985;
Kell y Westerhoff, 1986; Reder, 1988; Westerhoffy Kell, 1989). Para su aplicación,es
precisoel análisisde compuestosintracelulares,dificilmente analizables-seha propuesto
realizarsuseguimientomedianteisótoposde C (Zupke y Stephanopoulos,1994),por lo que
se ha llegado a intentarla simulaciónde estas rutasmetabólicasin vitro (Delgadoy col.,
1993).
44
Introducción
A principios de los años 90 ya se encuentranrevisionescompletassobre estos
estudios (Felí, 1992; Liao y Delgado, 1993); sin embargo,su aplicación prácticano se
encuentraextendida.
La identificación del sistema metabólico, y su influencia en la produccióndel
metabolitode interés,se ha abordadodesdeel punto de vista estequiométrico(Hamer,
1989; Noormany col., 1991; Goel y col., 1993; Vallino y Stephanopoulos,1993); la razón
principal de estecambiode estrategiaesel granerror que conlíevala determinaciónde los
coeficientesde control y elasticidadnecesarios,así como la necesidadde conocer en
profundidadla cinética enzimáticade la red de reaccionesque forman la ruta metabólica
estudiada(Pons y col., 1996). En los antecedentescitados, se emplea un método que
denominande “balancede materia”, suponiendoparalos metabolitosintermediosun estado
pseudoestacionario,aproximaciónque evita la necesidadde sumedida.Cabendestacartres
gruposde investigaciónen la aplicación de estaherramientade la lingeniería Química a
procesosde producciónmicrobianos:el grupo de Delft (Holanda)(Noorman y col.,
1991;Deiong-Gubblesy col., 1995; Gulik y Heijnen, 1995; Vanrolleghemy col., 1996),el
grupo de Michigan (E.E.U.U.) (Varma y col., 1993; Varma y Palsson,1994a y 1994b;
Varmay Palsson,1995),y, por último, el grupode Lyngby (Dinamarca),que ya en sulibro
sobreIngenieríade la Biorreación(Nielseny Villadsen,1994) incorporanesteestudioen el
capitulo de análisis estequiométricode reacciones,como pasoprevio al desarrollo de
modeloscinéticosde estetipo de procesos(Nielsen y Villadsen, 1992; Jorgenseny col.,
1995; NoronhaPissaray col., 1996).
La utilidad potencial que Varma y Palsson(1994) asignanen su revisión a esta
técnicaesamplísima: la interpretaciónde datosexperimentales,el diseñode métodospara
trabajar con técnicas de Ingeniería Genética, la formulación de medios óptimos, la
optimizaciónde las condicionesde operacióny el diseñode bioreactoresparabioprocesos.
Todo ello alcanzablecon ciertasencillez,aunquesigue siendonecesarioel análisisde los
“componentesclave” obtenidosa partir del estudioestequiométrico,ya que además,el
númerode compuestosintracelularesque es necesarioanalizar está en función de las
simplificaciones empleadasen el citado estudio (lumping o agrupación de moléculas
similares, hipótesisde estadopseudoestacionario,etc.).
45
fY?tYOd¿ ¿celán
Bailey (1995)destacaLa aportaciónde la metodologíaque la IngenieríaQuímicaha
desarrolladoenel estudiode reaccionesquímicascomplejas,en el desarrolloy optimización
de procesosde producciónmicrobianos.Por tanto, hoy díapareceque se puedetrasladarla
metodologíadesarrolladaen el estudiode redescomplejasde reacción (García-Ochoay
Romero, 1993) al planteamientode modelos cinéticos para este tipo de procesos.No
obstante,hay que tenerpresenteque es necesariotener en cuentaotros fenómenosparael
cambiode escalade estosprocesos,como ya seindicó al comienzode estecapitulo, estos
son los relacionadoscon la transferenciade oxigeno y el daño celular o stress
hidrodinámico que se puedecausaral microorganismo por el propio fenómeno de la
energíainvolucradaparaaumentarla transferenciade oxígeno.
-/6
introducción
1.3.- GOMAde XANTANO
El xantanoes un biopolimero de origen microbiano. En el término biopolímerose
mcluyen un gran número de moléculasde elevado peso molecular, tales como ácidos
nucleicos,polisacáridosy lípidos, producidospor unaamplia variedadde sistemasbiológicos
(Higgins y col., 1985). Desde un punto de vista industrial han tenido importancia los
biopolímerosdenominados“gomas”. En términos prácticoso funcionales,las gomas son
compuestosde pesomolecularelevado, con propiedadescoloidalesque, en un disolvente
adecuadoo agentesuspendedor,producengeleso suspensionesde elevadaviscosidad. En la
industria, técnicamente,se empleael término “goma” referido a polisacáridosobtenidosde
plantaso animales,asícomoa susderivados,que sondispersablesen aguafría o calientepara
producirgeleso disolucionesviscosas.
La importancia industrial de las gomas se fundamenta en dos características
importantes:
• La capacidadparaalterarlas propiedadesde flujo de agua.
• La posibilidad de formar geles capacesde actuar como emulsificantes, adhesivos,
floculantes,formadoresde película,lubricantes,reductoresde fricción y enlazadores.
Segúnla fuente de obtención, las gomas se puedenclasificar en gomas naturales
modificadaso semisintéticasy sintéticas.Las gomasnaturalesson las obtenidasa partir de
plantas(semillas,algas,cereales,tubérculos),microorganismos(bacterias,hongos)o animales
(leche, huesos). Las gomas semisintéticas se pueden obtener también de plantas y
microorganismospero la moléculaobtenidaesmodificadaquímicamentey, por último, están
las gomasobtenidaspor sintesisquímicao gomassintéticas.
Los biopolimerosobtenidosmedianteprocesosmicrobianospresentanciertasventajas
respectoa las queseextraende plantas(Sutherland,1983;Pace,1987; Galindo,1988):
• Su producción no dependede las condiciones climáticas, contaminaciónmarina o
limitacionesde la cosecha.
• La variabilidad en la calidad y cantidaddel producto es menor, ya que las gomas
producidaspor plantasvarian su composiciónsegúnlas necesidadesmetabólicasde las
mismas.
47
IfltlO(hiCCiOfl
• Finalmente,a nivel microbianosepuede realizarunamanipulacióngenéticaque permita
obtenergomascon propiedadesreológicasfijadas,lo cualestálejos de conseguirsecon las
especiesvegetales.
Entre los biopolímeros que están teniendomayor potencial de comercializaciónse
encuentranlos polisacáridosde origen microbiano.Desdefinales de los 50 se han venido
publicandonumerosostrabajossobrela producciónde polisacáridosde origen microbiano,la
mayor parte no explotadoscomercialmente.Las investigacionesque han proporcionado
mejoresresultadosfueron las realizadaspor los laboratoriosN.R.R.L. del Departamentode
Agricultura de Estados Unidos, que a fmales de los 50 comenzaronuna investigación
exhaustivasobrelas aplicacionesindustrialesde biopolimerosmicrobiológicos.El dextrano,
sintetizadopor la bacteriaLeuconostocmesenteroides,fue el primerpolisacáridomicrobiano
producidoy utilizado en la obtenciónde sustituyentesdel plasmasanguíneo.A éstele siguió
el xantano,que luegocobrómuchamayorimportancia.
Los polisáridosde origen microbianoson macromoléculasorgánicasformadaspor
cadenasde monosacáridos,unidos entre si medianteenlacesglucosídicos.Son uno de los
tipos de moléculas naturales más comunesen los seres vivos, siendo frecuentemente
producidaspor bacterias,levaduras,hongosy algas.Susíntesisestárelacionadacon distintas
funciones biológicas, tales como conseguir una reservaenergética,formar parte de las
membranascelulares,actuarcomo barreraprotectoracontrael ataquede virus y anticuerposy
protegeral microorganismode la desecación(Petitt, 1979; Aspinalí, 1982;Pace,1987).
Los polisacáridos,dependiendode la constituciónde la cadena,puedenclasificarseen
honiopolisacáridos,cuandocontienenun único tipo de azúcar,tal como glucosa,fructosao
manosa-como por ejemploel dextrano,el levanoy el escleroglucano-y heteropolisacáridos,
cuandocontienendos o másazúcares,como glucomananoso arábigo-xilanos-como la goma
xantano-.Desdeotro punto de vista, los polisacáridosmicrobianospuedenclasificarse,según
su origen, en tres grandesgrupos (Margaritis y Zajic, 1978): polisacáridosintracelulares,
polisacáridos estructuralesy polisacáridosextracelulares.Estos últimos tienen distintas
funcionesbiológicas;unosson producidospor bacterias,dandolugar a cápsulasmicrobianas
querodeansupared;otros forman unapelículaviscosa,en la parteexteriorde la paredcelular,
quetiene lacapacidadde difundirseal medio líquido dondeseencuentrael microorganismo.
48
Introducción
La ‘goma de xantano”fue descubiertaa fmalesde los 50, como ya se ha indicado, por
los NothemRegional ResearchLaboratories(N.R.R.L.) del Departamentode Agricultura de
los EstadosUnidos,duranteunostrabajosde investigaciónsobrelas aplicacionesindustriales
de polisacáridos microbiológicos y la utilización de excedentesagrícolas. Los estudios
realizadosmostraronque el polisacárido,producidopor la bacteriaXanthomonascampestris
NRRL B-1459, poseíapropiedadesmuy interesantes.Propiedadesquehicieronpensarque el
polisacáridopodríasuplir, por susmejorescaracterísticasreológicas,a otrasgomasnaturalesy
sintéticassolublesenagua(Kennedyy Bradshaw,1984; Kangy Pettit, 1993).
Su importancia industrial se basa en su capacidadde controlar la reologia de los
sistemasde baseacuosa.incluso a bajas concentraciones,las solucionesde gomade xantano
presentanun alto gradode viscosidad,en comparacióncondisolucionesde otrospolisacáridos,
como carboximetilcelulosa,gomade guary de garrofin (Rocks,1971; Cottrell y Kang, 1978;
Pettit, 1979;Casas,1989).
Las solucionesde xantanotienengranestabilidady compatibilidadcon sales,excepto
con ionespolivalentesa valoreselevadosdel PH (Margaritis y Zajic, 1978). Las soluciones,
especialmenteen presenciade electrolito, tienen una estabilidadtérmica excelente,y su
viscosidad,en presenciade cantidadesmoderadasde electrolito (0,1%NaCí),esindependiente
del pH enel intervalode 5 a 9 (Margaritisy Zajic, 1978).
El xantanopresentauna gran cantidadde aplicacionesindustriales,debidoa la alta
viscosidad que proporciona en disolución, incluso a bajas concentraciones,siendo la
consistenciade dichasdisoluciones muy estableen amplios intervalosde temperatura,pH y
pK (Margaritis y Zajie, 1978).Por ello, presentaun amplio abanicode aplicacionesen gran
cantidadde industrias.En la Tabla 1.2 serecogenlas aplicacionesmásimportantesde la goma
xantano.
En general, las casas comercialesestablecendos calidades del producto: grado
alimentarioy gradotécnico. Supresentaciónes generalmenteen forma de sólido, aunqueen
aplicacionesespecíficasen el campo de la recuperacióndel petróleo utilizan caldos de
fermentaciónclarificados.De cualquierforma, el xantanodebecumplir una seriede requisitos
referentesa suscaracterísticasfisicasy químicas.
49
Introducción
TABLA 1.2.- Aplicacionesdel xantanoen los diferentestipos de industrias.
INDUSTRIA APLICACION GONG~TRAC[ON PUNCIONES
ALIMENTARIA
Aderezos para ensaladas 0,1 - 0.5 adherencia; mantiene en suspensión lasProductos de pasteleria y panadería 0,1 - 0,4 Retiene el agua, mejora la textura
Bebidas 0,05-0,2 Mejora la palatabilídad, estabíliza
Productos instantáneos 0,05 - 0,2 ~ea dar cuernosolubijidad enfrío yen ca ente
Alinsentos enlatados 0,1 -0,3 Control de viscosidad durante elprocesado
Sopas, salsas yjugos 0,05- 0,5 Mejora la textura, contribuye a darcuerno
Helados ~ alimentos congelados 0.05 -0,2 Controla la formación de cristales;contribuye a la textura crenlosa
Confitería 0,1 -0,4 estabilidad térmica, facilitaProporciona el procesado
Productos lácteos 0,05 - 0,2Inhibe la sinéresis; estabiliza la
emulsión
Productos dietéticos 0.3 - 0,5 Mejora la textura, estabiliza. bajocontenido calórico
Productos cárnicos 0,2- 0,5 Estabiliza; retiene el agila; inhibe lasinéresis
COSMETICA
Pastas dentífricas 0.7-1,0 Proporciona fácil extracción de lostitos y buena permanencia en eí cepilloCremas y lociones 0,2 -0,5 Estabilíza las emulsiones, proporciona
consistencia cremosa
Champúes 0,2- 0,5 Controla la reologia
FARMACEUTIGA
Suspensiones y emulsiones 0,1- 0,5Estabiliza las emulsiones y proporciona
estabilidad frente a las fluctuacionestérmicas
Tabletas- o,s- ~o ingredientes activosProlos~a•efliempo decontactodelos
ALINIENTACIONANIMAL.
Sucedáneos de leche 0,05-0,2 Estabíliza la suspensión de losingredientes insolubles
Alimentos enlatados para animalesdomesticos
0.1 -0,4 Evita la sinéresis, contnbuye a darcuerpo a los jugos
VARIOS
Productos agroquimícos 0,1 -0,3 Suspende los ingredientes activos;controla la adherencia del escurrido
Limpiadores y pulimentos 0,2-0,7Proporciona estabilidad frente a valoresextremos de pH, prolonga el tiempo de
contacto
Pinturas 0,1-0,3 Controla lareologia
Estampado de textiles y alfombras 0.2 -0,5
Controla la migración el color; mejora
el procesadoAdhesivos 0,1 -0,3 Controla la penetración
Industria papelera 0,1 -0,2 Conírola las propiedades de flujo
Mineria 0,1-0,3Controla la sedimentación en procesosde separación, mejora la estabilidad de
la espuma
Tintas 0,05-0,1 Controla la reologia
Esmaltes cerámicos 0,3 - 0,5 Proporciona buena estabilidad desólidos en stispensión
EXTRACCIONDEL
PETROLEO
Perforación 0,1-0,4 Proporciona buena estabilidad frente ala sal, temperatura y cizallado
Recuperación forzada del petróleo 0,05-0,2 Confiere estabilidad, buena movilidad yelasticidad en la inyección de polimeros
.50
Introducción
En cuanto al proceso de producción y purificación, el xantano se obtiene
industrialmentemedianteun procesode fermentaciónsumergidadesarrolladoen los años
sesenta. En la Figura 1.9 se muestra esquemáticamente, el diagramade producciónpara la
obtención del polímero. El desarrollo del proceso se puede resumir en las siguientes fases:
• Produccióndel polisacárido
• Aislamientoy purificación
• Producción del polisacárido: para llevar a cabo el proceso, son necesariasunas
etapasprevias,como la conservación,mantenimientoy crecimientode la bacteriacon
el fin de prepararel inóculo que se emplearáposteriormenteen la citadaproduccion.
En cualquieretapa del proceso,es fundamentalmantenerla esterilidadpara evitar
posibles contaminaciones.Las etapasde conservación de la cepa, así como el
crecimiento del microorganismo,son criticas en el proceso,ya que el estadodel
microorganismoen el reactorinfluirá de formanotable,tantoen la duraciónde la fase
de latenciadurantela produccióncomo en la calidaddel xantanoque se obtenga.Las
condicionesde fermentaciónson muy importantes,ya que tanto el crecimientode la
bacteriacomo la biosíntesisdel xantano se encuentranafectadaspor numerosas
variables(Santos1993,García-Ochoay col., 1997): el inóculoprevio, la composición
del medio de cultivo, la aireacióny agitacióndel medio, el pH del mediode cultivo y
la temperaturade fermentación
• Aislamiento y Purificación: una vez obtenido el caldo resultante,es precisa la
eliminación de las bacteriasdel mismo paraposteriormenteobtenerel xantano.Es
necesanaunaetapade desactivacióny eliminaciónde lasbacterias-pasteurizacióny
posteriorclarificación-, seguidade la obtencióndel xantano,generalmentemediante
precipitacióncon disolventesorgánicos.La repercusióndel costede estaetapa,sobre
el coste final del proceso es muy importante,debido a que los caldos son muy
viscosos y el mezcladocon cualquierreactivonecesitaun aportede energíaelevado,
siendo necesariala dilución en algunasetapasdel proceso.El xantano se somete
posteriormentea tratamientosde lavado,secadoy molienda,siendonecesarioevitar
efectos como la degradación,la decoloracióno la pérdidade solubilidadque puedan
afectara la propiedadesfisico-quimicasdel polisacárido.
si
Introducción
BACTERIAXanlwmonas campestris
ESTERIL IZAC IÓN
r
rMEDIO de PRODUCCIÓNSustratos (C,N)Nutrientes:
MacroNIlero
r
CALDO DE FERMENTACIÓN
YPASTEURIZACIÓN
Física,Quimica y/o Enziinática
CLARIFICACIÓNFiltración, Centrifugación
PRECIPITACIÓNAlcoholes,Sales,Mezclas
FILTRACIÓN
LAVADO, SECADO, MOLIENDA
¡ XANTANO
—PROPIEDADES
Figura 1.9.-Esquemadel procesode produccióndel xantano
CONSERVACIÓNy
MANTENIMIENTO
CRECIMIENTO
MedioComposiciónTemperaturaTransporte de 0~
4INÓCULO
Volumen1 Fasesen la preparación
BIORREACTORTemperaturaPH, controlOxígenodisuelto
- Caudal- Agitación
1
HumedadCenizasNitrógenoAcetatoPiruvatoPesoMolecular
VISCOSIDAD
52
Introducción
La estructuraquímicade la moléculade xantanoesbásicamentesimilar a la molécula
de celulosa.La gomade xantanocontienemanosa,glucosay ácidoglucurónico.Cadabloque
repetidocontienecinco unidadesde azúcar-dos unidadesde glucosa,dos unidadesde manosa
y una unidadde ácidoglucurónico-queformanunacadenaprincipaly unacadenalateral (ver
Figura 1.10).La cadenaprincipalestá constituidasobreunidadesde B-D-glucosaenlazadasa
travésde las posiciones1 y 4, como sucedeen el casode la moléculade la celulosa.La cadena
lateral consisteen las dos unidadesde manosay la unidad de ácidoglucurónico.La unidad
terminal<3-D-manosaestáunida glicosidicamentea la posición4 del ácido glucurónico,que
vuelvea unirse glicosídicamentecon la posición2 de la ct-D-manosa(Janssony col., 1975;
Kennedyy Bradshaw.1984). Estacadenalateralde tres azúcaresse une a la posición 3 de
cualquierotro residuo de glucosa de la cadenaprincipal. La distribución de las cadenas
lateraleses desconocida.Alrededor de la mitad de los residuosde D-rnanosaterminales
contienenun residuode ácidopirúvico,unido vía grupocetoa las posiciones4 y 6 de la citada
moléculade azúcar. La distribución de estos grupospiruvato también es desconocida.La
unidadD-manosatenninalcontieneun grupo acetiloen la posición6 (Kennedyy Bradshaw,
1984). Debido a la presenciade las unidadesde ácido pirúvico y ácido glucurónico en la
molécula,el xantanoesun polisacáridoanioníco.
La distribuciónde pesosmoleculareses amplia, el pesomoleculardel polímero varía
entre 2.106 y 20.106 Daltons. En disolución acuosa,a baja temperatura,presentaun ficticio
mcrementoen el peso molecular, como consecuenciade la tendenciaque tienen estos
polimerosa formar estructurasordenadasde las moléculasen disolución (estructuraterciaria).
En el xantanose han detectadodos conformaciones-hélice y ovillo-, dependiendode la
temperaturade disolución(Hortony col., 1985; García-Ochoay Casas,1993).
El hecho de que se trate de un polisacárido ramificado explica, en parte, la
extraordinariacapacidadespesantey de estabilidadquepresentanlas disolucionesacuosasde
estagoma,lo quehahechoquesus aplicacionesindustrialesseanmuy amplias,incluyendola
industriaalimentaria,la recuperaciónforzadadel petróleo,la industriapapelera,etc, como ya
se ha indicado previamente.Existen diversosderivadosdel xantano tales como xantano
desacetilado,carboxymetil éter y el propilen-glicol éster. Sin embargo,hasta el momento,
ningunode ellos tienela importanciaindustrialdel biopolimero(Kangy Pettit, 1993).
53
Introducción
CH2 OHCH2 OH 1
:oo M o
cCH3
Figura 1.10.-Esquemade la moléculade xantano
Se han realizado muchos trabajospara estudiary optimizar las condiciones de
producciónindustrial del biopolímero(Moraine y Rogovin, 1966, 1971,1973;Cadmusy col.,
1978; Davidson, 1978; Kennedy, 1982; De Vuyst y col., 1987ay 1987b; Hasslery Doherty,
1990; Shu y Yang, 1991; Santos, 1993; García-Ochoay col., 1995a). Los procesosde
producciónpuedensermejoradoscon el conocimientode la rutade síntesisdel xantanopor la
bacteria Xanthonzonascampestris. Sin embargo, en la actualidad, es aún limitada la
informaciónexistentesobrela síntesisde xantano,ya que setratade un procesocomplejoen el
queintervieneun sistemamultienzimático(Santos,1993).
Sutherland(1977)generalizala síntesisde polisacáridosextracelularesindicandoque
se lleva a cabo en cuatro grandesprocesos:consumode sustrato,formación de intermedios
metabólicos,produccióny modificación del polisacárido.En la Figura 1.11 se muestrael
mecanismopropuestoparala biosíntesisdel xantano(Sutherland,1977; Pace,1980; Kennedy
.54
r
co~
OH
- Na, K~, 112 Ca2
Introducción
1.11.-Xantlwinonascampestris
Xanthomonasesun génerode la familia Pseudomonaceae.Sonbacilosrectosaislados,
quemiden de 0,4 a 0,7 ~mde anchoy de 0,7 a 1,8 vm de largo. No poseenvainani seconocen
estadosde reposo.SonbacteriasGram negativasmóviles, ya que poseenun flagelo polar.
Estosmicroorganismossonaerobiosobligadosy sumetabolismoesestrictamenterespiratorio,
nuncafermentativo. Son bacteriasno desnitrificantesy no reducenlos nitratos, son catalasa
positivasy oxidasanegativas(Bradbury, 1984), formancoloniasusualmenteamarillas,lisas y
viscosas.
La cápsulade estetipo de bacteriasno presentaunaestructuraespecial,por observación
microscópicacon técnicassimplesde tinción. Sin embargo,la tinción capsularcon tinta Indio
ha llevado a observarcápsulasen muchoscultivos de Xanthomonasy especialmentede X
campestris(Bradbury, 1984).La producciónde grancantidadde estospolisacáridoscapsulares
-o gomadexantano-se llevaacabocuandoseempleanmediosricos enhidratosde carbono.
En cuantoa la pared celular, es similar a otras células Gram negativas.Ya se ha
comentadoqueposeenun solo flagelo, observablepor tinción y en microscopioelectrónicoen
cultivosjóvenes.Su longitudsueleser de 1,79 j.tm, pero ocasionalmentevariaentre2 y 3 gm.
No se ha observadopiti enXanthomonas,peroestono indica la ausenciade estasestructuras.
En lo referentea pigmentos,la mayoríade las bacteriasdel géneroXanthomonaspresentan
pigmentosamarillos-denominadosxanthomonadinas-,que son polienosaril-bromados.En la
Figura 1.12. se puedeobservaruna fotografia deXanthomonascampestrisrealizadamediante
MicroscopiaElectrónicade Transmisión(MET) donde se apreciauna célula en la fase de
división, y se ve claramenteel flagelo polarasícomola morfologíade la bacteria.Las especies
de Xanthomonasson quimioorganotrofas,son aerobiasestrictasy empleanel oxígenocomo
aceptorde electrones.Sonbacteriasoxidasanegativas,capacesde creceren un medio sintético
puro, conteniendominerales,nitrógeno amónico y una fluente de carbono como glucosay
suplementode aminoácidos(Bradbury, 1994).
.56
Introducc,ón
y Bradshaw, 1984; Sutherland, 1985). Hay que destacar la importancia de los lípidos
intennediosde la síntesis,queparecenserlos quetransportanel monómerodexantanohastala
membranacelular y graciasa ellos,se unena diferentesmonosacáridosparala formacióndel
esqueleto carbonado(Sutherland, 1975 y 1977). El residuo de piruvato proviene del
fosfoenolpiruvato(P.E.P)- obtenidogeneralmentepor vía de Entner-Doudoroff,quees la ruta
por la que la bacterialleva a caboel metabolismode la glucosa(Bradbury, 1984: Ponsy col.,
1989)-uniéndose,finalmente,al esqueletocarbonadoya formado(lelpi y col., 1981ay 1981b).
SicGP —.-—*GIc—1P
LIPIDO—PUDP— SIc
¡ UMPSic LIPIDO—P-P-G(c
¡DF- ¡DF
UDP-Ac SIc LIPIDO-P-P-Gíc-GIc
Entier GP—*Man- GP—*ManLIPIDO-P-P-GIc-GIc-Man
Doudoroff 1 ¡
PEP
LIPIDO-P-P
UD PLíPIDO- P-P-GIc-Glc- Man
Ac- Sic
LIPIDO-P-P-GIc- Sic-Man
- Ac-Gk
Many,
1 r
LIPIDO-Glc- Sic- Man- Ac-GIc
PYR= Man
MONOMERO DE XANTANO
1— Sic- Sic—
Man
Ac Sic
Mcin= Pyr
Figura 1.11.- Esquemade reaccionesde la síntesisde xantano.
55
Introducción
Figura 1.12.-Fotografia de XanthomonascampestrisrealizadamedianteMET (12000aumentos).
En cuantoal metabolismode carbohidratos,oxidanla glucosa,siendola rutade Entner-
Doudoroff la predominanteen el catabolismode la glucosa,solo desvíande un 8 a un 16% de
la glucosaa la ruta de las pentosasfosfato. El ciclo de la hexosano se emplea de forma
significativa. Tantoel ciclo del ácidotricarboxilicocomoel ciclo del glioxilato estánpresentes
entodo el géneroXanthomonas(Bradbury,1984).
El xantano se produce por bacterias del género Xanthomonas; aunque es,
principalmente,la especieXanthomonascampestris, la másestudiaday empleadaparallevar a
cabola producción.Se ha observadola síntesisde polisacáridossimilaresal xantanoa partir de
otrasespeciesde Xant/zomonas(Slodki y Cadmus,1978). A partir deXi mannihotisseobtiene
un polisacáridoformadotambiénpor D-glucosa,D-manosa,ácidoglucurónicoy ácidosacético
y pirúvico, aunqueen diferentesrelacionesmolares,obteniéndoseun 2,2% del polisacáridoa
57
Introducción
partir del 4 al lOOo de azúcar.Si se empleaAl phaseolise puedeLlegar aobtenerhasta10 gIL
de una gomade característicassimilares, con una composiciónsimilar, al xantano.pero con
diferente relación molar entre los azúcares que lo forman. Otras especies, como Xi
ma!vacearurn,Xi heredae,Xi papavericolay Xi vesicatoria,producenpolisacáridosformados
por las mismasunidadesde azúcar(Margaritis y Zadic, 1978; Bradbury, 1984). Es la goma
sintetizadaporXsrewartii la quepresentaunaclaradiferenciacon el resto,ya que las unidades
de azúcarque la forman son D-glucosa,D-galactosay ácidoglucurónico(Slodki y Cadmus,
¡978). La mayoría de las bacteriasdel género Xanthomonasproducen una familia de
polisacáridosextracelulares,cuyo papel pareceser protegera las células de la desecacióny
otrascondicionesadversas,ya que es,en realidad,la cápsulabacteriana(Bradbury, 1984).En
la Tabla 1 .3 seresumen¡a composiciónde diversosbiopolímerossintetizadospor diferentes
especiesdel géneroXanthomonas.
Tabla 1.3.-Composiciónmedia(en porcentaje)de Los diferentespolisacáridossintetizadosporLas bacteriasdel géneroXanthomonas(Kennedyy Bradshaw,1984).
Especie O-Glucosa 0-Manosa Ac. D-Glucurónico Piruvato Acetato
36 campestrus 30.1 27,3 t4.9 7.1 6.5
36 olbilíneans/739” 30,2 27,5 13.9 53 5.8
36 a/ti lineans2257 25,2 26,1 14,2 5.8 5,1
X wconopodis 457 30,6 28,6 13,7 7,2 5,5
36 fregaría1469” 32,5 28,5 15,1 7.0 3,9
XIfragarza1822 24,6 26,1 14,0 4.9 5.5
36 gurnnñsucians 2182 34,8 30,7 16,5 4,7 10,0
Xjug/andis 411 33.2 30,2 16,8 6,9 6,4
36 inanihotis 4459 33,3 28,7 16,7 7.6 6,8
36 phaseoli 556 29,1 34,2 17,8 7,7 1,8
36 phaseoli1/28 30,9 28,6 15,3 1,8 6,4
36 vu.scuíomm 702 34.9 30,2 17.9 6,6 6,3
36 vascularum 796 22.2 26,2 15,3 5,4 8,8
acontiene O-Galactosa
58
Introducción
Como ya se ha comentado, la especiemásampliamenteutilizada para La producción
de xantanoes Xanthomonascampestris. Aunque estabacteriano es dificil de cultivar en
mediosestándarde laboratorio,se hanobservadovariacionesen las cepas,tanto en cultivo en
continuo(Silman y Rogovin, 1972),comoen discontinuo(Cadmusy col., 1976),queafectana
la calidady al rendimientodel xantanoproducido.
Se han descritotrestipos diferentesde cepasde estabacteria(Slodki y Cadmus,1978;
Cadmusy col., 1976 y 1978;Jeanesy col., 1976;Kidby y col., 1977):
• CepaL (Large):presentacoloniasmucoidesamarillasbrillantes,de 4 a 5 mm
de diámetro.Proporcionabuenrendimientoen xantanoy con un nivel alto de
piruvato(tambiéninfluye el mediodeproducciónempleado).
• CepaSm (Small): coloniasmucoidesde color amarillo más oscuroque la
cepa L y de unos 2 mm de diámetro. Proporcionamenor rendimiento en
xantanoque lacepaL y con menorcontenidoenpiruvato.
• CepaVs (Very Small): producecoloniasno mucoides,de color indefinido y
de un diámetromáximode 1 mm. No producexantanoapreciablementey no es
muyfrecuente.
Pareceque las cepasSmy Vs se producenpor degeneraciónde la cepaL; normalmente
debido a un envejecimientodel cultivo, que puede ser aceleradopor una conservación
deficiente. Por lo tanto, es necesariomantenerla bacteriacomo cepa L, para obtenerun
xantanocon buenaspropiedadesy con buenrendimiento.
1.3.2.-ProduccióndeXantano
Un factorimportanteateneren cuentaesel estadodel microorganismoempleadocomo
inóculo en la producción,puesafectaa la duracióndel procesoy a la composicióndel xantano
obtenido.Los diferentesautoreshan abordadoesteproblemacreandoun inóculo a partir de
variosciclosde crecimiento,esdecir, en etapas(Rogoviny col., 1961; Sumany Rogovin, 1970
y 1972; Morainey Rogovin, 1971; Cadmusy col., 1976 y 1978; De Vuyst y col., 1987ay b;
59
In/toducción
Petersy col.. 1989: Pons y col., 1989 y 1990; Santos, 1993). El tiempo necesariopara la
preparacióndel inóculo estáinfluido por la composicióndel medio empleadoparael desarrollo
del microorganismo-algunosautoresvarian la composiciónde una etapaa otra (Rogovin y
col., 1961; Cadmusy col, 1978; Petersy col., 1989; Ponsy col., 1989) - y por la temperatura
empleadaparael crecimientode Xi campestris,existiendoun intervalo óptimo de 25 a 30 0C,
parallevarloa cabo(Thonarty col., 1985; Shuy Yang, 1990).
En trabajosprevios (Santos, 1993), tras un cuidadosoestudio,se ha concluidoque el
móculo deberealizarseen dosetapas,paraque de estemodo el microorganismose aclimatea
las condicionesdel fermentador,tanto al medio como a la agitaciónmecánica.La primera
etapadel inóculo consisteen incubar el microorganismoen tubo de ensayocon medio YM,
durante12 horasa 280C y 210 r.p.m., para,acontinuación,pasarloa un Erlenmeyercon medio
YM-T e incubarlo durante6,5 h, a28 0C y 210 r.p.m..
El medio de producción empleadoen los primeros estudiosrealizados sobre la
producciónde xantano(Rogovin y col., 1961 y 1965) era de tipo complejo; se empleaban
sustanciasabundantesen EstadosUnidos para probar la síntesisdel polisacárido(azúcarde
maíz, CSL, etc.). El desarrollodel proceso de producciónha llevado a la propuestade
diferentestipos de medios,entrelos quetodavíaseencuentransustanciascomplejas,cornoson
lapeptona(Kennedyy col., 1982;Pinchesy Pallent,1986; Leey col., 1989; Ponsy col., 1989
y 1990), extracto de levadura(Pons y col., 1989 y 1990; Shu y Yang, 1990 y 1991), CSL
(Kennedyy col., 1982; De Vuyst y col., 1987ay b), extractode Pharmamedia(Pattony Dugar,
¡981) y DDS (Moraine y Rogovin, 1971; Silman y Rogovin, 1972; Cadmusy col., 1976;
Kennedy y col., 1982). Sin embargo,en general,paramejorarel sistemade producciónde
xantano,podercontrolar las concentracionesde los diferentesnutrientesque seincorporanal
medio y observar su influencia en el proceso, se suele trabajar con medios sintéticos
(Davidson, 1978;Cadmusy col., 1978; Souwy Demain, 1979 y 1980; Trilsbachy col., 1984;
Tait y col., 1986; Petersy col., 1989; Schweickarty Quinlan, 1989;Suhy col., 1992).
Las fuentesde carbonomásampliamenteutilizadassonglucosay sacarosa(Morainey
Rogovin, 1966y 1971; Silman y Rogovin, 1972; Cadmusy col., 1976 y 1978;Davidson,1978;
Souw y Dennin, 1979 y 1980; Kennedyy col., 1982; Trilsbachy col., 1984; Thonarty col.,
1985; Tait y col., 1986; Pinchesy Pallent, 1986; Funahashiy col., 1987; De Vuyst y col.,
1987ay b; Lee y col., l989; Petersy col., 1989; Qadeery Baig, 1989; Vashitzy Sheintuch,
60
Introducción
1991; Zaidi y col., 1991; Suh y col.. 1992). Sin embargo, parece que es la sacarosa,en
concentraciónentre20 y 40 gIL, la que proporcionamejoresresultados(Souw y Demain,
1979; Funahashiy col., 1987;De Vuyst y col., 1987a;Santos,1993).
Respectoa! nutriente nitrogenado a emplear en la producción, existe una gran
discrepanciaen la literatura;mientrasquehay autoresquedestacanel efecto beneficioso,sobre
la producción del polisacárido, de fuentes nitrogenadasorgánicaso complejas(Souw y
Demain,1979y 1980; Kennedyy col., 1982; Qadeery Baig, 1989), otros autores comentan
que es mejor, para el transporteen el caldo, cuantomenory más sencilla sea la molécula
empleada(Slodki y Cadmus, 1978). La idea general sobre el sustratonitrogenadoparece
indicar que se debe emplear un compuesto orgánico (urea, ácido glutámico) o sustancias
complejas (CSL, DDS).No obstante, Santos (1993) realizó una comparación de [aproducción
obtenida cuando el nitrógeno se añade al medio de fomia inorgánica, como amonio y cuando
la frente nitrogenada es de naturaleza orgánica, observando que, para la misma cantidad de
nitrógeno, la cantidad de xantano producida con amonio era mayor que cuando se incluía una
fuente nitrogenada de naturaleza orgánica.
En cuanto al resto de los nutrientes, su incorporación al medio se suele realizar de
forma sintética, con compuestos inorgánicos; excepto en los casos en los que la sustancia
compleja empleada como fuente nitrogenada (DDS) incorpore las cantidades necesarias de los
citados nutrientes.
En los medios de producción se suele incorporar ácido cítrico, ya que se ha
comprobado el efecto beneficioso en la producción de ciertos ácidos orgánicos añadidos en
pequeñas cantidades en el medio (Souw y Demain, 1980; Trilsbach y col., 1984).
La composición del medio fue optimada en trabajos previos (García-Ochoa y
col., 1992; Santos, 1993) mediante diseño factorial de experimentos. La composición de
este medio aparece detallada en el capitulo 2 de esta Memoria y ha sido el medio empleado
para la producción de xantano en el presente trabajo en todos los experimentos. La
concentración óptima de amonio es de 0,257 gIL, concentraciones superiores pueden
ocasionar un efecto tóxico en las células, pudiendo verse afectado tanto el crecimiento como
la producción de xantano. Sin embargo, por motivos que luego se explicarán, la
concentración de la fuente nitrogenada ha sido variada. En cuanto a la fuente de carbono se
61
Introduccían
ha empleadosacarosaen una concentraciónde 40 gIL, la cuales lo suficientementeelevada
para favorecer la síntesis del polisacárido, pero no para tener efecto negativo en la
producciónpor inhibición delcrecimiento(Souw y Demain,1979).
El resto de variables que influyen en el procesode producciónson: temperatura,
agitación, caudal de aire y pH. En la Tabla 1.4 se muestralas condicionesde operación
empleadaspor diferentesautoresen biorreactorestipo tanqueagitado.
Tabla 1.4.- Condicionesde operaciónempleadaspor diferentesautoresparallevar a cabolaproducciónde xantanoen un tanqueagitado.
Autores V(L) Q(L/L/min) N(r.p.m.) T(0C) pH1
Cadinus y col. (1978) lO 1.5 225-300 20-30 6.8(control)
Rogovinycol(1965) 2272268
0.5 90-29030-250
28 7
Moraine y Rogovin 0966) --- 1 1000 28 7
Moraine y Rogovin (1971) 8 1 500-1000 28 72.1(control)
Moraine y Rogovin (1973) --- --- --- 28 (
(control)Souw y Desnain (1980) --- 0.5 500 25 (
(control)
PinchesyPallent(1986) 102.5
0,4 6001000
30 ((control)
De Vuysty col. (1987) 6 1 250-700 28 7
Funahashly col. (1987) 6 1 350-1200 30 7
Peters y col (1989) --- 0.3 200-800 28 ((control)
ShuyYang(l990) --- 1.16 800 20-34 ((control)
¡ Pons y col. (1990) 3.6 0,3, 0.6 500-900 29 6.9(control)
Kennedyy col. (1982) 3.5 0.5 400-600 30 ((control)
SchweikartyQuinlan(1989) 1.2 1 300-1300 26 (
(control)
Santos(1993) 1,5 1 210-1300 28 7
Comopuedeapreciarseen la tabla, la temperaturaque se debeemplearparallevar a
cabola producciónse encuentraen el intervalo de 25 a 33 0C. La gran mayoríade los autores
empleanla misma temperaturaen la preparacióndel inóculo que en la producción(Rogovin y
col., 1961 y 1965; Moraine y Rogovin, 1966, 1971 y 1973; Sumany Rogovin, 1970 y 1972;
Davidson, 1978; Souwy Demain,1979 y 1980; Kennedyy col., 1982; Trilsbachy col., 1984;
62
Introducción
Pinches y Pallent, 1986; Tait y col., 1986; Funahashi y col., 1987, De Vuyst y col., 1987a y b;
Petersy col., 1989; Lee y col., 1989; Qadeery Baig, 1989; Ponsy col., 1989 y 1990; Zaidi y
col., 1991; Suh y col., 1992). Sin embargo,se ha propuestoel empleo de temperaturas
diferentesen ambasetapasdel proceso(Thonarty col., 1985; Shuy Yang, 1990 y 1991).
En trabajosprevios (Santos,1993 y García-Ochoay col., 1997)se determinóque la
temperaturaóptima para la producciónde xantanoes 28 0C, si bien no existe una gran
diferenciacon la temperaturade 310 C.
Debido a que Xanthomonascampestrises una bacteria estrictamenteaerobia, la
transferenciade oxígeno en la fermentación se convierte en una variable de gran
trascendencia.En cadatipo de reactorlas variablesde operaciónquepuedenafectara la citada
transferenciade oxígenosondiferentes.Como el reactormásempleadoparala producciónde
xantanoesel tipo tanqueagitado,las condicionesde operaciónquemásinfluyen sonel caudal
de aire y la agitación.
Aunquelos valoresdel caudaldeaíreempleadosson dispares(de 0,3 a 1,5 L/L/min),
todos los autoresmantienenconstantela citadavariable.Portanto, la transferenciadel oxígeno
en el caldo dependeúnicamentede la velocidadde agitación.Sobreesta última variable
citada,hay dos tendencias:por una partehay autoresque la mantienenconstantedurantetoda
la fermentación(Souwy Demain, 1980; Pinchesy Pallent, 1986; Shu y Yang, 1990 y 1991),
mientrasque otros la van aumentandoa medidaqueaumentala viscosidaddel caldo (Rogovin
y col., 1961 y 1965; Moraine y Rogovin, 1971; Cadmusy col., 1978; Kennedyy col., 1982;
Funahashiy col., 1987;De Vuyst y col., 1987ay b; Schweickarty Quinlan,1989; Ponsy col.,
1990).
Diversos autores (Santos, 1993) han propuesto que la velocidad de agitación
empleadadebe ir incrementándosea medida que aumentar la viscosidaddel caldo, para
mejorarla transferenciadel oxígeno,ya que los microorganismosseencuentranrecubiertosde
una capade polisacáridoque evita surotura por efectode la elevadavelocidadde agitación,
que es necesarioalcanzarpara mantenerla concentraciónde oxígeno disuelto a niveles
adecuados.Paraun caudalde aire constantede 1 L/L/min, la velocidadde agitacióninicial
debeserde 210 r.p.m. y tiene que ir aumentandoa medidaque crecela viscosidaddel caldo
enel biorreactor,hastaalcanzarun valorentre800 y 1000 r.p.m..
63
Introducción
Finalmente, respecto a la última de las variables citadas anteriormente,el pH,
únicamenteThonarty col. (1985)proponenrealizarla preparacióndel inóculo aun valor de 5,
el restode los autorescomienzanla fermentaciónpartiendode un inóculo crecido a pH cercano
al neutroy con el medio de producciónajustadotambiéna un valor cercanoa 7. La diferencia
entre unos trabajosy otros radicaen controlar o no estavariabledurantela fermentación,e
incluso se estudiala mejor basea emplearpara realizarel citado control. Hay autoresque
señalan,de forma especial,el beneficiodel control del pH durantela fermentación(Moraine y
Rogovin. 1971), mientrasque otros autoresúnicamentetrabajanempleandoel citado control,
pero sin comentarsi esta variable ha sido o no estudiada(Cadmusy col., 1978; Davidson,
1978; Souw y Demain,1980; Pattony Dugar, 1981; Pinchesy Pallent, 1986; Tait y col., 1986;
Robinsony Wang, 1988; Ponsy col., 1989; Lee y col., 1989; Petersy col., 1989; Schweickart
y Quinlan, 1989; Shu y Yang, 1990 y 1991; Suh y col., 1992). Moraine y Rogovin (1971)
señalanla mejoríaque suponeel empleo de hidróxido amónico como álcali para realizar el
controldel pH.
En la literatura,sin embargo,existetambiénun grannúmerode trabajosen los que
serealizala fermentaciónsin llevar a cabo el control del pH (Rogovin y col., 1961 y 1965;
fvloraine y Rogovin, 1966; Sumany Rogovin; 1970 y 1972; Souw y Demain,1979; De Vuyst
y col., 1987a y b; Funahashiy col., 1987). Santos(1993) y García-Ochoay col. (1997)
proponenrealizar la producciónsin control de pH pues no resultabeneficioso para la
producción.Durante el periodo de crecimiento,el pH del medio prácticamentesemantiene
constanteen estevalor, pero al llegar a la faseestacionariade crecimientoel pH disminuye,
si secontrolaestavariable la producciónsedetiene.
Finalmente,en la Tabla 1.5 semuestrala comparación entrela cantidadde xantano
producido,así como el rendimientoobtenido,en las condicionesempleadaspor Santos(1993)
en comparacióncon otrosautoresen tanqueagitadoy en discontinuo.Comopuedeobservarse,
Shuy Yang (1990) obtienenmejor rendimientoen xantanoqueel obtenidoen dicho trabajo,
pero la concentracióndel polisacáridoobtenidapor estosautoresesapenasla mitad que la
obtenidapor Santos(1993), siendo un factor más importantellegar a una concentraciónde
xantanoelevada. Sólo Funahashiy col. (1987) han obtenido la misma concentraciónde
xantano,perohannecesitadoun díamásdetiempode fermentación.
64
Introducción
Desdeque se comenzóa estudiar la síntesisdel xantano, su producciónse ha
llevado a cabo en reactorestipo tanqueagitado, realizándosela operación de forma
discontinua.Existen, desdeentonces,una gran cantidadde trabajosque, incluso en la
actualidad, siguen llevando a cabo la fermentación en las mismas condiciones de
operacióny tipo de reactor(Rogovin y col., 1961 y 1965;Moraine y Rogovin, 1966, 1971
y 1973; Cadmusy col., 1976 y 1978; Souwy Demain,1979y 1980; Kennedyy col., 1982;
Thonart y col., 1985; Dussapy Gros, 1985; Pinches y Pallent, 1986; De Vuyst y col.,
1987ay b; Funahashiy col., 1987; Petersy col., 1989; ShuyYang, 1990 y 1991; Ponsy
col., 1990).A partir de los años70 comenzarona realizarseestudiosparallevar a caboel
procesoen continuo (Silman y Rogovin, 1970 y 1972; Davidson, 1978; Pattony Dugar,
1981; Trilsbachy col., 1984; Tait y col., 1986; Leey col., 1989),aunquela produccióna
escalaindustrial se siguerealizandoen operacióndiscontinua,ya que elproblemaesevitar
la contaminacióndel cultivo con microorganismosindeseables(Kennedy y Bradshaw,
1984) y la degeneraciónde las cepas.En los últimos años,han comenzadoa realizarse
trabajosen reactoresdiferentes al tanqueagitado, como son columnasde burbujeoy
airlifts (Ponsy col., 1989 y 1990; Zaidi y col., 1991; Suh y col., 1992), los cuales,según
estosautores,presentanventajas en algunosaspectosrespectoa los de tanqueagitado
mecánicamente,como menor stress hidrodinámico, aumento en la velocidad de
transferenciade materiay calor,mejorescondicionesde mezclay menoreslimitacionesen
el cambiode escala.Inclusose han empleadoreactoresprototipo, como esel T.O.R.U.S.
(Krebser y col., 1988), llevándose a cabo el proceso, en todos los casos,de forma
discontinua.En trabajosprevios (Santos, 1993; García-Ochoay col. , 1997), se ha
empleadoun tanqueagitadoen operaciónen discontinuo.La Tabla 1.6. muestrade forma
comparativalos resultadosobtenidospordiferentesautoresquellevana caboel procesoen
diferentestipos de biorreactores,apareciendotanto la concentraciónde xantanoalcanzada,
como el rendimientodel procesoy el tiempo en que se alcanzala concentraciónque se
especifica.
65
!ntíoducc¡on
Tabla 1.5.- Producciónde xantano y rendimientosobtenidostrabajando en tanque agitado y aereado
por los diferentes autores
Autores t(h) P(g/L)
Cadmusy col. (1978) 46 72-96 14
Rogovinycol.(1966) 67 96 15
Morainey Rogovin(1966) 70 96 15
Morainey Rogovin(1966) 73 40 14.6
Morainey Rogovin(1966) 75 96 29
Souwy Demain(1980) 50 60 10.5
Pinchesy Pallent(1986) 76 45 ¡‘7
DeVuystycol.(1987) 75 144 27.9
Funahashiy col. (1987) 96 30
90 18.5
52 19
50 13
Kennedyy col. (1982)
Schweikarty Quinlan(1989)
Santos(1993)
Producción de xantano y rendimientos obtenidos en diferentes trabajosen operación discontinua y diferentes clase de biorreactores.
Autores X’p ~ t (h) Cp (g/L) Fermentador
Ponsycol., 1990=9 80 12 ColunnadeBurbujeo
65 50 ¡3 Tanqueagitado
Ponsycol..¡989 50 120 20 Columnadel3urbujeo
Zaidiy col, 1991 “Pluggingjet”
Suhycol.. 1992
Kesslery col.. 1993
Santos,1993
Fermentaciónen dos etapas,primeratiempoenlas 49 h de fermentación.
etapa 12 h en tanqueagitado,no siendoconsideradoeste
66
Tabla 1.6-
Introducción
1.3.3.- Transponede Oxí2eno
El estudiode la transferenciade oxigenoen la producciónde xantanoes de suma
importanciadebidoa dosaspectosfundamentales.Porun lado, la bacteriaque lleva a cabo
esteproceso,estoes,Xanthomonascampestrises estrictamenteaerobia,lo que quieredecir
que el microorganismonecesitapara crecery producir el biopolímero, el oxígeno; este
nutrientedebetomarlo de la fase líquida y debidoa que susolubilidad en aguaesmuy
pequeña,debe ser suministrado de forma continua al medio. Por otro parte, en la
producciónendiscontinuode xantano,la viscosidaddel cultivo aumentaconsiderablemente
como consecuenciade la acumulacióndel biopolímero, produciendo una significativa
disminuciónde la transferenciade materia.En estas circunstancias, la velocidad de
transportede oxígenocontrola,o influye notablemente,la velocidaddel procesoglobal; por
lo que el parámetrocaracterísticode este transporte,el coeficiente volumétrico de
transferenciade materia,kLav, debeserconocido.
Por otra parte, teniendo en cuenta que, para efectuar cambios de escala en
fermentacionesaerobias, uno de los criterios más ampliamenteutilizado es el de mantener
valoressimilaresde la concentraciónde oxígenodisueltoo su velocidadde transferencia, se
entiendequela determinaciónde esteparámetroseade graninterés.
La importanciade la transferenciade materiagas-líquido en las biotransforrnaciones
aerobias—donde la máximaconcentraciónde productoalcanzableestágeneralmentelimitada
por la velocidadde transponede oxigeno-haceque en los últimos añoshayasido objeto de
numerosostrabajos(Yagi y Yoshida,1975; Figuciredoy Calderbank,1979; Nishikaway col.,
1981ay b; Ogut y Hatch, 1988; Poizat y col., 1992; Nocentiol y col., 1993; Romany col.,
1993; Pederseny col., 1994; García-Ochoay Gómez, 1998). Sin embargo,es escasala
informaciónque existesobrela influenciade las variablesde operaciónen el coeficientede
transportey su predicción,en los cultivos de elevadaviscosidad(Margaritis y Zajie, 1978;
Vashitzy col., 1989; Suhy col., 1992; Ivlerbst y col., 1992; Gómez,1995).Sin duda,estafalta
de información en caldos con microorganismosse debe a que se suponeque los datos
obtenidoscon caldossimulados-dondelos trabajoshansido másextensos-son extrapolables
a la fermentaciónen presenciade los microorganismos,sin tener los inconvenientesdel
trabajocon microorganismos(Dussapy col., 1985; Vlaev y Valeva, 1990; Kawasey col.,
1992).
67
Introducción
Como ya se ha comentado,en los procesosde fermentaciónaerobioses necesario
proporcionaral microorganismola cantidadde oxigeno suficientepara que éste satisfaga
sus requerimientos metabólicos. La utilización de los nutrientes por parte de los
microorganismos,principalmentela oxidación de la fuente de carbono y su posterior
transformaciónen biomasa,productosy dióxido de carbonosólo esposiblecon el suficiente
aportede oxígenodesdela fasegas. Cuando,en un biorreactor,un componente poco soluble
como el oxígeno, debe ser transferido desde el gas —aire- al medio liquido, donde se
encuentranlos microorganismos,el balancede oxígenopuedeexpresarsecomo (Moo-Young
y Blanch, 1987):
¿¿CL =kLaV (C0 *Á30$
dt - q02 •C~ [1.60]
Siendo, el primer sumandoa la derechade la expresión,el término referidoal transportede
oxigeno y el segundo sumando, el referido al consumo del oxigeno por parte del
microorganismo.
Se han desarrolladoun gran número de técnicasexperimentalesde medida, con
distintasvariantes,todasellasaplicablesdentrode un intervalo restringidode condicionesde
operación y que se pueden clasificar en: técnicas de medida indirecta y técnicas de medida
directa.
Las técnicas de medida indirecta son aquellas que se llevan a cabo en sistemas donde
no se está produciendouna biotransformacion.Los valores de kLav obtenidos en medios
artificiales que simulan los caldosde fermentaciónse emplean,generalmente,para realizar
comparacionesentrediferentesbiorreactoresque operanen condicionessimilares o en la
obtenciónde correlacionesempíricasquepermitanestimarel coeficientede transportey poder
describirla transferenciade materiagas-líquido(Dussapy col., 1985; Vlaev y Valeva, 1990;
Yasukaway col., 1991a; Leckiey col., 1 991b; García-Ochoay Gómez,1988).
En estos casos, en ausencia de transformación microbiana, el término correspondiente
al consumo de oxigeno, q0, - C~, de la ecuación [1.60] es cero, resultando la siguiente
ecuación:
dC0, =kLaV.(CO —C0) [1.61]
dt
68
Introducción
Los datos experimentalespara la resoluciónde esta ecuación se pueden obtener
mediante diferentes técnicas o métodos,que puedenserclasificadosen químicosy fisicos. Los
métodosquímicos,se basanen la medidade la concentraciónde oxígenodisuelto a travésde
una reacciónquímicatal como la oxidacióndel sulfito (Yoshiday col., 1960; Dussapy col.,
1985; Yang y coL, 1992), la adsorciónde CO2 (Danckwertsy Gillham, 1966; Danckwerts,
1970) o la oxidación de la hidracina (Onken y col., 1985). Los métodosfisicos utilizan la
respuesta de un electrodo de oxígeno, a los cambios en la concentración de este gas en el
medio, en condicionesno estacionariaso dinámicas.Esteúltimo tipo de método esel más
ampliamente utilizado y se basa en la medida de la concentración del oxígeno disuelto durante
la absorcióno desorciónde oxígenode la disolución(Dussapy col., 1985; Costay col., 1982a
y 1982b; Merchuky col., 1994; Arranz, 1993; Gómez, 1995, García-Ochoay Gómez,1998).
Su aplicaciónpresentaciertasrestriccionesque esnecesarioteneren cuentaparala obtención
de valorescorrectos,como son la adecuadadisposiciónen el reactordel electrodode medida
del oxígenodisuelto, el tiempode respuestay la linealidaddel mismo(Nocentiniy col., 1993;
Merchucky col., 1994).
Las técnicasde medidadirectason aquellasen las que sedeterminala velocidadde
transferencia de materia en presencia de microorganismos, es decir, en la fermentación real por
lo que el valor obtenido es más representativodel sistema en estudio. La medida de la
variación de la concentraciónde oxígenoen el biorreactorpuederealizarseen condiciones
estacionadaso no estacionariaso dinámicas.
La técnicadirectamásutilizada por su sencillezy relativa exactitudes la técnica
dinámica(Dussapy Gros, 1985; Yang y col., 1988; Gaoy Lee, 1992; Raney Sims, 1994;
Gómez, 1995). Este método se basaen el balance de oxígeno disuelto en el biorreactor,
expresado en la ecuación [1.60], midiendo la evolución de la concentración del oxígeno
disuelto durante la interrupciónde la aireacióndel caldoy suposterioraireación.Si a su
vez, semide la concentracióncelulardel medio de cultivo se puededeterminarel consumo
específicode microorganismo,qo2.
En la Figura 1.13 serecoge,de forma esquemática,las distintas fasesde aplicación
de este método. En una primera fase, se suspendela aireacióndel medio de cultivo,
registrandoel decrecimientode la concentracióndel oxígenodisuelto con el tiempo, de
formaque la ecuación[1.60],en estascondiciones,sereducea:
69
Introducción
dc0,
dt — ~~“1o. C\
Co2*
Co2
e
[1.62]
Figura 1.13.-Esquemade la técnicadinámica(régimenno estacionario)parala medidadelcoeficientede transferenciade materia.
Antesde que la concentraciónde oxígenodisuelto alcanceun valor crítico, sereanuda
la aireacióndel medio de cultivo y seregistrala variaciónde la concentraciónde oxigeno
disuelto con el tiempo. En estascondiciones,la ecuación[1.601se puedeexpresarcomo:
de0, =k,a~ .<Q, * —9, )dt—q0 .9, dr
Teniendo en cuenta que, en el momento que se inicia la aireacióndel caldo de
fermentación,las condicionesiniciales son t t~ y C Cm, la ecuación [1.63] se puede
íntegrar,obteniéndosela siguienteexpresion:
[1.63]
C ~ _ ______02 02 — k,a,
AIRE‘ETENIDO
FASE 11
Ccrit 1 FASE 1
AIREACIÓN
* ~—c) — q0, ¿1-.dt
t
70
Introduccion
q0, C~ (t~lm)+(Co, ~Cm) kLaVIj (C0, *C02).dt [1.64]
ecuación,que unavez integrada, permite calcularel valor de kLav a partir de la variaciónde
la concentraciónde oxigeno con el tiempo, una vez conocidoel valor del consumo del
microorganismo,q0 C,<, de la pendientede la primerapartede la curva.
La transferenciade oxígeno en un biorreactor tipo tanque agitado -el más
ampliamenteutilizado en estetipo de procesos-es función de numerosasvariables, tales
como las propiedadesfisicas del líquido (viscosidad,tensiónsuperficial,etc.), la geometría
del tanquey del agitador,el tipo de difusorempleadoy las condicionesde operación.
Esteelevadonúmerode variableshacequeexistannumerosascorrelacionesempíricas
para predecir el valor de kLaV que podemosclasificaren dos categorías.Unas tienen una
formadimensional,correlacionandokLav con la velocidadde agitación(o potenciapor unidad
de volumen, la velocidadsuperficialdel gasy, en casode que el fluido seano-Newtoniano,
con la viscosidad.Segúnunaexpresióndel tipo:
o bien,si seutiliza la potenciasuministradaporel agitador:
Pi?kLaV =C,V~”(—-) -p~ 11.661
Los valoresde las constantes,C1 y C2, y de los exponentesen ambos tipos de
ecuacionescambian para los distintos autores, dependiendo, principalmente, de los
parámetrosgeométricosdel tanque. En la Tabla 1.7 se presentanlos valores de los
exponentesde cadauna de las variablesen algunasde las correlacionespropuestasen la
literatura.
La segundacategoría,tiene una forma adimensionaly expresan,generalmente,el
númerode Sherwoodcomounafuncióndel númerode Reynolds, Aireacióny Weber.
Sh C ReN). NaX2 WCÁ3 [1.67]
Ambos tipos de ecuaciones,son únicamenteaplicables,en un restringidointervalo de
las condicionesde operacióny sonespecíficasde cadarecipiente.
71
introducción
Tabla 1.7.- Valores de los exponentesencontrados por distintos autores en correlacionesdimensionales.
FLUIDO Autores N INI’ ½ T
NEWTONIANOS
Yagi y YosI,ida (¡975) 2,2 - 02 - -0.4 -
Ríguciredo ~‘Calderbank ¡1979) 0,6 0 8 ¡.0 -
Nishíkawaycol. (1981) - 0,8 0.3 - - -
Moo-Young y Blanch ([987) - 0,4 0.r - -
Oguí y F-latch <¡988) 0,9 - 0.7 0,5 - -
Poizal yco. (¡992) 2,7 - 0.6 - -
Nocent¡n¡ y col. (¡993) - 0,6 04 - -¡2 -
komai, y col. (1993) 0.5 0.4 0.5
L¡nek y col (19944 - 0,7 0.4 -
Pedersen y col. (1994) 2.0 - 0.5 -
NO NEWTONIANOS
N,shíkaway col. (1981) 2,4 0,8 0.3 -2.5 -0,5 -
Costa y col (¡982> 2,0 0.4 2,5 -0,4 -
Dtissap y col. <¡985) 1,5 - 0.5~ - -0,’ -
bock y Vacek (1988) - 0,9 0.4 - - -
Ogiit y Hatch (1988) 0,5 - 0.5 0,1 -0.4 -
- 0,02 0,9 - -0,6 -
Linek y col (1991) - 1,1 0.4 - -
Pedersen el al. (1994) 2,7 - 0.6 - - -
Garcia --Ochoay Gómez. (1998)
García-Ochoa y Gómez (¡998)
2,0 - 0.67 - -0,67 -1,0
- 0.6 0.67 - -0,67 -1,0
En un trabajoprevio, llevado a cabopor esteequipo de investigación,serealizó un
amplio estudiode la transferenciade oxígenoen esteproceso,determinándosekla tanto en
disolucionesde xantanocomo en caldosde fermentación,durantela biotransformación,en un
amplio intervalo de condicionesde operacióny geometríasde tanque(Gómez, 1995). En
amboscasos,seempleóunatécnicadinámica.
En el caso de disolucionesde xantanoy paraun biorreactorde 25 litros, cuandola
reología se describe mediante el modelo de Ostwald-deWaele, se obtuvo la siguiente
ecuacion:
72
Introducción
[1.68]
y parauno de 2 litros:
kLaI, =c, y’72 N1 u~E’3 [1.69]
El exponentede la viscosidadcambiacuandola viscosidadsedescribemedianteel
modelo reológico de Casson,tomandoun valorde—1.
Los valoresobtenidossonacordescon los propuestosen la bibliografia. En la Figura
1.14 secomparanlos valoresobtenidosa partir de la ecuación[1.69] con las correlaciones
propuestaspor otrosautoresparasistemasanálogosy en el mismo mtervalode condicionesde
operación.En la misma se observa,que los valores obtenidos por Ogut y Hatch(1988) son
significativamentesuperioresal resto de los trabajos, siendo las diferencias tanto más
significativascuantomenores la velocidadde agitación. La presenciade electrólitos y la
aplicación de una técnicapoco adecuada(el método químico del sulfito) que proporciona
valores muy superiores,no comparablesa los obtenidosmediantemétodosfisicos. Las
diferencias obtenidas por otros autores y las calculadas con la ecuación [1.69]se explican por
el efecto de los parámetros geométricos sobre el coeficiente de transporte en el biorreactor
usadoen el estudio(altura, tipo de agitador,tipo de difusor, etc.)y las propiedadesfisicasdel
fluido.
Asimismo, en presenciadel microorganismoXanthomonascampestris,la correlación
entrelas variablesde operaciónqueinfluyenen el sistemay el coeficientede transporte, en un
biorreactorde 2 litros es:
kLak. = 3,O8.1O~ . . N’75 p39 [1.70]
Como puede observarse, la influencia, sobre el coeficiente volumétrico de
transferenciade materia,de la velocidadsuperficial del gases similar; mientras que la
velocidad de agitaciónes mayor y la influencia de la viscosidadaparente,menor. Así
mismo, los resultadosexperimentalesobtenidosmuestranque los valoresdel coeficientede
transporte son superiores en presencia de microorganismo que cuando se realiza en
ausencia de transformación microbiana. Por ello, en el resto del trabajo se utilizará esta
última ecuaciónpara la determinacióndel coeficientede transporte,en su aplicacióna los
modeloscinéticos.
73
Introducción
2 4 6 8N (r.p.s.)
0,1
~iz 0.01
.2
0.001
10
Figura 1.14.- Predicciónde diferentescorrelacionesadimensionalespara valoresde kLavobtenidos por diferentes autores. VsO,002 mis; g~>-t~ 8.1 o3 a 30.10’Pas.
1.3.4.- Aislamiento y Purificación
Una vez obtenido el xantano, queda bastante diluido en el caldo de fermentación, y
se encuentramezcladocon unagranvariedaddeotros compuestos—componentesdel medio
utilizado que no ha empleadoel microorganismo(salesy nutrientes), las propias células,
etc.-. La composiciónmedia de un caldo resultantede una fermentaciónpararealizar la
producción de xantano es, aproximadamente, la siguientede: 1 a 4% de xantano,de 0,2 a
O,50o de células y de 0,1 a 1% de sales y azúcares no consumidos. Además, debido a la
presencia de xantano, el medio es muy viscoso, unos 100 Kg/ms. Por todo ello, la
recuperacióndel xantano del caldo de fermentaciónno es sencilla, ya que se debede
74
0,000 1
Introducción
eliminarcercadel 95%del caldo.Paraconseguirestefin sepuedenemplear tantométodos
fisicos como químicos (Kennedy y Bradshaw, 1984), dentro de los que se encuentran:
• Tratamientospreliminares,enfocadosa la degradacióny eliminación de las
células.
• Precipitacióndelpolisacárido.
• Etapasfinales,como sonlavado,secado,molienday empaquetado.
En la literatura se han propuesto y empleado diferentes técnicas para llevar a cabo
este proceso. Así, los tratamientospreliminaresempleadosson de naturalezatérmica
(Smith, 1983; lnkson y Wilkinson, 1981), química (Jnksony Wilkinson, 1981; Patton y
Holman, 1968) y/o fisica (Pattony Holman, 1968; Bouniot, 1976; Towle, 1977; Inkson y
Wilkinson, 1981).
En cuantoa la etapade precipitación,éstase puedellevar a cabodisminuyendola
solubilidadde la gomapor adición de alcoholeso cetonasde bajo peso molecular,tales
como metanol (Smith, 1983), etanol e isopropanol(Smith, 1983; Inkson,1979;Bouinot,
1976), t-butanol (Bouinot, 1976), acetona (Smith, 1983), etc. En la mayoríade los trabajos,
el disolventeempleadoes isopropanol(Smith, 1983; Inkson y Wilkinson, 1981; Bouinot,
1976),en cantidadesreferidasa volumende caldoentre 1,8:1 y 2,5:1 (y IPA/v caldo).
Otros autores (Patton y Holman., 1968; Pace y Righelato, 1981; Albretch y col,
1964; Kenedy y col., 1981) han propuesto la adición de cationes polivalentesa las
soluciones de xantano, realizándose la precipitación del xantano debido al carácter
políelectroliticodel polisacárido.Se puederealizarla precipitaciónpor la adición de sales
de calcio(Pattony Holman,1968; Macneelyy O’Conell, 1966) a pH básico(entre8,5 y 12)
o por salesde aluminio (Albretch y col., 1962 a pH ácido(entre4 y 4,5). De este modo se
obtiene una sal de xantano insoluble, que debe de ser transformado en un compuesto
soluble,en formade sal sádicao potásica,parasuempleocomercial.
75
Introducción
Otra posibilidades el empleocombinadode ambosefectos(debido al disolventey a
la presenciade cationesen la disolución). Smith (1983)señalóla posibilidadde añadiral
caldo sales —de calcio, magnesioy cinc- así como isopropanol,disminuyendoen gran
manera la cantidad de disolvente necesaria para llevar a cabo la precipitación. El empleo de
salespolivalentessedebea que, cuantomayores la cargadel catión empleado,menores el
volumen necesario de disolvente para conseguir la precipitación de la misma cantidad de
xantano(ver Figura 1.15).
Las etapasfinales empleadasdependende las propiedadescomercialesy los usos a
los que sevayaadedicarel xantanopurificado.
Fernández(1992)propusoun métodopararealizarel citadoprocesode aislamientoy
purificacióndel xantano,dentrode las especificacionesexigidasparasu comercialización.
Esteprocedimientoconsisteen diluir el caldo de fermentacióncon alcohol. La adición del
alcohol cumple una doble misión, por un lado la dilución de los caldos,provocandouna
notabledisminuciónen su viscosidad,y por otro actuar como un biocida, destruyendola
actividadbacteriana,así como, en muchoscasos,su paredcelular. Una vez diluidos, los
caldos se filtran, separando así las células del medio.
El xantano se separadel medio por precipitación al adicionar más cantidad de
alcohol o alcohol y sales, siendo el alcohol isopropílico el más adecuado ya que generaba un
menorcosteen disolventes,puesaunquecantidadessimilaresde acetonaproducela misma
separación, tanto por la cantidad requerida como, sobre todo, por su menor toxicidad, es
preferible el empleode IPA, como puedeapreciarseen la Figura 1.15. Además, este
comportamientoesbastanteparecidoa distintasconcentracionesde xantanoen disolución.
La adición de sales al medio hace reducir notablemente la cantidad de alcohol
necesaria para la precipitación del xantano, aunque hay una gran diferencia entre utilizar
salesmonovalentes,divalenteso trivalentes,cuantomayor es la cargadel catión, menor es
la cantidadde alcohol necesariaparaobtenerLa precipitacióndel xantano(Figura 1 .1 5>. El
aumentode la concentraciónde salesen el medio reduce,también,la cantidadde alcohol
necesariaparala precipitación(García-Ochoay col., 1993).En la Figura 1.16 se observala
influenciade la concentraciónde salesempleadasobreel volumende PA necesario para la
precipitacióndel xantano.Las salesde cationesmonovalentespuedenser las elegidaspara
76
Introducción
realizar el proceso,ya que evitan la etapa posteriorde conseguirque la sal de xantano
insoluble,obtenidaen el casode emplearsalesde cationespolivalentesseatransformadaen
solubleporcambiodelcatión.
Cuando el xantano es separado del caldo se le somete a sucesivoslavados con
alcohol o con diversasmezclasalcohol-agua.De estaformase eliminan las salesque haya
podido arrastraren el proceso,tratandode evitar la redisoluciónde partedelxantano.
6
2
o
Figura 1.15.-Utilización de diferentesagentesparala precipitacióndel xantano.
77
Introd¿¡cc¡ón
a>—y
Figura 1.16.- Influenciade la adición de salessobreun volumende WA parala precipitacióntotal de xantano
1.3.5.-Proniedadesdel Xantano
Las propiedadesy caracteristicasexigidas al xantano, que deben cumplir las
especificacionescomercialesson las siguientes:
- Contenidoen cenizasy humedad.
- Contenidoen nitrógeno,acetatoy piruvato.
- Viscosidad (como indicación del peso molecular) y comportamiento reológico.
Debido a que la propiedad más característica del xantano es la elevada viscosidad
en disolucionesacuosasse hanrealizadodiversosestudiosde estapropiedad.En un trabajo
previo(Casas,1991),seestudióel comportamientoreológicoempleandoun viscosímetrode
cilindros concéntricos, marca Brookfield, modelo LVT-Sinchrolectric, ampliamente
empleado en la industria y en la literatura para determinar la viscosidad de los caldosde
78
(~0 o’ a6 1,0
Introducción
fermentación. La naturaleza polielectrolitica del xantano obliga a estabilizar su
conformación en disolución, por adición de pequeñascantidadesde sal (generalmente
NaCí), siendoestala únicaforma de obtenerresultadosreproduciblesy evitar así posibles
comportamientostixotrópicoso de agregaciónde moléculas.
Las disoluciones de xantano presentan un comportamiento claramente
pseudoplástico,aumentandoextraordinariamentela viscosidadal aumentarla concentración
en disolución,como se apreciaen la Figura 1.17. La viscosidadseve poco afectada,pero
disminuyealgo, al aumentarla temperaturade medida,como ponede manifiesto la Figura
1.18, y varia de una forma poco habitualcon el cambio de la tertiperaturade disolución,
segúnseapreciaen la Figura 1.19. Estaextrañainfluenciade la temperaturade disolución
en la viscosidadse debea un cambioen la conformaciónde la moléculade xantanoen
disolución, lo que se denominaestructuraterciaria. La conformación que adquiere el
xantanodependede la temperaturaa la que se realizala solubilización,pudiendoadquirir
unaconformaciónordenada(doble hélice,a temperaturasde disolución comprendidasentre
25 y 4fl0 C) o una conformacióndesordenada(de ovillo, paratemperaturasde disolución
más elevadas,60~80O C). El cambio conformacionalse observó por medidastanto de
rotación óptica como de dicroismo circular. Este cambio en la moléculade xantanoen
disolución no fue relacionadoclaramentecon la variación de la viscosidad,y seestableció
claramentela diferenciaentrela variaciónde la temperaturade disolución y la de medida,
aunqueen otros trabajosno se indica si el cambio conformacionalse produce con una
variaciónde la temperaturade medida—o a la que seutiliza-, siendo independientede la
temperaturaa la que la moléculaseha disuelto.
En el trabajoprevio citado se determinóla viscosidadde las disolucionesde xantano,
en distintas condiciones de concentración de xantano, temperatura de disolución y
temperaturade medida,y sehacorrelacionandoutilizando distintosmodelos,como los que
aparecen en la Tabla 1.10. Los citados modelos reproducían de forma satisfactorialos
resultadosexperimentalesque obtuvieronlos autores.Aunquetodos ajustabanbien los datos
experimentalespareceobservarseuna menor dispersiónen la reproducciónde datos al
utilizar el modelo de Casson; esta diferencia es más notoriacuantomayoresseanlos valores
de viscosidad.En el ajustecon el modelode Horschel-Bulkleyseobtienenvaloresparate
(esfuerzocortanteaparente)muy próximosa cero, lo quehaceque estemodelo se reduzca
al de Ostwald-de Waele.
79
Introducción
Tabla 1.10.- Modelos reológicos para disoluciones acuosas de xantano.
MODELO FUNCION
Ostwald-de Waele y = k ytYp
0 = 1< yfl~I)
Casson 2 «~ +k0 .~‘<2Horschel-Bulkley ~- = +
E
2
11
lo-;
—2lo
roo
—1lo
-2lo
Figura 1.16.-Comportamientopseudoplásticode lasdisolucionesde xantano.Influenciade la concentracióndel polisacárido.
80
io~ 102—4-y ls-’)
102
Introducción
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F¡gura 1.17.- Influencia de la temperatura de medida en la viscosidad de disoluciones dexantano.
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Figura 1.18.- Cambio conformacional en la molécula de xantano. Variación de laviscosidad, ángulo de rotación óptica y dicroismo circular con latemperaturade disolución
La reologíadel xantanocambiacon la naturalezadel polímero,esdecir, dependede
supesomoleculary del nivel de acetilaciónde la molécula(Tako y Nakamura,1984)y del
gradode piruvatización(Petersy col., 1993; Kangy Pettit, 1993).Estos niveles en el
contenido de acetato y piruvato varían con las condiciones en las que crece la bacteria
(Souw y Demain, 1979; Cadmus y col., 1978; De Vuyst y col., 1987), con las condiciones82
(Kg/ms>
SO
— 1, rc
Introducción
de operación (Trilsbach y col., 1984; Peters y col., 1993) y con la especie de Xanthonionas
spempleada(Cadmusy col., 1976; Kennedy y Bradshaw, 1984; Tait y col., 1986).
Un xantanocon un nivel alto de acetatoy, especialmente,de piruvato, aumentala
viscosidadde las disolucionesacuosasal favorecerlas asociacionesintermoleculares(Tako
y Nakamura,1984).
Existennumerosostrabajosque abordanel estudiode las condicionesde operación
en la estructuray pesomolecular. La variable más estudiada,es la influencia de las
propiedadessobreel grado de piruvatización,debidoa que estavariableesindicativa de la
calidaddel polisacárido(Cadmusy col., 1978).
En cuanto a la influencia de la temperatura, algunos autores (Cadmus y col.,
1978; Shu y Yang, 1990) han observadola influencia de estavariable en el grado de
piruvatización,llegandoa obtenerel máximo contenidoen piruvatocuandoel proceso se
realizabaa 270C. En el trabajo realizadopor Casasy col. (1999), se observóque el
contenidoen piruvatono variabacon la temperaturade producción,pero el contenidoen
acetatodel xantanoobtenido,a bajastemperaturas25 y 280 C eramayorque el contenidoa
temperaturasmásaltas.En cuantoal pesomoleculardel xantano,estees mayor a medida
que disminuye la temperatura.Concluyeronque la concentraciónde productoobtenidaera
mayorcuandola temperaturade operaciónera de 280 C. Paraun intervalo de temperatura
entre 25 y 34 0C, la viscosidadde las disolucionesde xantanoesmayorcuantomenores la
temperaturade producción. Los parámetrosde los modelosde Ostwald-de Waele y de
Casson-indice de consistencia(K) y esfuerzocortanteaparente(to)- aumentana medida
quedisminuye la temperaturadelprocesode fermentación.
La composición del medio de producción también influye en la estructura
moleculardel xantano.Esteaspectoha sido estudiadoteniendoen cuentavarios nutrientes,
pero la mayoría de los trabajos se centranen el estudiode la fuente de nitrógeno. Hay
autoresque encuentranun mayor grado de piruvatización cuandola fuentede nitrógeno
empleadaes de naturalezaorgánica(Qadeery Baig, 1989; Kennedyy col., 1982), pero
Cadmusy col (1978)concluyenque la mejor frentede nitrógenoparaconseguirun xantano
con alto contenido en piruvato es (NH~)2HPO4. Sin embargo,De Vuyst y col., (1987)
observaronuna influencia inversadel ión (PO3)3~ y el grado de piruvatización.Kennedyy
83
Introducción
col. (1982) encontraronun incrementoen el contenido en piruvato cuando la concentración
de nitrógeno en el medio se aumentaba, pero Davidson y col. (1978) obtuvieron mayor
piruvatización y menor contenido en acetato cuando la fuente nitrogenada era el nutriente
limitante. Trilsbach y col. (1984) no encontraron relación entre el contenido en piruvato de
la moléculay la composicióndel medio. Posteriormente,Casasy col. (1999), también
estudiaron la influencia de esta variable sobre las propiedades de la molécula. Así, en el
trabajo realizadose muestraque la concentraciónde nitrógenono afectaal contenidoen
piruvato y acetato ni al peso molecular del polímero. Además en su estudio se observó LLfl
máximo de producción de xantano, coincidente con la concentraciónde amonio optimizada
por Santos(1993),por debajoo porencimade estaconcentración(0,257 g/L de amonio)la
concentraciónde xantanoesmenor. En lo referentea la viscosidadde las disolucionesde
xantano.seobservóque esmayorcuantomenores la concentraciónde sustratonitrogenado
empleadoen el mediode producción.
La influencia de la concentración de oxígeno disuelto ha sido estudiada, sobre
todo en el contenido en piruvato (Cadmus y col., 1978) y en el peso molecular (Suh y col.,
1987; Peters y col., 1989). Cadmus y col (1978) estudiaron el grado de piruvatización
cuando el proceso se llevaba a cabo con diferentes caudales, no encontrando diferencias
significativas entre caudales de 0,75 hasta 1,5 L/L/min. Peters y col. (1989) estudiaron la
influencia del oxigeno disuelto sobre el peso molecular (cambiando la velocidad de
agitación y empleando aire enriquecido), observaron que el peso molecular del xantano
aumentaba cuando no existían limitaciones del oxígeno durante el proceso. Esta influencia
tambiénha sido observadapor Casasy col (1999) que han llevado a cabo el estudiode la
influencia del oxígeno disuelto, variando la velocidad de agitación en el biorreactor,
observando que la influencia de esta variable se ve reflejada en la mayor producción
obtenida con el aumento de la concentración de oxígeno disuelto en el biorreactor. Cuanto
mayor es la concentración de oxígeno disuelto, mayor es la viscosidad de los caldos de
fermentación. El contenido en piruvato es independiente de la cantidad de oxígeno disuelto
en el medio, sin embargo, se obtiene un mayor grado de acetilación cuando la producción se
realiza con una agitación elevada (500 r.p.m.); por otro lado, en cuanto al peso molecular, la
limitación de oxígeno disuelto da lugar a polisacáridos de menor peso molecular.
84
2. - PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
ProcedimientoExperimental
2.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
El trabajodescritoen estaMemoriaha precisadode la utilización y puestaa punto de
diversas técnicas, tanto de experimentación como de análisis; a continuación se detallan cada
unade ellas,asícomolos equiposy el materia] queha sidoempleado.
2.1.- EQUIPOS
En esteapanadosedescribenlos numerososequipose instalacionesnecesariospara
llevaracabola experimentaciónrealizadaen estetrabajo.
Para obtenerlos datos experimentalesnecesariosparamodelizar la producciónde
xantano se han realizado experimentos en un biorreactor comercial, empleando una incubadora
orbital para la preparación de los inóculos. Además de estos equipos,ha sido necesariala
utilización de otros para conseguir la esterilidad de los medios y las temperaturas programadas
en el mantenimientoy crecimientodel microorganismo.Tambiénha sido necesarioutilizar y
disponerde un buennúmerode aparatosde medidaparaanalizarla evoluciónde los diferentes
componentesdelprocesoobjetode estudio.
85
Procedirnieu/o Experimental
A continuaciónsedan las caracteristicasprincipalesde los equiposempleados:
• FERMENTADOR COMERCIAL
El proceso de fermentacióncon microorganismosse ha llevado a cabo en un
biorreactor BIOSTAT Mde tipo tanque agitado, diseñado y comercializado por BRAUN. Está
constituido por un tanque de cultivo de 2 L de capacidad y con los sistemas de medida, control
y regulación de pH, oxígeno disuelto, temperatura y velocidad de agitación, de acuerdo a un
diseño modular e insertados en una cabina metálica. En la Figura 2.1 se muestra un esquema
del biorreactor empleado, que consta de los siguientes elementos:
Reactor:estáconstruidoen borosilicatocon un volumen total de 2 L y un volumende
trabajo de 1,5 L. La vasija está constituida por una doble pared de vidrio que se
encuentra cubierta por una capa de acero inoxidable con tres orificios de 19 mmde
diámetro y siete orificios de 6 mmde diámetro, unidas mediante un anillo de acero
inoxidable, que se detalla en la Figura 2.2.
Sistemade Medida y Control de Temperawra:el fennentador BIOSTAT M lleva un
controlador PID, con un alto grado de eficacia. La temperatura del medio de cultivo es
medida mediante un sensor de temperatura Pt-lO0, a la vez que un segundo sensor
mide la temperatura del fluido calefactor que circula a través de la camisa del reactor.
Ambas señales son llevadas al regulador de temperatura que opera sobre el sistema
mediante una resistencia de 500 W (Figura 2.3). La temperatura de operación es
seleccionaday ajustadamedianteun indicadordigital, con unasensibilidadde 0,10C.
Sistemade azitacMny aireación: la unidadde agitaciónestáformadapor un motorde
70W de potenciamáxima,que ejercesuacciónsobreunavarílla de aceroinoxidable,
sobre la que se encuentrandos agitadoresde turbina de cuatro palas rectas.Este
sistema garantiza una velocidad de agitación adecuada en procesos en los que se llega a
alcanzarunaelevadaviscosidaden el caldo.
La velocidadde agitaciónesmedidapor un tacómetro,ajustableentreO y 1990 r.p.m.,
con una resolución de 10 r.p.m. El valor fijado se presenta en un indicador digital y es
reguladomedianteun controladorPI.
86
ProcedimientoExperimental
La aireación del caldo se consigue suministrando aire mediante un compresor,
filtrándose a través de un filtro que posee una membrana de 0,2 ~m,para conseguir la
esterilizacióndel aireque se introduceen el reactor.El aire se distribuye en el interior
mediante un difusor toroidal. El caudal de aire es ajustado mediante una válvula y
medidopor un rotámetro.
Sistemade mediday control de oxígenodisuelto: La medidadel oxígenodisuelto es
realizada empleando un electrodo esterilizable, fabricado por IINGOLD. Este electrodo
funciona mediante el principio de polarización y consta de un ánodo de plata y cátodo
deplatino separadosde la disoluciónamedirpor unamembranadeteflón.
La señalde medidaesamplificaday convenidaen unaseñaldigital. La concentración
de oxígeno disuelto puede ser controlada mediante la acción sobre el caudal de aire o
bien mediante la velocidad de agitación. En la Figura 2.4 se presenta un esquema del
sistema de control de oxigeno disuelto.
Sistemade mediday control de oH: El pH del mediode cultivo es analizadoen línea
mediante un electrodo esterilizable fabricado por INGOLD. Opera en un rango de
medida de 2 a 12 unidades de pH, disponiendo de una compensación manual o
automática de temperatura. La señal de medida, previamente amplificada, es
alimentadaa un controladorde tipo PI. Unavez fijado el valor de pH al quese desea
trabajar es mantenido por la acción del controlador sobre sendas bombas de
alimentación de álcali o ácido, como se muestra en la Figura 2.5.
Sistemade mediday control de Espuma:la apariciónde excesiva espuma es combatida
mediante la introducción de un compuesto antiespumante. Para la detección de espuma
se utiliza un simple sensor de contacto, donde la parte metálica del reactor actúa como
tierra. La señal de salida del sensor es enviada al módulo de control de espuma que
actúasobre la bombade dosificaciónde antiespuniante.El tiempo de respuestadel
controlador puede ser ajustado mediante un potenciómetro. En la Figura 2.6 se muestra
un esquemadel sistemade mediday controlde espuma.
87
Pí-ocediínienwExperimental
Figura 2.1.-Esquemadel Fermentador Braun modelo BIOSTAT M.
Fermernadorcomercialde 2 1.
88
ProcedimientoExperimental
Figura 2.2.-Alzadode la vasijadefermentación.
89
Píoced¡niien¡oExperimental
Figura 2.3.-Esquemadel sistemade medida y control de temperatura.
SEÑAL CONTROLADOR DECONSIGNA TENFERATURA
SALIDA DE AGIlA
90
ProcedimientoExperimental
Figura 2.4.-Esquemadel sistemade medida y control de oxígenodisuelto.
F~LTROAIRE
RO! AMETRO
AIRE
AMPLIFICADORDE SEÑAL
— — COUTROLADOR
ELECTRODO •—~.~J~jjjjjj--— ———1SEÑALCONSIGNADE Di
---e- WQROLAOOROC VELOCIDAD
9’
ProcedimientoEvpcrirnental
Figura 2.5.-Esquema del sistemade medida y control del pH.
92
ProcedimientoExperimental
Figura 2.6.-Esquemadel sistemade control y medida de espuma.
—~--2CONTROLADOR
——1
TIEMPO GEDOSIFICACION
DUR A O O NDOS IP OAGIO N
SUSTANGIAANTIE SP UMA NTE
93
ProcedimientoExperimental
• INCUBADORAORBITAL
Parael crecimientode los microorganismosdurantela preparaciónde los inóculosen
matracesErlenmeyers se ha empleado una incubadoraorbital GALLENKAMP modelo
IINR-200. Con lassiguientescaracterísticas:
Rangode temperatura:de +5 0(3 a 70 0C.
Variación máxima de temperatura: + 0,50(3.
Fluctuación de temperatura interna: 0,10C.
Rangode velocidaddeagitación:de 40 a 400 r.p.m. y con un radioorbital de 32 mm.
Capacidad: 30 Erlennieyers de 250 ml o número equivalente de otro tamaño, con cambio
de plataforma.
• ESTUFA DE CULTIVO
La estufabacteriológicaempleadade la marca SELECTA, modelo 2000207,es de
convecciónnatural. Poseeuna homogeneidadde ± 2,5 % y una estabilidadde + 0,5 %,
pudiendo regular la temperatura desde la ambiental + 5 0C hasta600C.
• CAMARADE FLUJO
Para la manipulación de microorganismos en condiciones estériles se ha trabajado en
una cámara de flujo laminar vertical de la firma TELSTAR modelo MICRO-V, capaz de
desarrollar una velocidad de impulsión de 0,45 mIs.
• ESTIJFA DE SECADO Y ESTERilIZACIÓN
Estaestufa es de la firma SELECTA, modelo S-202, con termómetrode referencia,
termostatode regulaciónde la temperaturay termostatode seguridad.
94
ProcedimientoExperimental
• BALANZADE PRECISIÓN
Parala cuantificacióndel pesode los diferentescompuestosempleadosse ha utilizado
unabalanzadigital marcaSARTORIUS,modeloHandy.Estabalanzapermiteobtenerpesadas
del ordende miligramoscon unafiabilidadde + 0,1 mg.
• CENTRIFUGAS
Parala centrifugaciónde las muestrassehanempleadodostipos de centrífugas,una
de la firma HERMLE, modelo Z 230, con capacidadparaocho tubos de 10 ml cadauno;
alcanzaun máximo de 5000 r.p.m.- lo que correspondea 2000 g- duranteun tiempo
controladode hastaunahora.
Parala preparaciónde las muestrasparacitometríade flujo, la centrífugaempleadafue
de la marcaSELECTA, modeloCentrolitcon una capacidadpara30 Eppendorf,alcanzauna
velocidad fija de 10000r.p.m. (18000g) duranteun tiempoquepuedeserprogramado.
• URMIETRO
La medida del pH de las muestrasse ha realizadocon un pHmetro de la marca
CRISON, modelo MICROPTII 2002. Tiene una resoluciónde 10” y lleva incorporadauna
sondaCAT de temperatura,por lo que es capazde realizarla correcciónautomáticade la
lecturadel pH anteun cambiodetemperatura.
• VISCOSIMETRO
Para la medida de la viscosidad se ha empleado un viscosímetro BROOKFJELD
SYNCHRO-LECTRIC modelo LVT, con microadaptador,capazde medir a 0,3; 0,6; 1,5,; 3,
6; 12; 30 y 60 r.p.m.,con un spindledel n0 18; se ha utilizado, conectadoal microadaptador,un
bañotermostatizadomarcaTANSON TC9,con unaprecisiónde + 1 0C.
95
ProcedimientoExperimental
• ESPECTROFOTÓMETROde ABSORCIÓN tJV/VIS
La medidade la absorbanciade las muestrasseha realizado en dosespectrofotómetros
13V/VIS, uno de la firma SHIIN’IADZU , modelo SHIMADZULIV 1603 y otro de la marca
PERKIN ELMER, modelo552 13V/VIS.
• ESPECTROFOTÓMIETROde FLUORESCENCIA
Para medir la fluorescencia de las muestras se ha empleado un espectrofluorímetrode la
marca PERKII4 ELMIER modelo MIPF-44 E.
Para el Joduro de Propidio, la longitud de excitación y emisiónfueron,respectivamente,
de 536 y 623 nm, empleandounarendijade 19 paraexcitacióny de 5 paraemisión.
Parael Isotiocianatode Fluoresceina,las longitudes de ondade excitacióny emisión
fueron, respectivamente, de 494 y 520 tun, con una rendija de 4 para excitación y de 2 para
emisión.
• AUTOCLAVE
Para la esterilizacióndel material, a 1200 C durante20 minutos, seha empleadoun
autoclavemarcaRAYPA, serie“Sterilmatic-C” modeloAE-l 10.
• ELECTRODO de AMONIO
En la medidade la concentracióndel nutrientenitrogenadodisuelto se ha utilizado un
analizador electro-quín-úco marca ORION, modelo 720A. La medida se realiza por
desplazamientodel amonio contenidoen las muestrasal aumentarel pH. Las moléculasde
amonio en disoluciónpasana amoniacoy ésteatraviesala membranaselectivadel electrodo.
El amoniacoque se introduceen el electrodoescapazde producirunaseñaleléctricaque, una
vez analizada y comparadacon la curva de calibrado, proporciona la medida de Ja
concentraciónde amonio.El intervalode concentraciónpuedevariarentre 1 M y 5.1 ~ M.
96
ProcedimientoExperimental
• CROMATOGRAFíALIOUIDA de ALTA RESOLUCIÓN (HPLC
)
El equipode cromatografialíquida de alta resolución,HPLC, que se esquematizaen
la Figura 2.7, presenta las siguientes caracteristicas técnicas:
Bomba: KONTRONJKSYRUMENTS(325 System), capaz de mantener un caudal
constanteentre0,1 y 5 mL/mm a unapresiónquepuedevariarentre 1 y 450 bar. Puede
trabajar tanto en régimen isocrático como en gradiente,tanto de caudal como de
composición,ya queestádotadade un mezcladorde trescanales.
Inyector Automático. KONTRON JNSTRUMENTS-360,con capacidadpara 60
muestrascontenidasen viales de 2 mL. Tiene la posibilidad de termostatizarlas
muestrasy variar la cantidadde muestrainyectada,aunqueen todos los análisis
realizadossehautilizado un volumende muestrade 20 mL.
Horno: PERiKJN-ELMiER LC-l 00, mantienela temperatura5 0C por encimade la
ambientaly hasta99 0C, con una precisiónde ± 0,1 0C. La transmisiónde calor se
realiza por convección forzada de aire caliente. Está diseñado para albergar dos
columnasde cromatografiade hasta35 cmde longitud.
Detector:SEDEX 45, detectorde dispersiónde luz («light scattering»). Se basaen la
dispersiónde luz queseproduceal incidir un rayo sobreun nebulizadoquecontienela
muestraaanalizar.Es necesariofijar unascondicionesde temperaturade mediday de
composicióny presiónen el gasqueseutilizará paranebulizarla muestra.
97
ProcedimientoExperimental
Filtro
u
Reservadedisolvente
PrecolumnaBomba
Inyectorautomático
Columna
lI~tector de di spersionde luzAdquisiciónde datos
Figura2.7.-Representaciónesquemáticadel equipode HPLCutilizado.
• CONTADORde PARTÍCULAS
Parael contajedel númerode células,necesarioparael procesamientode las muestras
por Citometríade Flujo, se empleóun contador COULTER modelo ZM empleandoun tubo
de 30 ~tmy un canalizadoracopladomarcaCOULTER,modeloCHANNELIZER 256.
• CITOMETRODEFLUJO
Para el análisis de componentesintracelulares, se ha empleadoun citómetro
IBRYTE-HS (Biorad, Hempstead13K), con lámparade Xenonde 75 W, filtro de excitación
de 488 nm, filtros de emisión de 510 nm parala fluorescenciaverde y de 600 nm parala
fluorescenciaroja. El equipo perteneceal Centro de Citometría de Flujo (CMF) de la
U.C.M., situadoen la Facultad de Farmacia. Los componentesbásicosde un citómetrode
flujo sonlos siguientes(Figura2.8):
98
ProcedimientoExperimental
Sistemade Flujo de Fluidos: El flujo producidoes un flujo laminar, en el que se
mezclandos tipos de fluidos: el fluido de la muestray el fluido de la vaina. Las
partículas o células deben estar en suspensión, y son analizadas una a una, en el seno
del líquido.
SistemasOpticosy Fotodetector:El flujo de partículaso células pasaa travésde una
zonailuminadapor un rayo de luz focalizado.El impactodel rayo con cadacélula
genera señalesópticas que, una vez recogidas por medio de detectores, son
convertidasen señaleso eventoselectrónicosque midenlamagnitudde cadapulso.
SistemaElectrónicoy Computador:Los pulsosgeneradosson a suvezdigitalizados
y computerizadosen un tiempode milisegundos.Todo estopermite,por un lado, la
visualizaciónen pantallaen tiemporealde las medidasefectuadasen relacióna cada
uno de los parámetros analizados, la discriminación de panículas o células y
establecerventanas,puertaso regioneselectrónicasde acotacióno exclusión,que
posibilitan la adquisición,almacenamientoy/o análisisde eventoscorrespondientes
únicamentea unas determinadassubpoblacionesde interés, o bien la separación
fisica de subpoblaciones.Además la CMF permite la obtención de medidas
semicuantitativasy análisismultiparamétricosmuy precisos.
99
ProcedimientoExperimental
AguapresurizadalE*
r 1
SuspensiónW celular
fluorescente ¡— —, —, Detector ¡
Colección delentes
N
N .
Flujo N ¼.
NS
luz Q.$ijjj6%%%Fuente d~~X
Mistogramas‘4’
Figura 2.8.-Representaciónesquemáticade un citómetro de flujo
Rayo de luzexcitado
1~
cg 1
NS
Detec’tbr,~de luzdisnersa
NS
100
ProcedimientoExperimental
2.2.- MATERIALES EMPLEADOS
2.21.- Nlicroor2anismo
El microorganismoempleadoen el presentetrabajoha sido Xanthomonascampestris
NRRLB-1459. La bacteria se obtuvosolicitándolaa la siguientecoleccion:
Microbiologist Culture Collection Research.Fermentation Laboratory of United States.
DepartmentAgricultural. 1815North UniversityStreet.Peona.Illinois. 61604 U.S.A.
Existentres cepasdel microorganismo,como ya ha sido indicado en la Introduccion.
Comoallí secomentó,las cepasSm y Vs se producenpor degeneraciónde la cepaL, debidoa
un envejecimientodel cultivo, quepuedeser aceleradopor unaconservacióndeficiente.Por lo
tanto, es necesariomantenerla bacteriacomo cepaL, paraobtenerun xantanocon buenas
propiedadesy conbuenrendimiento.En la Figura2.9 se muestraunaplacade la cepaL, donde
puedeapreciarseel aspectode las coloniasde la bacteria.
Parala conservacióny el mantenimientode la cepade Xanthomonascampestrisse
describenen la literaturadosprocedimientos(Jeanesy col., 1976>:
- Conservacióna 1ar20 plazo: esun tipo de conservaciónno propagativa(la bacteriano
crece ni se reproduce).Este tipo de conservaciónse recomiendarealizarla liofilizando una
pequeñapartedel cultivo que seencuentraen condicionesóptimas.Tambiénsehan descrito
otrastécnicascomola congelacióny la conservaciónentirasde papel(Jeanesy col., 1976).
- Conservacióna corto plazo: este tipo de conservaciónes semipropagativa(la bacteria
crece y se reproduce).Se realiza en slants (tubos con medio sólido), pero requiere una
renovacióndel cultivo cadaquincedías(De Vuyst y col., 1 987ay b; Sumany Rogovin, 1970)
ya que si no se realizantransferenciasdel cultivo más o menosfrecuentes,la cepapuede
degenerara Sm (Cadmusy col., 1976).
En estetrabajose realizóla conservaciónde la siguienteforma:
101
ProcedimientoExperimental
- A largo plazo: seconservéel microorganismotanto liofilizado como por congelación.El
liofilizado se realizóen la empresaPI-IARMAMAR S.A.. creciendopreviamente,en medio
líquido el liofilizado obtenidode la colecciónamericanay realizandounacentrifUgacióndel
caldo,paraobtenerlas célulasqueposteriormentese liofilizan y encapsulan. La congelación
Ñerealizadaen Eppendorfscon glicerinaal 10%y posteriorcongelacióna la temperatura
de-250C.
- A cortoplazo: el microorganismoesconservadoen medio sólido, en estetrabajo se ha
empleadomedio YMagar.Los slantssonincubadosduranteun periodode 1 8 a 20 horasen
estufa de incubacióna 250 C y manteniendoposteriormenteel slant a 40 C durante un
periodode 14 díascomomáximo.Trasesetiemposerenuevael cultivo traspasándoloaotro
slantcon medio YM-agar.
Figura 2.9.-Fotografla de las coloniasformadaspor Xantho,nonascampestrissobreYMagar.
102
ProcedimientoExperimental
Paraobservarla viabilidad de la cepade X campestris,el procedimientoconsisteen
realizarsiembraspor agotamientode asaen placa Petri en YM agar. Las placasse incubana
250 C durantetresdías.
2.2.2.ReactivosUtilizados
En la Tablas2.1 a 2.6 aparecenlos reactivosempleados,tantoparala preparaciónde
los mediosde cultivo como aquellosque sehan ido utilizando en el análisis de los diferentes
componentesdel sistema.
En la Tabla 2.1 se muestran los reactivos empleados para la conservacion,
mantenimientoy crecimientodel microorganismo.En la Tabla 2.2 se recogenlos reactivos
empleadosen la preparacióndel medio óptimo de producción,denominadoen lo que sigue
como medio A (García-Ochoay col., 1992). En la Tabla2.3 seindicael agenteprecipitante
empleado en la extracción del producto. En las Tablas 2.4 y 2.5 figuran los reactivos
utilizadosen estetrabajoparael análisisde los componentesintracelularesy, finalmente,en
la Tabla2.6, los empleadosparael análisisde algunosde los componentesextracelulares.
Tabla 2.1.- Reactivos empleadospara los medios de crecimiento y mantenimientodemicroorganismos
Compuesto Marca Código
Agar-Agar PROBUS 29210
D(+) GlucosaAnhidra PANREAC 141341
Extractode Levadura OXOUJ L2 1
Extractode Malta OXOID L39
PeptonaBacteriológica OXOID L3 7
103
ProcedimientoExperimental
Tabla 2.2.-. Reactivosempleados(García-Ochoay col., 1992).
parael medio de producciónde xantano,Medio A
Compuesto Marca Pureza
Química
Código
Cloruro de Magnesio
AcidoCítrico Crista/Lado
PROBUS
PROBUSPuro
120410
11510
ÁcidoBórico PANREACPuro
23687
ÁcidoClorhídrico PANREACPuro
35%141019
Nitrato deAmonio PROBUS 21310
CarbonatoCálcico PROBUSPuro
1092 1Puro
Cloruro de Hierro (III) PROBUSPuro
91410
Oxido de Zinc PANREAC 15682
Fosfato PotasioMono-básico PANREACPuro
98%141509
Hidróxido de sodio PANREAC 141687970
Sacarosa PANREAC 176820Puro
Tabla 2.3.- Reactivos empleados para la precipitación y extracción del producto obtenido.
Compuesto Marca PurezaQuímica Código
isopropanolVIUDA eHIJOSde
MANUEL RIESGOPuro
104
ProcedimientoExperimental
Tabla 2.4.- Reactivos empleadosEspectrofluorimetria.
en los análisis por Citometría de Flujo y en la
Compuesto Marca Pureza Código
Química
Tris(hidroximetil) aminometano PANREAC Puro 131940
Cloruro Sódico PANREAC Puro 141659
Glutaraldehído RIEDEL-DEHAEN 25% 62621
Deoxiribonucleasa1 SIGMA 90 % DN-25
RibonucleasaA SIGMA 85 % R5503
loduro de Propidio SIGMA 95-98% P-4170
Isotiocianatode Fluoresceína SIGMA 90 % F-7250
RojoNilo SIGMA - N-3013
Albúminade Suerode Bovino BOEHRINGER-MANNHEIN - 10222
DNA de Timode Bovino BOEHIRIINGER-MANNHEIN - 109223
RNA de Levadura BOEHRIINGER-MANNHEIN - 104175
Tabla 2.5.- Reactivosempleadospara la realizaciónde análisismediante pruebasbioquímicas.
Compuesto Marca Pureza CódigoQuímica
Lisozima I3OEHRINGERMANNHEIM Puro 107255
Citrato de Sodio SIGMA 99% 54641
Dodecii Sulfatode Sodio SIGMA >99% L5901
SulfatoCúprico PANREAC Puro 141648
Tartrato de Sodioy Potasio PANTREAC Puro 141729
Reactivode Folin ANALEMA Puro PS
Fenol PANREAC Puro 141322
los
ProcedimientoExperimental
Tabla 2.6.-Reactivosempleadosparael análisisde azúcares
Compuesto Marca PurezaQuímica
Código
Kit enzimáticoSacarosa/Glucosa BOEI-IIRINGER-MANNHEIN - 139041
Acetonitrilo RIEDEL-DE HAÉN 99,8 % 34881
2.2.3- Composiciónde los MediosEmpleados
• MEDIOde CRECIMIENTO
VM Extractode Levadura 3 g/L
Extracto de Malta 3 g/L
GlucosaAnhidra 10 gIL
• MEDIOde PRODUCCIÓN
MEDIOA
Acído Bórico 0,006 g/L
Acido Cítrico 2,100 g/L
Acido Clorhídrico 0,130 mL
CarbonatoCálcico 0,020 g~L
Cloruro de Hierro (III) 0,0024g/L
Oxido deZinc 0,0060g/L
Fosfato PotásioMono-Básico2,866 g/L
Clorurode Magnesio 0,507 gIL
Sulfato Sódico 0,089 gIL
Nitrato Amónico 1,1440gIL
Sacarosa 40,00 gIL
Se ajustael pH a 7 con unadisolucióndeNaOH.
106
ProcedimientoExperimental
2.2.4.- Composicion de las Disoluciones
• DISOLUCIONES
Tampón y Preparacionesnara Análisis
TAMPÓN
Tris Hidroximetil Aminometano
Cloruro Sódico
0,1M
0,IM
Se ajustael pH a 7,5 con HCI
TAMPÓN B
Dodecil SulfatoSódico
Tris Hidroxim. Amino Met.
Citrato Sódico
Cloruro Sódico
1 ,5%(w/v)
10 mM
lmM
10 mM
Se ajustael pH a 8 con HCI
• REACTIVOSLOWRY(Lowry y col., 1951)
LOWRYA
LOWRYB
LOWRYC
Carbonatode Sodio
Hidróxido Sódico
Sulfatode Cobre
Tartratode Sodioy Potasio
LOWRY A: LOWRY B
TAMPÓN TRIS
2 % (w/v)
0,1 N
0,5%(w/v)
1 ,O%(w/v)
50:1
107
ProcedituienboExperimental
2.3.-REALIZACIÓN de un EXPERIMENTO
Todos los experimentos llevados a cabo en el presentetrabajo se han realizado en
fermentador.Para ello, se ha empleadoun biorreactorde la marcaBraun, modelo BIOSTAT
M, tal y como seha comentadoen el apartado2. 1. El desarrollode un experimentose detalla
a contrnuac¡on:
Para la preparación del inóculo e inoculación en el fermentador, se parte de un slani del
microorganismoque no tenga más de tres días.Con asa de siembra,se obtiene un ioop de
inóculo que se transfiere al medio de crecimiento,en el que se va a prepararel inóculo
(contenidoen Erlenmeyero en tubo de ensayo, segúnel caso);en esta operaciónse debe
trabajar siemprecercade la llama del mecheroBunseny flamear la bocadel Erlenmeyero del
tubo de ensayo,tanto después de abrirlo, como antesde cerrarlo. El medio de crecimiento
inoculado se cultiva en la incubadora orbital en las condicionesóptimasparaXanthomonas
carnpeshls(Santos,1993), quesonlas siguientes:temperatura2S~C, velocidadde agitaciónde
210 durante 12 h en el medio de crecimientoYM.
Una vez transcurridoel tiempode incubacióndel inóculo, se lleva éstea la cámarade flujo
-previamenteesterilizadacon alcohol-y se toma, de modo estéril, una pequeñacantidadpara
realizardiluciones y conocerla concentraciónde biomasaobtenida.Este último detalle es
inprescindiblepara la repetitividad delos resultadosobtenidos en diversosexperimentos.
El procedimientoa seguirpara llevar a cabo la esterilizacióndel biorreactor esel siguiente:
antesde ser introducidoen el citadoautoclave,se prepara,de modoque seconecteal cuerno
del fermentadorlo más rápidamenteposible.Se deben colocar filtros, tanto para la entradade
airecomo a la salidadel refrigerante,que se cubrencuidadosamentecon papelde aluminio y
se sellan con cinta adhesiva.Mi mismo, se colocan los electrodosde oxigeno disuelto,
antiespumay pH -ésteúltimo debecalibrarseantesde la esterilización-y se cubrentambién
con papel de aluminio y con cinta adhesiva.Tambiénse cubre con papel de aluminio el
conectorde la sondade temperaturaPt-l00 y la salidademuestras.
El ferinentadorse debeesterilizarcon el medio a empleardentro, por lo que se deben
pinzartodaslas gomasdesaliday entradaparaevitarpérdidas.Cuandoel medioquese va a
emplearen el experimentono se puedeesterilizartodojunto -porcontenerla mentecarbonada
y salesinorgánicas-,se introduceen el reactoruna partedel mismo, conteniendotodos los
componentesexcepto la mente de carbono. El sustrato carbonado se prepara en un frasco
aparte-de los preparadosparacontroldel pH, consalidaal fermentador-y se esterilizaunidoal
mismo, tomando la precauciónde pinzarla gomaque los une,paraevitar que haya pasode
liquido de uno a otro.
/08
ProcedimientoExperimental
Unavez introducido todo en el autoclave,se esterilizaa 1200Cdurante30 minutos. Después
de la esterilización,se quita la cinta adhesivay el papel de aluminio y se conectael
ferinentador al cuerpo del mismo; tambiénse conectala entraday la salidade aguade la
camisay se abre la válvula de llenado.Se conectanel agitador,los tres electrodosy la bomba
peristáltica,paraque se introduzcael sustratocarbonado,si es el caso. El biorreactorse debe
dejar duranteal menosseis horasdespuésde realizar los pasoscomentados,para que el
electrodo de oxigeno disuelto se polarice antesde ser calibrado.Transcurridoel tiempo de
polarización,el fermentadorya se encuentraa la temperaturadeseada.Unavezes introducida
la fluentedecarbono,secalibrael electrodode oxigenoconnitrógenoy aire,fijando asi el cero
vel l00% de saturación,respectivamente,antesde realizarlainoculación. Se fija la agitación
en 210 r.p.m.y el caudaldeaireen 1 L/L/ntn.
Finalmente,serealiza la inoculación, una vez preparado el inóculo, como se ha comentado
previamente,y conocidala concentracióndebiomasaen el medio,seprocedea la inoculación
en el fermentador.Paraello, se introducea travésde una membranapreparadaal efecto,
medianteunajeringaestéril.La membranase cubrecon alcoholy se prendefuego cuandose
va a realizarla inoculación.
Para llevar a cabo el seguimiento de la evoluciónde este sistemadurante el proceso,sc realiza
la toma de las muestrasa distintos tiempos, así como el análisis de las mismas. En el
fermentador, la tomademuestrasserealizapor la salidasuperior. Unaveztomadala muestra
sepinzala gomay se introducealcohol por el extremo inferior, hasta la siguiente muestra,para
evitarcontaminaciones.
Las muestrasdebensertomadasencondicioneslo másasépticasposibles,por lo que los tubos
donde van a ser almacenadasdeben ser esterilizadospreviamente. Unaveztomadala muestra,
es centrifugadaa 4000 rpm. <2860 g> durante 30 mlii. con el fin de separar el caldo de las
células,y de estaformapararel crecimientoy la evoluciónde sustratosy productos.Unavez
centrifugadassonalmacenadasa 40 C para el posterior análisisde cadacompuesto.
Preparacionesespecialesde las muestras,como las necesariaspara contar el número de
células,o analizarpor fluorescencia,citometría de flujo o microscopiaelectrónica,sedetallan
en puntos siguientes,dentro de los protocolosespecíficospara el análisisde cada componente.
109
P,-ocedímicn/oExperimental
2.4.- METODOS DE ANÁLISIS DE COMPONENTES EXTRACELULARES
2.4.1.- Análisis de Biomasa
Para el análisis de A? campestris como biomasa se ha empleadoun método
turbidimétrico, es decirun métodoóptico basadoen la absorbanciaquepresentanlas bacterias
en longitudesde ondadel espectrovisible. Consisteen medirla absorbanciade la muestraa
una cierta longitud de onda, frente a un blanco.La longitud de ondaempleadaen el presente
trabajo, para este análisis, fije de 540 nmy el blanco utilizado, agua destilada.
El calibradodel método se realizó en un trabajo previo (Santos,1993).El ajuste de los
datos experimentalespor regresiónlineal a la expresiónde Lambert -Beer apareceen la
ecuación[2.1].
c~~j (g ¡ L) 0.285 . <540 nm) [2.1]
En la Figura 2.10 se muestrala recta de calibradoobtenidade la relación entrela
absorbanciamedidaa 540 nmy la concentraciónde la bacteria.
En cuanto al seguimientode la biomasadurante los experimentoslas muestras
obtenidas,durante la producciónde xantano,eran tratadassegúnel siguiente protocolo
experimental:
Se toma una muestradel biorreactor y se diluye con aguadestilada,de modo que la
alisorbanciamedidaentredentrode la región lineal de la curva de calibrado.El valor de
absorbanciaobtenido a 540 nm es convenido en concentraciónmediante la ecuación
[2.1], que luegoes corregida de acuerdoa la dilución realizada previamente.
110-
ProcedimientoExperimental
.4
u
20
Figura 2.10.- Recta de calibrado para la medida de biomasa de Xanthomonascampestrispor relaciónentrela absorbanciay el pesoseco.
2.4.2.-Medida de la Concentración del Sustrato Carbonado
Parala determinaciónde la concentracióndel sustratocarbonado,estoes sacarosa,se
han utilizado dos técnicasdistintas, una basadaen una prueba enzimáticaque ha sido
realizadamedianteun kit comercial y la otra basadaen la cromatografialíquida de alta
resolución(HPLC) utilizando un detectorde dispersiónde luz. La primeratécnicase empleó
inicialmente,pero cuandose dispusodel equipode cromatografialíquida de altaresoluciónse
empleóestatécnicaen lugarde latécnicaenzimática.
Parala determinaciónde la sacarosa,medianteun kit enzimáticocomercialse empleó
un testde combinaciónde la marcaBoehringer-Mannheim(n0 de catálogo139041).Antesde
aplicarel kit de medidaa las muestras,esnecesariosometerlasa un determinadotratamiento
térmico, para detener las reaccionesenzimáticasde las células bacterianasque puedan
interferir en la medida.Dicho tratamientoserealizaconformeal siguienteprotocolo:
Se introducenlas muestrasen baño de aguaa 800C, duranteunos 15 minutos, y se
centrifuganposteriormentea 5000 r.p.m. durante20 mm., siendo el sobrenadantede esta
última operación, generalmentediluido, el que se utiliza para la determinacióndel azúcar
correspondiente.\~ 4=
7 fl$>
~1 ~ —
Q5 1,0 1,5
Abs(S~mi)
Proccdim¡en/o Experimental
Paracl análisisde sacarosa,se determinael contenidoen D-glucosaantesy despuésde
la hidrólisisenzimáticade la sacarosa.Unavezpreparadala muestracomo se ha indicado, los
pasosa seguirson los siguientes:
Inversiónenzimática:La sacarosase hidrolizamediantela 13-fructosidasa(invertasa)a pH 4,6
en O-glucosay D-flvctosa,deacuerdoa:
Sacarosa * Fructosa /3— Fructosidadasa glucosa+ i~ — fructosaD [2.2]
Determinaciónde glucosa:Se añadela enzimahexokinasa(1-11K), que cataliza-apH 7,6- la
fosforilación de la O-glucosacon adenosín-5-trifosfato(ATP) bajo la forma simultáneade
adenosín-5-difosfato (ADP). La glucosa-E-fosfato formada (G-6-P) es oxidada
específicamentepor el nicotinarnin-adenin-dinucleátido(NADP> en presenciade la glucosa-
6-fosfato-dehidrogenasa(G6P-DH) a gluconato6-fosfato, formándose, a la vez,
Nicotinamin-adenin-dinucleótido-fosfato(NADPH). La cantidad de NADPH fonnada
durante la reacciónes estequiométrica,con respectoa la cantidadde 0-glucosa,y se
determinapor suabsorbanciaa 340 nm.
D — <Pu cú~ a + -IT? Ffexoqu¿nasa (Y/u casa—E — P + <ID? [2.3]
<3—6-- 1’ + NADP~ (36P—Dfcf. — G/uconuto6p± NADPfI w 1< [2.4]
El cálculode la cantidadde sacarosapresenteen la muestrase realizaprinerosustrayendo
de la lecturade la absorbanciadela muestrala obtenidaparael blanco:
AA = AA9- AM [2.5]
Y el cálculode la cantidaddesacarosa,por la siguienteecuación:
U’
= /000 [2.6]
Siendo:V, el volumen del test, V~ el volumen de la ¡nuestra,M el pesode la sustancia
analizadael pesode la sustanciaanalizadad el pasoóptico de la cubetay 3 el coeficientede
extinción molardel NADPH.
Como ya ha sido comentado,el análisis de este disacárido también fUe realizado
mediante I{PLC. Para esta técnica, la preparaciónde la muestrasolamenteprecisa la
separaciónde las célulasdel caldode fermentación.Estaseparaciónpuederealizarsetantopor
centrifUgación a 5000r.p.m (2000g) durante15 minutos, como por filtración a través de un
1/2
ProcedimientoExperimental
filtro Millipore de 0,2 ~tm. Como ya se ha comentado,paraesteanálisis se ha utilizado un
cromatógrafomarcaKONTRON, modelo SEDEX45, con detectorde dispersiónde luz. Las
condicionesutilizadashan sido las siguientes: la columnaempleadaha sido tipo Nucleosil
NH2 de Sgm, con unasdimensionesde 250 x 4,6 mm. Se ha empleadocomo eluyenteuna
mezclaAcetonitrilo/aguaMili Q en proporción 75:25, con un caudal de 1 L/min. En cuanto al
detector, es de dispersiónde luz, trabajandocon unagananciade 6, una presión de aire de 1,9
atm. y a 280 C de temperatura.
En la Figura 2.11 se muestrala curvade calibradoparala sacarosa y la Ecuación [2.7]
da la relaciónentreel áreadel cromatogramay laconcentraciónde esteazúcar.
Cs(g/L) = 0,00863A
[2.7]
.4
1
2.4.3.-Análisis del Sustrato N¡tro2enado
La concentraciónde nitrógeno(en forma de sal de amonio) ha sido medida en
discontinuo,medianteun electrodode membranasemipermeablede la casaORJON, modelo
720A. El procedimientoseguidoparael análisisdel amonioha sido el siguiente:
~ooA
Figura2.11 — Rectade calibradoen HPLC parael análisisde sacarosa.
113
ProcedimientoExperimental
Sc toma una muestrade 10 mL y se adicionauna disoluciónde NaOH, hastaalcanzarvalores
de pH superioresa lo (momentoen el que el indicadorsuministradopor el fabricante,azulde
timol. vira de incoloro a azulado);a pH alcalinose libera el nitrógenoamónicopresenteen la
muestra, pasando a amonio gaseoso. El amoniaco generado atraviesa la membrana
semipermeabledel electrodoy produceuna señalenel detector.Estaseñalse comparaconlos
datosdel calibradoy~ automáticamente,apareceen la pantalladel aparatola concentraciónde
nitrógeno presente en la muestra. El calibrado se realiza introduciendo dos patronesde
concentraciónconocida(10 y 100 p.p.m.).El intervalo deconcentraciónde calibradoes de O a
¡00 p.pm. l~os patronesson analizadosdel modo indicado y la pendientees calculaday
almacenadapor e] aparatode modoque, una vez realizadoel calibrado, la concentraciónes
leidadirectamenteen el aparato.
2.4.4.-Análisis de Xantano
El análisisdel xantano sellevó a caboestableciendouna relaciónentre la viscosidad
del caldo y la concentraciónde xantanoen una muestra dada. La viscosidadse mide
generalmentea 30 r.p.m. entre25 y 300C (Silman y Rogovin, 1970 y 1972; Cadmusy col.,
1976 y 1978: Souwy Demain,1979; Tait y col., 1986; De Vuyst y col., 1987ay 1987b). En el
presentetrabajo, el análisis del contenidoen xantanode las muestrasse realizó mediantela
determinación_dela viscosidad,medidaa 25 0C y 30 r.p.m. , de acuerdoa un procedimiento
previamenteestablecido(Santos,1993).
Pararelacionarla viscosidaddel caldocon la concentracióndexantanoen el mismo, se
realizó el calibrado del método.Segúnlas característicasdel xantanodisuelto,la relaciónentre
la viscosidadde la disolucióny la concentraciónde xantanopuedeser muy diferente(Casas,
1989); en consecuencia,paracalibrar este métodode análisis se empleóel propio xantano
obtenido en cadaexperimentopara realizar el calibrado. El procedimientoseguido fue el
siguiente:
Se tomaun caldo resultantede la fennentacióny se añadeun volumen conocidode alcohol
isopropílico (IPA), precipitandoel xantanoy quedándoseen suspensiónlas bacterias.La
relacióncaldo:IPAes normalmentesuperiora 1:2,3, debidoa que no se empleóninguna sal
para no falsear la medidapor pesada.Despuésde filtrar, lavar y secar, se mantieneen una
estufa a temperaturade 50 0c, hasta pesadaconstante.Por otra parte. se realizanvarias
dilucionesdelcaldodefermentaciónysemidesuviscosidada25 0C y 30 r.p.m. Los valores
obtenidosencadacasoseajustarona unaecuaciónde tipo potencial,por lo que las ecuaciones
114
ProcedimientoExperimental
de calibradose recogenen cadaexperimento,es decir, cambianlos valoresde a y de b en la
ecuaciónsiguiente:
= a ¡4 [2.8]
La relación entre la viscosidad aparente del xantano (g~) con su concentración (gIL)
de acuerdo con la Ecuación [2.8] para cada experimento, se muestra en la Tabla 2.7.
Tabla 2.7- Valores de los parámetros a y b de la ecuación [2.8] para los diferentesexperimentosrealizadosen los que sevarian las condicionesque se indicanen la primeracolumna.
Experimento b
250C, 257 pp.mNB0 0,12 0,97
280 C. 257 p.p.mNH2 0,34 0.70
310C,257p.p.mNH¿ 0,43 0,51
340 C, 257 p.p.mNI-l< 2,05 0,34
28~C, 65 p.p.mNI-1$ 0,77 0,32
280 C, 130 p.p.mNH¿ 0,77 0,31
280 C, 475 p.p.mNH 0,23 0,71
115
ProcedimientoExperimental
2.5.- ANÁLISIS de COMPONENTES INTRACELULARES
Para el desarrollo de Modelos Cinéticos QuímicamenteEstructuradoses necesario
realizarel análisisde ciertoscomponentesintracelularesduranteel proceso,comoya se citó
en el primer capítulo de esta Memoria. El análisis de estoscomponentespermiteexplicarla
evolución del sistema cuando el microorganismoes sometido a determinadosfactores
externosque puedenafectaral crecimientoy por tanto a la evoluciónde sus componentes
estructurales.
La Citometría de Flujo (CMF) pareceser la mejor técnicapara poder realizar un
seguimiento del proceso, teniendo en cuenta los cambios producidos intracelularmente
cuando el microorganismo se encuentra bajodiferentescondicionesambientales.
La técnicade la CMI esanalíticay preparativa,y se puedeutilizar parael análisis
de células tanto eucariotascomo procariotas.Se basaen la medida de la emisión de
fluorescenciay dispersiónde luz inducidospor la iluminación apropiada de células o
partículas en suspensión para ser analizadas en el seno de un líquido con flujo laminar
(Maftah y col., 1993).
La CMFpresenta importantes ventajas con respecto a otras técnicasanalíticas,por
ejemplopermitela caracterizaciónde célulasindividualesen términosde distribuciónde sus
componentes,talescomoDNA, RNA, y proteinas,o bien de sus propiedadestales como
viabilidad, tamaño, variación morfológica (complejidad), etc.; además,permite análisis
multiparamétricoscon alto gradode precisión.En la Tabla 2.8 semuestranalgunosde los
principales parámetros biológicos ana]izablespor CMIF, tanto mediante el uso de
fluorocromoscomo sin ellos, siendo posible tambiénel análisis simultáneode varios de
estosparámetros.
El citómetro empleadoen este trabajo, como ya se indicó en el apartado2.1,
perteneceal CAL del servicio comúnde investigaciónde la Facultadde Farmaciade la
U.C.M (marcaBryte,modeloHS, BioradHempteadUK).
116
ProcedimientoExperimental
Tabla 2.8.-Parámetrosanalizablesmediante Citometria de Flujo.
PARÁMETROSESTRUCTURALES
PARÁMETROSFUNCIONALES
SINFL UOROCROMO¡
VolumenCelularComplejidadCelular
Pigmentos
Potencial REDOXViabilidad celular
CONFLUOROCROMO
MacromoléculasOrgánulos Subcelulares
ReceptoresMetabolítos de Bajo Pesomolecular
Etegridad de membranaMovimientos iónicos
Potencial de MembranaViabilidad CelularSíntesisde DNA
Transporte Celular
Estatécnicaha sido habitualmenteutilizadaparaanalizarcélulaseucariotas(Hullet y
col., 1969; Criasman y col. 1975),especialmente células sanguíneas. Su aplicación para el
análisisde célulasprocariotases menor, debidoa queel contenidoen constituyentesobjeto
de análisis (componentesintracelulares),en dichascélulas procariotas,es de dos a cuatro
órdenesde magnitud inferior que en eucariotas,lo cual haceque se requieranequipos
muchomássensibles(Steeny Boye, 1980; Steeny col., 1982).
Existen pocos estudios donde se empLee la CMF para el seguimientode los
componentesde la poblaciónduranteun procesofermentativo,esto es,parael estudiode
transformacionesmicrobianas(Bailey, 1978; Fazel-Madjlessiy col., 1979; Agar y Bailey,
1982;Alberghinay col., 199; Alberghinay Porro, 1993).
Bailey y colaboradores(Bailey, 1977; Bailey y col., 1978; Fazel-Madjlessiy Bailey,
1979) emplean la CMIF para conocer la evolución de componentesintracelulares en
bacterias,apuntandola necesidadde conocerla cantidad de cada componentepara la
aplicaciónde ModelosCinéticos.
A. pesar de las enormesventajasde la CMIF frente a otras técnicas,como las
microbiológicaso bioquímicasconvencionales,estatécnicapresentainconvenientesa la
hora de emplearlos datosnecesariosparala formulaciónde Modelos Cinéticos,debido a
117
Procedimlento Experimental
que dichos datosvienendados en unidadesrelativas(unidadesde fluorescencia)y no en
absolutas(unidadesde concentración),comoesnecesarioparadichatarea
Para obtener valores cuantitativos mediante Citometría de Flujo es necesario
disponer de estándarescon los que poder comparar,para interpretarcorrectamentelos
resultadosrelativosobtenidosporCMF (Alberghinay col. 1991).Paralas distribucionesde
tamañoy volumencelularesen diferentesexperimentos,el canalizadorpuedesercalibrado
mediante estándaresde tamaño y volumen conocido. Sin embargo la medida de
fluorescencia es siempre relativa, no disponiendo de estándaresde componentes
intracelularesde concentraciónconocidapara el calibrado del aparato.Algunos autores
realizanuna comparaciónentrelos datosde Intensidadde Fluorescencia(IF) con los datos
cuantitativos obtenidos medianteotras técnicas;por ejemplo, Agar y Bailey (1982) y
Alberghinay col. (1991)empleantécnicasbioquímicasparadeterminarestarelación, pero
sólo Agar y Bailey. (1982) muestranuna correlaciónentreel númerode canaldel citómetro
con la cantidad de componente por célula obtenido por análisis mediante técnicas
bioquímicas.
Basadosen el trabajo llevado a cabopor Agar y Bailey (1982), seabordóel estudio
paraestablecerunacorrelaciónentrelos datosobtenidosmedianteCMF con otras técnicas
de análisis.
2.5.1.-Análisis de ComponentesIntracelularesporEspectrofotometríade Absorción
Con el fin de llevar a cabo unacuantificaciónde los componentescelularesy, de
esta forma, obtener datos cuantitativos con los que relacionar los de Intensidad de
Fluorescencia(IF) obtenidosmedianteCMF, se realizóla puestaa punto de técnicasparael
análisisde proteínatotal, DNA y RNA a lo largo de una fermentaciónllevadaa cabopor
Xanthomonascampestrisrealizada en fermentadory bajo las condiciones óptimas de
producciónde xantano(Santos,1993).
2.5.1.1.-Análisis de Proteínas
Para realizar la cuantificaciónde proteínastotales se empleóel método de Lowry
(Lowry y col., 1951),por seruna de las técnicasmás habitualmenteutilizadas.Se trata de
1/8
ProcedimientoExperimental
un método colorimétrico basadoen el hechode que los gruposfenólicosde las tirosinas
presentesen las proteínasreducenel reactivode Folin, dandoun complejode colorazulado
cuya intensidades proporcional a la concentraciónde proteína. Para la formación del
complejoazuladoesnecesarioque las tirosinasesténaccesiblesal reactivode Folin, paralo
cualseañadenionescalcioque seunena las proteínasdandocomplejosproteína- calcio.
Previoa la aplicación de estatécnica,fUe necesarioponera punto un protocolo de
roturacelulary homogeneizaciónde las célulasquees detalladoa continuación.
El primer pasoa realizares el lavado y rotura de células,con estaetapa se pretende
obtenerel homogeneizadode la muestrasobreel que se va a realizarel análisis.Paraello,
se toma un volumendeterminadode muestray secentrifuga durante30 minutosa 4000
r.p.m. (2860 g) con el fin de separarlas célulasdel medio de cultivo. Se resuspendeel
precipitadoen tampón Tris. Estaoperaciónse deberealizaral menoscinco veces,conel
fin de eliminar todo el polisacáridoque pudiera estar pegado a las células, lo cual
introduciríaun error enormeen esteensayoen concreto,debidoa la interferenciaentreel
vantanoconel reactivode Folin.
Se vuelve a centrifugara 4000 r.p.m (2860 g) durante15 minutos y el precipitadose
resuspendeen 2 mL de unadisoluciónde lisozima(10 mg/mL en tampónTris). Se agita
y sonicadurante1 minuto pararomperlos agregadosquepudierandificultar la acciónde
la enzima.A continuación,se incubala muestraa 37 oc durante30 minutos;pasadoeste
tiempose añade lOO ktL del TampónB. Se incubacon estetampón durante10 minutosa
37 0C. Finalmente,se adiciona 1 mL de una disolución de NaOH IN paradetener la
reacciónenziunática.
Una vez obtenido el homogeneizado,se toma 1 mL y se le añaden5 mL del reactivo
Lowry C (Lowry A:Lowry B, 50:1), seagitae incubadurante30 minutosa temperatura
ambiente.A continuaciónse añaden0,5 mL del reactivode Folin (dilución 1/2), seagitabien la mezclae incubadurante30 minutosa temperaturaambiente.
Finalmente se procedea la lectura de la absorbanciaa 500 nm, empleandocomo
blancoaguadestiladaa la quese le hayaefectuadoel mismo tratamientoquea las demás
muestrasdesdela etapade adiciónde la lisozima, la cualserácuantificadatambiéncomo
proteínay cuyaconcentracióndebeserrestadaentodaslas muestras.
Los valoresde absorbanciaobtenidosson extrapoladosen la curva patrón previamente
realizada con patronesde Albúmina de suerode bovino (BSA) con concentraciones
entre10 y 100 pg/mL.
119
ProcedimientoExperimental
La Ecuación[2.9] es la obtenidamedianteajustepor regresiónlineal de los valoresde la
absorbanciaconla concentración,el valor del coeficientede correlaciónobtenidode este
ajustees r0,998.En la Figura2.12 semuestranlos resultadosobtenidos.
cA =4/~,674>
PR [2.9]
Figura 2.12.-Calibrado para proteínas obtenido mediante el métodode Lowry.
Se realizaronmedidasde la evolución de proteínasa lo largo de una fermentación
para la producciónde xantano empleandoeste método. La Figura 2.13 muestra los
resultadosobtenidosparados ensayosrealizadoscon cadauna de las muestrastomadasa
diferentes tiempos. Como puede observarse,ambos ensayosproporcionan resultados
similares, lo que estaríaindicando la buenareproducibilidaddel métodode Lowry parael
análisisde proteínas.
0,16
A(500nm)
120
Procedimlento Experimental
O lO 20 30 40 50 60
t(h)
proteínasintracelulares de XanthomonascampestrispormétodoLowry.
o
0.6
0,4
0,2
0
Figura 2.13.- Evolución deanálisiscon el
2.5.1.2. Análisis de Ácidos Nueleicos
Los ácidosnucleicosde la bacteriaobjetode estudiofueronextraídosy purificadosa
partir de las célulasmedianteun procedimientoque puedeconsiderarseuna modificación
del métodode Sambrook(Maniatisy col., 1983).
El análisisrequierede la digestiónenzimáticaconRNAasaparala medidadel DNA
y con DNAasaparael análisisde RNA, puesamboscomponentesinterfierenen el análisis
debido a que la técnicase basaen la absorbanciaa 260 nm que es la longitud de onda
característicade los cromóforosde los ácidosnucleicos,estoes,de las basesnitrogenadas.
Inicialmenteserealizóel análisispreviaroturade célulasy posteriordigestióncon la
enzimacorrespondiente,pero debido a la labilidad de las moléculasde ácido nucleico se
invirtió el orden en esteprotocolo, es decir una primera etapaen la que se trataba con
DNAasa o RNAasa(previapermeabilizaciónde las célulasa las enzimas)y una posterior
etapa de rotura celular, de esta forma se consiguió una significativa mejora en la
repetitividadde los resultados.
0
121
ProcedimientoExperimental
El protocolo de preparaciónde las muestraspara el análisis de Ácidos Nucleicos
medianteel métodode SambrookModificado se detallaa continuación:
En primer lugar debe realizarseel lavadode las célulasmediantecentrifligaciona 4000
r.p.m. (2860 g) durante30 minutosy resuspensióndel precipitadoen el tampónTris. Esta
operación se repite 5 veces para eliminar el xantano adherido a las células. A
continuaciónse procedeal fijado de las células,con ello se pretendeabrir poros en la
pared de la bacteriapara permeabilizarlaa las enzimasque se van a emplear.Paraello,
una vez lavadaslas célulasse centrifugana 4000 r.p.m. (2860 g) durante15 minutosy se
resuspendenen 3 mL de la disoluciónde glutaraldehidoal 3% en Tris 0.1 M - NaCí 0.1
M. se agita y sonicadurante 1 minuto para disgregarlos agregadosde células,que se
formancon frecuencia,y finalmentese incubadurante4 horasa 40C.
Una vez eliminado el glutaraldehidomediantecentrifugacióna 4000 r.p.m. (2860 g)
durante15 minutos,y la posteriorresuspensiónen tampónTris, las muestrassonpasadas
a Eppendorfpreviamenteesterilizados.Las células son centrifugadasa 10000 r.p.m.
(18000 g) durante10 minutosy resuspendidasen una disoluciónde DNAasa 1 mg/mL
cuandose quieraanalizarRNA y en una disoluciónde RJNAasa1 mg/mL cuandolo que
se quiereanalizares DNA. Se incuba,en amboscasosa 370C.durante30 minutos.
Pasadoel tiempo de incubación,las célulasson tratadaspara conseguirsu rotura. Para
eflo, se centrifugaa 10000 r.p.m. (18000 g) durante10 minutos y se resuspendeel
precipitadoen una soluciónde lisozima lO mg/mL se agita e incubadurante15 minutos
a 37 T y, a continuación,se añade lOO gL de tampón3, se incubadurante15 minutos
a 370 C y se mezcla cada5 tninutospor inversión.
Pasado el tiempo de incubación, se realiza la extraccióny purificación del ácido
nucleico, para lo cual seañaden400 gL de fenol (equilibradoen tampónTris), se agita
suavemente y se centrifuga durante5 minutosa 10000 r.p.m. con esto se consiguela
desproteinización,quedandoel ácido nucleicoen la fase superior.Dicha fasesepasaa un
Eppendorf limpio, añadiéndose400 .ii de una disolución de cloroformo - alcohol
isoamulico. se agita y centrifuga a 10000 r.p.m. durante5 minutos. Se pasa la fase
superiora Eppendorflimpio y se repite estaoperación2 ó 3 veces(fenol, cloroformo-
alcohol isoarnilico). Finalmentesepasala fase superiora un tubo de vidrio estéril y se
añaden2 mL de etanol al 90 % (a 40C) dejándoloresbalarpor las paredespara que
quedendosfases.Se dejaprecipitarde 1 a 4 horasa -700C.
Se recogeel ácidonucleicoprecipitadomediantecentrifugación,se lava el precipitado
con 500 4L deetanolal 70 %.y despuésseresuspendeenimLde tampónTris.
122
ProcedimientoExperimental
Luego se preparandiluciones a partir del ácido nucleico resuspendidoempleandoel
mismo tampón.
Se lee la absorbanciaa 260 nm. Tambiénes necesariomedir la absorbanciaa 280 nm
paraconocersi el ácidonucleicoextraídoestaimpurificadocon proteínas.Si el cociente
entrela lecturade absorbanciaa 260 nm y el de 280 nm esaproximadamente1,8 el DNA
estápuro; en cuanto al RNA este cocientedebeserpróximo a 2, parapoder considerar
que se ha purificado. Para convenir los valores de absorbanciaen concentraciónse
realizade la siguienteforma (Sambrooky col., 1987):
ParaRNA: 1 unidaddeabsorbanciaes aproximadamente40 yig/mI.
ParaDNA: 1 unidadde absorbanciaes aproximadamente50 É.tg/mL.
Los resultadosexperimentalesdel análisisde las muestrastomadasdel fermentador
se muestranen la Figura 2.14 parael DNA y en la Figura 2.15 para el RNA. Como se
puedeobservar,los valoresobtenidosen cadaensayosonbastantediferentesy, por tanto, el
método no permiteobtenerresultadosrepetitivos.La dispersiónobtenidaen los resultados
proporcionadosporel análisisdescritohaceque estemétodono seaaplicableparaconseguir
datos utilizablesen el desarrollode modeloscinéticos,ya que en ocasionesel error llega al
70%. No obstante,hay que comentarquedesdeun punto de vistacualitativo los resultados
son buenos,debidoa la buenapurificacióndel ácidonucleico.
0,4
0,2
Q
0.00 0 20 30 40 50 60
t (h)
Figura 2.14.-Evoluciónde la concentracióndeDNAel métodode Sambrookmodificado.
de Al campestrismedidapor
223
ProcedimientoExperimental
.4
0
30
(h)
Figura 2.15.- Evolución de la concentración de RNApor el métodode Sambrookmodificado.
De todo lo anteriorsobreel análisisde componentesintracelularesmediantepruebas
bioquímicasbasadasen la medidade absorbancia por espectrofotometríade absorciónse
puedeconcluir que el método Lowry permite una buenacuantificaciónde las proteínas,
mientras que el método de análisis de ácidosnucleicosno aportaresultadosrepetitivos,
debidoa ciertosinconvenientesque puedenresumirseen los siguientesaspectos:
Las sucesivascentrifttgacionesrequeridasen el análisis puedenprovocarla pérdidade
ciertacantidaddel componente.
2.- Puede existir un elevado error en el método debido a la interferencia1 y en la
absorbanciaa 260 nm, entrelas proteínasy los ácidosnucleicos.
3<- La ruptura y degradaciónde las moléculasa analizar(debido a su labilidad) pueden
suponertambiénuna fuenteimportantede error.
de Xi campestris medida
124
ProcedimientoExperimental
2.5.2.-Técnicasde Fluorescencia
Debido a que no se obtuvieron buenos resultadoscon las técnicas basadasen la
espectrofotometríade absorciónpara la cuantificaciónde componentesintracelularesy su
posteriorrelacióncon los datos obtenidosmedianteCMI, fue necesariobuscarotratécnica
que permitiesesolventarlos inconvenientesobservados,básicamenterelacionadoscon la
roturay extraccióndel componenteintracelular.
Porello, la técnicaque se empleófUe la Espectrofluorimetría(EFM), que se basa,al
igual que la CMI, en la medida de la intensidadde fluorescenciade los fluorocromos
unidos de forma específicaal componenteobjeto de análisis. La gran ventajaofrecidapor
estatécnicaesquela preparaciónde las muestrases idénticaa la seguidaparaCitometriade
Flujo, es decir no implica rotura celular ni extraccióndel componente.Ademáspermite
obtener curvas patrón para la correlaciónentre la intensidad de fluorescenciacon la
concentracióndel componente.
El fluoróforo más habitualmenteempleadopara la tinción de proteínas es el
[sotiocianatode Fluoresceína(ITCF), el cual forma uniones covalentespermitiendoel
análisisde proteínatotal (Petit y col., 1993).
El protocolode preparaciónde las muestrasparael análisisde proteínasmediante
ambastécnicas t1uorimétricas (CMF y EFM) se detalla a continuacióny se presenta
esquematizadoen la Figura2.16.
En primer lugar debe realizarseel lavado y fijado de las células, siendo estaetapa
idénticaa la ya descritaen el apanadoanterior.Con ello, ademásde eliminar el xantano
pegadoa las células,se consigue la perrneabilizaciónde la pareddel microorganismo
paraqueentrentanto los fluorocromoscomo las enzimas.
Con el fin de llevarsiempreun determinadonúmerode célulasal Citómetro,es necesario
ajustarla concentraciónde las mismas.Esteajustese harealizadopor contajemediante
el contadorde partículasCoulterCounterconun tubo de 30 l.tm, y diluyendolas muestras
en tampónTris para llevarun númerode célulasen un intervaloentre500-2000cel4tL.
Una vez ajustadala concentración,las muestrassonpasadasa Eppendorfestérilescon el
fin de procedera la tinciónespecífica.
125
ProcedimientoExperimental
MUESTRA
Cenírijugac¡on:000 r.p.m.10 m¿nuut
SOBRENADANTE PELLET(Células)
LAVADO Cenlrifugación5000 r.p.m.
110mmCELULASLAVADAS
Cenrrifugación5000r.p.m., 10 muzFIJADO ResuspensiónRe/leíGlutaraldehido 300
4/r 40(’
CELUL4SFIJADAS}Ceníríjúgación5000r.p.m.LO mit?.Resuspensión en TampónTris
AJUSTECONCENTRÁClON
~ÍNAS
TINCIÓNcon¡Tel’ (0.1 íng/mL)
I Incubar4’ C
40 mm
LAVAR EDICESTIONRNAasa DIGESTIÓNDNAaso
(1 mg/LI, 37’ C, 4Omin) <1 mg/mL.37”(’, 40 mm.)
TINCIÓNconIP (0.1 mg/mL)
¡Incubar 4 “C, /0
MEDIDA en CITÓMETRO DE FLUJO y en FLUORÍMETRO
Figura 2.16.- Protocolo de preparación de las muestras para análisis porEspectrofluorimetriay Citometríade Flujo.
126
ProcedimientoExperimental
Parala tincióncon ITCE se centrifugaa 10000 r.p.m. (18000g) durante10 minutos.El
precipitadoes resuspendidoen una disoluciónde ITCF de 0,1 mg/mL se agita e incubaa
40C durante1 hora,posteriormentese lavanlas célulastres vecesen TampónTris, para
eliminar el excesode fluoróforo que podríaprovocarproblemasen la fluorescenciade
fondo enel análisis.
Para la lectura de fluorescencia en el espectrofluorímetro, la longitud de onda de
excitación hasido 498 nm conuna rendijade 4, para la emisión, la longitud de ondafue
de 520 nm y unarendijade 2. La temperaturade análisisfue 250 C en todoslos casos.
Los valoresde fluorescenciaobtenidossonextrapoladosen la curva patrónpreviamente
realizada con uSA (albúmina de suero de bovino) de concentraciónconocida, para
obtenerlas curvascorrespondientesserealizó el calibradode la siguienteforma:
Calibrado del Análisis por FluorimetríasaraProteínas
Parael calibradode proteínasse empleó albúminade suerode bovino(BSA). Debido a
que el fluoróforo empleadopara la tinción de proteínas(Isotiocianatode Fluoresceina)
emite fluorescenciatanto si se encuentraunido a las moléculasde proteínacomo si no lo
está, fue necesarioeliminar el excesode ITCF paraevitarde estaforma la fluorescencia
de fondo.Paraello, se aplicó unadisoluciónde 1 mg/mL a unacolumnade filtración de
membrana(PO lO). Las primerasfraccionessonlas correspondientesa la proteinaunida
al ITCE. Se realizó una valoraciónde la concentraciónproteicade estafracción,paralo
cual se empleóel método deLowry (Lowry y col., t951).A partir de estadisoluciónse
preparanmuestrasen un intervalo de concentraciónentre 0,01 a 0,5 mg/mL. Los
resultadosde la relación intensidad de fluorescencia(IF) con la concentraciónde
proteínassereflejanen la Ecuación[2.10], enesteajusteel coeficientede correlaciónfue
de r0,952.
c;~(g/L) = 1,931W3 .jJ7F ED [2.10]
La Figura 2.17 muestralos resultadosobtenidosal analizar la evolución de las
proteínasmedianteespectrofluorimetríaa lo largo de la fermentación. Los datos son
expresadosen concentración, por extrapolaciónde la intensidad de fluorescenciade
acuerdoa la ecuación[2.10]. Los resultadosparalos dos ensayosrealizadossonrepetitivos
al igual que ocurríacon el análisismedianteel métodoLowry.
Aunque los resultadosobtenidospara el análisis de proteínasmedianteel método
Lowry eran repetitivos,se decidió realizarla correlaciónde los datos obtenidosmediante
127
ProcedimientoExperimental
CrVIF con los obtenidos medianteespectrofluorimetría.La razón ftmndametnales que la
preparaciónde las célulasporambastécnicasde análisises idéntica.
0
0.
Para llevar a caboel calibradode los datos obtenidosporCMF con los obtenidos
por EFM se emplearon50 muestras,las cualesse obtuvierona lo largo de un proceso
fermentativo con el fin de obtenerdatos a lo largo de toda la fase de crecimientodel
microorganismoy así obtenertodo el intervalo de concentraciónposible de proteínas.La
Figura 2.18 muestrala relaciónentreel valor de Mean (intensidadmediade fluorescencia
porcélula)con el contenidoporcélula(g/célula)de proteínaobtenidoal extrapolarlos datos
de IFF en la Ecuación [2.10]. La curva de calibradose ha obtenido con muestrascon un
númerode células comprendidoentre200 a 2000 cel! gL. La Ecuación[2.111muestrala
correlaciónobtenidade estaforma:
C(g/L) = (0,25 IF—5,9S) ED NC [2.11]
0,8
o
0.4
(It
Figura 2.17.-Evoluciónde proteínasobtenidamedianteEFM.
128
ProcedimientoExperimental
-é
Q
IF (nnn)
Figura 2.18.-CalibradoCMF - EspectrofluorimetríaparaProteínas.
Para el Análisis de Ácidos Nuteicos,el fluoróforo empleadopara la tinción de
ambostipos de ácidosnucleicosesel loduro de Propidio (II’) que esun agenteintercalante
entreparesde basesenácidosnucleicosde doblehebra;por tanto seunetanto aDNA como
a RNA, lo que implica que debe realizarseun tratamientoprevio con RNAasa o con
DNAasaen fUnción del ácidonucleicoa analizar(Petit y col., 1993).
Se puedenempleartambiénfluoróforosespecíficosparacadatipo de ácidonucleico,
por ejemplonaranjade acridinaparaRNA y DAPJparaDNA (Mafiah y col., 1993),pero,
en principio, se decidió realizar el estudio con IP, por ser uno de los fluoróforos más
habitualmenteempleados.
El protocolo de preparaciónde las muestrasparael análisis de ácidosnucleicos
medianteambas técnicas fluorimétricas (CMF y EFM) se muestratambién de forma
esquemáticaen la Figura 2.16, presentadaanteriormente,el protocolo de este análisis se
detallaa continuación:
15,
20 30 40 60 60 70 80
129
ProcedimientoExperimental
En primer lugar, debede realizarseel lavadoy fijado de las células,siendoesta etapa
idéntica a la va descritaen el apartadoanterior. Con ello, ademásde eliminarel xantano
pegadoa las células,se consigue la permeabilizaciónde la pared del microorganismo
paraque entrentanto los fluorocromoscomo las enzimas.
Con el fin de llevar siempreun parecidonúmerode células al citómetro, es necesario
ajustar la concentración de las mismas.Esta operación se ha realizadomedianteel
contadorde paniculasConíter Counter con un tubo de 30 ~¡m,y diluyendolas muestras
en tampónTris parallevar un númerode célulasenun intervaloentre500-2000cel4tL.
Debidoa que cliP se unetanto a DNA como a RNA, debehacerseun tratamientoprevio
con DNAasao RNAasa,segúnel componentea analizar(Petit y col., 1993).Lasetapasa
seguir, unavezfijadas las células,sonlas siguientes:
Digestión con enzimas. Se reparte 1 mL de cada muestraen tubos lBppendorfy se
centrifugana 10000 r.p.m. (18000g) durante10 minutos.Se resuspendeel precipitadoen
una disolución de DNAasa 1 mg/mL en Tris 0.IM-NaCI, (pH 7,4) para el análisis de
RNA, y en tina disolución de RNAasade 1 mg/mL en Tris 0,1 M-NaCI, (pH 7.4) parael
de DNA; se agita e incubaa 37 0C durante40 minutos.
Parala tinción con IP primero es necesariocentrifugar a 10000 r.p.m. durante lO
minutosparaeliminar la enzima.El precipitadose resuspendeenuna disoluciónde IP de
0,1 mg/mL en Tris posteriormentesc debe agitar y, protegidode la luz, incubara 4 ~C
durantelO minutos.
Para la lectura fluorescencia de las muestras teñidas con IP debenemplearselas
siguientes condicionesde análisis en el Espectrofluorimetro: longitud de onda de
excitaciónde 536 nin y una rendija de 19. Para la emisiónse empleó una longitud de
ondade 623 nm y unarendijade 5. La temperaturaempleadaduranteel análisisfue de
25~ C en todoslos casos.
Los valores de fluorescenciaobtenidosson convenidosen concentracionesde DNA y
RNA por calibrado. Paraobtenerlas curvascorrespondientesse realizó el calibrado de
lasiguienteforma:
Calibradodel Análisispor FluorimetríaparaÁcidosNucleicos
Parael calibradode DNA y RNA se emplearon,respectivamente,patronesde DNA de
timo de bovino y RNA de levaduraen un intervalode concentracionesentre0,001 a 0.1
mg/mL. Tiñendoconloduro de Propidio0,02mg/mL. ya quese comprobóque éstaera la
concentraciónde saturaciónde la disoluciónde 0,1 mg/mL de DNA y RNA para el IP.
130
ProcedimientoExperimental
Los resultadosobtenidosdel ajuste por regresiónlineal de losdatos deconcentraciónde
las disolucionespatróncon los valoresde Intensidadde Fluorescencia(1pE), se muestran
en las ecuaciones[2.12] y [2.13]:
<g L)=3,68!0’ UF> ED [2.12]
Cj(g Lp’ 3,4610> lE . ED 12.13]
Siendo [F~ la intensidadde fluorescenciamedidaen el fluorimetro y FD el factor de
dilución de la muestraanalizada.
Parael análisisde las muestrasen el Citómetro de Flujo las condicionesempleadasson:
Filtro parala excitaciónde 488 mn, mientrasque paraemisión el filtro empleadofue de
600 nm. La fuentede iluminación fue una lámparadexenonde 75 W.
Unavezpreparadaslas muestrasprocedentesdel fermentador,siguiendoel protocolo
que se ha indicadomás arriba,se obtuvieronlos resultadostanto de su análisismediante
EFM comoporCMF.
En el casodel análisis utilizandoCMI, seobtieneun histogramapormuestra,con
una serie de datos estadísticos,como son la mediade la intensidadde fluorescenciapor
célula (Mean) y el coeficientede variación (CV), ademásde indicar el númerode células
por unidadde volumen.Los histogramasobtenidosen el análisisde muestraslo han sido de
forma monoparamétricapara cadacomponente.La abcisarepresentala distribución de la
señalde fluorescenciaen canalesy la ordenadael númerorelativo de células.En la Figura
2.19 semuestraun histogramatipo, de los obtenidosparauna muestraanalizadamediante
CMF. Se muestraen la citadafigura un histogramacorrespondientea la fluorescenciaverde
(FLI) que es la fluorescenciaemitida por las proteínasteñidas con isotiocianato de
fluoresceína.El otro histogramamuestrala fluorescenciaroja (FL2) que esla fluorescencia
emitida por los ácidosnucleicos(DNA y RNA> teñidoscon loduro de propidio. En ambos
casosla fluorescenciamedia por célula aportael valor Mean, necesariopara realizar la
cuantificacióndel componentecorrespondiente.
Las Figuras 2.20 y 2.21 muestranla evoluciónde DNA y RNA obtenidasmediante
espectrofluorimetriaa lo largo de la fermentación. Los datos son expresadosen
concentraciónpor extrapolaciónde la intensidad de fluorescenciade acuerdo a las
131
ProcedimientoLrperimental
ecuaciones[2.12] y [2.13], para DNA y RNA, respectivamente.Los resultadosobtenidos
paralos dos ensayosrealizadosson repetitivosy evitan los problemasencontradoscon los
métodosbasadosen la espectrofotometríade absorcion.
4,
o.0~
¡ 2
FL2FLI 2 2170
4.’c.20•(-y
54;?
156
Figura 2.19.- Histogramatipo de una muestra obtenida mediante CMF. FI] es lafluorescencia verde (proteínas) y FL2 la fluorescencia roja (ácidosnucleicos).
0,4
10
7
0,0
Figuras 2.20.- Evolución de RNA duranteEspectrofluorimetría.
la fermentación analizado por
4~~1
132
ProcedimientoExperimental
0,4
0.2
rj~
0,0
50 60
Figura 2.21.- Evolución de RNA durante la fermentación analizado porEspectrofluorimetria.
De lo visto en esteapartadoparael análisisde ácidosnucleicosmediantetécnicas
basadasen la medidade la fluorescenciade las célulasteñidascon IP, sepuedeconcluir que
la espectrofluorimetríaes una técnica que permite la correcta cuantificación de los
componentes intracelulares,dadala repetitividadde los resultadosconseguidosen dos
análisisde las mismasmuestras.Por lo tanto, con estatécnicase puedenobtenerresultados
fiablesparael seguimientode ácidosnucleicosduranteun procesomicrobiano.No obstante,
ya se comentó anteriormenteque, debido a las enormesposibilidadesque presenta la
Citometríade Flujo frentea otrastécnicas,erainteresanteemplearestatécnicaparaefectuar
el seguimientode los diferentes componentesintracelulares.Ahora bien, es necesario
encontrarla forma de obtenerresultadoscuantitativoscon dicha técnica.Debido a que la
fluorimetríarinde resultadosfiablesparaobtenerunarelacióncuantitativacon los datos de
intensidadde fluorescenciade la CMF —como hicieron Agar y Bailey (1982)-, sepensóen
obtenerunarelaciónentrelos datoscuantitativosconseguidosmedianteespectrofluorimetría
y los datosen unidadesrelativasobtenidosporCitometríade Flujo.
Ya que el protocolo de preparaciónes idéntico para ambastécnicas,la misma
muestrafue analizadautilizandoambosmétodosde análisis. LacorrelaciónCMTF-EFM para
DNA y RNA fue realizadamedianteel análisis de 50 muestrasparacadaclasede ácido
nucleico. La misma muestraera analizadamedianteambastécnicasen un intervalo de
133
O lO 20 30 40
t (h)
ProcedimientoExperimental
tiempo no superiora 5 horas,paraevitar posibleserrorescomo consecuenciade la pérdida
de fluorescencia.Es importantellevar al citómetromuestrascon un númerode célulaspor
unidadde volumen muy similar, prácticamenteigual, con el fin de que los histogramas
fuesen siempre comparables,por lo que las muestras analizadastenían todas tina
concentracióncelularcomprendidaentre200 a2000eel/gL. Otroaspectoimportantea tener
en cuenta,a la hora de realizarel caJibrado,es el intervalode concentraciónde cadatipo de
ácido nucleico pues era absolutamentenecesariocubrir todo el intervalo que permitiese
posterioresanálisis,durantetodo el ciclo celular de la bacteria.Paraello, las 50 muestras
analizadasfueron tomadasdurante las diferentes etapasde la fase de crecimiento de
Xanthomonascampestrisy, de estaforma, se obtuvo todo el intervalo de concentración
posible.En la Figura 2.22 aparecereflejadala relación entre las medidasconseguidaspor
CMF y EFM para ácidosnucleicos. Como puedeverse en dicha figura, las pendientes
obtenidasal representarconcentraciónpor célula vs. “mean” son igualespara ambostipos
de ácidosnucleicos,por tanto,el ajustepor regresiónlineal serealizó uniendo lo obtenido
parael DNA y lo obtenidoparael RNA. El resultadode este ajusteaparecereflejado en la
ecuación[2.13].,en la que es necesarioconocerel númerode células(NC); estedato,como
ya seha comentado,esobtenidotambiénmedianteCitometríade Flujo. El coeficientede
regresiónobtenidoenesteajustees r0,996.
C~\V~\~(gXL) = 0,11 JEúwr ED NC [2.14]
o
y.,
2
70
IF(n~n)
Figura 2.22.-RelaciónentreIF obtenidaCMF y concentraciónobtenidapor EFM
20 30 40 50 60
234
ProcedimientoExperimental
2.6.-MÉTODOSMATEMÁTICOS
Debido a que en la presenteMemoria ha sido necesariola aplicaciónde diferentes
técnicasde cálculo, se va a dedicareste apartadoa realizaruna breve descripciónde las
mismas.
Las técnicasmatemáticasempleadasse puedendividir en dos grandes grupos:
técnicasde estimaciónde parámetrosa partir de datosexperimentales(regresión)y técnicas
de simulaciónde la evolucióndel sistemacon lasvariablesestudiadas.Todos los programas
de cálculo empleadosse han desarrolladopara llevar a cabo este trabajo y han sido
realizadosen FORTRAN 77. A continuaciónse expone brevementeel fundamentoy la
forma de aplicaciónde estastécnicas.
2.6.1.-TécnicasdeEstimacióndeParámetros
Las técnicas de estimación de parámetros o regresionesse han empleado
principalmenteen la aplicacióna datosexperimentalesde los modeloscinéticospropuestos,
pero han sido necesariaspreviamenteen la obtenciónde las expresionesde calibradode las
diferentestécnicasde análisisempleadascomentadasanteriormente.
Para la obtenciónde las ecuacionesde calibrado de los diferentesmétodosde
análisisse ha utilizado en todos los casosregresioneslineales,con ordenadaen elorigeno
sin ella, dependiendodel método de análisis empleado. El criterio de optimización
empleadoha sido el de los mínimoscuadrados:
y
t ~yexp — Y¡eor Y -4 mínimo [2.15]¡=1
En los casosen los quesehaempleadoestetipo de regresión,paradescribirel grado
de ajustesehatenido encuentael coeficientede regresión,r.
En el casode la aplicaciónde estastécnicasde regresióna datosexperimentales,
en todos los casosse han utilizado métodos no lineales basadosen el algoritmo de
Marquardt (1963). Dependiendodel modelo a aplicar, se ha llevado a cabo el ajusteen
135
ProcedimientoExperimental
simple-respuestao en múltiple-respuestazesdecir, seha ajustadoúnicamentela evolución
de un componente,generalmentedebidoa que en la expresiónque representasu velocidad
de producciónno apareceningún otro componente(simple-respuesta);o, por el contrario.
si las velocidadesde producciónde varios o todos los componentesclave del sistemaestan
tnterrelacionadases necesario llevar a cabo la regresión simultánea de todos los
componentes(múltiple-respuesta).En este último caso, se hace necesarioigualar los
residuosde los diferentescomponentes,en caso de que los valoresde unoscomponentes
respectoa otros presentendiferenciassignificativasen órdenesde magnitud.es decir, se
hace necesario“pesar los residuos” para que todos los valores presentenla misma
significaciónen el algoritmo de regresión,que de nuevooptimiza la sumade los cuadrados
de los residuos(ecuación[2.15)).
La obtención de todos los parámetroscinéticos se ha llevado a cabo tanto en
términos de velocidades de produccióncomo de velocidadesde reacción, empleando
siempreel método integral, ya que es el mejor método para llevar a cabo estecálculo
cuando se cuentacon datos integrales(evolución de la composicióndel sistemacon el
tiempo). En el caso de plantear los modelos cinéticos términos de velocidadesde
producción,es decir, como un conjunto de ecuacionesdiferenciales, ha sido necesario
acoplarun métodonuméricode integraciónde las citadasecuaciones,debidoa que los datos
experimentalesobtenidosson, como seha indicado,datos integrales.El métodonumérico
de integraciónempleadoha sido el algoritmode Runge-Kuttade cuartoorden,por lo quese
ha hecho necesario acoplar este algoritmo en forun de subrutinas a los programas
desarrolladospara el ajustede los datosexperimentalesa cadamodelo cinéticopropuesto.
En la Figura2.23 sepuedeobservarel diagramade flujo general delprogramade regresión
no lineal empleadoen los diferentesmodeloscinéticosajustados.
Cuandoseempleael métodode velocidadesde reacción,el ajustese lleva a caboen
simple-respuesta,empleandocomo método de integraciónde las ecuacionescinéticasel
algoritmo de Simpson,siendo necesario,en estecaso,acoplaruna subrutinacon el citado
algoritmoal métodono lineal de ajuste.En la Figura2.24 se recogeel diagramade flujo que
resumeestemétodode cálculo.
En el caso de que el ajuste realizadocon los modeloscinéticos a los diferentes
experimentosllevados a cabo proporcioneuna evoLución lógica de los parámetrosque
136
ProcedimientoExperimental
contienen, se lleva a cabo de nuevo el ajuste de todos los datos de los diferentes
experimentosintroduciendo,en el lugar de los parámetrosdel modelo la expresiónque
correspondasegúnlaevoluciónobservadaen los ajustesprevios.
En todas las regresionesno lineales llevadas a cabo se han consideradocomo
indicativos de la bondaddel ajusteobtenido los siguientesparámetrosestadísticos:E de
Fischer,indicativo del gradoglobal de ajuste;t de Student,indicativo del grado de ajuste
parámetroa parámetro(relacionadocon el intervalodeconfianzade los parámetros:valores
mínimo y máximo proporcionadospor el algoritmo de regresión); y SRC o suma de
residuos al cuadrado, indicativo de la calidad en la reproducción de los datos
experimentales.La comprobaciónde la bondaddel ajuste,en lo referentea los parámetros
estadísticoscomentadosse realizaapartir de la comparacióncon los valoresde los mismos
parael 950o de confianza,segúnel númerode parámetrosa calcular y el númerode datos
queseempleanen el ajuste.
2.6.2.-Simulacióncon los ModelosCinéticos
Las simulacioneso prediccionesque se llevan a cabocon los diferentesmodelosa
los que se hanajustadolos datosexperimentalessirven paracomprobarqué influenciasson
capacesde predeciren cadacaso.Paraello, únicamenteesnecesariorealizarla integración
conjuntade todaslas ecuacionesdiferencialesque formanlas velocidadesde produccióndel
modelocinéticodel que se trate.Los programasdesarrolladospararealizarlas simulaciones
necesitanúnicamenteel algoritmo de Runge-Kuttade cuartoordenparala integracióndel
modelo y proporcionarlos valoresde las concentracionesde los diferentescomponentes
clave del sistema, una vez introducidos los valores de los parámetrosa emplearen la
simulación,así como los valoresde las variablesa emplear(temperatura,agitación,caudal
de aire,etc.) y los valoresde las concentracionesinicialesde los nutrientesy de la biomasa.
En la Figura 2.25 se recogeel diagramade flujo generalde los programasempleadospara
realizarla simulacióncon los modeloscinéticos.
137
ProcedimientoExperimental
sí
Figura 2.23.-Diagramade flujo del programade regresiónno lineal en múltiple respuestaempleadobasadoen el algoritmode Marquardt (1963).
NO 1INVERCálculo de inversak
RUNOE NEcuacionesdiferenciales
138
ProcedimientoExperimental
sí
Figura 2.24.- Diagramade flujo del programade regresiónno lineal en simple respuestaempleando el método en velocidadesde reacción con el algoritmo deMarquardt (1963).
139
ProcedimientoExperimental
INICIODIMENSIÓN
RUNGFNEcuacionesdiferenciales
ARCHIVORESULTADOS
RESULTADOS
Figura 2.25.-Diagramade flujo del programade simulaciónempleado.
RLTNOKNAlgoritmoRunge-Kutta
140
3.- RESULTADOSEXPERIMENTALES
ResultadosExperimentales
3.- RESULTADOS EXPERIMENTALES
Se han realizadodiversos experimentos,en todos ellos utilizando Xanthomonas
campestrisparaproducir xantano,el polisacáridocuyaspropiedadesse describieronen la
Introducción.En dichosexperimentossehanmantenidoconstantesunaseriede condiciones
de operación,previamenteestudiadasy optimizadasen otros trabajos (Santos, 1993 y
García-Ochoay col., 1997). Estascondicionesde operaciónsonlas siguientes:
- Inóculo, realizado en una etapa en el medio YM a partir de un cultivo en medio
sólido (YM agar) de menos de tres días. El inóculo se incuba en incubadora
orbital durante12 horasa 280 C.
- Medio de Producción: estemedio esel denominadoMedio A, y quefue descrito
en el apartado 2.2.3 de esta Memoria, con el que se consigue un rápido
crecimientode X Campestris y una producciónadecuadade xantano(García-
Ochoay col., 1992).
- pH inicial de 7,00 dejándolo evolucionar libremente a lo largo de la
fermentación.
141
ResultadosExperimentales
- Temperatura, la optimizada para la producción es de 280 C. si bien se ha
experimentadoa diferentestemperaturascomo 25, 3 1 y 34 o C, para tratar de
describir la influenciade estavariablecon un modelo cinético.
- Agitación programada,ya que el extraordinarioaumentode viscosidad,debidoa
la produccióndel polisacárido,haceque no puedaemplearseuna agitaciónfija.
Si la velocidadde agitaciónes inicialmentemuy alta, las bacteriassufrendaños
celulares,pero si no se subela agitacióncuandoaumentala viscosidad,no se
consigueuna eficiente velocidadde transportede oxígeno, y su concentración
disminuyehastacero, lo cualafectade formanegativaal microorganismo,quees
aerobioestricto,y en consecuenciaa la produccióndel polisacárido.
En los experimentosrealizados,sehan variadodoscondicionesde operacion:
- Temperatura,como ya fue establecidoen un trabajoprevio (Santos, 1993) la
temperaturainfluye de forma considerableen la producción,por ello se han
realizadoexperimentosa cuatrotemperaturasdiferentes25, 28, 31 y 340 C.
- Concentracióninicial de nitrógeno, siempreen forma de amonio, se han
realizadoexperimentoscon cuatrovaloresde concentraciónde amonio: 65, 130,
257 y 475 p.p.m..
En total se hanrealizado7 experimentos,cuyascondicionesse muestranen la Tabla
3.1. La programaciónde la agitación,aún siendosimilar en todos los experimentos,varia,
debidoa queel aumentode la agitaciónesrealizadosegúnla evoluciónde oxígenodisuelto
en cada caso, y dicha evolución no ha sido igual en los distintos experimentos,pues el
cambiode todasestascondicioneslleva a unaevolucióndel sistemabastantediferente.
A la hora de planificar el seguimientode los distintos componentesdel sistemaa
estudiar,sehizo un planteamientopreviode los modeloscinéticosque iban a seraplicados
de modoquees lógico pensarque paralos ModelosCinéticosNo Estructurados,estoes los
modelosmás sencillos,el númerode componentesa analizarseareducido,mientrasque el
142
ResultadosExperimentales
número de componentesa seguir y/o analizaraumentecon el grado de complejidaddel
modelo.En los modeloscinéticosmáscomplejosaplicados,los denominadosEstructurados
o de Célula, esnecesariorealizarel análisis de componentesintracelulares.
Por ello, desdeel principio se realizóel seguimientoy análisisdel mayornúmerode
componentescon el fin de aplicar los diferentestipos de modelospropuestospara los
mismosexperimentos.Además, todos los experimentosfueron repetidosdos vecescon el
fin de tenerel mayor númerode datosa lo largodel tiempode fermentación.Debido a que
el tiempo a que se tomaronalgunasde las muestrasen las dos fermentacionesrealizadasen
las mismascondicionescoinciden,los valoresobtenidossepresentancomo la mediaentre
ambos en la tabla correspondiente.Los resultadosde los distintos experimentosse
representanen lasTablas3.2 a3.8, unaparacadaexperimento.
Tabla 3.1.-Experimentosrealizados: condicionesvariadas
ExperimentoMedio A
Concentración NH4~(p.p.m.)
Temperatura(0C)
1 257 25
2 257 28
3 257 31
4 257 34
5 65 28
6 130 28
7 475 28
‘43
ResultadosE?vperimentales
Tabla 3.2.- Resultadosobtenidosen el Experimenton0 1. Condicionesexperimentales:250C, 257 p.p.m. de amonio inicial y agitaciónvariable(210r.p.m. iniciales)
Tiempo Biomasa(It) (g/L)
0,00
1,00
2.00
4,00
5,75
7,75
9,00
10,00
12.00
16,50
1 7,00
20,00
24,00
24.50
25,00
25.75
28,00
29,00
29,50
32,75
34,75
35,00
3 8.00
50,00
50,50
52,25
55,00
56,75
0.010
0,011
0,012
0,0 17
0,028
0,048
0,065
0,07 1
0,106
0,350
0,4 lO
0.62 5
0,780
0.862
0,901
0.930
0,93 8
0,989
1,222
1,400
1,530
1.560
1,590
1,618
1,620
1,680
1.680
1 ,680
O->(0/ sat)
95,5
86.2
79,8
69,0
59,0
55,0
35,0
25.0
15,0
30,0
15,0
8,0
50
25,0
18,0
14,0
7.0
20,0
16,0
18,0
13,0
8,0
12,0
11,0
15,0
12,0
16,0
13.0
Agitación¡ (rpm)
210
210
210
210
210
210
210
210
210
350
350
350
350
400
400
400
400
550
550
550
650
650
650
750
750
750
860
860
NH4
(g/L)
0,3 10
0,300
0.290
0,270
0,250
0,2 10
0,190
0,180
0,160
0,080
0,070
0,060
0,077
0,073
0,069
0,067
0,055
0,050
0,045
0,03 5
0,029
0,025
0,022
0,021
0,020
0,020
0.020
0,020
Sacarosa(gIL)
40,0
39,9
39,5
39,0
38,0
37,8
37,2
36,7
36,9
36,2
35,6
35,2
35,0
34,8
34,0
33,9
32,0
31,0
30.0
28,0
25,5
24,3
23,9
16,9
16,5
16,0
15,9
15,7
Xanrano(g/L)
0.33
0,33
¡ 0,35
0,39
0,40
0,44
0,48
0,49
0,50
0,89
0,96
1,00
1,20
1,85
2,12
2,20
2.32
3,57
4,44
5,00
5,51
6,05
7,20
11,38
12,38
13,20
13,99
14,26
DNA(gIL)
0,0025
0,0027
0,003
0,003 5
0,0045
0.0082
0,011
0,019
0,022
0,036
0,070
0,150
0,190
0,2 10
0,250
0,270
0,290
0,320
0,340
0,349
0.3 70
0,400
0,420
0,430
0,430
0,430
0.430
0,430
RNA(g/L)
0,00 18
0,0019
0,002 1
0,0031
0,0055
0,0078
0.0095
0,012
0,019
0,063
0,073
0,108
0,14
0.155
0,162
0,167
0,168
0,178
0,2 19
0,259
0,270
0,280
0,283
0,288
0,290
0,304
0,306
0,306
Proteinas(g/L)
0,005
0.005
0.006
0,009
0,011
0,020
0.021
0,030
0,032
0.089
0,120
0,198
0,260
0,350
0,450
0.460
0,469
0,500
0,600
0,720
0,750
0,780
0,800
0,820
0,830
0,830
0,830
0,830
‘44
ResultadosExperimentales
Tabla 3.3.- Resultadosobtenidosen el Experimenton0 2. Condicionesexperimentales:280C, 257 p.p.m.de amonio inicial y agitaciónvariable(210r.p.m. inicial)
Tiempo Biomasa 02 Agitación N1-bt Sacarosa Xantano DNA RNA Proteínas(h) [ (g/L) (%) (rpm) (gIL) ~ J~fi~ ~ (gIL) (gIL)
0,309
0,300
0,298
0,287
0,280
0,275
0,269
0,266
0,254
0,247
0,220
0,190
0,166
0,140
0,100
0,082
0,073
0,055
0,045
0,025
0,0 13
0,00 1
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
36,5
36,4
36,0
36,0
35,9
35,7
35,0
34,7
34,0
33,8
33,5
32,9
32,0
31,8
28,7
26,0
25,0
24,0
23,0
21,0
20,2
18,0
17,2
12,0
10,6
10,6
10,6
10,6
0,00
2,00
4,00
7,00
9,00
12,00
13,00
14,50
16,00
16.50
19,50
23,50
24,00
24,50
28,00
32,00
33,50
34,00
38,00
38,50
39,50
41,50
42,00
43,75
48,00
48,50
52,00
59,00
0,070
0,084
0,099
0,130
0,156
0,209
0,229
0,288
0,300
0,350
0,480
0,620
0,663
0,790
0,910
1,220
1,252
1,350
1,400
1,450
1,500
1,548
1,560
1,580
1,580
1,580
1,580
1,580
100,0
73,0
¡ 59,0
34,0
24,0
16,5
10,5
8,0
5,0
35,0
25,0
15,0
5,0
28,0
19,0
15,4
10,2
24,5
18,5
10,0
5,0
17,0
28,0
21,8
20,3
30,0
28,0
21,0
210
210
210
210
210
210
210
210
210
310
310
310
310
380
380
380
380
550
550
550
550
650
650
650
750
850
890
890
2,19
2,19
2,19
2,19
2,23
2,29
2,33
2,39
2,59
2,62
2,99
3,90
5,82
6,21
7,30
7,59
7,78
8,10
8,40
8,90
10,48
11,20
12,00
13,28
14,90
15,13
15,22
15,20
0,017
0,03 1
0,037
0,042
0,049
0,065
0,085
0,120
0,137
0,165
0,199
0,235
0,240
0,250
0,290
0,330
0,33 5
0,3 50
0,3 70
0,3 75
0,3 80
0,3 90
0,395
0,395
0,395
0,3 95
0,3 95
0,395
0,0 12
0,020
0,021
0,030
0,035
0,042
0,048
0,054
0,081
0,088
0,110
0,149
0,160
0,170
• 0,199
0,215
0,229
• 0,230
0,255
0,260
0,265
0,269
0,270
0,270
0,270
0,270
0,270
0,270
0,035
0,039
0,044
0,050
0,05 8
0,069
0,089
0,092
0,115
0,129
0,135
0,210
0,250
0,320
0,480
0,600
0,7 10
0,720
0,760
0,765
0,772
0,775
0,780
0,780
0,780
0,780
0.780
0,780
14S
ResultadosExperimentales
Tabla 3.4.- Resultadosobtenidosen el Experimenton0 3. Condicionesexperimentales:310C, 257 p.p.m.de amonioinicial y agitaciónvariable(210r.p.m. inicial).
1 1 1Tiempo
(h)Biomasaft¿LL.
~2
(% sat)
Agitación(rpm)
NH4
...=±LSacarosa
~Xantano
(gIL)DNA(gIL)
RNA(g/L)
Proteinas(gIL)
0,220
0,219
0,212
0.200
0,197
0,190
0.189
0,180
0.172
0,170
0,084
0,064
0,057
0,056
0,050
0,048
0.030
0,027
0,025
0.0 15
0,010
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
40,0
40,0
40,0
39,9
39,9
39,9
3 9.89
39,80
39.50
38,20
38,00
36,50
36,00
34,00
33,00
32,00
30,00
29,70
29,20
28,30
27,00
26,02
25,60
25,00
24,60
24,20
0,00
0,50
1,15
3,00
3.50
6,00
8.00
8,50
9,00
10,00
12,00
14.50
15,00
16.00
18,50
20,00
23,50
24,00
24,50
25,00
26.50
27,00
28,00
30.00
31,75
35,00
0.130
0,150
0,158
0,169
0,173
0,199
0,230
0,25 1
0,304
0,385
0,420
0,550
0,590
0,600
0,680
0.700
0,890
0.900
0,950
0,985
0.990
1,026
1.026
1,07 3
1,058
1,05 8
90.0
59,0
46.0
34,1
23,0
14,5
35.0
22.0
12,8
10.0
6,0
32,0
20,0
12,0
8,0
4,0
22,0
18,8
17,0
10,0
20,0
1 8,0
15,0
20,4
16,3
15,0
210
210
210
210
210
210
350
350
350
350
350
450
450
450
450
450
500
500
500
500
580
580
580
700
700
700
0,39
0.39
0,39
0.46
0,47
0,53
0,60
0,67
0,87
0,87
0,91
0,99
1,10
2,30
3,20
3,50
4,30
4,80
5,20
5,90
6,20
7,00
7,21
8,07
8,67
8,60
0.0 12
0,0 12
0,0 12
0,0 13
0,015
0,018
0,021
0,02 8
0,030
0,032
0,036
0.048
0,067
0,072
0,082
0,100
0,126
0,129
0,130
0,132
0,143
0.145
0,152
0,158
0,160
0,160
0,003
0,004
0,006
0,007
0,010
0,0 16
0.0 10
0,021
0,024
0,030
0,03 3
0,040
0,05 5
0,065
0,078
0,099
0,116
0,122
0,126
0,129
0.13 1
0,13 3
0,13 8
0,142
0,143
0,143
0,010
0.0 12
0,0 14
0,025
0,027
0,050
0,078
0,086
0,095
0.116
0.160
0,230
0.250
0,280
0,3 20
0,400
0.470
0.500
0.530
0,564
0,580
0,590
0.590
0,5 90
0,590
0,590
146
ResultadosExperimentales
Tabla 3.5.- Resultadosobtenidosen el Experimenton0 4. Condicionesexperimentales:340C, 257 p.p.m. de amonioinicial y agitaciónvariable(210r.p.m. inicial).
Tiempo(It)
Biomasa(gIL)
02
(% sat)
Agitación(rpm)
N1-W~ Sacarosa...ÁÉLL....J (gIL)
Xantano....Ls~LL...
DNA 7 RNA ¡Proteínas~
0,00 0,045 97,70 210 0,202 40,0 0,94 0,011 0,008 0,020
3,00 0,087 81,00 210 0,175 39.8 0,99 0,021 0,015 0,043
6,00 0,104 70,00 210 0,161 38,9 1,00 0,026 0.019 0,520
9,00 0,122 60,00 210 0,156 38,3 1,13 0,030 0,022 0,061
12,00 0,135 67,50 250 0,148 37,9 1,16 0,033 0,024 0,067
14,00 0,191 50,00 250 0,147 36,8 1,20 0,047 0,034 0,095
14,50 0,200 45,00 250 0,145 35,7 1,30 0,100 0,036 0,102
18,00 0,280 30,00 250 0,143 34,1 1,50 0,070 0,050 0,140
20,00 0,320 29,00 250 0,142 34,2 1,90 0,080 0,057 0,160
24,00 0,407 41,20 280 0,140 33,0 2,05 0,101 0,073 0,203
24,50 0,496 32,30 280 0,139 32,5 2,20 0,124 0,089 0,248
30,00 0,698 28,10 280 0,133 31,4 4,47 0,174 0,125 0,349
33,00 0,739 20,50 280 0,127 30,5 4,98 0,184 0,133 0,369
36,00 0,820 45,00 350 0,125 28,9 5,75 0,205 0,147 0,410
36,50 0,890 40,00 350 0,122 28,0 6,50 0,220 0,160 0,440
40,00 0,950 38,00 350 0,120 27,9 7,50 0,237 0,171 0,475
42,00 1,090 43,00 350 0,119 27,8 8,00 0,272 0,196 0,540
45,00 1,089 42,00 350 0,110 27,5 8,12 0,272 0,196 0,540
48,00 1,089 45,00 350 0,110 27,2 8,12 0,272 0,196 0,540
147
ResultadosExperimentales
Tabla 3.6.- Resultadosobtenidosen el Experimento no 5. Condicionesexperimentales28’ C, 65 p.p.m. de amonio inicial y agitaciónvariable(210r.p.m. inicial)
Tiempo(h)
Biomasa O->( IL) (%)
7~iaciónNH4~
fL~~L1J~2Sacarosa
(g/L)Xantano~
DNA(g/L)
RNA Proteínas( L) ( /L)
0,0650
0,0620
0,0600
0,05 50
0,0500
0,0400
0,0330
0.0220
0.0 180
0,0 120
0,0 lO
0,008
0,007
0,005
• 0,004
0,0009
0,0008
0,0008
0,0008
0,0008
0,0008
0,0008
0,0008
0,0008
40,00
39,86
39,68
39,42
39,00
38,63
37,50
36.25
35.00
34,18
33,87
3 3,654
33,39
32,50
28,00
27,55
26,25
26,00
26,00
26,00
26,00
26,00
26,00
26,00
0,00
1,50
3,00
4,50
6,00
8,50
12,00
16,00
20,00
23,50
24,50
25.25
26,00
27.50
31,00
32,50
33,00
35,00
40,00
40.50
43.00
47,50
50.50
55,00
0.00853
0,0093 8
0,00980
0,0110
0,0 140
0,0330
0,05 20
0,1250
0,290
0,640
0,660
0,680
0,690
0,700
0,700
0,700
0,700
0,700
0.700
0,700
0,700
0.700
0,700
0,700
99.80
93.90
92.82
91,20
87,30
82,50
72.00
56.00
35.00
22,10
19,10
45,00
32,00
25,00
19,00
54,00
43,00
42.00
40,00
3 8.00
38,50
39,00
40,00
41,00
210
210
210
210
210
210
210
210
210
210
210
250
250
250
250
400
400
400
400
400
400
400
400
400
0,402
0,402
0,402
0,5 12
0.6 18
0,72 1
0,980
1,230
2,700
3,520
4,680
6,120
6,850
7,220
8,112
9,850
10,12
10,12
10,12
10,12
10,12
10,12
10,12
10,12
0,00 1
0,002
0,003
0,005
0,006
0,0 10
0,0 12
• 0,030
0,041
0,054
0,056
0,05 8
0,060
0.065
0,065
0,065
0,065
0,065
0.065
0,065
0,065
0,065
0,065
0,065
0.0008
0,0009
0,00 1
0,00 1
0,002
0.003
0,004
0,004
0,010
0,0 18
0,026
0.030
0,03 4
0,03 8
0,038
0,03 8
0,03 8
0,03 8
0,03 8
0,03 8
0.038
0,03 8
0.03 8
0,03 8
0,003
0,004
0,004
0.006
0,007
0,0 17
0,029
0,073
0,142
0,258
0,330
0,3 50
0,372
0,400
0,420
0.420
0,420
0,420
0.420
0,420
0,420
0,420
0,420
0,420
148
ResultadosExperimentales
Tabla 3.7.- Resultados obtenidos en el Experimento n0 6. Condicionesexperimentales280C, 130 p.p.m.r.p.m. inicial).
de amonio inicial y velocidadde agitaciónvariable (210
Tiempo(h)
Biomasa(g/L)
O,(% sat)
Agitación(rpm)
NH4~
(g/L)Sacarosa
(g/L)Xantanoj(~¿
DNA..ÁsIL...
RNA~
Proteinas(g/L)
0,130
0,129
0,129
0,128
0,128
0,127
0,127
0,126
0,120
0,110
0,063
0,044
0,020
0,012
0,009
0,007
0,004
0,003
0,002
0,002
0,002
0,002
0,002
39,7
39,5
39,3
39,0
38,7
38,5
38,0
37,7
36,7
35,9
34,9
34,6
33,3
32,5
31,0
30,2
29,0
27,5
26,0
24,0
23,5
21,7
21,0
0,00
2,50
3,50
5,50
7,50
8.50
9,25
10,50
16.00
20.00
24,25
25.00
26,50
28,50
30,50
31,50
32,00
33,50
38,00
45,00
49,00
50,00
51,00
0,011
0,0 15
0,017
0,026
0,027
0,034
0,055
0,07 5
0,098
0,300
0,5 80
0,654
0,69 1
0,703
0,706
0,708
0,709
0,710
0,712
0,712
0,7 12
0,712
0,712
100,0
98,0
93,0
86,0
78,0
70,0
67,0
55,0
35,0
26,0
18,0
45,0
33,0
32,0
29,0
25,0
23,0
20,0
19,0
30,0
21,0
19,0
18,0
210
210
210
210
210
210
210
210
210
210
210
310
310
310
310
310
310
310
310
450
450
450
450
0,521
0,52 1
0,52 1
0,54 1
0,56 1
0,58 1
0,623
0,792
1,480
1,980
2,3 50
2,297
3,297
4,016
5,105
5,920
7,080
8,939
10,300
11,200
11,500
12,000
12,900
0,001
0,002
0,002
0,004
0,005
0,006
0,008
0,012
0,0 15
0,045
0,079
¡ 0,082
0,103
0,105
0,105
0,106
0,106
0,106
0,106
0,106
0,106
0,106
0,106
0,00 1
0,00 1
0,002
0,003
0,003
0,004
¡ 0,006
0.009
0,020
0,036
0,069
0,078
0,083
0,084
0,084
0,085
0,085
0,085
0,085
0,085
0,085
0,085
0,085
0,006
• 0,008
0.010
0,0 14
• 0,015
0,0 19
0,027
0,03 2
0,056
0,174
0,336
0,379
0,400
0,405
0,409
0,4 10
0,4 13
0,413
0.415
0,4 15
0,4 15
0,4 15
0,4 15
149
J?esidta¿losE.vperimenudes
Tabla 3.8.- Resultadosobtenidosen el Experimento n0 7. Condicionesexperimentales280 C, 475 p.p.m. de amonioinicial y agitaciónvariable(210 r.p.m. inicial).
• Tiempo(It)
0,00
1,00
4,00
6,00
7.50
8,50
9,50
12,00
16,00
22,50
23,00
23,50
26.00
29,00
30,50
32.50
34,00
34,50
35,00
¡ 42,00
45,00
47,50
50.50
55,00
Biomasa(g/L)
0.005
0,006
0,009
0,0 12
0,022
0,03 1
0,047
0,068
0,08 5
0,180
0,214
0,320
0,470
0,608
0,750
0,820
0.850
0,890
0,920
0,990
0,990
0,990
0.990
0.990
O,(%)
100,0
97,3
86.5
80,0
77.3
65,0
55.0
40,0
26.0
10,0
60,0
49,6
35,0
20,0
10,0
8,0
50,0
42.0
30.0
22,0
12,0
8,0
35,0
20,0
Agtación(rpm)
210
210
210
210
210
210
240
210
210
210
310
310
310
310
310
310
350
iSO
350
350
350
350
400
400
NH4 ¡ Sacarosa
(g/L) -j
0.475
0,475
0,475
0,468
0,453
0,445
0,440
0,429
• 0400
0,3 65
0,3 55
0,3 20
0,300
0.285
0,231
0,166
0,140
0,135
0,130
0,130
0,130
0,130
0,130
0,130
40,00
38,90
39,80
39,70
39,50
38,40
37,90
37,00
36.75
36,00
35,75
35,00
34,50
34,00
33,80
33,00
29,50
28,50
27,70
26,00
25,00
23,20
23,10
23,10
Xantano
(gIL)
0,86
0,86
0,866
0,866
0,86
0,86
0,93
1,02
1,09
1,13
1,32
¡ 1,42
1,48
1,51
1,63
1,72
2,58
3,75
4,00
6,90
9,50
11,39
11,39
11.39
DNA
(gIL)
0,001
0,002
0,003
0,004
0.006
0,009
0,013
0,040
0,063
0,092
0,093
0,098
0,100
0.103
0,125
0,146
0,170
0,173
0,175
0.176
0.176
0,176
0.176
0,176
RNA(g/L)
0,001
0,001
0,002
0,003
0,003
0,008
0,011
0,032
0,05 3
0.079
0,08 8
0,09 1
0,092
0.13 1
0,142
0,152
0,158
0.159
0,160
0,161
0,161
0,161
0,161
0,16!
Proteinas(g/L)
0,003
0,004
0,006
0.0 II
0,0 15
0.023
0.034
0,065
0,160
0,230
0,245
0,25 3
0,255
0,350
0,420
0,465
0,467
0.467
0.467
0.467
0.467
0,467
0,467
0,467
150
ResultadosExperimentales
Como ya se comentó en el apanadoanterior, ProcedimientoExperimental, el
xantanose siguió por medidade la viscosidaddel caldo, realizandoel calibradoal final de
cadaexperimento,pues el xantanoproducidoen las diferentescondicionesde operación
empleadasno presentasiemprela misma relaciónentreconcentracióny viscosidad.Para
cadaexperimento,las ecuacionesfinalmenteutilizadasfueron las siguientes:
Parael Experimentonl:
C~(gXL) = 0,12 y0097(cp) [3.1]
Parael Experimenton0 2:
0 70Cp(g/LÁO,34p< (cp) [3.2]
Parael Experimenton0 3:
C~(g XL) t0,43.,u0
051(cp) [3.3]
Parael Experimenton0 4:
C~(g/L) 2,O5.,u0
0’3~(cp) [3.4]
Parael Experimenton0 5:
C~(g/L) = 0,77 y0
03tcp) [3.5]
ParaelExperimenton0 6:
C~(g/L) = 0,77 ,u0
03(cp) [3.6]
Parael Experimenton0 7:
C~(g XL) = 0,23 tUa’(cjJ) [3.7]
La viscosidadaparentedel caldo se midió con un viscosímetroBROOKFIELD
SIINCHRO-LECTRIC modelo LVT, a una temperaturade 25 0C y a una velocidadde 30
r.p.m.
151
4.-MODELO CINÉTICO
NOESTRUCTURADO
Modelo CinéticoNo Estructurado
4.- MODELO CINÉTICO NO ESTRUCTURADO
Los Modelos CinéticosNo Estructurados(MCNE) son los modelosmás sencillos
empleadosparala descripciónde sistemasmicrobianos.La cantidadde microorganismose
expresamedianteel término de biomasao población microbianaen unidadesabstractasde
vida, ignorándosela estructurainternadel microorganismoo célula que componela biomasa
puesse consideraa la poblacióncomo unaunidadhomogénea.Como ya ha sido comentado,
estetipo de modelossonuna gran simplificación del problemareal, y suelenserusadoscon
fines tecnológicos,ya que proporcionanecuacionessencillascon sentido fisico, en las que se
trataal microorganismocomounaespeciereactantesencilla,aunque paraserútiles deben de
describir un número suficiente de componentesdel sistema;es decir, a pesar de ser los
modelosmássimples,requierenla medidade varioscomponentesquepermitanla descripción
de, al menos, la evoluciónde la biomasa,la frentede carbono,el productoy otros sustratos,
como la frentede nitrógeno.
La producciónde xantanoha sido modelizadaempleandoestetipo de modelospor
varios autores(Morainey Rogovin, 1966y 1971; Weissy Ollis, 1980; Quinlan 1986; Pinches
y Pallent; 1986; Schweickarty Quinlan,1989); no obstante,estosautoresno tienenen cuenta
en sus ecuacionestodos los nutrientesesencialesde estesistema.
153
ModeloCinéticoNo Estructurado
Estudiosexperimentalesllevadosa caboen un trabajoprevio (Santos,1993) apuntan
claramentela dependenciade la velocidad de crecimiento del microorganismode las
concentracionesde nitrógenoy de oxígenodisueltoen el medio. En la Figura4.1 se muestran
los resultadosexperimentalesobtenidosen el Experimento2, donde se observanclaramente
estas dependenciasentre nutrientes y crecimiento de microorganismoy formación del
producto.El sustratolimitante en esteexperimento,debidoa las condicionesempleadas(280
C, medio A. con 257 p.p.m. de amonio y programaciónde la velocidadde agitación)es la
fuentenitrogenada,de modo que, cuandoel amonio seagota,el microorganismoentraen la
faseestacionariadel crecimiento.Además,hay que destacarque la concentraciónde amonio
influye en la biomasafinal obtenidaen cadafermentación,de modo que con concentraciones
iniciales de amonio bajas. la biomasafinal también lo será; estaproporcionalidadentre
biomasafinal y concentracióninicial de sustratonitrogrenadoes ciertahastaun cierto valor
de concentraciónde amonio, ya que para concentracionespor encimade un valor critico,
puedetenerun efectotóxico parala célula.
Debido a que Xanthomonascampestrises una bacteriaaerobiaestricta, el oxígeno
disuelto en el mediopuedeserun nutrientelimitante del crecimientodel microorganismo.No
obstante,en estecaso,el oxigenodisuelto no actúade limitante del crecimientoya que los
experimentoshansido realizadosconprogramaciónde agitaciónparacompensarla bajadade
concentraciónde oxigeno por el consumode las células en el crecimientoy ademáspor el
aumentode la viscosidaden el medio,comoconsecuenciade la producciónde xantano.Como
puedeapreciarseen la Figura 4.1, su concentraciónno desciendehastacero si no que
permanecealrededordel 10%del valorde saturación.
En cuantoa la formaciónde xantano,sepuedeobservaren la misma figura que se
trata de un producto asociado al crecimiento, es decir se forma a medida que el
microorganismoestácreciendo,si bien el incrementomayor de concentraciónse produce
cuandoel microorganismoseencuentraen la faseestacionariadel crecimiento.Porotro lado,
se observa la estrecharelaciónentre la formación del productoy el consumode la fuente
carbonada.
154
Modelo CinéticoNo Estructurado
0.35
.8
[.6 0,30
025¡.2
~L0 0,20
U 0.8 0,15 U
0,6 ojo
0.4
0,2 0,05
0.0 0,00
2.030 z
“st,
U o
1,0
U
0.5
0,0
Figura4.1-Resultadosexperimentalesobtenidosenel experimenton0 2, realizadoa280C,con 257 p.p.m. de amonio y agitación variable (210 r.p.m inicial).
Se han propuestovarios modelos no estructuradospara la modelización de la
producción xantano(Moraine y Rogovin, 1966 y 1971; Souw y Demain.1980; Pinchesy
Pallent,1986;DeVuyst y col,. 1987ay b). Estosmodelospuedenclasificarseendosgrupos:
- Aquellos que consideranel crecimientoy la produccióndependientesde diferentes
nutrientes.
- Aquellos que expresanel crecimientoy la producciónsólo en ffinción de la biomasa
y suevoluciónconel tiempo.
Al primer grupo citado pertenecenlos modelospropuestospor Moraine y Rogovin
(1966y 1971),y porQuinlany colaboradores(Quinlan y col., 1986; Schweickarty Quintan,
155
20
30~ifl
1Jode/o (‘PuÁtico No Estruciurado
1989>. La diferencia entreellos estáen el tipo de ecuacionescinéticasempleadaspara la
evolucióndel crecimientoy la descripciónde la producción.
Moraine y Rogovin(1966y 1971) empleanecuacionestipo Monod (Ecuaciones(4.1]
y (4.3]). paradescribirla evoluciónde xantanoy biomasa,considerandoel nitrógeno como
limitante del crecimiento,ecuación(4.1] y la fuentede carbonolimitante parala producción
de xantano,ecuación[4.3]. Laevoluciónde los dossustratoscon el tiempovienenexpresados
utilizando dos coeficientesestequiométricos(ecuaciones[4.2) y [4.4)) denotadospor Yp~5 e
YXN. Estemodelo puedeserexpresadopor el siguientesistemade ecuaciones:
dC~ _ ¡¿~ C~ •C [4.1]
dt K~+ (j
dE’5 _ 1 dC1, [4.2]
di’ Y di’
dC~ _ <E’5 [43)— .Cx
dt K5-vQ
dC~ ~Á.dQ [4.4]di’ ~ dt
El modelo de Quinlan (1986) y Schweickarty Quintan (1989) tambiéndescribenel
consumode nutrientesmediantelas ecuaciones[4.2] y [4.4]; sin embargo,la biomasay la
producciónde xantanono vienendadaspor ecuacionestipo Monod, sino potencialesde la
forma expresadaen las ecuaciones[4.5] y [4.6]:
dC~ = . ~05 [4.5]di’
dC~ = * ~
Porcombinaciónde las ecuaciones[4.4] y [4.5] seobtienela ecuaciónlogística:
cdCYk A,, [4.7]
di’ X y - k Y.
Weissy Ollis (1980) y Pinchesy Pallent (1986)proponenmodelospertenecientesal
segundogrupo,esdecir, aquellos dependientessolamentede la biomasay suevolucióncon
el tiempo. Expresanel crecimientocomo función de la concentraciónde biomasamediantela
156
ModeloCinéticoNo Estructurado
ecuaciónlogística,puesestafunciónpresentaunatendenciasimilar a la curvade crecimiento
del microorganismo,ecuación[4.8]. La producciónde xantanoy el consumode la fuentede
carbonoviene dado por ecuacionestipo Luedeking-Piret(ecuaciones[4.9) y [4.10]). Sin
embargo,estosautoresno tienenen cuentala fuente de nitrógeno.Por tanto, estemodelo
vieneexpresadoporlas siguientesecuaciones:
dC~ Cx [4.8]
dt
dC~ _ _ .c±n.dQ [4.9]
dr dt
dC~ a.c<~.dCx [4.10]
dr di’
El modelo de Pinches y Pallent (1986) emplea las mismas ecuacionespara
crecimiento,xantanoy consumode la frentede carbonoque el empleadopor Weissy Ollis
(1980),pero incluyen la ecuación[4.4] para la evoluciónde nitrógenoy añadenla ecuación
[4.11] para el consumo de oxígeno (sin incluir su transporte),el cual dependede la
concentracióndebiomasay de la velocidadde crecimiento:
dE’0 CBdCV [4.11)
tú di’
Ninguno de estos autoresempleatécnicasde regresiónparaobtenerel valor de los
parámetrosque aparecenen las ecuacionesanteriores,por el contrario empleantécnicasde
estimaciónpor simplificación de ecuacionesen puntossingulares,obteniendounos valores
de los parámetrosqueproporcionanun ajusteexperimentalde forma aceptable,aunquesolo
paraun experimentoen cadacaso.
En la Tabla4.1 se resumenlos modeloscinéticosno estructuradosparala producción
de xantanoen forma diferencial,incluyendoel que secomentaráen el próximoapanado.En
ella sehanconsideradolos cinco modelosmásrepresentativos,así como las cincorespuestas
posibles,expresadasen concentracionesmásicas(gIL). Sólo dosde estosmodelosconsideran
las cincorespuestas.
157
J~.
O 0 O e O O o o ci, fl e O.
e. o o ch z o O e.
-t e O e. e ~1 o-
o ci, -e ~1 -t -t o e e) o o’ e o-
O e e. e 9
Gr
o O 3m
zm
CV + ~<
Kb
*
‘y
—J
ti-] IIqN o
t st
z~
Ct
st st
ModeloCinéhcoNo Esi’ructurado
4.1.- FORMULACIÓN DEL MODELO
En trabajosprevios (Santos,1993 y García-Ochoay col., 1995) se ha propuestoun
MCNE parala producciónde xantano.En estemodelo setienen en cuentalas dependencias
del crecimientoy la producciónde nutrientes,incluyendo una expresiónpara describir la
evolución de otro nutrienteesencialen el sistema:el oxigenodisuelto.
El crecimiento del microorganismoviene dado mediantela ecuaciónlogística, la
cualesobtenidaporcombinaciónde las ecuaciones[4.4] y [4.5].
Los resultadosexperimentales,obtenidosen un trabajoprevio (Santos,1993, García-
Ochoay col., 1997),muestranclaramenteque cuandola fuentede nitrógenoesel sustrato
limitante, el parámetroCxm puedeserreemplazadopor:
= Cx» + [4.12]
Si la ecuación.[4.12] essustituidaen la ecuación[4.7], se obtiene la ecuación
logísticaen formadiferencial
IrdC\. — -¿~ ±C1¿C<j— 1 [4.13]
di’ YI%v>) C~, + li~ C~
Esta última ecuacióntiene en cuentatanto el crecimientocomo el consumode la
frentenitrogenada.El consumode la frentede carbonoseexpresateniendoen cuentaque
esutilizada tantoparamantenimientocomoparacrecimiento,incluyendo en “crecimiento”
la producciónde xantano,puestoque el polisacáridoes,en realidad,la cápsulabacteriana,
de acuerdoa la ecuación[4.14]:
dE’5 — ~, 1 dC~<. [4.14]
di’ Y~ di’
La integraciónde estaúltimaecuación,con la condiciónde contorno,t=0 .. C5
proporcionala siguienteexpresión:
159
ModeloCinéticoNo Estructurado —
ky >x<> +C~. j ¿. <‘y” ¿3- )~iv
[4.15]IC.~ )l 1
La producciónde xantanose expresamediantela ecuación[4.6] (Quinlan, 1986;
Schweikarty Quinlan, 1989) y la evoluciónde oxígenodisuelto se describemediantela
Ecuación[4.16]:
dC0 * —un0 ¡ dE’
)
di’ = kLaU (E’0 —C<3) C~. + [4.16)- - y ~it’0,1~
Estaecuación[4.16] incluye un términoparala transferenciade oxígenodesdeel gas
y otro parael consumo de oxígeno- tantoparamantenimientocomo paracrecimiento-tal y
como fue propuestopor Pinchesy Pallent (1986). Para ello, es necesarioemplearuna
expresiónpara el coeficiente de transferenciade oxígeno, para lo cual se ha utilizado la
expresióndadaen la ecuación[4.17] (Gómez,1995):
k1a~=3,08IcY4V%43N175 ~ -0>39 [4.17]
Sustituyendola ecuación[4.15] en la ecuación[4.6] se puedeexpresarla velocidad
de producciónde xantanodeacuerdoala ecuación[4.18]:
dE’
di’ — ~ (Z~ -k<C>~..m8
—< + C~ [4.18]~\IV
LnijI— C~ +Y~ CV, Lí~exPk4ÁvCÑÚi.i~ <.C~ .(c~ Cx)
160
ModeloCinéi’ico No Estructurado
En la expresión anterior se identifican tres sumandos,el primero expresala
producciónmáxima de xantanoa cada tiempo, alcanzablesi el sustrato carbonadose
emplearaúnicamenteendichaproducción;el segundotérminoexpresala cantidadde frente
carbonadaequivalentea la cantidadde xantanodesviadoparamantenimientode las células
en estadoviable; el tercer sumandoindica la cantidadde xantanono producidaa cada
tiempo, debidaal consumode sustratocarbonadopara la formación de masacelular, es
decir,empleadaen el crecimiento.
Por tanto, el modelo constade siete parámetros,los representativosde la biomasa,
queen estecasoson e YXN, y los parámetroscorrespondientesa la evolucióndel azúcar,
el xantanoy el oxigenodisuelto: ni5, Yxs, k~, ni0 e
4.2.- AJUSTE DE LOSDATOS EXPERIMENTALES
La aplicación del modelo a los datos experimentales,para el cálculo de los
parámetroscitados,se tuvo querealizarde la siguienteforma:
• Primeroseobtienenlos valoresde kx e Y~, representandoel primero la velocidad
de crecimientoy el segundola concentraciónmáximaalcanzablede biomasaa partir
de la cantidad de sustratonitrogenadoinicial empleadoy la cantidadinicial de
biomasaal principio de la reacción.La obtenciónde estosparámetrosseha llevadoa
cabo medianteregresiónno lineal en simple respuestaacopladaal algoritmo de
Runge-Kutta,aplicadaa laecuación[4.13].
• Una vez calculadosestosparámetros(kx e YxN), sonsustituidosen la ecuación
[4.13], empleándose,juntocon las ecuaciones[4.14] y [4.16], parael cálculode los
parámetrosni5, Yxs y k~, por aplicación de una regresiónno lineal en multi-
respuestaacopladaal algoritmo de Runge-Kuttade cuartoorden(parala integración
de las ecuacionesdiferencialessin integraciónanalíticaposible).
161
Modelo CinéticoNo Estructurado
• El cálculo de los parámetrosm02 y Yo2x se realizaaplicandouna regresiónno
lineal simple-respuestaal conjunto de ecuacionesdiferenciales formado por las
expresiones[4.14], [4.161,[4.17] y [4.18] sustituyendolos valoresde los parámetros
calculadoshasta el momento en las tres primerasecuacionescitadas, siendo,por
tanto, los únicosparámetrosa calcularm02 e Yo2x. En estecaso,al igual que con la
biomasa,no seaplica la regresiónen múltiple respuesta,debido al menorpesoque
en la minimizaciónde la suma de residuospresentaríala ecuaciónde evolución de
oxígeno.
dE’0 * ___ ___di’ =kLaÍ. (E’0, — Coijy’ . dCx $..tn<jj> E’~ [4.19]
En la ecuación [4.16], correspondientea la correlación del coeficiente
volumétrico de oxigeno en el proceso, es necesario sustituir la ecuación
correspondientede calibrado de la concentraciónde xantanoen función de la
viscosidadparacadaexperimento.Porotro lado,el cálculode las concentracionesde
oxígenodisueltoen cadamomentoen términos de moles/L, se realizaempleandola
expresión:
C0(mol/L) = 2,3~1O~ E’0 (so) [4.20]
En la que se ha supuestoque la concentraciónde saturaciónde oxigeno
disueltoen las condicionesde trabajoes de 2,3.1(0mol/L (correspondientea 280C y
1 atm).
En las Tablas4.2 a la 4.8 se recogenlos valorescalculadosde los parámetrosfisicos
y estadísticosobtenidosde la aplicacióndel ModeloCinéticoNo Estructuradoa los datosde
los experimentosrealizados(experimentosdel 1 al 7). Así mismo, las Figuras 4.2 a 4.8
muestranla reproducciónde los datosexperimentalescon el MCNE aplicado.En todaslas
figuras, la líneacontinua correspondea los valoresproporcionadosporel modelo MCNE,
y los simbolos a los datos experimentalesobtenidos del análisis de los diferentes
componentesdurantela fermentación.
162
Modelo CinéticoNo Estructurado
La Tabla 4.2 muestralos parámetrosobtenidosdel ajustede] experimenton0 1,
realizadoa 250 C y con 257 p.p.m de amonio inicial , todos los valoresde los parámetros
cumplenlas restriccionesestadísticas,estoes, ninguno incluye el cero en sus intervalosde
confianzay seobservaque los valoresobtenidosde la t de Studentmásbajoscorresponden
a los parámetrosobtenidosdel ajustede la concentraciónde oxigeno (m0 , Y0j, y los
valoresmásaltos, a los obtenidosdel ajustede la concentraciónde azúcar( ms, Yxs y kv).
En la Figura 4.2-a, se muestrael ajustede la evoluciónde la biomasaa la ecuaciónlogística,
dondese observala buenareproducciónde los datos experimentalesa estafunción; sin
embargo,en la misma gráfica se muestranlos resultadosobtenidosen el ajuste de la
evolucióndel nitrógeno,dondepuedeobservarsequeestemodeloes incapazde predecirun
buenaevoluciónde estecomponente.En cuantoa la evolucióndel restode componentes,
tanto la evoluciónde la sacarosay como la del xantanosonbuenos,mientrasque parael
oxígenono se consigueun buenajuste(Figura4.2-b).
Los parámetrosobtenidosdel ajusteal MCNE del experimenton’ 2 realizadoa 280
C y con 257 p.p.m de amonio inicial, son recogidosen la Tabla 4.3, donde se puede
observarque los intervalosde confianzade los parámetrosobtenidosdel ajusteal MCNE no
incluyen el cero y que, al igual que en el experimentoanterior, se observanunos valores
muy bajos de la t de Studentpara los parámetroscorrespondientesa la evolución de
oxígenodisuelto,quedandoreflejadoen la mala reproducciónde estecomponente,tal como
muestrala Figura 4.3-b; mientrasque paralas concentracionesde sacarosay xantanolos
resultadosdel ajustesonbuenos.En la Figura4.3-asemuestrala excelentereproducciónde
la concentraciónde la biomasacon la ecuaciónlogística,mientrasque la reproducciónde la
evolución del amonio de nuevo es defectuosa,aunquees mejor que la obtenidaen el
experimentoanterior.Se reproducebienel consumode la fuentenitrogenadadurantela fase
exponencial,no siendobuenoel ajusteen la faseestacionariadel crecimiento.
En la Tabla4.4 aparecenreflejadoslos parámetrosfisicos y estadísticosobtenidos
porajustede los datosdel experimenton0 3 realizadoa310 C y con 257 p.p.mdeamonio
inicial al MCNE, dondevuelvea observarseque, aunquelos valoresson significativos,los
valores de la t de Studentobtenidospara m0~ e son muy bajos, quedandoesto
reflejadoen la malareproducciónde la concentraciónde oxígeno(Figura4.4-b),si bienhay
que comentarque,encomparacióna los dosexperimentosanteriores,la reproducciónde los
163
ModeloE’inéi’ico No Estructurado
datos experimentaleses algo mejor. En la Figura4.4-a se muestrala reproducciónde los
valoresexperimentalesde la biomasay de la concentraciónde amonio, siendolos resultados
muy similares a los observadosen los casosanteriores,es decir, un buen ajustepara la
biomasay peorparala evoluciónde la fuentenitrogenada.
Los parámetrosobtenidospara el experimenton~ 4 realizadoa 340 C y con 257
p.p.m de amonio inicial serecogenen la Tabla 4.5-a. Se puedeobservarque al realizarel
ajustede esteexperimentoal MCNE el valor obtenidodel parámetrom5 es negativo, lo que
indicaríaque a estatemperaturaesteparámetrono tiene influenciay, fisiológicamente,que
el microorganismono consumeazúcarparasumantenimiento.Parapoderrealizarel ajuste
posterior de la evolución del oxígeno en simple respuesta,es necesarioemplear los
parámetrosms, Yxs y k~ obtenidosdel ajuste en múltiple-respuestadel xantanoy la
sacarosa.Debidoa que no es posibleintroducir un valor de m~ negativo,sevolvió a realizar
el ajustefijando m8 en valor cero, obteniéndoseasí nuevos valoresde Yxs y k~, los cuales
se muestranen la Tabla4.5-b.Estosnuevosvaloresde los parámetrosfreron utilizadospara
la obtenciónde los correspondientesparael oxigenodisuelto. Las restriccionesestadísticas
se cumplenparatodos los parámetros,los intervalosde confianzason estrechos,siendoalgo
másamplios parael parámetroY~~,parámetroque a suvez presentaun valor de la t de
Student muy bajo,reflejándoseen la malareproducciónde los datosexperimentalesde la
evoluciónde la concentraciónde oxígenodisuelto que se muestraen la Figura 4.5-b. En
cuanto a la reproducciónde la biomasa,es buena, no siendo así para la evolución del
amonio,tal comomuestrala Figura4.5-a.
En la Tabla4.6 semuestranlos resultadosobtenidosde la aplicacióndel MCNE al
experimenton0 5 realizadoa 28 0C y con 65 p.p.m.de amonio inicial. Los intervalosde
confianzaparalos parámetroscorrespondientesalajustede la concentraciónde oxígenoson
muy amplios, presentandoun valor de la t de Studentbajos,estando el parámetro Y0<
prácticamenteen el límite del valor teórico, tabuladoparaun 95% de confianza.La Figura
4.6-amuestrala buenareproducciónde la biomasacon la ecuación logística,mientrasque
la evolución de nitrógeno,muestraun mal resultadoen cuantoa la reproducciónde los
resultadosexperimentales.En la Figura4.6-bapareceel ajustede la evoluciónde xantanoy
de sacarosa,en los que el resultadoes aceptable,mientrasque para la concentraciónde
oxígenola reproducciónobtenidano essuficientementebuena.
164
Modelo CinéticoA~o Estructurado
La aplicacióndel MCNE al experimenton0 5 realizado a28 C y con 130 p.p.m.
de amonio inicia! proporcionalos parámetrospresentadosen la Tabla 4.7. Paratodos los
parámetrossecumplenlas restriccionesestadísticasimpuestas,esdecir ningúnparámetro
incluye el cero,obteniéndoselos menoresvaloresde t parael parámetroY0~. Estoúltimo
se refleja en la mala reproducciónde la evolución del oxígeno,la cual apareceen la
Figura4.7-b.Parala concentraciónde sacarosay la concentraciónde xantanode nuevose
obtieneun buenajuste.En la Figura4.7-a, se observacómo la evoluciónde la biomasaes
perfectamentereproducidapor la ecuaciónlogística. En cuanto a la concentraciónde
amonio, pareceque la reproducción,obtenidapor ajustede los datos experimentalesal
MCNE, esbuenaparaesteexperimento,tal comoseobservaen la Figura4.7-a.
Por último, la Tabla 4.8 muestralos valores fisicos y estadísticosobtenidospor
ajustea estemodelo parael experimenton0 6 realizadoa 28 0C y con 475 p.p.m. de
amonio.Tanto los parámetrosrepresentativosde la biomasa,como los correspondientesa
la sacarosay xantanocumplen tasrestriccionesestadísticasimpuestas.El parámetromox
proporcionaun valorque incluye el cero,obteniéndoseun valor de la t de Studentque está
por debajo del tabulado.En cuantoal parámetroY0~, poseeun valor de t de Student
muy bajo, prácticamenteen el límite delvalor tabuladoal 95%de confianza.La evolución
de oxigeno disuelto (Figura 4.8-b) obtenidade esteajuste,al igual que en todos los
experimentosanteriores,no esbuena,sin embargo,tambiéncomo en casosanteriores,la
reproducciónobtenidaparaevoluciónde sacarosay xantanoesaceptable.La reproducción
de la evoluciónde la concentraciónde biomasa(Figura4.8-a)de esteexperimento,al igual
que en todos los anteriores,es muy buena.En cambio, parala evolución del amonio, la
reproducciónobtenidano se correspondebiencon los valoresexperimentales,tal como se
ha ido viendoen el ajustedel restode los experimentos.
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(a) Evoluciónde biomasay amonio(b) Evoluciónde xantano,azúcary oxígenodisuelto
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Figura4.6- Ajuste de los datosexperimentalesdel experimenton0 5 al MCNE, realizadoconXanthomonascampestrisa la temperaturade 28’ C, medio A (65 p.p.m.deamonio),programaciónde agitación(210r.p.m. inicial).(a) Evoluciónde biomasay amonio(b) Evoluciónde xantano,azúcary oxígenodisuelto
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ModeloCinéticoNo Estructurado
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0.5
del experimenton0 6 al MCNE, realizado¡a temperaturade 280 U, medio A (136deagitación(210r.p.m. inicial).
Ajuste de los datosexperimentalescon Xanthomonascampestrisap.p.ni.deamonio),programacton
(a) Evoluciónde biomasay amonio(b) Evoluciónde xantano,azúcary oxigenodisuelto
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Modelo CinéticoNo Estructurado
2.0
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Figura 4.8- Ajustede los datosexperimentalesdel experimento7 al MCNE, realizadoconXanthomonascampestris a la temperaturade 28~ C, medio A (475 pp.ni. deamonio),programaciónde agitación(210r.p.m. inicial).(a) Evolución de biomasay amonio(b) Evoluciónde xantano,azúcary oxígenodisuelto
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0.0
30
(h)
180
Modelo CinéticoNo Estructurado
4.3.- DISCUSIÓN
4.3.1- Variacióndel Valor de los Parámetroscon lasVariables
4.3.1.t- Influencia de la Temperatura
En el primer capitulo de este trabajo, ya fue comentadala importancia de la
temperaturaen la produccióndexantano.En trabajosprevios(Santos,1993; García-Ochoay
col., 1995), se observóla influencia de esta variable sobre la produccióndel polisacárido,
obteniéndoseun máximo de producción a 280C. Como en todo proceso químico, la
temperaturadebeinfluir mucho,exponencialmente,en la velocidadde las reaccionesquímicas.
Sin embargo,al evaluarun procesocomplejo,comoel crecimientode un microorganismoy la
producción,en estecaso, de un polisacárido,dichainfluenciapuedequedarenmascarada.No
obstante,esde esperarque la temperaturainfluya en el valor de los parámetroscinéticosy de
equilibrio queaparecenen las ecuacionescinéticas.Estoseanalizaa continuación.
En las Figuras4.9 y 4.10 se muestranlas evolucionesde los parámetrosobtenidosdel
ajusteal MCNE paralos experimentosrealizadosa diferentestemperaturas.
En la Figura4.9 (a y b) semuestranlas evolucionesde los parámetrosrelacionadoscon
el crecimiento,obtenidosdel ajustede los datosexperimentalesa la ecuaciónlogística. Se
observaqueel parámetrokx, indicativo de la velocidadde crecimiento(Figura4.9-a),muestra
unatendenciadescendentecon latemperatura.El parámetroYxsÑ (Figura4.9-b)en cambiono
parecemostrarunaevoluciónclaracon la temperatura.Porello, no esposiblerealizarun ajuste
de estosparámetrosafimcionesmatemáticasquelos relacionencontemperatura.8-
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Figura 4.9.- Evolución de los parámetroscon la temperaturaobtenidospor ajustecon laecuaciónlogística.
(a)
5’
(b)
5’5’
181
ModeloCinético No Estructurado
En la Figura4.10 (a, ti, c) se muestranlas evolucionesde los parámetrosrelacionados
con las ve!ocidadesde produccióndel xantano y consumode azúcar en fimción de la
temperatura.La tendenciade m8 y Yxs presentaun valor máximo a 310 C, mientrasque el
parámetrok~ parecemostrarla mismatendenciaperocon un máximo en 28 o
En la Figura4.10 (d y e) semuestranlastendenciasde los parámetrosrelacionadoscon
el oxígeno-m0 e YJ~- respectoa la temperatura.Puedeobservarseque ambosparámetros
tienen una tendenciamás o menos lineal con dicha variable; m0 muestra una evolución
ascendente,mientrasque Y0~presentaunaevolucióndescendente.
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35
35
Figura4.10.-Evoluciónde los parámetrosdel MCNE con la temperatura.La líneadiscontinuaindica la tendenciateóricade los parámetrosy la continuael ajustedel modeloen funciónde la temperatura(MCNE(T)).
(a) m~ (b) Yxs (c) k~ (d)m02 (e) Y01.
(b)
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Tcn,pemtura(’C)
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182
ModeloCinéticoNo Estructurado
De acuerdo con estasobservaciones,se pensóque los parámetroscorrespondientesa
m~ y ky. , podíanser ajustadosen función de la temperaturade acuerdocon la expresiónde
Ratkowskyy col. (1983),segúnla ecuación[4.211:
k<T)=< Ci~(TTrnrn) Ji -exp(C2a(T-Tmb)]}2 [4.21]
El parámetroYxs, en cambio,sesupusoconstanteduranteel ajusteen el que se dejó
flotar el restode los parámetros.debidoa queel valor delparámetroobtenidoparatodaslas
temperaturasessimilar.
En la Figura 4.10 (d y e) semuestranlas tendenciasde los parámetrosrelacionados
con el oxigeno - e Y0.’>.. - respectoa la temperatura.Puede observarseque ambos
parámetrostienenunatendenciamáso menoslineal con dichavariable.- rn0, presentauna
evoluciónascendente,mientras,Y02~ presentatendenciadescendente.
El ajusteconjunto de todos los datos de los experimentosrealizadosa diferentes
temperaturas(experimentosdel 1 al 4) al MCNE (T) (Modelo CinéticoNo Estructuradoen
función de T) para m5, Yxs y k~ fue realizadoen múltiple-respuesta,considerandocomo
respuestas:sacarosay xantano.Debidoa las tendenciaspresentadasporestosparámetrosen
función de la temperatura, -mostradas anteriormente en la Figura 4.10 (a, b, c),
respectivamente-se realizó el ajuste de acuerdoa las funciones representadasen las
ecuaciones[4.22] a [4.24].EsteMCNE(T) tienenueveparámetros:Ci, Trnin, C2, Tmax, C %, T
mli,, C 2, T ‘max y C3:
m5(T)={ Cj(T-T).H-exp<>C,.<T-T [4.22]
= ( C’1 . (T - T’mrn) [1 exp(C%. (T - [4.23]
Y (T)=C3 [4.24]xs
La Tabla 4.9 muestralos parámetrosobtenidosdel ajustede los cuatroexperimentos
realizadosa distintas temperaturasa este modelo en función de dicha temperatura. Como
puede observarse,los parámetros correspondientesal parámetro m5 dan un resultado
estadísticoaceptableal igual que sucedecon el parámetro Yxs dondeseobservael valor
elevadode la t de Student.Encuantoa los parámetrosCí’ y C,’, correspondientesal ajustedel
¡83
ModeloCinético Nro Estructurada
parámetrok~ a una función de tipo Ratkowsky. se observaque ambosincJuyen el cero y
ningunosuperael valorde t de Studenttabulado.
En cuantoa la evoluciónde la concentracióndeoxígenodisuelto, el modeloen función
de la temperaturaha sido realizadoen simple respuesta.En estecaso,el ajustede los datos
experimentalesse ha hecho teniendo en cuenta la evolución lineal de los parámetros
relacionadoscon este componente,esto es, ni0 e ~%x. En este caso, se tienen cuatro
parámetrosen el modeloen funciónde la temperatura:a, ~3,a’, ~‘, tal comose muestraen las
ecuaciones[4.25j y [4.261:
ni0 (T) = a + /T T [4.25]
= a’+fi’T [4.26]
Los valores de estos cuatro parámetros,así como sus valores estadísticosde se
muestrantambién en la Tabla 4.9. Como puede observarse,los parámetros ci’ y 13’
correspondientesal parámetroYo2x incluyen el cero, y ninguno cumple las restricciones
estadísticasimpuestas,es decir, que los valoresde t de Studentobtenidosno superanlos
valorestabuladosteóricos.
Los ajustes de los parámetrosen función de la temperaturaa las funciones
matemáticasquesehanmostradosepresentanen la Figura4.10,dondeaparecencomolínea
continua. Este ajuste es el resultado de sustituir las temperaturasen las siguientes
ecuacionescon los valorescorrespondientesde los parámetrosobtenidos(con un 95% de
probabilidad):
= {O,227 . ([—16,6) [i —exp(&068 (T — 3554)42 [4.27]
= {O,OO I52~(T —17,36)11—exp(O,65] IT — 39,23)42 14.281
Y (T)=O,1445 [4.29]xs
m0 (T) = 9,8? io-3 + (—2,6 ](74) •T [4.30]
Y (T)=—5,6±O,89•T [4.31]0,X
184
Modelo Cinético No Estructurado
Todos los datosexperimentalesobtenidosen los experimentosrealizadosa diferentes
temperaturashansido reproducidosmediantela sustituciónde lasecuaciones[4.27]a [4.31]en
el MCNE. Las Figuras4.11 a 4.12 muestranla reproducciónde los resultadosexperimentales
con dichoMCNE (T).
Como eslógico, y ya que no seha conseguidounabuenaestadísticade los valores
de los parámetrosen función de la temperatura,este modelo MCNE(T) no mejora la
reproducciónde los datosexperimentalesobtenidosexperimentoa experimento.De hecho,
en alguno de los experimentos,como a 280 C y 250 C, la reproducciónde los datos
experimentaleses mucho peor que la obtenida con el MCNE, especialmenteen la
descripciónde la evolución del oxígeno. Por ello, no es posible aceptareste modelo
MCNE(T) como válido, y podemosconcluir que el modelo cinéticono estructuradono es
capazde predecirlaevoluciónde los parámetrosenfunciónde la variabletemperatura.
185
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ModeloCinéticoNo Estructurado
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Ajuste de los datosexperimentalesdel experimenton0 1 alMCNE(T) realizado con Xanthomonas campestris a latemperaturade 250 C, medio A (257 p.p.m. de amonio),programaciónde agitación(210 r.p.m. inicial).
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Figura 4.12.-
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Ajuste de los datosexperimentalesdel experimentono 2 alMCNE(T) realizado con Xanthomonas campestris a latemperaturade 2W C, medio A (257 p.p.m. de amonio),programacióndeagitación(210r.p.m. uncial).
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187
ModeloCinéticoNo Estructurado
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Figura 4.13.- Ajuste de los datosexperimentalesdel experimentono 3 alMCNE(T) realizado con Xanthomonas campestris a latemperaturade 310 C, medio A (257 p.p.m. de amonio),programaciónde agitación(210 r.p.m. inicial).
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Figura 4.14.
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Ajuste de los datosexperimentalesdel experimentono 4 alMCNE(T) realizado con Xanthomonas campestris a latemperaturade 340 C, medio A (257 p.p.m. de amonio),programacióndeagitación(210r.p.m. uncial).
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441AS A-A A-A
188
ModeloCinéticoNo Estructurado
4.3.1.2- Influencia de la Concentración de Amonio Inicial
La concentraciónde amonio esuna variableimportanteen el procesode producción,
puesesel nutriente limitante en el crecimientoen el medio de producciónempleado.Es un
componentequeinfluye significativamenteen la concentraciónde biomasaobtenidaduranteel
proceso.Por estarazón se ha realizado el estudiode la influencia de esta variable en los
parámetrosdel modelo.
La evolución de los parámetrosobtenidos de la aplicación del MCNE a los
experimentosrealizadoscon diferentesconcentracionesde amonio se muestraen las Figuras
4.15 y 4.16.
En la Figura 4. 15 se muestranlas tendenciasde los parámetrosrelacionadoscon el
crecimiento,dondese observaque, al igual que ocurriacon la temperatura,no esposible
relacionarlos parámetrosde crecimientoobtenidoscon funcionesque los relacionencon la
concentraciónde amonio. Se observaque el parámetrokx -indicativo de la velocidadde
crecimiento- muestrauna tendenciadescendentecon la concentraciónde amonio. El
parámetrorelativo al rendimientode amonio en biomasa(YxIÑ) presentaun valor máximo
en 65 p.p.m. y un valormínimo en 514 p.p.m.,mientrasquecon 130 p.p.m. y 257 p.p.m. no
presentadiferencias significativas.
35
~11— 30 ~
25 H
20 —2
~- ‘~-1lOt
06— 5—4
o—0 ¡00 200 300 400 500 0 00 200 300 400 500 600
Anxn¡o (mm) ánn,ío (mm>
Figura 4.15.- Evolución de los parámetrosdel crecimiento en función de laconcentracióndeAmonio.
a)kx
189
1•1~1~1~
(a)a,’
5’-c
1 l 1 2
o (b)?
oo
- Vot/e/oCinéticoNo Estructurado
En La Figura 4.16 (a, b. e) se muestranlas tendenciasen función de la concentración
inicial de amonio, de los parámetrosdel MCNE relacionadoscon las velocidadesde
produccióndel azúcary dcl xantano:m5, Yxs y k?. Laevoluciónde los parámetrosrelacionados
con la evolución del oxigeno, mo~eYox, aparecenen la Figura 4.lód y 4.16e,
respecúvarnente.
Ninguno de los parámetrosdel MCNE muestrauna tendenciaclara ni lógica en
funciónde la concentraciónde amonio.Porello, en estecasono es posiblesiquieraplantear
ecuacionesmatemáticaspara proponer un modelo cinético en función de la variable
estudiada,tal comoseintentó en el casode la temperatura.Además,con estemodelo no fue
posible obtenerunabuenareproducciónde la evolucióndel amonio, tal como fue mostrado
en las Figuras4.2aa 4.Ba. Por tanto, eslógico pensarque el modelo es incapazde mostrar
una evoluciónde parámetrosen funciónde estavariable.03 5
0.4 4
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Figura tU- Evoluciónde parámetrosdel MCNE con la concentraciónamonio.
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1 (d)
N.
190
ModeloCinéticoNo Estructurado
4.3.2.- Simulación de una Operación Discontinuscon el Modelo Cinético NoEstructurado
La realización de simulacionescon modeloscinéticosconstituyeuna herramienta
predictiva muy útil, permitiendo prever lo que ocurre cuando se modifican ciertas
condicionesduranteel proceso,sin necesidadde experimentar,lo cual permite un gran
ahorrode trabajoy tiempo. La simulacióndebede serrealizadacon un modelocorrecto,es
deciraquelcuyo planteamientoy parámetrospermitanpredecirde la formamásfiable lo que
puedeocurrir ante cambiosen las condicionesde operación. De esta manera,una vez
obtenidoslos parámetrosde un modelo bajo ciertas condicionesde operaciónes posible
realizarsimulacionesconsiderandootras condicionesiniciales (temperatura,velocidadde
agitación, cambiosen la composicióndel medio, etc); otros tipos de reactores(air-lifts,
columnas,etc) o cambio en las dimensionesdel reactor empleado.Todo ello implica la
utilidad de realizarunasimulaciónparaefectuarun cambiode escalaen el proceso.
Por todo ello, es importanteconocer quéescapazde predecirel modeloplanteado
de forma adecuada,hayquesaber,también,qué variablesinfluyen en el proceso,y cuánto,
esdecir, evaluarla sensibilidaddel sistemafrenteadiferentescondicionesde operación.
La forma más adecuadade efectuar las simulacionescon un modelo cinético-es
empleandoparámetrosen funciónde las variablesde operaciónquepudieraninfluir.
En estecapítuloseha visto queel MCNE no ha podido serobtenidoen función de
ninguna de las variables estudiadas—nitrógeno y temperatura-,por lo que realizar
simulacionesprobandodiferentesvaloresde estasvariablesno va apermitir obtenerbuenas
predicciones,puesel modelono contemplaestainfluencia.
Se hanrealizadosimulacionesque en principio, cabríaesperarmostraseninfluencia
en la evoluciónde componentes,como concentraciónde biomasainicial, concentraciónde
azúcarinicial y concentraciónde oxígenodisuelto.
Es lógico pensar que la concentraciónde biomasainicial influya en la evoluciónde
componentesdel sitema . Esta concentración de biomasainicial influye en primera instancia
191
Modelo Cinét¡coNo Estructurado
en la evoluciánde biomasatal como contemplala ecuación[4.131correspondientea la
ecuaciónlogísticaparael crecimiento.Además, al influir en la concentraciónde biomasase
verán afectadosel resto de componentesdel sistema,esdecir, concentraciónde sacarosa
(ecuación [4.15]), evolución de oxígeno disuelto (ecuación [4.16]) y evolución de la
concentraciónde xantano(ecuación[4.18]), puestodasincluyen el término de biomasaen
sus expresiones.
En cuantoa la influencia de oxigeno disuelto, sólo cabepensarque al modificar
algunacondiciónenel biorreactorque alteresuconcentración(velocidadde agitación)sólo
seve afectadala propiaevoluciónde estecomponente,puesa la vistade las ecuacionesdel
modelo no estructurado,sólo sereflejará la influenciaen el coeficientede transferenciade
materia(ecuación[4.17]), y éstaen la ecuación[4.18], correspondientea la evoluciónde
oxígenodisuelto.
Finalmente,la influenciade la concentracióninicial desacarosaseverá reflejada
tanto en la evoluciónde la concentraciónde producto(ecuación[4.18]), como en la propia
evolucióndelazúcar,tal como indica la expresióndadapor la ecuación[4.15].
Así pues,se han realizadodiversassimulacionesparaobservarla influenciade ¡os
factorescomentadossobrela producción,el crecimientoo la evoluciónde oxígenodisuelto
durantela fermentación.
En La Tabla 4.8 se muestranlas condicionesde operaciónempleadasen diferentes
simulacionesque han sido realizadascon el MCNE en operaciónen discontinuo. Las
simulacionessehanrealizadocambiandoel valor inicial de diversosfactorescuyainfluencia
en el procesoesde sobraconocida(Santos,1993).
192
ModeloCinéticoNo Estructurado
Tabla 4.8 .- Simulacionesrealizadascon el MCNE en operacióndiscontinua.
Simulación Valores
Influencia de la concentracióndebiomasa inicial
Cxo = 0,03 g/LCxo 0,07 g/LCxo = 0,50 g/LCxo 1,00g/L
Influencia de la concentraciónazúcarinicial
C50 10g/LCso = 20 g/LC50 = 40 g/LCso SOgfL
Influencia de la concentracióndeoxígenodisuelto
Agitación constantePerfil de agitación
4.3.2.l~..Influencia de la Concentraciónde BiomasaInicial
Tal como muestra
biomasay se observósu
modelo: sacarosa,xantano,
la Tabla 4.8, se probaron cuatro concentracionesiniciales de
influencia en la evolución de los diferentes componentesdel
oxígenodisuelto y biomasa.
La influencia de la biomasainicial en el crecimiento, a lo largo del tiempo de
fermentación,se muestraen la Figura 4.17. Como puedeobservarse,cuantomayor es la
concentracióninicial, mayores la concentraciónmáxima de biomasaal final del periodo
exponencialde crecimiento.
En cuanto a la influencia sobre la velocidad de producción de xantano y de
consumode azúcar(Figura4.18),sepuedeapreciarque cuantomayor es la concentración
de biomasamásrápidaes la producción,no habiendodiferencias en la concentraciónfinal
193
ModeloCinético No Estructurado
alcanzada,puestoque éstaseestabilizacuandose acabael azúcar.El consumode sacarosa,
comoeslógico. esmásrápidocuantomásrápidaes la produccion.
En la Figura 4.19 se observa la mala simulación obtenidapara la evolución de
oxígenodisueltopues, comoya ha sido comprobadoa lo largode estecapitulo estemodelo
no permitepredecir de formaadecuadala evoluciónde estavariable.En cuantoal valor de
la constantede tranferenciade oxígeno (k¡~av) su valor es mayor cuantomenor es la
biomasainicial, debido, lógicamente,a la relación de éste con la viscosidaddel caldo
(relacionadaa su vez con la concentraciónde xantano).Si se observa la Figura 4.18 de
nuevo, observamosque coincide, en tiempo,que las mayoresconcentracionesde xantano
corresponden,en la Figura 4.19, a los menoresvalores de kLaV, para finalmente
estabilizarse,al igual que la produccióndel polisacárido.
194
ModeloCinéticoNo Estructurado
3
2
(3<
o
0,3
0,2
cf
o,’
0.0
t(h)Figura 4.17.- Simulaciónrealizadaparala producciónde xantanoen operaciónen
discontinuocon el Modelo Cinéticono estructurado:influenciade laconcentracióninicial de biomasa sobre la evolución de biomasa.
Figura 4.18.- Simulación realizadapara la producción de xantano en operación endiscontinuo con el Modelo Cinético no estructurado: influencia de laconcentracióninicial debiomasasobrela evolucióndexantanoy sacarosa.
0 20 40 60 80
40
t(h)
195
ModeloCinéticoNo Estructurado
25
2,5
202,0
~I,5 I5~
~2x
1.0
0,5
5
0,0
Figura 419.- Simulación realizada para la producción de xantano en operación endiscontinuo con el Modelo Cinético No Estructurado: influencia de laconcentracióninicial de biomasasobrela evolucióndel oxígenodisueltoyel k¡ay
0 20 40 60 80
(h)
196
Modelo CinéticoA~o Estructurado
4.3.2.2.-Influenciade la Concentraciónde Inicial Azúcar
Se han realizadosimulacionescon cuatro concentracionesiniciales de sacarosa,tal -
como se ha mostradoen la Tabla 4.8. En cuanto a la influencia en la velocidad del
crecimiento.la Figura 4.20 muestraclaramenteque el modelo prediceque la concentración
inicial de sacarosano influye enel crecimiento.
Enla Figura4.21 puedeversecomo influyen las diferentesconcentracionesde azúcar
sobrela evoluciónde la biomasaduranteel proceso.El modeloprediceque cuantomayor es
laconcentracióndesacarosamayor esla concentraciónde xantano,siendocapazde predecir
que la produccióncesecuandola concentraciónde azúcarescero,debidoa que la ecuación
correspondienteala velocidadde producciónde xantanoaparecela concentraciónde azúcar.
La simulaciónparaobservarla evoluciónde oxígenodisuelto puedeobservarseen la
Figura4.22, dondeademásde observarla malapredicciónde estecomponentecon el modelo
cinético no estructurado,seobservala predicciónde la evolucióndel valor de kLaV mayor
cuantomenoresla concentracióninicial de sacarosa.
2,0
1,
1,
0,5
0,.
0,3
0,2
cf0,1
0,070
Figura 4.20.-
t (Ii)
Simulación realizadapara la producciónde xantano en operación endiscontinuo con el Modelo Cinético no estructurado: influencia de laconcentración inicial de sacarosa sobre la evolución de biomasa.
197
ModeloCinéticoNo Estructurado
-s
tE
(y
3
Figura 4.21.- Simulación realizada para la producción de xantano en operación endiscontinuo con el Modelo Cinético no estructurado:influencia de laconcentracióninicial de sacarosasobre la evolución de xantina ysacarosa.
y
80
70
60
SI)
406
30~
20
lo
o
Figura 4.22.- Simulación realizada para la producción de xantano en operación endiscontinuo con el Modelo Cinético no estructurado: influencia de laconcentracióninicial deazúcarsobrela evolución de oxígenodisueltoyktav.
198
50-
40
20
t (Ji)
t (Ji>
ModeloCinético No Estructurado
4.3.2.3.- Influenciade la Agitación
En las Figuras 4.23 y 4.24 se muestranlos resultadosobtenidos al realizar
simulacionesconelMNE con diferentesprogramacionesde la velocidadde agitación.Sehan
realizadosimulacionesconunaagitaciónconstantey un perfil de agitación.En la Figura 4.23
aparecela influenciade los dostipos de agitaciónsobreel crecimiento,el consumode fuente
nitrogenada,sobrela fuentede azúcary la produccióndelpolisacárido,observándosequeel
modelo es incapazde predecirla influenciade la velocidadde agitaciónen la evoluciónde
estoscomponentes.Dondesi se ve reflejadala influenciade la velocidadde agitaciónes en
la evolucióndeloxigenoy el valor de la transferenciade oxígeno.(kbav) tal como se muestra
en la Figura4.24.
J
40
30
20j~
(y
lo
o
«jo
tqi}
Figura 4.23.- Simulación realizada para la producción de xantano en operación endiscontinuo con el Modelo Cinético No Estructurado: influencia de lavelocidaddeagitaciónsobrela evoluciónde amonio,biomasa,sacarosayxantano.
2,0
0 20 40 60 80
199
ModeloCinéticoNo Estructurado
30
25
20
46lo
5
o
‘(jo
Figura 4.24.- Simulación realizada para la producción de xantano en operación endiscontinuo con el Modelo Cinético no estructurado: influencia de lavelocidaddeagitaciónsobrela evolucióndeoxigenodisueltoy lu¿Lav.
0*1*115
ab
iv
0 20 40 60 80
t(h)
200
Modelo CinéticoNo Estructurado
4.3.3.- Validez del ModeloCinéticoNo Estructurado
A lo largode esteapartadosehanido exponiendolos diferentesresultadosobtenidos
con el MCNE propuesto,tanto en ajustesa datos experimentalescomo en las distintas
simulaciones.Se ha visto que se ha conseguidoun buen resultadoal aplicar el MCNE a los
diferentesexperimentosrealizadosen estetrabajo en las evolucionesde biomasa,xantanoy
sacarosa;sin embargo,estemodeloesincapazde predeciruna buenaevolucióndel oxigenoy
del amonio.
Seha planteadoun modelocinéticono estructuradoen función de la temperatura(T)
de acuerdoa la tendenciaquepresentabanalgunosde los parámetrosobtenidosen los distintos
experimentos.No obstante,al reproducir los datos con el citado modelo en función de
temperatura, se observó que las reproduccionesobtenidas con el MCNE(T) no son
suficientementebuenas.
Para la otra variable estudiada,es decir la concentracióninicial de amonio, no fue
posiblesiquieraobtenerunarelaciónde estetipo, pueslos parámetrosobtenidosdel ajustecon
el MCNE no presentabanunatendenciacapazde respondera algunafunciónmatemáticaque
permitieseplantearun MCNE(NH4~).
Las simulacionesfueronrealizadastomandocomo parámetroslos obtenidospor ajuste
del experimentocentral—aquel realizadocon las condicionesóptimas (Santos,1993)-.Sehan
realizadolas simulacionesoportunascon el fin de observarlavalidezdel modeloplanteado.
Al compararlos resultadosobtenidosa partir de las diferentessimulacionescon los
resultadosexperimentales,seha podido llegar a las siguientesconclusionesrespectoa lo que
el Modelo CinéticoNo Estructuradoescapazdepredecir:
• La concentraciónde xantanose ve influida por la concentracióninicial de amonio,
observándoseun máximoen la produccióna 257 p.p.mde amonio, sin embargoel modelono
lo predice.
201
—liodelo CinéticoNo Estructurado
• La concentraciónde oxígenoen el medio se ve influida por la concentraciónde xantano
fonnado, el modeloesincapazde predecirla evoluciónde oxígenodisuelto segúnaumentala
concentraciónde polisacárido,ni tampocopredecirestaevoluciónsegúnse va aumentandola
velocidadde agitación.
• El modelo es capazde predecirbien la influenciade la concentracióndesacarosainicial
sobrela evoluciónde la concentraciónde polisacárido,en cambioes incapazde predecirde
formaadecuadala influenciadel azúcaren la evoluciónde la biomasa.
Por todo ello, se puedeconcluir que el modelo cinético no estructuradopermite
predecirbien la influenciade azúcarinicial en el medio,y la influenciade la biomasainicial,
en cambio no permite obtenerbuenasprediccionesde la evolución de oxígeno disuelto,
variablesesumaimportanciaen esteproceso.Así pues,el ModeloCinéticoNo Estructurado
no essuficienteparala descripciónde la producciónde xantano.Se hace,pues,necesario
mejorar el modelo de modo que se consiga una mejora en las predicciones de las
evolucionesde ¡os componentes.Ello implica teneren cuentaen el modelo factoresque
influyen en el procesoy, que no han sido consideradoshastael momento.En cl próximo
apanadose aplicará un modelo cinético más complejo, esto es un Modelo Cinético
Metabólicoque, es de esperar,mejoresignificativamentela descripciónde la producciónde
xantano.
202
5.- MODELO CINÉ ¡‘moMETABÓLICO
ModeloCinético Metabólico
5.- MODELO CINÉTICO METABÓLICO
Como ya seha visto, los modeloscinéticosno estructuradossonbuenosparadescribir
el sistemacuandola composicióncelularestáaproximadamenteen estadoestacionarioo no es
necesarioteneren cuentala influenciadeciertasvariablesen los valoresde los parámetros.Sin
embargo,en una situaciónen la tienenlugarcambiosen la composicióncelular, los modelos
no estructuradosproporcionanunapobreaproximacióna la realidad.Porotra parte,es lógico
pensar que los modelosno estructuradosno seancapacesde reflejar la influenciade ciertas
variables,fundamentalmentela composicióndel medio, tal como ha quedadoreflejadoen el
apartadoanterior. Parasalvarestasdebilidadesen estetipo de casos,hay que recurrir a los
modelosestructurados.
Estos últimos fueron clasificadospor Nielsen y Villadsen(1992) en varios tipos, tal
como se detalló en el primer capítulo de estaMemoria. Dentro de esta clasificación, se
encuentranlos ModelosCinéticosMetabólicos(MCM), los cualesno estructuranla biomasa,
peroplanteanrelacionesestequiométricasdefinidasparael metabolismodel sustratocarbonado
(Kogaycol. 1969;HallyBarford 1981;Barfordy col. 1992).
203
ModeloCinético Metabólico
En La literaturahay diversosModelosCinéticosMetabólicos(MCM), entendidoscomo
aquellosquehacen un tipo de estructuraciónsólo parael metabolismodel o de los sutratos
carbonados,sin diferenciarpanesen la biomasa,ya que la siguen considerandocomo en los
modelosno estructurados.Dentro de estetipo, existenmodelosmuy diferentes,muchosdc
ellospropuestosparaproblemasmuy especificosde forma teórica(Van Dedemy Moo-Young,
1973; Gerastsy col., 1990; Bibila y Flickinger, 1991), realizandosimulacionesa partir de
parámetrosestimadosde forma que no queda muy clara. Otros autoresplanteanestudios
metabólicosmásgenerales,como esel casode Koga y col., (1969)y del grupode Bardford
(Barford y col.. 1990; Hall y Bardford, 1981 Bardfordy Hall 1981;Bardford y col., 1992ay
1 992b), estos últimos autores proponeneste tipo de modelospara el caso específicode
Saccharomycescerevzs¿ae.
El único modelo de tipo metabólicopropuestoen la literatura parala producciónde
xantanoes el planteadopor Ponsy col. (1989).Estemodelofue formuladocon datosobtenidos
en operacióntipo batchy en un reactortipo columnade burbujeo.Consideranla biomasacomo
una entidadindependienteen el sistema,el crecimientoes consideradocomo no estructurado;
sin embargose estructurala producciónde xantano,esdecir, el modelo tiene en cuentael
metabolismodel sustratocarbonadoen el metabolismo celular. La Figura 5.1 muestrala
mterrelaciónentrela síntesisdel xantanoy el catabolismode la glucosavíaEntner-Doudoroff
en conjuncióncon el ciclo de Krebs.Las dos rutasno son independientesdebido a que los
sutituyentesde la molécula de xantano,acetatoy piruvato, presumiblementederivan del
acetilCoA y del fosfoenolpiruvato(PEP). En dicho esquemase muestraademásdónde se
requiereno generanlos compuestosde alta energía(ATP, GTP)y susprecursores(cofactores
reducidos,NADH,It FADH2).
20~
ModeloCinético Metabólico
UDP- GLc
/1
UDP-Ac Gle
LIPIDO-P.~1
1’4UMPLIPIDO-P-P-G(c
IDP-GIc IDP
LIP!DO-P-P-GIc-GIc
Fre GP—.Mari- GP—.Man lP—*GDP-ManRuta IIIEntner ~-UDPDoudoroft
Ir
PEP
LIPIDO-P-P y,
LIPIDO-P-P- Glc-GIc- Man
LIPIDO- P- P-Glc- GIc- Man
Ac-Glc
LIPIDO- P-P-GLc- GIc- Man
Ac-Glc
Man
LIPIDO-Gle-Gle- Man-Ac-GIc
¿ PVR= Man
MONOMERO DE XANTANO
Figura 5.1.- Rutas del catabolismode glucosa y síntesis de xantano empleadasporXanthomonascampestris.
GIc
¿Gle SP —.‘GIc—1P
— Gte— Gle—
Man
Ac Gte
Man= Pyr
205
ModeloCinético Meíabólicc
Las relacionesestequiométricasplanteadaspor estos autoresparala evoluciánde los
diferentescomponentessonlas siguientes:
Para la síntesis de xantano, Pons y col. (1989) proponen tres relaciones
estequiométricas.La primeraestablecela síntesisdel esqueletocarbonadoconteniendocuatro
hexosas(dosmanosasy dosglucosas)y una deácidoglucurónico:
5C6H1206+ 1 }(ATP + 1120)+ NaOH + 2NADP —* C30H47026Na+ 1 ]<‘ADP + Pi)
±(NADPH,FU)±5H20 [5.1]
La segundaecuacióndescribela sintesisde Acetil CoA, el precursordel constituyente
acetato:
C6HlrOú + JIDP + Pi + NADP~ + 3NÁ4D~+ 2CoASH~—> 2AcetilCozt+ IITP
+NADPH,H~ ±3(NADH,H~)±H20±2C02 [5.2]
El piruvatoesdirectamenteobtenidoa partir del fosfoenolpiruvato(PEP):
CÓH/2Oó+ Pi + NADP~ + 2NAD~ + 2CoASH—> PEZ’ + ,4cetilCoA+ NADPH, W±2(NADH,W)+ 1120±CO? [5.3]
Las ecuaciones[5.1] y [5.3] son multiplicadaspor los coeficientesestequiométricos
queestosautoreshan extraídode la literatura,y se muestranla siguienteecuación:
5,49C6FJj:Oá + 10,S9ATP+ 3,58(NADP~ NAD~)+ ],3SNaOH+ 0,6CoASH+ 0,302—* C3. 34His5802736NQ1,38+ bO,89(ADP+ Pi) [5.4]
338(NADPH,H4; NADE!, H~) + 0,6 CoA + 0,6C02
Parala producciónde xantano,seconsideraque el pesomoleculardel monómerode
xantano correspondea una fórmula empírica: C32,341Ls,580n,36Na,,3s,por lo que su peso
moleculares 906,2 g/mol.
Parael catabolismototal de la glucosa,considerandoque la ruta catabólicaes la de
Entner-Doudoroffen conjuncióncon el ciclo de Krebs,seasume:
C6H/206 + 3(ADP+ Pi) + 2FAD~ + 10NAD~ + 6H20—* 6C02+ 3ATP
+ 10(NADH,H~)+2FADH2 [5.5]
206<
ModeloCinético Metabólico
La energíade mantenimientose formulacomo:
ATP —* ADP+ Pi [5.6]
Parala fosforilaciónoxidativa:
NADH,H~ + 0,502 -* NAD~ ±H2O[5.7]
FADH2 + 0,502->FAD~ + H20
Las velocidadesespecíficasde crecimiento de las ecuaciones[5.4] a [5.7] son,
respectivamenteq ~, q c, q ni, q y q p. La relaciónentre las ecuaciones[5.61y [5.7] puede
expresarsecomo la relaciónq’p/ q?,siendo la relaciónP/O o númerode moléculasde ATP
formadasdurantela transferenciade un par de electronesa travésde la cadenarespiratoria
haciael oxigeno,queesel aceptorfmal de estoselectronesenlos organismosaerobios.
Ponsy col. (1989)planteanrelacionesestequiométricasparadiferentescomponentes
del sistema:
Velocidadde consumodeglucosa:
q’g = qj +5,49 q’x [5.8]
Velocidadde producción de CO2:
q rn. = q c~05 [5.9]
Velocidaddeconsumode oxígeno:
q0=0,5q’~ [5.10]
Velocidaddetransferencia de oxígeno:= kLaV [5.11]
CbMax(C*~Co,)
Velocidadde produccióndecofactores:
[5.12]
207
Modelo Cinético Metabólico
VeLocidadde consumode ATP:
qÁTP=]O,89qX+q,,, [5.13]
Velocidadde produccióndeATP:
q ÁT~” =3 qj ±qj [5.14]
Se asume estado pseudoestacionariopara cofactores y balancesde ATP. Las 7
ecuaciones([5.8] a [5.14]) del modelo implican 10 incógnitas,donde nueveson velocidades
especificasqg, q’c, q’x, q’ccn, q’o2, q?,qp, q1w, qATP y la concentraciónde oxígenodisuelto.
Un aspectoimportantequeconsideranestosautoresesel mecanismoparala energíade
mantenimiento,proponiendoque el consumode energía para este mantenimientopodría
proporcionarrendimientosteóricosde xantano Yg.x entre 0,9 y 0,77 g de xantano/gde
glucosaparavaloresde P/Oen un rangoentre3-0,5 respectivamente.Estono pareceapoyarlos
resultadosexperimentales,los cualesno excedende 0,7 g de xantano¡gde glucosa
Entrelas suposicionesdel modelohayqueconsiderar:
• El requerimientode ATPparala síntesisde xantano(1O,89q’x) no iguala la velocidad
de síntesisq’ATP puestoque la demandade ATP paramantenimientoq’,,, espositivo.
• Asumenque los requerimientosde ATP parael mantenimientosonproporcionalesal
requerimientoparala síntesisde xantano,lo cualrinde:
_ [5.15]q ~
Si se sustituyela ecuación [5.15]en la [5.13]se obtienela ecuación[5.16]:
~ATP _____ — 89+ E [5.16]
Estaecuaciónindica que la cantidadde ATE’ implicado en la síntesisde xantanoes
mayorquela cantidadque estequiométricamentepredicela ecuación[5.4].
2 08a
Modelo Cinético Metabólico
• Los resultadosexperimentalesmuestran la clara influencia del coeficiente de
transferenciade oxigenosobrelas velocidadesespecíficas.Esto debeser expresadoa
través de la limitación de oxigenosobrela velocidadespecifica ¿opIadaal consumo
de oxígeno,de acuerdoa:
qrMCO: [5.17]
q = (Kc+ Co2)
Cuandoel oxígeno no es limitante, se obtiene el valor máximo, q’rM. Cuando el
oxígenoes limitante , esdecir suconcentraciónes cercanaa cero, la ecuación15.17]
quedacomo:
qrM Co
;
[5.18]qr= Kc
• La relaciónfmal estábasadaen las investigacionesde Rbels (1983).La relaciónPÍO
de 3 esestequiométricamentepoco realistaparalos organismosen vivo. EJ valor P/O
debeser máspequeñodebidoa la fosforilaciónoxidativa.Basadosen la condiciónde
Róelsde no limitación de oxigeno,el valor másalto de PÍO esde 1,2 mol ATP/mol de
cofactor. Por tanto, Pons y col. (1989) asumenque la relación entre la tensiónde
oxígenoy PÍO esfuncionalmentesimilar a la relaciónentretensiónde oxigenoy la
velocidadderespiración:
q~ _ 1,2 Co; [5.19]qr — (Kc+Co;)
Lasecuaciones[5.16],[5.17]y [5.18]introducentresnuevoscoeficientesF, q’rM y ‘Cc.
La constantede Michaelis, ‘Cc, es estimadacomo el valor más bajo de tensión de
oxígenodisuelto (2% de saturaciónde aire correspondea Kc = 4,6 . 10.6 molfL). El
coeficienteq’~ escalculadoa partir de la velocidadespecíficamáximade producción
de xantanoen tanqueagitado con limitación de oxígeno(q’xirO,2S g de xantano/g
biomasa h) el correspondientevalor de q’~M=8.10~3 mol NADVg biomasa h.
Finalmente,el valor de F esestimadoen 23 mo] de xantano/molde ATP empleado
paramantenimiento.Esto rinde un valor de Y’X.ATP de 34 mol ATP/mol de xantanoy
unaimportanteeficienciaen el turnoverdeATP en xantanode l0,89/340,32.
Portanto, el modelopropuestoporPonsy col. (1989)sepuedeescribir,adaptándoloa]
métodoutilizado en estaMemoria:
209
Íklodelo Cinético A’Íetabólk~
Evoluciónde biomasa:
Evoluciónde xantano:
Evoluciónde glucosa:
Evoluciónde oxígeno:dC0
,
dt= kLaV(C * —Co:) — ros
Asumiendoestadopseudoestacionarioparala concentraciónde oxígenodisuelto:
dC<
)
dt
Las velocidadesde reacciónplanteadaspara las reaccionesdel esquema,en el que
intervienenla biomasa,el sustratocarbonado,oxígenoy dióxido decarbono son:
Parala biomasa:
r x = Ch qr.
Parala glucosa:
Kg = C8 qr
(1 + 4. Y? -
(3,58 + 4~ Y’r - ArZ’)
Y’x - MP(5,49+ 20,77 Y’~• - p + (—•—---—-)
________________ 3(3,58+4Y’r-ATP)
Para el oxígeno:
Para el dióxido de carbono:
r o~ = 0,5 Ch qr
[5.281r CO: = 0,3 r’x + Ch~/2
dCb—=/;dt
dCx=
[5.20]
[5.21]
dCg
¿It[5.22]
[5.231
[5.24]
[5.25]
[5.26]
[5.27]
21 Oa
ModeloCinético Metabólico
Las ecuacionescinéticasdel modelo las planteande la siguienteforma:
l—Ct [5.29]rh=/JMCh.( )
Ch,.q’r = qrM Co: (Kc Coz) [5.301
Y’r - = l,2~ Coz~/(Kc — Coz) [5.31]
Ch~. =6,35ACb—Cho [5.32]
Ponsy col. (1989) sólo realizanajustede datosexperimentalesde la biomasaparala
cual empleanla ecuaciónlogística.Parael restode componentesrealizansólo una simulación.
Parala integraciónde las ecuacionesdiferencialesempleanel algoritmo de Runge—Kuttade
cuarto orden. Al comparar los resultadosobtenidosde la simulación del modelo con los
resultadosexperimentalesconfirmanla validezdel modelopropuesto.
Ponsy col. (1989)planteanel modelo queseha descritoparaun reactortipo columna
de burbujeo,porello, no esposiblela aplicacióndirectade estemodelo propuestoa los datos
experimentalesobtenidosen el presentetrabajo.unido a esto, tampocorealizabanun ajustede
los datosexperimentalesparaobtenerlos parámetrosdel modelo.Poresto,seha formuladoun
modelo cinéticometabólicoparala producciónde xantanoen un tanqueagitado,teniendoen
cuentaparaello algunasde las consideracionesplanteadasenel Modelo Metabólicopropuesto
porPonsy col. (1989).
21]
ModeloCinético Metabólico
5.1.-FORMuLACIÓN DEL MODELO
En estecaso, al igual que en el anterior, el modelo propuestodescribeel crecimiento
del microorganismomediantela ecuaciónlogística, como función de la concentraciónde
nitrógeno.Sin embargo,el modeloestructurala producciónde xantano,es decir el modelo es
metabólicamenteestructurado,puestiene en cuentael metabolismode la fuentede carbono
dentrode la célula.Se hantomadotodaslas relacionesestequiométricaspropuestaspor Ponsy
col. (1989)a excepciónde la planteadaparael xantano,puesel pesomolecularmedio del
precursorde xantanono es906,2 , comosuponenestosautores,sino queespróximoa 923 por
lo que la relación estequiométricapara la producciónde xantanoqueda conformea la
ecuación [5.33]:
549C6H¡206 + l~89ATP+3.58(NADPj)VADV~ 1.38NaO!!
±U6CoAS!!+a3o, -4Cnn H
49.%ÍO?suNaíJs+O6CO
2 [5.33]
±5.38í-j,O±1089(ADP+ Pi) +3.58(NADPH,H~;NADH,Ht) +0.6CoA
Las relacionesestequiométricaspara el catabolismototal de la glucosa,energía de
mantenimientoy fosforilaciónoxidativa,vienendadaspor las ecuaciones[5.5], [5.6] y [5.7],
propuestaspor Ponsy col. (1989).
Por tanto, las velocidadesde producciónde los componentes,suponiendoque toda la
sacarosa-sustratocarbonadoempleadoen estetrabajo- esasumidoen las ecuacionescomo
glucosa,son:
dC3 — 5,49 ri—r~ [5.34]
¿It
dC~ = ri [5.35]
dt
= —10,89ri+3re--r3 ±rs [5.36]¿It
dCCof — 3,58 ri + 12 r~ — r4 [5.37]
¿It
dC02 =—0,3r1 —0,5r4 +kLaV (CC0) [5.38]
¿It
212
Modelo Cinético ;Vletabólico
SegúnPonsy col (1989)la cinéticade la reaccióndadapor la ecuación[5.7] es:
k4Co:______ Cxr4=K4+ Co:)
[5.39]
Para la reacciónde la ecuación[5.33], la producciónde xantano,Ponsy col. (1989)
proponen:
= r4.[1±4 Y’rp
3,58+4Y,trp,p[5.40]
Suponiendoestadopseudoestacíonarioparalos cofactores:
dCcoj = O = 3,58 ri + 12 r~ —
[5.41]¿It
Sustituyendoen estaúltima ecuaciónlas ecuaciones[5.39]y [5.40]y despejandor2, se
obtiene:
!Á1~3~58C 1+4. Y’rp
3,58±4.YÁTrP)J
Portanto, lasvelocidadesde reacciónquedande la siguienteforma:
(c~rx=kx ¡ +Cxo ¡Y Yw~’ )
k4Co2ri =
K4 + Cm
1 k4~Co
,
r2 = —. _________
12 K4+Co,
CxJ’l— Cx
Y Cxo + Yxv CNO)
Cx j358+4JflTPP j
[5.43]
[5.44]
[5.451CxI’1YATPPjI ji
Los valoresde Y,~, y YATPP sehan fijadoen los propuestosporPonsy col. (1989):
Co[5.46]
[5.47]
[5.42)
Yrp W,2~
K4 + Co.
YATPP 34
213
Modelo Cinético Metabólico
Quedandoasíel modelocinéticometabólico(MCM), formadoporel siguientegrupo
de ecuacionesdiferenciales:
Parala biomasa:
dOy (Cv 6 Cx
¿It = kv.y0 + C,i — Cx +Yxw Cx) [5.48]
Parael azúcar:
dCs J 5,94 dO” 1 MCc, F( 1+4Yrp Ml___=180 — ____ . ___—-—. - Cx.tl—358d¿It 923,2 ¿It 12 K4±Co, L’K 3,58±4YITPP )jJ
1 ¿ICx
Yxs ¿It [5.49]
Parael producto:
k4 Co, ( 1±4Y1~
,
___r:923,2. K4±CO,K3, Cx [5.50]
¿It 58 + 4. YATPP
Parala evoluciónde oxígenodisuelto:
¿ICo, — 0,3 dC~ k4Co, Ck(C*C)’ dCx [5.51]
¿It 923,2 ¿It K4±Co Yox ¿It
El valor del coeficiente volumétrico de transferenciade oxigeno se ha calculado
empleandola mismacorrelaciónqueparael MNE, quevienedadopor la ecuación[4.23].
Por tanto, el Modelo Cinético Metabólico propuestotiene de siete parámetros,los
representativosde la biomasa: k~ y YxN -obtenidosde la mismaformaqueen el MINE- y los
parámetroscorrespondientesa la evoluciónde azúcar,xantanoy oxígenodisuelto: k4, 1<4, Y~<5,
Yox. En estecaso,la aplicacióndel MCM a los datosexperimentalesparala obtenciónde los
parámetrosserealizó de la siguienteforma:
21~
ModeloCinético Metabólico
• Primeroserealizó el cálculode los parámetrosrelacionadoscon el crecimiento:kx eYxrÑ.
Estosparámetrosse obtienenmedianteregresiónno lineal en simple respuestaaplicadaa la
ecuación [5.48] (estosajustesson,por tanto, los mismosque los realizadosen el capitulo
anteriordel MCNE, por lo queno se volveránaexponer).
• Luego se aplicóuna regresiónno lineal en múltiple-respuestaa las ecuaciones[5.49]a
[5.51],obteniendoasí los valoresde los parámetrosk4, K4, Yxs andYox. Debido a quelos
datos experimentalesde la frente carbonaday del xantanoeran 1 05 dos órdenesde
magnitudmayoresquela concentraciónde oxígenodisuelto,esnecesariopesarlos residuos
paraoptimizarel valorde los parámetros.Además,en la ecuación[4.23],correspondientea
la correlacióndel coeficientevolumétrico de oxigeno, es necesariosustituir la ecuación
correspondientede calibrado de la concentraciónde xantanoen ifinción de la viscosidad
paracadaexperimento.
215
Modelo CinéticoMetabólico
5.2.-AJUSTEDE LOS DATOS EXPERIMENTALES
Parala aplicacióndel modelocinéticometabólicoplanteadosehanrealizadolos ajustes
de los experimentosdel 1 al 7. Al efectuarel ajustede los datosexperimentalesobtenidos, se
observóqueel modeloeraincapazde ajustarlos datosde ciertosexperimentosdebidoa la falta
de convergenciadel algoritmo. En la Tabla 5.1 se muestranlos resultadosde los parámetros
fisicos y estadísticosde los experimentosdonde sepudoaplicarel MCM.
Todoslos ajustesrealizadoshanproporcionadonivelesde confianzasuperioresal 950~,
hay que apuntarque los valoresobtenidosparael parametroK4 sonmucho másaltosque la
concentraciónde oxígeno disuelto, por lo que las ecuaciones[5.39] y [5.46], puedenser
simplificadasa orden 1 de la siguientemanera:
k4Co•Cx~kCo Cx [5.52]
Kq±Co
Yrp=L2 Co, k’Co, [5.53]
K4±Co, -
Los datos experimentalesfueron nuevamenteajustados,teniendo en cuenta estas
modificaciones.Para diferenciar el modelo en el que r4 e son ecuacionesde orden 1
respectoal anteriorque aparecíancon cinéticastipo Monod sedenominóa estemodelo como
Modelo CinéticoMetabólicoSimplificado(MCMS).
En las Tablas5.2 a 5.8 serecogenlos valoresde los parámetrosfisicos y estadísticos
obtenidosde la aplicacióndel MCMS a los experimentosdel 1 al 7. Las Figuras 5.2 a 5.8
muestranlas reproduccionesdel modelocorrespondientesacadaexperimentoal realizardicho
ajuste.En estasfiguras, la líneacontinuarepresentala reproducciónobtenidade la aplicación
del modelomientrasquelos símbolosindican los puntosexperimentales.
En la Tabla5.2 semuestranlos parámetrosobtenidosporajustedel experimentono i,
realizadoa 250C y con 257 p.p.m. de amonio inicial, como puedeobservarse,todos los
parámetrosobtenidoscumplen las restriccionesestadísticasimpuestas,todos los parámetros
presentanintervalosde confianzaestrechos,presentandovalorestantode la t de Studentcomo
de la F de Fischerelevados.En cuantoa la reproducciónde Josdatosexperimentalesreflejada
en la Figura 5.2, se observaque paraeste experimentoel modelo predicede forma adecuada
216
ModeloCinéticoMetabólico
tanto la evoluciónde la concentraciónde xantanocomo la concentraciónde sacarosa.Parael
oxígeno,si bienno estanbueno,el valorteóricomejoranotablementela reproducciónobtenida
con el MCNE, comose puedecomprobaren la Figura4.2 del capítuloantenor.
Los parámetrosobtenidosdel ajustedel experimenton0 2, esdecir el realizadoen las
condicionesóptimasde producción:28 0C y 257 p.p.mde amonio(Santos,1.993),aparecenen
la Tabla5.3. Todos los parámetrosobtenidosrindenintervalosde confianzasuperioresal 95%,
si bien hay queapuntarqueel valor de t de Studentdel parámetroYox esrelativamentebajo.
El ajustede los datosexperimentalesobtenido paraeste experimentoes significativamente
mejorque el quese obtuvoparael mismo experimentoconel MCNE. Paraesteexperimento,
el MCMS muestrauna excelentereproducciónde la evolución de los tres componentes
(sacarosa,xantanoy oxigenodisuelto)tal como seobservaen la Figura5.3.
En la Tabla 5.4 se muestranlos parámetrosobtenidosde la aplicación de modelo
experimentorealizadoa 310C y con 257 p.p.m. de amonio inicial (experimenton0 3). Al
igual que en los dos experimentosanteriores,secumplenlas condicionesestadísticasparala
de Studenty la F de Fischer.Se obtieneunabuenareproducciónde los datosexperimentalesde
la evoluciónde oxígenodisuelto,de la concentracióndexantanoy de sacarosa,tal comopuede
observarseen la Figura5,4.
En cuantoal experimenton0 4, realizadoa 34 0C y con 257 p.p.m.de amonioinicial,
se observa que el valor del parámetrok’ (Tabla 5.5) es significativamenteelevado en
comparacióncon el que presentaen los experimentosanteriores,mostrandoun valor de t de
Studentmucho menorque el obtenido en los ajustesde los experimentosrealizadosa otras
temperaturas.La reproducciónobtenida(Figura 5.5) no estan buenacomo en los dos casos
anteriores,perosuperacon muchoa la obtenidaconel MCNE.
En la Tabla 5.6 aparecenlos valoresde todos los parámetrosobtenidosal aplicarel
MCMS al experimenton~ 5, realizado a 28 0C con 65 p.p.m.de amonio.En dichatabla
puedeapreciarsequese cumplenlas restriccionesestadísticas,siendoel valor másbajode t de
Studentel obtenidoparael parámetroYox. En cuantoa la reproducciónde la evoluciónde los
los componentescon estemodelo, seobtieneuna evoluciónde la concentraciónde sacarosa
aceptablemientras que la evolución de la concentraciónde xantano y oxígeno disuelto
difieren bastantede las obtenidasexperimentalmente,tal comomuestrala Figura5.6.
217
Modelo CinéticoMetabólico
Parael experimenton0 6, realizadoa28 0C y con una concentraciónde amonio inicial
de 130 p.p.m, vuelve a observarseque todos los parámetrossuperanlos valores teóricos
tabuladosde t de Stt¡denty F de Fiseher.En la Figura 5,7 aparecenlas reproduccionesde las
evolucionesde los diferentescomponentesobtenidasal aplicarel MCMS. en estafigurapuede
observarseun buen ajuste a los datos experimentalestanto de la concentraciónfuente
carbonada,como de Jaconcentraciónde xantanoy del oxígenodisuelto.
La Tabla 5.8 muestra los parámetros obtenidos del ajuste al modelo para el
experimentorealizadoa 28 0C con 514 p.p.m. de amonio (experimenton0 7). Hay que
destacarel valor significativamentealto del parámetrok’, el cual es aproximadamente2
órdenesde magnitud superior al obtenido en el resto de experimentos.Además, el valor
obtenido para la t de Studentno superael valor tabuladocon un 95% de confianza. Otro
parámetroen el que se obtieneun valor bajo de la t de Studentes k, este parámetroentra
dentrodel limite teóricoperoel valor es bajoen comparacióncon los experimentosanteriores.
En cuanto a la reproducciónde los datos experimentales,en la Figura 5.8 se observauna
reproducción aceptable para la evolución de sacarosa, no siendo tan buena para la
concentraciónde xantanoni parael oxígenodisuelto.
2/8
ModeloCinéticoMetabólico
Tabla5.1. -Valoresfisicos y estadísticosde los parámetrosobtenidosmedianteel ajustede losdatosde los experimentos2,3, y 4 al MCM.
TPa,.
Valorn Parámetros t Studeu,t F Fiseber
5RC
Méx. ópt. Mio. Obtenido Tabulado Obtenido Tabulado
28
y 0,552 0.535 0.5 19 68,77
2,080 66984 317 2.0610’Nt 6.229 6,073 5,918 80.26
y 3.670 3.183 2.696 13,07
199 2778 2.48 2,09
It 5.97.10’ 5,95 [0< 5.94102 805,6
0.2 It) 0,177 0,145 0,87
Yox [54,8 117,3 79.82 6,26
31
kx 0,472 0,446 0.421 36,71
2,145 4(42 3.74 [.4110’St 4,652 4,325 3.998 27,29
y 6,912 6,030 5,148 13.67
It 6.66.10< 6,66.102 6.66.10.2 I.38.I0~
¾, 0,168 0.155 0.143 24,80
37.55 33.55 29,55 [6,77
1>. 0,439 0,423 0,408 57,76
2,262 4263 4,26 0.80:101YXÑ 5,021 4.732 4,443 34,53
y 0.808 0.759 0,711 31,45
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Reproducciónde los experimentalespor ajuste por ajusteexperimenton0 2, realizadoconXanthotnonascampestrisade 280 C, medioA (257 p.p.ni.de amonio),programaciónder.p.m. inicial).
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1,0 ~(2
0,5
0,0
al MCMS della temperaturaagitación (210
2,5
2,0
1,5 Z2
-yo“os
0,5
0,0
al MCMS della temperaturaagitación (210
t (h)
t (Fi)
227
ModeloCinéticoMetabólico
404
35,
30—
(3,
--Ay->
25—
20-
15—
lo—
5—
oo 10 20 30
2.5
2,0
3-1,0e->
0,5
0,040
t (Fi)
Figura 5.4.- Reproduccióndeexperimentono 3,de 310C, medioAr.p.m. inicial).
40-
35
30
5cf
25
20
‘5
lo-
5
o
los experimentalespor ajuste por ajusteal MCMS delrealizadocon Xanthomonascampestrisa la temperatura(257 p.p.m.de amonio),programaciónde agitación (210
2,5
2,0
1,5o
1,0
0,5
Figura 5.5-- Reproducciónde los experimentalespor ajustepor ajuste al MCMS delexperimenton0 4, realizadoconXanthomonascarnpestr¡sa la temperaturade340 C, medioA (257 p.p.m.deamonio),programaciónde agitación (210r.p.m. inicial).
—— .—— . a
a. AC~,a
a
•• 4
t (h)
228
Modelo CinéticoMetabólico
cf
Figura 5.6.-
cf
Reproducciónde los experimentalespor ajustepor ajusteexperimenton0 5, realizadoconXanthornonascampestrisade 280 C, medio A (65 p.p.m.de amonio),programaciónder.p.m. inicial).
25
20
t5~’
o
05
al MCMS della temperatura
agitación (210
2,5
2,0
15’b
1,0
0,5
0,0
Figura 5.7.- Reproducciónde los experimentalespor ajustepor ajusteal MCMS delexperimento~0 6, realizadoconXanthomonascampestrisa la temperaturade 280 C, medio A (130 p.p.m. de amonio),programaciónde agitación(210 r.p.m. inicial).
o 3J(h)
t (h)
229
ModeloCinéticoMetabólico
u
<Ay-,
Figura 5.8.- Reproducciónde los experimentalespor ajuste por ajusteexperimenton0 7, realizadocon Xantho,nonascampestrisade 280 C, medio A (475 p.p.m.deamonio),programaciónder.p.m. inicial).
al MCMS della temperatura
agitación (210
2.5
zo
L5
oEo
1,0 ~
230
ModeloCinéticoMetabólico
5.3. DISCUSIÓN
5.3.1.- Variacióndel Valor de los Parámetroscon las Variables
5.3.1.1.- Influencia de la Temperatura
En la Figura5.9 semuestranlas tendenciasde los parámetrosdel modelo(MCMS) con
la temperatura.No sehanconsideradolos parámetroscorrespondientesal crecimientodebidoa
quela biomasaseha consideradosin estructuracióny, portanto, los resultadossonlos mismos
queenel MCNE. vistosenel capítuloanterior.
En cuantoa los parámetroscorrespondientesa la evolución de las concentracionesde
sacarosa,xantanoy de oxigeno disuelto obtenidos del ajuste de los datos a diferentes
temperaturas,la tendenciapresentadapor los parámetrosYox y k esmuy similar, ambos
parámetrospresentanun máximo, en tomoa 28 oc paraVox y a 3 ¡ o c parak. Los otros dos
parámetrosdel modelo -Y=~sy k-’ presentan una tendencialineal con la temperatura.El
parámetrorelativo a la velocidadde desaparicióndel azúcar,Y~<s , decrece, mientrasque k,
parámetrorelacionadocon la velocidadde aparicióndel producto,aumentacon el incremento
de dichavariable.
De acuerdo con estas tendencias, los cuatro experimentoshan sido ajustados
conjuntamenteal MCMS, teniendo en cuenta la influencia de los parámetros con la
temperatura,de la mismaformaque serealizóparalos parámetrosdel modeloMCNE, visto en
el capítuloantenor.
Los parámetrosk y Yox puedenponersecomo fUnción de la temperaturade acuerdo
con la expresiónde Ratkowskyy col. (1983),dadaen las ecuaciones[5.54]y [5.55],mientras
queYx~ y k’ han sido ajustadosa expresioneslineales(ecuaciones[5.56]y [5.57]).
El ajustede todos los experimentosal MCMS (T) (Modelo Cinético Metabólico
Simplificado en fhnción de T) fUe realizado en múltiple-respuesta,considerandocomo
respuestas:sacarosa, xantano y oxigeno disuelto. Las tendenciaspresentadaspor estos
parámetros,asícomoel ajustea lasecuaciones[5.54]a [5.57]semuestranen la Figura5.9:
231
ModeloCinéticoMetabólico
k(T) / O - (T - T,~o-,.> -[1- expí’C: - IT - Tmax))Jf [5.54]
y0»(T)z{ C’1 (7’ -T’,~,~) fi -exp(C’-, -<‘7’- [5.55]
Y~s = a±/3-7’ [5.561
kYT)=a÷/3-T [5.57]
Este modeloMCMS(T), tienedoceparámetros:C1, Tmin, C2, Tn,a,c,Cí, T’min, C2, Ti,,a<,,
a, fl, a’ y fl’, tal como seindica en las ecuacionesanteriores.En la Tabla 5.9 aparecenlos
valoresde los parámetrosy sus estadísticas,obtenidosdel ajustede los cuatro experimentos
realizadosa diferentestemperaturas,dondelos parámetrosrelativosa la frentecarbonada,al
xantanoy al oxigenodisuelto han sido puestos en función de la temperaturade la forma
indicada.Comoseobserva,paratodos los parámetrosse cumplenlas restriccionesestadísticas
superandosiempreel valor teóricode t de Studenty de F deFischer.
Las tendenciasobtenidas para estos cuatro parámetroscuando son ajustados
conjuntamente,se mostraronen la Figura 59, donde el resultadode esteajuste erael
representadopor la línea continua. Este ajustees el resultadode sustituir los valoresde
temperaturaen las ecuaciones[5.54] a [5.57] con los valoresde los parámetrosobtenidos,
de la siguienteforma:
¡«7’,> (0,94-(7’ -19,45)-fi- exp(1,399-(7’ -34,24 [5.58]
k’(T) —2,913+ 2,048 7’ [5.59]
( 0,571 - (T -24,35)11- exp(—0,20S(T~ 37,16))]/2 [5.60]
Todos los datos experimentalesobtenidos en los experimentosllevados a cabo a
diferentestemperaturashan sido reproducidosmediantesustituciónen las ecuaciones[5.58]a
[5.61] dentro del modelo cinético. Las Figuras 5.10 a 5.13 muestran una excelente
reproducciónde los resultadosexperimentalescon el MCMS(T).
232
Mode/oCinéticoMetabólico
120
100-
~,, 80~ 60’~ 40-
20-
o20 25 30 35
T<0C)0,25
0,2 — —— ,% —— -—
045 1~>
0,1
0,05
o20 25 30 35
Tc7’C)
Figura5.9- Evolución de los parámetrosdel MCMS con la temperatura.La líneadiscontinuaindica la tendenciade los parámetrosobtenidosexperimentoaexperimento,la línea continua representael ajustea las ecuaciones[5.54] a[5.58].
140120-100780-6040-207
o20
180160140120
x 100o
>- 80604020
o20
Sr—
25 30 35
T(0C)
GOx
25 30 35
T (OC)
233
‘0 4-
‘-O
4-
La Os
—a
U.>
La o-.>
o [4 [4 La
[4 4-
b 00
o -:4
La U—>
‘0 o o-.>
o [4 U.> La
H U.> 4-
[4 [4U.
>
‘0 U-> y-.>
o O ‘-O
U.>
—4
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E o
la -w la’
E e, o
o-.>
[4 0
4 4-
~4
2- [4O
La ‘00 0
0-~
[4 Os
[4
‘ ‘-0
—
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0 $.
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0 00
La
L L La Os
4 4- U.>
—-
o
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Os
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o
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•n
o 2;
OO
‘oO
la‘e
-i la—
O
aC
L—
O-t O
O-
‘e o O-
la O o a ci, o O
-o ‘e O
-la O U, o -e o O -j <o la CD U, O
-o ‘e
ModeloCinéticoMetabólico
2,5
2,0
15—~
o1,0:
0,5
0,0
Figura 5.1O-
(-5-4$9(y
Reproducción de los datosmedioA (con 257 p.p.m.der.p.m.)al MCMS (T).
del experimenton0 1 realizadoa 250 C,amonio)y programaciónde agitación(210
2,5
2,0
1,5?
ib-
1,0 ~
0,5
0,0
Figura 5.11.- Reproducción de los datos del experimenton0 2 realizadoa 280 C,medio A (con 257 p.p.m. deamonio)y programaciónde agitación(210r.p.m.)al MCMS (T).
40
35
30
20-
15•
un
25
(-5--4
cf
O 10 20 30 40 50 60
t (h)
t(h)
235
ModeloCinéticoMetabólico
40
35
30
(-5-
$9cf
25
20
I5
I0~
5
o
Figura 5.12.-
40
35
30
$9zU
25
20
[5
lo
5
o
Reproducciónde los datos del experimenton0 3 realizadoa3¶O c, medio A
(con 257 pp.m. de amonio) y programaciónde agitación(210 r.p.m.) alMCMS (T).
2,5
2,0
l,5~
ib-
3-
1,0
0,5
Figura 5.13.-Reproducción de los datos del experimento ~0 4 realizado a 340 C, medioA (con 257 p.p.m.deamonio)y programaciónde agitación(210r.p.m.) alMCMS (T).
2,0
1.5-2
1~0
(-y
0,5
0,04020
t (h)
t (h)
236
ModeloCinéticoMetabólico
5.3.1.2.- Influencia de la Concentración de Amonio
Comoya sevió anteriormente,el ajusteobtenidocon el MCMS no permitióunabuena
reproducción de los datos experimentalesde los experimentosrealizadoscon 65 p.p.m.
(experimenton0 6) y con 514p.p.m.(experimenton0 7). Parael ajustedel experimentocon 514
p.p.m.de amonioel valor delparámetrok’ eramuy elevado, y el valor de la t de Studentpara
el citadoparámetroera inferior al valor tabulado.Parael experimentorealizadocon 65 p.p.m.,
aunque se cumplían las condicionesestadísticas,se observóque la reproducciónde la
evoluciónde la concentraciónxantanoy dela concentracióndel oxigenono erabuena.
Los experimentosllevados a cabo con 130 p.p.m. y 257 p.p.m. de amonio rendían
buenosresultados,tantodesdeun punto de vista estadístico,como en la reproducciónde los
resultadosexperimentales.
En la Figura 5.14 se muestrala evolución de los parámetrosdel MCMS con la
concentracióninicial de amonio empleada.Aunqueparael casode los parámetrosk’ e Yxs
(Figura 5. 14-by 5.14-d,respectivamente)parecenmostrarunatendenciaquepodríaajustarse
a una fUnciónmatemáticatipo Ratkowsky, no ocurrelo mismo paralos parámetrosk e
(Figura 5.14a y 5.14c, respectivamente).Por ello, no resulta planteable ningún modelo
(MCM) en fUnciónde lavariableconcentracióninicial de amonio.
237
Modelo CinéticoMetabólico
5)00 —
-1)00 -
x00 -
~oo-
1000 -
O—
600-
MX) —
cÚ —
300 —
20<1 -
1(X) —
1)
‘—n’ í y ¡
0 lOO 200 300 400 500Amonio (ppm)
0 [00 200 300 400 500Amonio (ppm)
so
60-
-40-
20 —
0—
020 —4
tOi5
1)10 —
600o
O -:
0 100 200 300 400 500 600Amonio (ppm)
1 ¡ i 1 i ¡
lOO 200 300 400 500 600Amonio (ppm)
Figura 5.14.- Evoluciónde los parámetrosdel MCMS con la concentraciónde amonioinicia].La línea discontinua indica la tendencia de los parámetros obtenidosexperimentoa experimento.
238
(a)
— — — — ~ —
1,1•1’1’1•
(b)
,,
A’~1~¿’0-1-
— —1- -H
1
(d) -
•1~
3$ ~It
ModeloCinéticoMetabólico
5.3.2.- Simulación con el Modelo Cinético Metabólico
Ya fue comentadoen el capítulo anterior la gran ventajapredictiva de realizar
simulaciones,unavezcomprobadoqueel modelocinéticoobjetode estudioesválido.
En este capítulose havisto que el MCM hapodido serobtenidoen función de una
de las variablesestudiadas,concretamente,de la temperatura.En cambiono sehaplanteado
un modeloquetengaen cuentala variaciónde la concentracióninicial de amonio, lo cuales
lógico si se tieneen cuentaquela concentraciónde amonio sólo influye en el crecimiento-
biomasa-y, en el modelo planteadoen estecapitulo, se ha consideradoeste componente
como no estructurado,esto es, expresadode la misma forma que en el MNE y, por
consiguiente,mediante la ecuaciónlogística.
Las simulacionesrealizadasen este capítulo son las mismas que en el capítulo
anterior.Se hanrealizadoaquellascon las que,en principio, cabríaesperarmayor influencia
en la evolución de componentes,comobiomasainicial, concentraciónde azúcarinicial y
concentraciónde oxigenodisuelto.
La concentración de biomasa inicial influye en la evolución de componentesdel
sistema.Estaconcentraciónde biomasainicial influye en primerainstanciaen la evolución
de biomasatal como contemplala ecuación[5.48] correspondientea la ecuaciónlogística
para el crecimiento! Por consiguiente,influirá en la evolución de la sacarosa(ecuación
[5.49]), de laconcentraciónde xantano(ecuación[5.50]) y del oxígenodisueltoen el medio
(ecuación[5.51]).
En cuanto al cambio de alguna condición que afecte a la evolución de oxígeno
disuelto, en estemodelo se verá la influencia no sólo en la evolución de este componente
sino en la velocidadde producciónde xantano,tal como se puedeapreciaren la ecuación
[5.50] y en la evoluciónde la concentraciónde azúcar,como se indica en la expresióndada
porla ecuación[5.49].
Finalmente,la influenciade la concentracióninicial de sacarosaseverá reflejada
en la propiaevolucióndel azúcar,tal como indica la expresióndadapor la ecuación[5.49].
239
ModeloCinéticoMe/abdico
Por el contrario, en la evolución del productono debede influir, pues la ecuaciónque
expresala citadaevolución(ecuación[5.50]), no presentaen suexpresiónla concentración
del azúcar.
En la
simulaciones
simulaciones
influenciaen
Tabla 5.10 semuestranlas condicionesde operaciónempleadasen diferentes
que han sido realizadascon el MCM(T) en operaciónen discontinuo. Las
se han realizado cambiando el valor inicial de diversos factores cuya
elprocesoesde sobraconocida(Santos,1993).
Los parámetrosdel modelo fueron obtenidosen función de la temperaturamediante
expresionesdadasen !asecuaciones[5.58] y [5.61], puesla formamásadecuadade realizar
simulacioneses teniendo en cuenta la influencia de las variables en los parámetrosdel
modelo cinético planteado. Esto ha sido posible para los experimentosrealizadosa
diferentestemperaturaspero no para la variable concentraciónde amonio como ya seha
comentado.
Tabla 5.10 .- Simulacionesrealizadascon el MCMT (T) en operación
Simulación Valores
Influencia de la biomasa inicial
Influencia del azúcar inicial
Influencia del porcentaje deOxígeno Disuelto
Influencia de la agitación
Cxo = 0,03 gILCxo 0,07g/L
= 0,50 g/LCxo = 1,00 gIL
Cso IOg/lCso= 20 gIl
40 gIlCsoSOg/l
C02= 10%= 20%
Agitación constantePerfil deagitación
240
ModeloCinéticoMetabólico
5.3.2.1.- Influencia de la Concentración Inicial de Biomasa
La influencia de la biomasainicial en el crecimiento,a lo largo del tiempo de
fermentación,se muestraen la Figura 5.15. Como puedeobservarse,cuantomayor es la
concentracióninicial, mayor es la concentraciónmáxima de biomasaal fmal de la
fermentación.
Encuantoa la influenciasobre la velocidadde produccióndexantanoy consumo
deazúcarse puedeobservaren la Figura 5.16, queel modelo prediceun máximo parala
producciónde xantano.Es decir, de las cuatroconcentracionesinicialesde biomasainicial
utilizadasen la simulación,el modelo prediceun máximo de producción de xantano con la
concentracióninicial de 0,07 gIL. En cuantoa la evolucióndel azúcar,como es lógico, la
tendenciaguardarelaciónconla concentraciónde xantano,estoes, en aquelloscasosen los
queel modelopredicemásxantano,tambiénpredicemayorconsumode la fuentecarbonada
y viceversa.
En la Figura 5.17 se observa la significativa mejoradel MCMS(T) en cuantoa la
simulaciónde la evoluciónde la concentraciónde oxígenodisuelto respectoa lo obtenido
con el MCNE. En la citadaFiguraseobservaque el valor de] coeficientede transferencia
de oxígeno(kLav), esmásbajo cuantomayores la concentraciónde xantanoobtenido.La
bajada de oxígeno disuelto también es mayor cuanto mayor es la producción del
polisacárido.
241
ModeloCinéticoMetabólico
4u
Figura 5.15.-
(3-
acf
SimulaciónMCMET con diferentesconcentracionesinicialesdebiomasa, influencia en laevoluciónde biomasa.
60
Figura 5.16.- SimulaciónMCMI con diferentesconcentracionesinicialesde biomasa,influenciaen la evoluciónde laconcentraciónde xantanoy de sacarosa.
0.30
025
020
0,1 5
j
0.10
0.05
0,00
t <h)
30
t (Fi)
242
ModeloCinéticoMetabólico
>1
(-3
o
25
20
15-y6(4,1
lo
5
o
Figura 5.17.- SimulaciónMCMT con diferentesconcentracionesiniciales de biomasa,influenciaenla evolucióndel oxígenodisueltoy en la transferenciade oxígenokLaV.
243
2,5
2,0
0,5
0 20 40 60
t (h)
ModeloCinéticoMetabólico
5.3.2.2.-Influenciade la ConcentraciónInicial deAzúcar
Se han realizadosimulacionesde cuatrooperacionescon concentracionesiniciales
diferentesde sacarosa,tal como se ka mostradoen la Tabla5.10.
En cuantoala influenciaenel crecimiento,la Figura5.18 muestraclaramentequeel
modelo predice que la concentracióninicial de sacarosano influye en la velocidad del
crecimiento, independientementede la concentracióninicial de la que se parta, ni la
concentraciónde biomasani el consumode la fUentenitrogenada,seven afectados.
En la Figura5.19 puedeversecomo influyen las diferentesconcentracionesiniciales
de azúcarsobre la velocidadde producciónde xantanoduranteel proceso.El modelo es
incapazde predecirla influenciadel azúcaren laevolucióndel producto,ya que la cantidad
de xantanoobtenidaessiempreigual, independientementede la concentraciónde azúcarde
la queseparta.
La simulaciónparaponerde manifiesto la influenciade la concentracióninicial de
azúcaren la evolucióndeoxígenodisueltoy el valor de kLav apareceen laFigura5.20. En
ella seobservaque el MCMT no es capazde predecircambiosen la evoluciónde dichos
1 -I~ 1componemesal cambiarestavariable,lo cual es lógico, debido a que¡a concenLraclonue ¡
xantano,directamenterelacionadacon la viscosidad,no seve influida por lo queel valor de
kLaV tampocoseveráafectado,ni portanto la concentraciónde oxígenodisuelto.
244
Modelo CinéticoMetabólico
cf
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
0,3
0,2
cf0,I
0,0loo
Figura5.18.- SimulaciónMCNE condiferentesconcentracionesinicialesdesacarosa,influenciaen laevoluciónde la biomasa
(-y-
(-y.>
t (Ii)
Figura 5.19.- SimulaciónMCMI condiferentesconcentracionesinicialesdesacarosa,influenciaen la evoluciónde sacarosay xantano.
t (h)
0 10 20 30 40 50 60 70
245
A-/adelaCinéticoMetabólica
2,5
2.0
¡-5
-t
O
(-3
¡,0
0,5
0,0
Figura 5.20.- SimulaciónMCMT condiferentesconcentracionesinicialesde sacarosa,influenciaen la evolución de la concentraciónde oxígenodisuelto y elvalor de kíav.
25
20
I5
I0-i
5
o‘0
t (h>
246
ModeloCinéticoMetabólico
5.3.2.3.- Influencia de la Agitación y del porcentaje de Oxígeno Disuelto
En la Figura 5.21 se ofrece la influencia de la agitación. Se han realizado
simulacionescon una agitaciónconstanteen todo el procesoy con un perfil de agitacion.
Puedeapreciarseque al realizar la simulacióncon un perfil de agitación,seobservauna
mayor velocidadde producciónde xantano.En cuantoa la evoluciónde la concentración
de sacarosa,evidentemente,cuanto mayor es la velocidadde producciónde xantano,se
predice un mayor consumo de la frente carbonada.La evolución de generaciónde la
biomasano se ve afectadaporel tipo de agitación.
En la Figura 5.22 aparecen las simulaciones realizadas con diferentes
concentracionesde oxígenodisuelto,con 10 y 20%del valor de saturación.Cuantomayor
es la concentraciónde oxígenodisuelto, el modelo predice una mayor concentraciónde
xantano,y por tanto un mayor consumode sacarosa.Al igual que en el caso anterior, la
evolucióndc la concentraciónde biomasano seve afectadapor laconcentraciónde oxígeno
disuelto.2,0
1,5
Z 10u4su
0,5
0,0
45
40
35
30
25~
u
‘5
lo
5
o70
t (h)
Figura 5.21.- SimulaciónMCMST convaloresde kLav, influencia en la evoluciónde labiomasa, xantano y evoluciónde azúcar.
247
ModeloCinéticoMetabólico
2- 45
40
1,5-
30
25~~ tO (-5-
202
(3<
0,5 10
5
0,0 0
Figura 5.22- Simulación MCMST con diferentesconcentracionesde oxígenodisuelto, influenciaen la evolución de biomasa,xantanoy sacarosa
t (h)
248
Modelo CinéticoMetabólico
5.3.3.-Validez del Modelo Metabólico
A lo largo de esteapartadosehanido exponiendolos diferentesresultadosobtenidos
con el MCMT propuesto,tanto los obtenidosen ajustesa datosexperimentalescomo en las
distintassimulacionesrealizadas.
Se han obtenidobuenosresultadosal aplicar el MCMT a los diferentesexperimentos
realizadosen este trabajo, describiendoadecuadamentelas evolucionesexperimentalesde
xantano,sacarosay oxígenodisuelto.Entreestosresultadosno sehanpresentadolos resultados
correspondientesa la evoluciónde biomasay concentraciónde amonio puesson los mismos
queen el casodel modeloanterior MCNE.
Se ha conseguidoplantearel modelo cinéticometabólicoen función a una de las dos
variablesestudiadas,concretamente,de la temperatura(T), de acuerdoa la tendenciaque
presentabanlos parámetrosobtenidosal realizarlos ajustesde los experimentosrealizadosa
diferentestemperaturascon el MCMTS. Se ha realizadola reproducciónde los datos
experimentalescon el MCMTS (1), consiguiéndoseun mejor resultado,en cuanto a la
descripciónde la evoluciónde los componentes,quelos obtenidospor ajustecon el MCNE
No fue posible obteneruna relación de los parámetroscinéticos calculadospara
experimentosrealizadoscon distintasconcentracionesde amonio,debidoaque los parámetros
obtenidosno presentabanuna tendencialógica respectode la concentracióninicial de dicho
sustratonitrogenado.
Las simulaciones,pues, fueron realizadastomandolos parámetrosen función de la
temperatura.Al compararlos resultadosobtenidos de las diferentes simulacionescon los
resultadosexperimentales,seha podidollegara lassiguientesconclusiones,en cuantoa lo que
el Modelo CinéticoMetabólicoescapazdepredecir:
• El modelo cinético metabólico es incapaz de predecirpor medio de simulacionesla
influenciade la concentracióninicial de azúcar en laevoluciónde la biomasa.Tampoco
predice ningunainfluencia de este componenteen la evoluciónde la concentraciónde
xantano. Experimentalmenteesto no es cierto, pues la concentracióndel sustrato
carbonadotieneinfluenciaen la concentracióndel polisacárido(Santos1993).
249
ModeloCinéticoMetabólico
• El modelo predice un máximo en la producción de xantano cuando se realizan
simulacionescon diferentesconcentracionesiniciales de biomasa(Figura 5.16), si bien
estoúltimo no fue observadoexperimentalmente(Santos,1993).
• El MCMT es capazde predecirla influenciadel oxígenoen la velocidadde producción
de xantanopero no en la evolución de la concentraciónde biomasa.Los resultados
obtenidosen los ajustesa datosexperimentalessobrela evolución de estecomponente
han permitidoobservarla validezdel MCMT parala reproducciónde la concentración
del oxígeno, mejorandosignificativamentelos resultadosde la evolución de oxigeno
obtenidosporel MCNE.
Por todo esto, el Modelo Cinético Metabólico permite una buenareproducciónde
datos experimentalesde la concentraciónde xantano,sacarosay oxigeno disuelto. Este
último componenteno pudoserreproducidode formaadecuadapor el MCNE.
Porotro lado, en lo que respectaa la evoluciónde biomasao partede crecimiento
del modelo,deberíarealizarseunamejoraparapoderexplicarla influenciadel oxigenoen el
crecimiento,pues desdeun punto de vista fisiológico no tiene sentido que una bacteria
aerobiaestricta,comoXanthomonascampestris, no se veainfluida por la concentraciónde
oxigenodisuelto en el medio. Se planteaahorala necesidadde estructurarla biomasapara
tratar, además,de predecirla influenciade la otra variable estudiada,-la concentraciónde
amonio-, que influirá, como es lógico en la parte correspondienteal crecimiento del
microorganismo.
Con el MCMT se ha estructuradoel metabolismode la fuente carbonadaen la
producción, es ahora necesario estructurar la biomasateniendo en cuenta la frente
nitrogenada. En el próximo apartadose aplicaráun modelo cinéticomáscomplejo,estoes
un Modelo Cinético de Célula, el cual describirá el crecimiento de Kant/tomonos
campestristeniendo en cuenta el sustrato nitrogenado en la síntesis de componentes
intracelulares,tales como proteínasy ácidosnucleicos, por lo que la biomasaaparecera
estructuradaen varioscomponentes,lo cualcomplicael modelode formasignificativa.
250
r
6.- MODELO CINE liCO
DE CÉLULA
ModeloCinéticode Célula
6.- MODELO CINETICO DE CÉLULA
La principal característicade Los modeloscinéticosde célula es que describenla
biomasaconsiderándolaformadapor varias especies,teniendoen cuenta los componentes
intracelulares,como ácidosnucleicos,proteínas,lípidos e hidratosde carbono,proponiendo
parasudescripciónun esquemade reacciónsimplificado.
Todoslos modelosde estetipo existentesen la literaturaexplicansólo el crecimiento
de microorganismos,y están desarrolladospara aquellosmuy conocidoscomo la bacteria
Escherichia coli o la levadura Saccharomycescerevisiae. Los modelos de célula se
caracterizanpor tener un elevadonúmerode parámetros(entre 74 y 200), los cualesson
obtenidossiemprede datosde la bibliografia. En ningún trabajose presentan valoresde los
parámetros calculados mediante ajuste de datos experimentales. Esto es debido
fundamentalmentea dos razones:una con relación al elevadonúmero de parámetros que
presentanlos modeloscinéticosde célula, lo que implica una gran dificultad a la hora de
abordar matemáticamenteel problema; la otra, tiene relación con el análisis de los
componentesclave del sistema.El seguimientode componentesintracelularespresentauna
especialdificultadparaobtenerdatosfiablesquepuedanserutilizadosen el modelocinético.
251
ModeloCinético de C.’élula
En este capítulo se propone un modelo de célula para el crecimientode la bacteria
Xanthomonascampestris,estoes,un modelo quetieneen cuentala evoluciónde componentes
intracelularesque formanpartede la biomasadel microorganismo.Se tratapuesde un modelo
de crecimientoque constade un númerode parámetrosaproximadamentede 10, algo inferior
a los planteadoshastaahoraen la literatura(Esenery col., 1983)y que van aser determinados
por ajustede datosexperimentales.
En el modelocinéticode célulaqueseva a plantear,se estructuratanto e] metabolismo
del sustratocarbonadocomoel nitrogenadoen el crecimientodel microorganismo.Se incluirá
el metabolismodel sustratonitrogenadoen el interior de la célula,de unaformasimilar a Pons
y col. (1989), que plantearonel correspondienteal sustratocarbonadoen la producciónde
xantano.En la Figura 6.1 se muestraun esquemadel metabolismosimplificadode la glucosay
el amonio, particularizandoparaestabacteria,Xanthomonascampestris (Bradbury, 1984).
A la hora de plantear el modelo de célula para el crecimiento de Xanthomonas
campestris,hay unaseriede dificultadesa considerarpreviamente.
- Como ya se ha comentado,para obtenerdatos experimentalesque se puedan
emplearen el modelo, esnecesariodisponerde técnicasde análisis fiables para cl
análisisde componentesintracelulares.Esteesuno de los puntoscríticos, sobretodo
cuando el microorganismoa analizar tiene un tamañopequeñocomo una bacteria
(García-Ochoay col., 1998). No resulta sencillo encontrar la técnica de análisis
adecuadaque permita obteneruna buenaresolucióny fiabilidad de los datos de la
evoluciónde componentesintracelulares.Como ya se describióen el Capítulo2 de la
presente Memoria, existen diferentes técnicas para cuantificar los componentes
intracelulares,no obstante,no todasdanresultadosreproducibles,lo quehacenecesario
realizarun especialesfuerzoen la puestaa punto de técnicascon tal fin. Como ya se
indicó, la técnicade Citometriade Flujo fue elegidaparael análisisde la evoluciónde
los componentesintracelularesduranteel crecimientode Xanthomonascaínpestrisen
los experimentosllevadosa caboen estetrabajo.
252
ModeloCinéticode Célula
- Por otro lado, otro aspecto fUndamental es el conocimiento detallado del
metabolismodel microorganismocuyo modelo de célula va a serplanteado.En el
caso concreto del microorganismo empleado en este trabajo, existe suficiente
información en la literatura sobre las rutas catabólicasy anabólicasempleadaspor
Kanthomonascampestriscon diferentessustratoscarbonadosy nitrogenados,lo cual
facilita, desde este punto de vista, el planteamientodel modelo y permite así la
simplificación del citado metabolismomedianteel denominadolu¡nping, que consiste
en la agrupaciónde moléculascon fórmulasmolecularesmediasqueintervendrán,a su
vez, en reaccionesglobales,llegándosea formular un esquemasimplificado de
reacción.ATP
GLUCOSA Ribosa-6P . Fosforihosilpirofosfato
Glucosa-6P
Ac 6 Fosfoglucónico
irPiruvato
,4cet¡1coA
Oxa¡acetato
14TP
Isocilrato
¡IMP
4,ATP
NAD~
k AMINOÁCIDOS
¡
4,GTP
(iMP
4
,4TPNAD~
ir
OXIDACIÓN-REDUCCIÓN
dATP dGTP dCTP dUMP
dTTP
CO2 ATP
Figura 6.1.- Metabolismo simplificado de la glucosay el amonio en el crecimiento deXanthomonascampestris.
IMP
GMP
253
Modelo Cinético de (‘Ñu/a
6.1.-ETAPAS EN EL PLANTEAMIENTO DEL MODELO
Ya seha comentadola prácticainexistenciade precedentesen la literaturade estetipo
de modelos,especialmentede un modelo de estascaracterísticasparael sistemaobjeto de
estudio.Porello, se hacenecesariodesarrollaruna metodologíaparaabordarun problematan
complejocomoesel plantear,aplicary obtenerparámetrospor ajustede datosexperimentales
del modelo cinético de célula para el crecimientode un microorganismo,en estecasode la
bacteriaXanthomonascampestris.Es un problemarelativamenteparecidoal análisis de redes
complejasde reacciones.El análisis cinético de dichos sistemascomplejoses un problema
complicadoque precisamás infonnación que en el caso de reaccionessimples. La mayor
complejidadviene dadapor una estequiometríay una termodinámicamás complejasy un
número mayor de posibles modelos cinéticos -combinación de esquemasde reacción y
ecuacionescinéticasde cadareacción-entrelos quehay quediscriminar.
Se hanintentadovarios caminospararealizaresteanálisis cinético.Fundamentalmente
dos(García-Ochoay Romero,1993):
• Estudiarunaa unalasreaccionesdel esquema,parareducirla complejidaddel problemaa
unasumade reaccionessimples,si bienno siempreesposibleaplicaresteprocedimiento.
• Proponerun esquema,a menudo muy simplificado—molecular-,suponerunasecuaciones
cinéticas,calcular los parámetrosy compararcon los datos experimentalesobtenidos,
cambiandocualquierade las suposicioneshastaquela coincidenciaseaaceptable.
Si la reacciónesmuy compleja(craqueo,oxidaciónde hidrocarburos,por ejemplo),la
primerade las alternativasno esposible.La segundade las opcioneslleva aplantearesquemas
moleculares,muy simplificados, empleando lumping de las especiesquímicas, y con
ecuacionescinéticasparalas posiblesreacciones,aserposible,muy sencillas. Lasecuaciones
cinéticassuelensermodelospotencialesy enpocoscasoshiperbólicos.
Tras el cálculo de los parámetrosse puedeprocedera la discriminaciónentre las
distintosmodeloscinéticos.Los criteriosde discriminaciónutilizadosnormalmentehan sido
estadísticosy fisicos o impuestos(García-Ochoay col., 1 989ay 1 990a).
254
Modelo Cinéticode Célula
En consecuencialasetapasa seguiren la formulacióndel modelocinéticodecélulason
las siguientes:
• La primeraetapaen la formulacióndel Modelo Cinético de Célulaes la determinación o
elecciónde las especiesquimicasqueparticipan.
• Una vez conocidaslas especiesquimicas,se debeplantear un esquemasimplificado de
reacción.Parallegar a él, sedeberealizar un análisisexhaustivode los datosexperimentales.
Además,se aplicará lumping de las especiesquímicasque forman este sistema,llegando,
posteriormente,a la formulaciónde las ecuacionesde filiación (o relacionesestequiométricas
defmidas)de los diferentescompuestosqueintervienenen las reacciones.
• A continuación,se debe plantearun sistema de ecuacionesdiferenciales,que son las
velocidadesde producciónde los compuestosclave, las únicas independientesentresí. Los
métodosaplicadospara el cálculo de los parámetrosdel sistema citado se basan en una
regresiónde las ecuacionesa los datosexperimentales.
• Unavezcalculadoslos parámetros,esnecesariocomprobarla reproducibilidaddel modelo.
Para ello debe formularseel modelo cinético, mediantecombinación de las ecuaciones
cinéticasparadeterminarlas velocidadesde reacción. Si éste no es aceptable,es necesano
recurrir a otro modelo, siendo primordial el establecimientode criterios para realizar la
discriminaciónen estaetapa(García-Ochoay Romero,1993).
• Determinaciónde las EspeciesQuímicas
El estudioestequiométricodel sistemaobjeto de estudiopuedeserde notableayudaen
los primerospasosde la formulaciónde la redde reacción.La infonnaciónquesedebeobtener
es:
- El númerode componentesclave.
- El númerode relacionesindependientesentrelasespeciesquímicasqueparticipan.
- Cómopuedencalcularselos cambiosen la composicióndel sistemaconociendolos cambios
en la concentraciónde los componentesclave.
255
Modelo Cinético de Célula
Estainformaciónesmuy importanteparala determinacióndel métodoanalíticocapaz
de seguirlos cambiosen la composición.Además,puedeserde gran utilidad parala propuesta
del esquemade reaccióndebidoa queel númeromínimo de reaccionesquedebenincluirseen
el esquemadebe coincidir con el númerode variables independientesy con el númerode
componentesclave. En este caso,en principio, seha optadopor asumirla biomasapor tres
especiesintracelulares:proteínasRNA y DNA. Estahipótesisse contrastarámásadelante.
• Esquemade ReacciónSimplificado
La propuestadel esquemade reacciónes un aspectoque no está totalmente
sistematizado,cadaautortratade solventarsuproblemaparticularizandoparasucaso. El
problema puede ser muy diferente dependiendode la complejidaddel sistema objeto de
estudio,el cual cambiade acuerdoadiferentesaspectos:
- El primerpasoen el planteamientode cualquiermodeloesla propuestade un esquema
de reacción simplificado. Para ello, ante la falta de antecedentes,parecenecesario
realizarun riguroso análisis de los datos experimentales,químicos o bioquímicosdel
sistema.
- El númerode reaccionesy de especiesimplicadasvariansegúnlos casos,desdecuatro
a cinco especieshasta cientosde ellas, aunquecomo se verá más adelantees muy
convenienteque coincidan el número de componentesclave y el de reaccionesdel
esquema.
- En la mayoría de los casos, es casi imposible formular un esquemamolecular
simplificado debido a que el cálculo de cientosde parámetrospor regresiónde datos
experimentalesesprácticamenteimposible. En los casosmáscomplejos,hay también
posibilidadde formularcientosde posiblesmodeloscinéticos,entrelos quees necesano
discriminar. La mayoría de los trabajossobre casosprácticosde redesde reacciones
tratancon esquemassimplificados,con no másde seis reaccionesy, generalmente,el
mismonúmerode componentesclavey de relacionesindependientes.
256
ModeloCinéticode Célula
En resumen,el esquemade reaccióndebe ser relativamentesimple, pero capaz de
describirla realidaddel sistema,consiguiendounadescripcióncon un error del mismo orden
demagnitudqueel queseda en los datosexperimentales.
En muchosde los casos,el único camino para simplificar el problemaes empleando
lumping,quepermitereducirel númerode componentesa considerar.El lumpingasumequees
posible agruparcomponentesque participanen reaccionessimilares dentro del sistema. La
aplicaciónrigurosadel luniping solo se haestudiadoen sistemaslinealesmuy sencillos,en los
casosprácticosse ha aplicadode acuerdoal sentidocomún: por tamañode las moléculas,por
reactividad,etc.(García—Ochoay col., 1989a).
Propuestade las EcuacionesCinéticas
Al analizaruna red complejade reacciones,como debe serel esquemasimplificado
propuesto en el apartado anterior, las ecuacionesque ligan las magnitudes medibles
(velocidadesde produccióno concentraciones)con las magnitudesquehay quedeterminar,en
función de las condicionesde operación(velocidadesde reacción),son (García-Ochoay
Romero,1993):
NR
i”1
De cuya integración,según el método propuestopor Himeelblauy col. (1967), se
obtienela ecuación:
NRCj—C10 =Zvi~ j< r, .dtJj = ]...NC) [6.2]
o
Los métodosdiferencialesestánbasadosen la aplicaciónde la ecuación[6.1]a los NC
componentesclavedel sistema.Así, parael casode cinéticaspotenciales,la expresióndadapor
la ecuación[6.1]tomala forma:
dC NRR~= Á~=Zv,1.k,.fi(Cx);(C1=1...NC) [6.3]
257
ModeloCinético de Célula
El sistemade ecuacionesdiferencialesque se obtiene se puedeexpresaren forma
matricialcomo:
vr [6.4]
La aplicaciónde estemétodo lleva consigolas siguientesetapas:
• Cálculo de las velocidadesde producciónRj, para los NC componentesclave. Estecálculo
se realiza por ajustede los datos experimentalesa una función del tiempo conocida y
posteriormentese deriva analíticamente,obteniéndoselos valores discretos de las
velocidadescitadas si, como es habitual, se trata de datos integrales, composición‘,‘s
tiempo.
• Cálculode los parámetroscinéticosdel sistema;paraello, sepuedenrealizardiferentestipos
de regresiónlineal o no lineal y, ademássepuederealizar empleandosimple o múltiple
respuesta.
El método integral está basadoen la aplicación de la ecuación [6.2] a los NC
componentesclavedel sistema.En el casode una cinéticapotencial.dichaecuacióntoma la
forma:
VR
Cj—C~0 =Zvi1 k, ff(Ck).dt;(j=I...NC) [6.5]
El sistemade ecuacionesintegralesquese obtiene,se puedeexpresarmatricialmentede
la forma:
u~ r5 [6.6]
donder5 representael productode las integralespor las constantesde la ecuación[6.5].
Las etapasnecesanasparala aplicacióndel métodointegralson:
• Cálculo de las integralesde las velocidadesde reacciónr5, para las NR reaccionesque
tienenlugar. Este cálculo sepuederealizarmedianteel ajustede los datosa una función
conociday posteriorintegraciónanalítica,obteniéndoselos valoresdiscretosnecesariosde
dichasintegrales.
• Cálculo de los parámetroscinéticosdel modelo.Paraello, puedenseraplicadostanto la
regresiónlineal como la no lineal, comoen el casoanterior.258
ModeloCinéticode Célula
García-Ochoay col. (198% y 1 990b) pusieron de manifiesto la clara ventaja que
presentanlos métodosintegralesfrentea los diferenciales,cuandose dispone,como en este
caso,de datosde variaciónde la composicióncon cl tiempo, debido,ftmclamentatmente,a la
mayor precisiónde los métodosnuméricosde integraciónfrente a los de derivación. Así
mismo,propusieronel empleode un conjunto de ecuacionesen términosdevelocidadesde
reacción,en lugar de, lo habitualmenteempleado,en términosde velocidadesde producción
de los componentesclave(Garcia-Ochoay Romero,1993),de acuerdoa:
r y’. R [6.7]
Aunque la ecuaciónanterior solo es aplicable cuando y es cuadrada,es decir, el
númerode componentesclave es igual al númerode relacionesindependientes,el método
basadoen las velocidadesde reacciónpresentaventajas,tanto desdeun punto de vista de
cálculo -una matemáticamucho más sencilla, donde se individualiza el cálculo de cada
parámetro-,comodesdeel puntode vistaconceptual,de tratamiento,ya que,cuandoel número
de reaccionesdel esquemay el de componentesclaveseael mismo,al individualizarel cálculo
de cadaparámetro(k), sepuedetratar un sistemacomplejo de reaccionescomo la sumade
reaccionessimples. Para aplicar este método en su variedad integral, hay que realizar la
transformaciónde la ecuación[6.6]en la ecuación[6.8]:
r5 =v’ -C [6.8]
La aplicación de estaecuacióna los NC componentesclave del modelo cinético
conduceagruposde ecuacionesindependientesque permitencalcularlos parámetroscinéticos
del sistemapor aplicaciónde una regresiónlineal simple sin término independiente,de forma
individual (en el caso de modelospotenciales).La ecuación [6.8] desarrollada,se puede
escribircomo:
kfj1(CK ).dt=Zv •(Cj—C~0 >;(i= INI?) [6»]
259
ModeloCinético de Célula
• Formulación del Modelo Cinético
Una vez conocidaslas cinéticasaplicandométodoscomo el de las velocidadesde
reacción,esnecesariocalcularlos parámetrosrealizandoun ajusteen múltiple respuesta,es
decir no obteniendolos parámetrosde las reaccionesindividuales,sino de forma conjunta
mediantecálculopor regresiónde los datosexperimentales.
Unavez calculadoslos parámetroses necesariocomprobarla reproducibilidadque el
modelo cinético molecularproporcionade los resultadosexperimentales;si el ajusteno es
aceptable,sedeberecurrira otro modelo.
Los modelospropuestospuedenobtenersepor combinacionesentredistintascinéticas
dentrodel mismoesquemade reacciónpropuestoal formularel modelo.Muchasvecesocurre
que varios modelosson capacesde describirel sistema, de forma que, en este punto, es
primordialel establecimientode criteriosde discriminación.
• Criterios de Discriminación de Modelos
Como se ha indicado anteriormente,a veces se planteala necesidadde discriminar
entre un elevado número de modeloscinéticos, si bien muchosautoressolo presentanlos
resultadosobtenidoscon un solo modelo,sin llegar a describirpor qué lo han consideradoel
mejorfrente a otrosmodelos,en principio, igualmenteválidos.
Los criterios parala discriminaciónde modelosseagrupanbásicamenteen dos tipos
(García-Ochoay col., 1989y 1990):criteriosestadísticosy criteriostisicos.
- Los criterios estadísticosestán basadosen la comparación de los valores de la F de
Fischer y de la t de Student obtenidos del ajuste por regresión de los datos
experimentales,siendomejoraquelmodeloquepresenteestosvaloressignificativamente
másaltos. Así mismo,obtenerintervalosde confianzamuy estrechosindica un mejor
ajustedel modelo a los datosexperimentales,y por tanto un criterio de discriminación
entrevariosmodelos.Tambiénpuedencompararselos valoresde la sumade residuosal
cuadrado,considerandoigualesaquellosque esténpor debajo del errorexperimental.
260
ModeloCinéticode Célula
- Criterios Físicos (o impuestos),el primero es el obtenervalores positivos de los
parámetros(k y 10>0) en todos los ajustesrealizadoscon el modelo propuesto. El
segundocriterio eslaobservaciónde unavariaciónlógica de los parámetrosobtenidosen
los modelospropuestoscon las variablesque se estudian,por ejemplo temperaturao
variaciónen la composicióndel medio,enel casoqueseestáanalizando.
6.2.-MODELO CINÉTICO DE CRECIMIENTO DE Xanthomonoscampestris
En esteapanadoseva a realizarla aplicación de todo lo comentadoen el apartado
anterior, esdecir, se va a proceder a realizar el planteamiento de un modelo cinético de célula
parael crecimientode la bacteriaXanthomonascampestris.Para ello, se pondrá en práctica,
pasoa paso,la metodologíacomentadaenel apanadoanterior,en estecasoparaun sistema
biológicocomplejocomoesel crecimientode la bacteria.
6.2.1.-Determinaciónde las EspeciesQuimicasy Formulación del Esquemade Reacción
El primerpasoenel planteamientodecualquiermodeloesla propuestade un esquema
de reacción simplificado. Para ello, ante la ÑIta de antecedentes,parecenecesariorealizarun
rigurosoanálisisde los datosexperimentales,del crecimientodel microorganismo,obtenidos
en estetrabajo.
Se ha realizadoun seguimientode los componentesintracelularesde las células de
Xanthomonascampestrisa lo largo de todo el crecimiento del microorganismo. La técrnca
empleadaha sido la citomnetría de flujo. Con esta técnica se han obtenido resultados de
concentraciónde ácidosnucleicos(DNA y RNA), así como de proteínaintracelular (tanto
proteínasestructurales,como enzimas)porcélula.Comoya fue comentadoen el Capítulo 2 de
la presenteMemoria, los datosde intensidadmediade fluorescenciade cadacomponentepor
individuo, pueden ser convertidos en cantidad (g) de componentepor individuo, gracias al
calibrado obtenido, como indica la Figura 6.2. Los datos de contenido en g/célula, puedenser
puestosen unidadesde g/L (gramode componentepor litro de caldo),graciasa la aplicación
de la ecuaciones[2.111paraproteínasy [2.14]paraácidosnueleicos(DNA y RNA).
261
1VIodeloCinético de Célula
Ademásdel seguimientode los componentesintracelulares, se ha analizadootro
compuestoclave, en estecasoextracelular,importanteen el crecimientodel microorganismo,
esto es, la evolución de la concentración de amonio en el caldo. El metabolismo de este
sustrato nitrogenado es importante por serel sustrato limitante del crecimiento en el proceso, y
porque, una vezconsumido,estaráformandopartede ácidosnucleicos(DNA y RNA) y de
proteínas,principalmente.Portodo ello, un balancede materiaparael sustratonitrogenadoes,
sin duda,de ayudaparahacerla primeraaproximaciónal esquemade reaccióndel modelo
cinéticodecélula.
Comoyaseha indicado,el nitrógeno(en formade amonio)queseráconsumidoporel
microorganismo,irá a férmar los componentesintracelulares,pero ademásparte de éste
nitrógenopuedeser empleadoparasintetizarotras proteínasque no quedaránen el interior
262
g componentelcaldo
Figura6.2.- Unidadesde los datosobtenidosa partir del Citómetrode Flujo y su conversiónenotrasparaaplicaren el modelocinético
Modelo Cinéticode Célula
celular sino que seránexcretadasal caldo, Estasproteínas(proteínasextracelulares)no han
sido analizadas,perosuevoluciónpuedeserobtenidarealizandoel balancede nitrógenoantes
comentado.
Pararealizardichobalancede nitrógeno,hay quecalcularpreviamentela concentración
de nitrógenoque hay en la moléculade amonio (que es como semcorporaen el medio de
cultivo); seempleóla siguienteecuación:
14
Parael cálculo de la concentraciónde nitrógenoque hay en las moléculasmediasde
[os componentes intracelulares (deducidas por aplicación del lumping) se emplean las
siguientesecuaciones:
La relaciónentreLa concentraciónde nitrógenoy la concentraciónde RNA se
calculapor (C~5H11,750~375N3,75P3)
3 75~ 14Cvg~~(g/L)=C~4(g/L)~
491,16 [6.11]
La relación entre la concentraciónde nitrógenoy la concentraciónde DNA
(C95H1201 335N3q5P3),es:
486,41
Paraproteínas,seconsideróla fórmulamedia: C5,34H9640237N136S0099,con lo
quela concentraciónde nitrógenoapartirde la concentraciónde proteína,seajustaa la
siguienterelación:
~ / L) = C»JgXL) ,36 14 [6.13]133,848
En las Tablas6.1 a 6.7 semuestranlas concentracionesde nitrógenoempleadaspor
el microorganismo en la síntesis de los componentesintracelulares en los distintos
experimentosrealizadosen estetrabajo.En las citadastablassemuestranlas evolucionesde
nitrógeno(por moléculade amonio)CNA, así como las cantidadesde nitrógenoen DNA
(CN DNA), RNA (CN,RNA) y proteínas intracelulares (CN,PRJ). Además,seha realizadola
sumade estostrescomponentes(CNT), con el fin de compararlocon la concentracióninicial
263
ModeloCinético de Célula
añadiday la que todavía no ha sido consumida(en caso de que todavíaquede).De esta
manera,se puedecalcular la cantidadde nitrógenoque empleala bacteria,en cadacaso,
parala síntesisde proteínaextracelular,cuyo análisisno fue realizado,pero que puede
deducirsede acuerdoa la ecuación [6.14],asumiendoquela cantidadde amonio consumido,
no inmovilizadocomocomponente,va a parara proteínasextracelulares:
C~2~ =CNÁ0 —C~1,- —CÑÁ [6.14]
En la Tabla 6.1 semuestranlos resultadosdel experimentorealizadocon 65 p.p.m.
de amonio inicial (experimenton05). Si comparamosla cantidadde nitrógenototal con la
añadidainicialmenteen el medio de cultivo (0,0506g/L de nitrógeno),se observaque la
cantidadde nitrógenoencontradacomo sumade DNA, RNA y proteínasintracelulareses
mayorque la cantidadinicial de nitrógeno, llegándosea obtener0,083 gIL de nitrógeno
“rnmovilizado” en componentes intracelulares. Este balance podría indicar que el
microorganismopuedesintetizarestoscomponentesempleandootra fuentede nitrógeno,
por ejemplo aminoácidos procedentesde! medio YM, que es el medio empleadopara
realizar el inóculo en el biorreactor.O bien, podría ser que el microorganismoestuviera
empleandoesteamonioen “fabricar” componentescon unacomposicióndiferentea la que
tiene cuando la concentraciónde amonio es mayor, o lo que es lo mismo, con una
estequlometríadiferente. Además,se observaen la tabla que no hay síntesisde proteína
extracetular,salvo la que apareceentre las 3 a 16 horasde la fermentación,pero en la fase
estacionariade crecimientono parecequeexistaexcreciónde estetipo de proteínas.
Parael experimentorealizado con 130 p.p.m. (experimenton0 6), queapareceen la
Tabla 62, el balancedel nitrógenoindica que el nitrógenoinicial añadido0,1011 g/L se
encuentra en los componentesintracelulares hasta una cantidad máxima 0,084 gIL
(observadaen la faseestacionariade crecimiento),teniendoen cuentaque se ha consumido
completamenteel nitrógeno a lo largo de la fermentación,el nitrógenoque “falta” estará
formandopartede la proteínaextracelular,comorefleja la última colunmade la citadatabla.
En la Tabla6.3 semuestrael balancede nitrógenorealizadoparael experimentocon
la concentraciónde 257 p.p.m. de amonio inicial y unatemperaturade 280C (experimento
n0 2). En él, la cantidadinicial de nitrógenoañadidaen forma de amonio es de 0,24 gIL,
mientrasque la obtenidacorno biomasa(sumade componentesintracelulares)esde 0,183
264
ModeloCinéticode Célula
g/L, considerandoquetambiénha habidoun consumototal de nitrógeno,la última columna
indica la cantidadde nitrógenoqueformarápartede proteínaextracelular.
Para el experimentorealizado con 475 p.p.m. y 280 C (experimenton0 7), que
apareceen la Tabla 6.4, la cantidadde nitrógenoinicial es muy elevada(0,369 g/L), no
obstantesólo apareceen forma de componenteintracelular la cantidadde 0,1147 gIL. El
microorganismo,en este caso,no consumetodo estenitrógeno,quedandouna cantidad
residualal final de la fermentaciónde 0,062 gIL. Al realizarel balancede la mismaforma
que en experimentosanteriores, se obtiene cierta cantidadde nitrógeno en forma de
proteínaextracelular.como indica la última columnade la tabla. El hechode que en este
experimentono haya consumo total de amonio indica que en este caso el sustrato
nitrogenadono está siendo el nutriente limitante del crecimiento,como ocurre en los
demas.
En la Tabla 6.5 aparecenlos resultadosobtenidospara el experimentorealizadoa
250C y 257 p.p.m. (experimentoni), al igual que en otros, el balance de nitrógeno indica
que partees empleadoparala síntesisde componentesintracelulares,(0,16g/L) y otrapara
la síntesisde proteínaextracelular,puestodo el nitrógenoañadidoinicialmente(0,151 g/L)
seconsumecompletamentedurantela fermentación.
En la Tabla 6.6, se presentael balancede nitrógenoparael experimenton0 3, es
decir, el realizadoa M0C y 257 p.p.m.,con una concentracióninicial de nitrógenode 0,17
g/L, la cualesconsumidaprácticamente,encontrándosecasitodoel nitrógenoinmovilizado
en los componentesde la biomasa0,12 gIL (nitrógeno total) en la fase estacionariade
crecimiento,yenun porcentajemenorcomoproteínaextracelular(0,014 gIL).
Porúltimo, en laTabla6.7 apareceelbalanceparael experimentorealizadoa340C y
con unaconcentraciónde amonio inicial de 257 p.p.m (experimenton0 4). En estecaso,no
llega a consumirsetodo el nitrógeno añadidoinicialmente (0,157 gIL) pues quedauna
cantidad residual de 0,077 gIL. En esteexperimento,todo el nitrógeno consumidose
encuentrainmovilizado como componentesintracelulares,y un porcentajede nitrógenose
emplearáparala síntesisde proteínasextracelularesen la faseestacionariade crecimiento,
como indica la últimacolumnade la Tabla6.7.
265
ModeloCinético de Célula
Cálculo del nitrógeno aprovechadofermentaciónen el experimenton0 5,280C.
por Xandzoinonascanipestris durante lallevadoa cabocon 65 p.p.m.de amonioy
Tiempo CN,x CRNA(h) ( /L) ( IL)
CDNA( /L)
CPRÍ
(g/L)
SCDNA,RNN,PIU
IL (IL)0 0.0505 0.00016 0.00023 0.00062 0.0010 01.5 0.0497 0.000173 0.0482 0.00018
4.5 0.0466 0.00021
0.00025 0.00068 0.0011 00.00026 0.00071 0.0011 0.0011
0.0003 0.0008 0.0013 0.00256 0.0451 0.00027 0.00038 0.0010 0.0016 0.0037
8.5 0.0435 0.00063 0.00089 0.0023 0.0039 0.003012 0.0326 0.001 0.0014 0.0037 0.0061 0.011716 0.0256 0.0024 0.0033 0.0090 0.0148 0.010020 0.0194 0.0055 0.0078 0.0210 0.0344 0
23.5 0.0132 0.0123 0.0172 0.0463 0.0759 024.5 0.0093 0.0127 0.0178 0.0478 0.0783 025.25 0.0062 0.0130 0.0183 0.0492 0.0806 0
26 0.0015 0.0132 0.0186 0.0499 0.0818 0
27.5 0.00078 0.0134 0.0188 0.0506 0.0830 031 0.00078 0.0134 0.0188 0.0506 0.0830 032
32.50.00078 0.0134 0.0188 0.0506 0.0830 00.00078 0.0134 0.0188 0.0506 0.0830 0
33 0.00078 0.0134 0.0188 0.0506 0.0830 035 0.00078 0.0134 0.0188 0.0506 0.0830 040 0.00078 0.0134 0.0188 0.0506 0.0830 0
Tabla 6.1.-
266
Modelo Cinéticode Cé/ula
Tabla 6.2.- Cálculo del nitrógeno aprovechadopor Xanthomonascampestrisfermentaciónen el experimenton0 6, llevados a cabo con 130amonio y 280C.
Tiempo CN.A(h) ( /L)0 0.1011
Cp.~Á(g/L)
C»~4
(g/L)CPRI
(g/L)
ZCDNA.RNA,PRI
<g/l)
CPRE
(g/L)
0.00021 0.0003 0.0008 0.00131 02.5 0.1008 0.00025 0.00035 0.00094 0.00154 03.5 0.0972 0.00031 0.00043 0.00116 0.0019 0.001885.5 0.0855 0.00035 0.00049 0.0013 0.00214 0.013317 0.0746 0.00040 0.00057 0.00152 0.00249 0.023848 0.0661 0.00048 0.00067 0.00181 0.00297 0.03192
9.25 0.0591 0.00092 0.0013 0.00348 0.0057 0.0361910.516
0.0528 0.00112 0.00157 0.00421 0.0069 0.041210.0248 0.0019 0.00267 0.00717
0.015880.011750.02602
0.064370.0555420 0.0194 0.0042 0.00592
24.25 0.0085 0.0051 0.00729 0.01955 0.03203 0.0604125 0.0073 0.0063 0.0089 0.0239 0.03915 0.05446
26.5 0.0058 0.0080 0.01133 0.03041 0.04982 0.0453528.5 0.0048 0.0092 0.01299 0.03487 0.05713 0.0390530.5 0.0031 0.0121 0.017 0.04562 0.07474 0.0231431.5 0.0019 0.0128 0.01808 0.04852 0.07949 0.0195732 0.00078 0.0132 0.01862 0.04997 0.08186 0.01836
33.5 0.00075 0.0138 0.01943 0.05214 0.08542 0.0148338 0.00066 0.0138 0.01943 0.05214 0.08542 0.0149247 0.00008 0.0140 0.0197 0.05287 0.08661 0.01431
47.5 0.00008 0.0140 0.0197 0.05287 0.08661 0.0143149 0.00008 0.0140 0.0197 0.05287 0.08661 0.0143150 0.00008 0.0140 0.0197 0.05287 0.08661 0.0143151
53.50.00008 0.0140 0.0197 0.05287 0.08661 0.014310.00008 0.0140 0.0197 0.05287 0.08661 0.01431
267
durante lap.p.m. de
Modelo Cinético de Célula
Tabla 6.3.- Cálculo del nitrógeno aprovechadopor Xanthomonascampestrisdurante lafermentación en el experimenton0 2, llevados a cabo con 257 p.p.m. deamonio.y28~ C
CRN4
(g/L)
XCDNA,RNA,PR¡Tiempo(h)
[ CNÁWg2~L=.
0.2403 0.0013
CDNA
( /L)
CpRI
(IL) J=~g~==
0.0048 1 0.0081
(gIL)0 0.0018 02 0.2333 0.0016 0.0022 0.0058 0.0097 04 0.2317 0.0019 0.0026 0.0068 0.0114 07 0.2232 0.0025 0.0035 0.0090 0.0150 0.0037
9 0.2177 0.0030 0.0042 0.0108 0.0180 0.006112 0.2138 0.0040 0.0056 0.0145 0.0242 0.0039
13 0.2092 0.0044 0.0061 0.0159 0.0265 0.0062
14.5 0.2068 0.0055 0.0077 0.0200 0.0333 0.0017
16 0.1975 0.0057 0.0081 0.0208 0.0347 0.0096
16.5 0.1921 0.0067 0.0094 0.0243 0.0405 0.0093
19.5 0.1711 0.0092 0.0129 0.0334 0.0556 0.015223.5 0.1477 0.0119 0.0167 0.0431 0.0718 0.022324 0.1291 0.0127 0.0178 0.0461 0.0768 0.0360
24.5 0.1088 0.0152 0.0213 0.0550 0.0915 0.04152832
0.0777 0,0175 0.0245 0.0633 0.1054 0.05870.0637 0.0234 0.0329 0.0849 0.1413 0.0368
33.5 0.0567 0.0240 0.0337 0.0871 0.1450 0.040134 0.0427 0.0259 0.0364 0.0940 0.1564 0.042838
38.5
0.0350 0.0269 0.0377 0.0974 0.1622 0.0448
0.0194 0.0279 0.0391 0.1009 0.1679 0.05450.05810.0618
39.5 0.0101 0.0288 0.0404 0.1044 0.173741.5 0.00078 0.0297 0.0417 0.1077 0.1793
42 0.00063 0.03001 0.0420 0.1086 0.1807 0.060643.7 0.00040 0.0304 0.0426 0 1100 0.1830 0.058548 0.00008 0.0304 0.0426 01100 0.1830 0.0588
48.5 0.00008 0.0304 0.0426 0.1100 0.1830 0.058852 0.00008 0.0304 0.0426 0.1100 0.1830 0
268
ModeloCinéticode Célula
Tabla 6.4.- Cálculo del nitrógeno aprovechadopor Xantho¡nonas campestrisdurante lafermentaciónen el experimenton0 7, llevados a cabo con 475 p.p.m. deamonio y 280C.
Tiempo(h)
CN,Á
(gIL)
CRNA
(g/L)
CUNA(gil)
CPRI(g/L)
ECDNÁ,LNA,pR,(gil)
CPRE(gil)
0 0.3694 0.0001 0.00016 0.00041 0.00068 02 0.3686 0.0001 0.00026 0.00067 0.0011 04 0.3678 0.00022 0.00032 0.00084 0.0014 07 0.3655 0.00043 0.00059 0.0015 0.0025 0.00099 0.3616 0.00050 0.0007 0.0018 0.0030 0.004312 0.3562 0.00067 0.00094 0.0024 0.0040 0.008713 0.3538 0.00089 0.0012 0.0032 0.0053 0.0097
14.5 0.3422 0.0011 0.0016 0.0041 0.0069 0.019816 0.3111 0.0016 0.0022 0.0059 0.0098 0.0480
16.5 0.2761 0.0017 0.0024 0.0062 0.0104 0.082419.5 0.1944 0.0024 0.0034 0.0089 0.0149 0.159623.5 0.1400 0.0061 0.0086 0.0222 0.0370 0.191924 0.1166 0.0090 0.0126 0.0327 0.0544 0.1978
24.5 0.0933 0.0117 0.0164 0.0423 0.0704 0.205228 0.0855 0.0157 0.0221 0.0571 0.0950 0.188432 0.0661 0.0177 0.0248 0.0640 0.1065 0.1963
33.5 0.0622 0,0190 0.0267 0.0689 0.1147 0.192034 0.0622 0.0190 0.0267 0.0689 0.1147 0.192038 0.0622 0.0190 0.0267 0.0689 0.1147 0.1920
38.5 0.0622 0.0190 0.0267 0.0689 0.1147 0.192039.5 0.0622 0.0190 0.0267 0.0689 0.1147 0.1920
269
ModeloCinético de Célula
Tabla 6.5.- Cálculo del nitrógeno aprovechadopor Xanthomonascampestris durante lafermentaciónen el experimenton0 1, llevados a cabo con 257 p.p.m. deamonio y 250 C.
Tiempo(b)
CN,.%
(g/L)
CRNA
(g/L)
CDN..x(g/L)
CPRI
(g/L)
ECDNA,RNA,PRI
JI..
CPRE(gIL)
0 0 0.0017 0.0021 0.0051 0.0087 0,00125.7 0.3012 0.0061 0.0031 0.0085 0.0176 0.00247.7 0.2951 0.0069 0.0101 0.0211 0.0369 0.00349 0.2922 0.0111 0.0161 0.0321 0.0582 0.004310 0.2812 0.0123 0.0171 0.0351 0.0642 0.00531216
0.2761 0.0182 0.0261 0.0473 0.0911 0.00790.2741 0.0591 0.0872 0.1522 0.2961 0.0168
17 0.1813 0.0641 0.1093 0.1831 0.3562 0.020320 [ 0.1241 0.1082 0.1325 0.2811 0.5183 0.034624 0.0901 0.1323 0.1922 0.3503 0.6744
0.2522 0.3802 1 0.78550.0679
25 0.0851 0.1522 0.080228 0.0752 0.1711 0.2712 0.4411 0.8821 0.127129 0.0414 0.1802 0.2811 0.4702 0.9332 0.143832 0.0333 0.2301 0.3511 0.6502 1.2321 0,176434 0.0112 0.2606 0.3824 0.7025 1.3422 0.178435 0.0091 0.2707 0.4225 0.7201 1.3933 0.178538 0.0006 0.2805 0.4122 0.7811 1.4733 0.178550 0.0006 0.3002 0.4300 0.7811 1.5121 0.1785
270
ModeloCinéticode Célula
Tabla 6.6.- Cálculo del nitrógeno aprovechadopor Xanthomonascatnpestris durante lafermentaciónen el expenmenton0 2, realizadocon 257p.p.m.de amonioy 310 C.
CPRE
(gIL)
Tiempo(b)
CNA
(gIL)
CRNA
(gIL)
CUNA
(gIL)
CPRI
(gIL)
ECDNÁ,~Á,PRI
J¡~j~[
0.0156 000.51.15
0.1711 0.0025 0.0035 0.00950.1697 0.0028 0.00405 0.0108 0.0178 00.1677 0.0030 0.00426 0.0114 0.0187 0
3 0.1655 0.0032 0.00456 0.0122 0.0200 03.5 0.1=95 0.0033 0.00467 0.0125 0.0205 06 0.1512 0.0038 0.00537 0.0144 0.0236 08 0.1445 0.0044 0.00621 0.0166 0.0272 0.0074
8.5 0.1329 0.0048 0.00677 0.0181 0.0297 0.00829 0.1299 0.0058 0.0082 0.0220 0.0360 0.005410 0.1221 0.0074 0.0103 0.0278 0.0456 0.003112
14.50.1061 0.0080 0.0113 0.0304 0.0498 0.01500.0846 0.0105 0.0148 0.0398 0.0652 0.0211
15 0.0803 0.0113 0.0159 0.0427 0.0711 0.020716 0.0718 0.0115 0.0161 0.0434 0.0711 0.0279
18.5 0.0524 0.0130 0.0183 0.0492 0.0806 0.037920 0.0423 0.0134 0.0188 0.0506 0.0830 0.0456
23.5 0.0243 0.0171 0.0240 0.0644 0.1055 0.041024
24.525
0.0224 0.0173 0.0242 0.0651 0.1067 0.04180.0206 0.0182 0.0256 0.0688 0.1127 0.03760.0189 0.0189 0.0265 0.0713 0.1168 0.0352
26.5 0.0145 0.0190 0.0267 0.0716 0.1174 0.038927 0.0133 0.0197 0.0276 0.0743 0.1217 0.035928 0.0111 0.0197 0.0276 0.0743 0.1217 0.038130 0.0077 0.0206 0.0289 0.0777 0.1273 0.0359
31.7 0.0056 0.0203 0.0285 0.0766 0.1255 0.0398
0.0030 0.0203 0.0285 0.0766 0. 1255 0.0424
271
ModeloCinético de Célula
Tabla 6.7.- Cálculo del nitrógeno aprovechado por Xanthomonascampes/Rsdurante lafermentaciónen el experimenton0 4, llevados a cabo con 257 p.p.m. deamonio y 340 C.
Cpftg
(g/L)
Tiempo
(h)
CN,Á(gIL)
CRNA] CDNAj
(g/L)~ Á~tL....J0.00019 0.00022 0.0002
SCDNA~NA,rRI
IL
CPRE1
(g/L)0 0.1521 DeDil 0
0,00113 0.1547 0.00029 0.0004 0.0010 0.00176 0.1462 0.00048 0.00067 0.0017 0.0029 0.00139 0.1361 0.00022 0.0010 0.0028 0.0046 0.001212 0.1151 0.0011 0.0014 0.0036 0.0060 0.001514 0.1143 0.0013 0.0018 0.0047 0.0078 0.0017
14.518
0.11040.1088
0.00140.0023
0.00190.0032
0.0050 0.00830.0083 0.0139
0.00220.0081
20 0.1052 0.0048 0.0067 0.0174 0.0289 0.002524
24.50.10110.0972
0.00670.0086
0.0094 0.0243 0.0405 0.01010.01100.0121 0.0313 0.0521
30 0.0933 0.0134 0.0188 0.0487 0.0811 0.012133 0.0855 0.0150 0.0210 0.0543 0.0903 0.015236 0.0855 0.0173 0,0243 0.0627 0.1043 0.0223
36.5 0.0777 0.0188 0.0264 0.0682 0.1135 0.025]40 0.0777 0.0269 0.0377 0.0975 0.1622 0.0252
0.0777 0.0269 0.0377 0.0975 0.1622 0,02520.0277 0.0269 0.0377 0.0975 0.1622 0.02520.0777 0.0269 0.0377 0.0975 0.1622 0.0252
272
Mode/oCinéticode Célula
Todosestosresultadossugierenqueel nitrógenoconsumidoporel microorganismova
a formarpartefundamentalmentede la biomasa(DNA, RNA y proteínaintracelular),y sólo
un pequeñoporcentajeva a constituir las proteínasextracelulares.Unaexcepciónla presenta
el experimentorealizadoa65 p.p.m.,dondeno ha sido posiblecenarel balancede nitrógeno,
probablementedebidoaquela estequiometriaasumidano esválidacon concentracionestan
bajasde nitrógeno,aspectoqueserácomentadomásadelante.Unavez realizadoel balance
de nitrógenoanterior,seobservóla evoluciónde los componentesintracelularesimplicados
directamenteenel crecimientodel microorganismo,puesel conocimientode suevolución
con el tiempo va a titeilitar los primerospasosenel planteamientodel modelo.En las
Figuras6.3 a6.9 semuestranlas evolucionesde los componentesintracelulares(DNA, RNA
y proteínas),asícomo la sumade estostres componentesestructurales de la célula, con el fm
de compararcon la biomasaexperimental.Así mismoapareceendichasfiguras el consumo
de amonio, ademásaparecela evolución de la proteínaextracelularcalculadade la forma
indicadaanteriormente.
Se puedeobservar que lasevolucionesde todos los componentes(eng/l..) en todoslos
experimentos es similar. El contenido en proteínas es siempre mayor que el contenido en
ácidosnucleicosy, dentrode éstos, la cantidaddeDNA essiempremayorque la de RNA. Por
otm lado, seobservala estrecharelaciónentrela síntesisde estoscomponentesy e] consumo
de nitrógeno,esdecir, cuando el sustrato nitrogenado se agota, el microorganismono puede
seguir sintetizando nuevasmoléculas,por lo que la síntesis de aminoácidosse detieney, en
consecuencia,la síntesisde ácidosnucleicos,lo queprovocaqueel microorganismoentreen la
faseestacionariadel crecimiento.Una excepcióna estaafirmaciónes la correspondienteal
experimento realizado con una concentraciónde amonio inicial de 0,475 gIL; en este caso,
cuandoel microorganismoentraen la fase estacionariadel crecimiento,todavía quedauna
concentraciónelevadadel sustratonitrogenadoenel medio, por lo quela entradaenestaIbse
sedebe,probablemente,aotro nutrientequesehaagotadoy no al nitrógeno.Además,en todas
las gráficasse ha representadola suma de los componentesintracelulares(DNA, RNA y
proteínas),queseha llamadobiomasateórica(Cxr~), seapreciaqueestasumaen todos los
casos es semejante al valor de la biomasaobtenidaexperimentalmente,existiendo una
diferencia-no muy significativa-enla faseestacionariadel crecimiento,debido a que no sehan
considerado otros componentes,como lípidos o hidratos de carbono,que, aunqueen mucha
menor cantidad, seencuentran en la biomasa, y pueden ser los responsablesde esapequeña
diferencia entre la biomasaexperimental y la teórica(DNA, RNA y proteínas intracelulares).
273
Modelo Cinético de Célula
0,8
0,6~
0,4-
(30,2 —
1~0 10
Figura 6.3.- Evolución de componentesintracelulares,fluente de nitrógenoy biomasadelexperimenton0 5. Condicionesexperimentales:CN665 p.p.m., Th 28 0C, Nvariable (210 r.p.m. inicial>.
2.0
1.5 —
I,0—
u
0,5 —
0.00 10 20
r30 40 50 60
t(h)
Figura 6.4.- Evolución de componentesintracelulares,fuente de nitrógenoy biomasadelexperimenton0 6. Condicionesexperimentales:CNO=130 p.p.ni., T 28 0C, N~=variable (210 r.p.m. inicial)
• ex
VA
~ %rot,, +CRNA+CDN
-s- - a -u. ----3.#
2,
y. ~gt” — - 0Q~’ O - - -
4,It,
‘7 .~o ~Ú~’v ~~v- y.>,1
‘—‘e
:
• -— -
20 30
(h)
40 50
e! ~ o,
5• .F0 0004 4 0
274
ModeloCinéticode Célula
2.0
1,5
I,0-
o
0,5—
0,0 ~o Jo 20 30 40 50 60
t(h)
Figura 6.5.- Evolución de componentesintracelulares,fuentede nitrógenoy biomasadelexperimenton0 2. Condicionesexperimentales:CNO=25’? p.p.m., fl 28 0C, N=variable(210 r.p.m.inicial)
2,0
1,5 —
¡ [0—
0,5,
0,0—
o 20 30 40
t(h)
Figura 6.6. Evolución de componentesintracelulares,fuente de nitrógenoy biomasadelexperimenton0 7. Condicionesexperimentales:CNO=475 p.p.m.,T= 28 0C, N=variable(210 r.p.m. inicial).
• CNAC
RNA
~ ~o• u
mio o
o
O
1P~ 000 0odio
g o
oji
tp
4~NA
o s1
.cxE,.,,
o CXT~<,~
uOc •,
ou
O‘.SS..•• •9s.. ollo 0~ ~
— —
275
• .0o
A CRNA
9u. u
O o
•
• UTM
u...
UD ~00
ou
• o0
r
10 20 30
o-O
40Y
50
t (Ii)
Figura 6.7.-
2,
1,5 —
-4
Eo
u
1,0—
0,5 —
0,04O
Evolución de componentesintracelulares,fluente de nitrógeno y biomasadelexperimenton0 1. Condicionesexperimentales:CNO=257 p.p.m., T= 25 0C, N=variable(210r.p.m. inicial).
¡ •
I0 20 30 40
t (h)
Figura 6.8.- Evolución de componentesintracelulares,fluente de nitrógenoy biomasadelexperimenton0 2. Condicionesexperimentales:[email protected],T 31 0C, Nvariable(210r.p.m. inicial).
ModeloCinético de Célula
2,0
1,5—
5
e
u
1,0—
0,5 —
0,0 ~1~
o 60
• 1
• CN ¡A C~A
9
O
a (‘
o u.....n-o o
u
u 0~ O- O
~ •q50 ~~AAA A~ WVV7 9
a a a- ---- -
276
Modelo Cinéticode Célula
2.0
1.5—
E
u
I,0—
0,5—
0,0o lo 20 30 40
t (h)
Figura 6.9.- Evolución de componentesintracelulares,frente de nitrógeno y biomasadelexperimenton0 4. Condicionesexperimentales:CNO=257p.p.m.,T= 34 <‘C, N=variable(210r.p.m. inicial).
¡ • ¡ •
•CNA
V C~
o• CYSi,ten
ocxT~ • u ~ a.O ~ O O O
Esaca
SO 0 0 0 00
~ 0 ~ ¿O~x x~X X XXe. •——.~~•~-• a
277
Modelo Cinético de Célula
Considerandotodosestosresultados,sepuedellegara plantearun esquemade reacción
sencillo paraexplicarel crecimientode la bacteriaXanthomonascampestris,tal como indica la
Figura 6.10. Unapartedel amonio va a ser empleadoparala formaciónde aminoácidosno
formadores de bases nitrogenadas (no formadores de ácidos nucleicos),en defmitiva, de
aminoácidosqueformaránexclusivamenteproteínas.Estasproteínaspuedenser intracelulares
o extracelulares.Otra parte del amonio se emplea para la formación de aminoácidos
formadoresde basesnitrogenadas(las que formaránpartede ácidosnucleicos).Estasbases,
asuvez, formaránporun lado RNA, porotroRNArn el cualsetranscribeaDNA. Es decir,el
RNA intracelular que se mide será, mayoritariamente,RNA que no evolucionahaciaDNA.
Este esquemaexplica la forma de las curvas de proteínasy RNA, que no correspondena
productosformadosenreaccionesen serie.
PROTEINAINTRACELULAR ]
FI~7flEZZZZ4~NA
Figura6.10.-Esquemade reacciónsimplificadoparael Modelo Cinéticode Célula deXanthomonascampesfis.
Aminoácidosnoformadoresde bases
PROTEINAEXTRACELULAR[ 1
278
ModeloCinéticode Célula
Una vez planteadoel esquemade reacciónsimplificado y consideradoel conocimiento
que se tiene del metabolismo del microorganismo, se deben plantear las relaciones
estequiométricasentre los diferentes compuestos.
- En la síntesisde las basesqueformanRNA sólo cedenátomosde carbonolos quesehan
denominadoaminoácidosformadoresdebases,cuya síntesissemuestraen la ecuación
(6.15]; mientrasque el restode aminoácidosque intervienenen la reacciónsólo ceden
gruposamino (NI-lfl, por lo que no sehan consideradocomo fórmula molecularen la
citadareacciónde síntesisde basesde RNA.
- En la síntesisde basesdel DNA, a partirde las basesdel RNAm, setieneen cuenta que
seproduceel mismoconsumode nitrógenoquesi seestuviesesintetizandoRNA. Si bien,
seconoceque, en la formaciónde DNA apartir de RNAm, seproduceunatransformación
en la basenitrogenada,es decir,el uracilo queformapartede los nucleótidosdel RNA, se
transformaen timina en el DNA, para lo que es necesarioun aporte de carbono e
hidrógeno,quesesuponequeviene de la frente de carbonooriginal empleada(sacarosa).
Además,es necesariala presenciade un intermedio reducido (IntRed) que realice la
reducciónparapasar la ribosaa desoxiribosa(ribonucicótidosa desoxirribonucleátidos).
Por tanto, el metabolismodel sustratonitrogenadosuponeuna estructuraciónde este
componenteen la biomasa,ya que es el citado compuestonitrogenado el que produce
aminoácidosy éstos dan lugar a proteínasy basesnitrogenadas,precursoras,de los ácidos
nucícicos.Si seaplica lumping en el sistema,englobandoaminoácidos,basesdel RNA y bases
del DNA en compuestoscon fórmulas molecularesmediasdel total de moléculasque los
forman, las reaccIonesglobales,que tienenlugaren la rutametabólicadel nitrógeno,se pueden
plantearlas siguientesrelacionesestequiométrieas(ecuacionesdefiliación):
279
,VfodeloCinético de Célula
- Síntesisde aminoácidosno formadoresdebases(r1):
0,933C6U1~O6+ 1,4NH ±O,2l6NAD~±0,ICoASH-t-ATP 7ZZ~
C56J-J~01O~3N~4S01~±O216(NADJ-I,fl+ )+0.lCoA+3.29h%O+(ADP+Pi)
- Síntesisde aminoácidosformadoresde bases(r,):
O,5C6H1,06+ + 2,2SNAD> z~’ C3 [-15503!V + 2,25(NADH,H ~)
- Síntesisde RNA (r3):
1.Or6HJ,06±qH5pN±Z74NF~±3.5ATP±3.5WAP’+0.2EGTÉ ±3QHf~3N5P3~
CqSLJI7PR7SNThP3±5.34k0±3.5(ADP+PP+3.5IÑV>4D[-fl- Sp-
O.2%GDP-i-Pi) +3QHJ,q0N5P,
- Síntesisde RNAm (r4):
L0W’~H,O6±C3H5503N+2,74N1-4+3,5A TP±3.5IN,4L1+0,2SGTI’ ÷3C101-112013N5P3zt’
Q5J-I~ 75O~ ~75iV375P3±5,34H20+3,5(ADP+Pi) ±3,5yN>4DHi- 5 ) +
O,2YGDP±PO±3C10H1=010N5P2
Síntesisde DNA (r5):
0,04C6U1,06+ 0,I2SNADP+ C9 5H11 750J375N375P3+ mt Red.
C95H1201375N375P3±6,125(NADPH,H~ ) + !ntOx.
[6.15]
[6.16]
[6. 17]
[6.18]
[6.19]
280
Modelo Cinéticode Célula
6.2.2.- Pronuestade EcuacionesCinéticas
Ante la falta de antecedentesen la literatura,y el desconocimientodel tipo de ecuaciones
cinéticasparalas reaccionesanteriores,se ha optadopor aplicar el método antescitado de las
velocidadesde reacción,junto con el métodointegral.Dicho métodoes aplicableal sistema
objeto de estudiodebidoa que el númerode componentesclave puedehacerseigual al número
de reaccionesdel esquemasimplificado, suponiendoestadopseudoestacionariode algunode los
componentesde estesistemaconcreto.
La aplicación de la ecuación[6.8] a los NC componentesclave del modelo cinético
conduceagruposde ecuacionesindependientesquepermitencalcularlos parámetroscinéticos
del sistemapor aplicaciónde una regresiónlineal simple sin término independiente,de forma
individual.
El primerpasoa realizaresel planteamientodel sistemade ecuacionesdiferenciales,para
ello se han realizadodos suposicionessobreel esquemasimplificadode reacciónanteriormente
propuesto:
• Simplificación 1 (MCC-1), donde seasumeestadopseudoestacionarioparaRNAm:
dCRNAm _ =0 [6.20]
dt —R~A
puestoque
RRNAm=r4—r5 [6.21]
seobtiene: [6.22]
Del mismo modo, se asume estado psedoestacionariopara los aminoácidos no
formadoresde bases:
dC00 — 1? = 0 [6.23]
dt aa~/f¿fi
281
ModeloCinético de Célula
puestoque
R =r,—r3 —r4
se obtiene:
r,=
La velocidadde consumode amoniovienedadapor:
dcNR4>
¿It—r, —2,75r3—2,75 r4
Sustituyendolas ecuaciones[6.22] y [6.25] en [6.26], se obtiene:
dCVR — 1,4
¿Itr1 —3,75r3—3,75’~
La velocidadde formacióndel RNA por:
dCRNA =
¿It
Mientrasquela velocidadde formacióndel DNA vienedadapor:
dCDÑÁ =
¿It
La velocidadde formaciónde proteínasintracelulareses:
¿It dt
[6.24]
[6.25]
[6.26]
[6.27]
[6.28]
[6.29]
dCPRE=1’3~ [6.30]
282
Modelo Cinéticode Célula
• Simplificación 2 (MCC-2»
Seasumeestadopseudoestacionariosólo paraRNAm (ecuaciones[6.201a [6.22],en este
casono se supone estasimplificaciónparalos aminoácidosno formadoresde bases,por lo que
la velocidadde consumode amoniovendrádadade formadiferenteal modeloMCC- 1, mientras
queel restode velocidades(paraRNA, DNA y Proteínasintracelulares)sonlas mismasqueen el
casoanterior.
Parael amonio:
dCÑÑ4+ =—1,4r~ —~ —2,75r3—2,75r4 =—1,4r, ~~‘2 —2,75r3—2,75r5
¿It[6.31]
Unavez propuestaslas velocidadesdeproducciónparacadacomponenteclaveespreciso
plantearestasecuacionesen términosde velocidadesde reacción,paraello se aplicala ecuación
[6.8] paraobtenerde forma individual cadaunadeestasvelocidades.
• Simplificación 1 (MCC-1):
- rsi vienedadapor:
= frl.¿It#Cppu—CPRJ)+(CPÑE) [6.32]
- y53 seobtieneal despejarde la ecuación[6.28],obteniéndosela expresion:
= frs . ¿It ~RNA — CRNÁO [6.33]
- rss se obtieneal despejarde la ecuación[6.29], obteniéndosela ecuación:
= fI ¿It «.‘DNA —CDÑÁO [6.34]
283
Modelo (‘luético dc Célula
• Simplificación 2 (MCC-2):
Tanto rs corno r53 y rs5 vienendadasde la mismaforma que en MCC-1, esdecir por las
ecuaciones[6.32),[6.33]y [6.34],respectivamente.
La diferenciaentrelas dossimplificacionesla marcala ecuacióncinéticar2. la cualviene
dadaporla siguienteexpresiónobtenidaal despejardela ecuación[6.31]:
S2 = fri di ——(2,YS(CPÚVA CItVÁO)+2,75.(CDNACDN#O )+l,4( C~
1~ — C¡~I?I0)) [6.35]
La aplicaciónde este método a los datosexperimentalesobtenidosen este trabajo fUe
realizadaen simple respuestaempleandoel método de integral, con una subrutinatipo
Simpson. Las funciones (f(Cj)) que sehan probado para cada una de las velocidadesde reacción
hansido:
Para las ecuacionesr1, r3, y r5, (ecuaciones[6.32], [6.33] y [6.34], respectivamente),
válidastantoparaMCC-l comoparaMCC-2, se hanprobadotrescinéticasdiferentes:
- Potencial 1:
- Potencial2:
5 k, ~ CÑ di = ~ (CJ -CN ¡ti = ¡NR) [6.37]
- Hiperbólica:
5 k1 .Cj . CN dí=XV,1 •(Cj—C1~ );p= 1 NR) [6.38]CN±K,
Parari, calculadasólo parala simplificación2 (MCC-2), comoya seha indicado,se han
realizadoajustescon doscinéticaspotencialesdel tipo queindica la ecuación[6.36]y la (6.37].
Debidoa que todos los experimentospresentanresultadossimilares, sehan elegido dos
experimentoscomo representativospara observar los resultadosde la aplicación de esta
metodología,y paraevitar alargarexcesivamenteel desarrollode la exposicióndeestecapitulo.
284
ModeloCinéticode Célula
Concretamenteel experimenton0 2, realizadoa 280C y con 257 p.p.m. de amonio, y el
experimenton0 4, realizadoa 340C y con 257 p.p.m. deamonio.
Los resultadosobtenidospara la velocidad de reacción r1, aplicandoeste método y
probandolas cinéticasque sehan indicado, semuestranen las Tablas6.8 a 6.14, donde se
observanlos valoresobtenidosparalos parámetrosde cadaunade las funcionesprobadas.
Todos los parámetroscumplenlas restriccionesestadísticasimpuestas,se observaqueel
valor de SRC (suma de residuosal cuadrado)es menor para las cinéticas hiperbólica y
potencial2. Estosecorroboraobservandoquelas formasde las curvas,tanto en forma integral
(Figuras6.11 y 6.12),como derivadas(Figura 6.13 y 6.14)seasemejanmuchomása la fUnción
queparael casode la cinéticapotencial 1, cuyasumade residuosal cuadradoesmuchomayor.
Las Figuras6.11 y 6.12 muestranlos resultados,portanto,parael valorde la integralde
r1 parael experimenton0 2 (280C, 257 p.p.m. de amonio)y el experimenton0 4 (340C y 257
p.p.m.), respectivamente.Las ecuacioneshiperbólica y potencial 2 son las que permiten
obtenermejorresultadorespectoal acercamientodelas curvasa la de la función.
En cuantoal valor de r1 ya derivado(Figuras6.13 y 6.14), se observaque la formade la
curva que correspondea la ecuaciónpotencial1 presentauna forma descendente,indicando
que no es posibleconsiderarestacinética en el modelo propuesto,mientrasque las cinéticas
hiperbólica y potencial 2 reproducenbien la forma que presentala función, siendo, en
principio, posibleconsiderarcualquierade lasdoscinéticasparael modelocinético.
Tabla6.8.- Parámetroscinéticosde r1 calculadosporajustede los datosdel experimenton0 1.
en simple respuesta a diferentes ecuaciones cinéticas. Condicionesexperimentales:T=250 C, CN=257 p.p.m de amonio,N= variable(210 r.p.m.inicial) modelo de célula.
C¡nética
Valores de los paranietros t Student F Fischer
SRC
Mix Ópt Mía Obt. Teor. Obt. flor.
k c1 k,=0,132 k=O.129 k,=O,126 4,3.l0~ 2,086 925 4,35 0,92
¡c~ o u k,=1,097 kño,977 k,=0.857 6,3.I0~ 2,086 2432 4,35 0,23
k1 •c« k1=0,035
K1=0,003k,=O.028K1~0,002
k1=0,021K,=0,00i
8.1 i03 2,093 3331 4,38 0,12
285
Modelo Cinético de Célula
Tabla 6.9.- Parámetroscinéticosde r1 calculadosporajustede los datosdel experimenton0 2.
en simple respuesta a diferentes ecuaciones cinéticas. Condicionesexperimentales:T=280 C, CN257p.p.m de amonio,N= variable(210 r.p.m.inicial).
Tabla 6.10.-
Cinética
Valores de los parametros t Student r FiseberSRCMáx Ópt Nlíu 0W.
k”0.152 k=0.150 I<~=0.148 i,iio~ 2.074 1120 4,54 0,85
k1 •c~ k,=0.44 k1=0.43 k1=0.45 8.3.10’ 2.074 1332 4.54 0.092
kft’0.051 k1’~0,050 k1~0.0490< + k K1=0.O05 K1=0.005 K,=0,005 3.1102 2.080 2331 4,60 0,012
Parámetroscinéticosr1 calculadospor ajustede losen simple respuesta a diferentes ecuaciones cinéticas.experimentales:T31
0 C, CN~257 p.p.m de amonio,N variableinicial) modelode célula.
Cinética
Valores de los parámetros t Student F Fiseher
SRCXláx Ópt Mm Obt. Teor. Obt. Teor.1
k,=0.315 k1=0.195 k1=0,075 4,3.10~ 2,080 925 435 15k,=0.704k o~ k1=0.590 k1=0,470 6.3. ¡o
3 2.080 2432 4,35 0.23
k ~ <jV k, ‘0,450 k1=0.310 k,=O.170
K1 K1 0,600 K1=0.390 K1=0,180s.í.ío
3 2,086 3331 3.52 0,12
Tabla 6.11.-Parámetroscinéticosde r1
4 en simple respuestaexperimentales:T34
0 C,inicial) modelo de célula.
datosdel experimenton0 3Condiciones(210 r.p.m.
Cinética
Valores de los parámetros t 5h¡dent F flscher
SRCMáx Ópt Mm Obt. Teor. 0W. Teor.
k ¡ kJO,143 k,=0.131 k,=0.O,11 4,310~ 2,060 925 4.35 3.75
c~ k1=0,237 k1=0,150 k1=0,063 6.3.10~ 2,060 2432 4,35 1.23
<~C..~ ±K¡
k=0.268K1=0,093
k1=0.173K,’~0.063
k1=0.095K,=0,033
8,1.10~ 2.064 3331 3.52 0.82
calculadospor ajustede los datosdel experimenton0
a diferentes ecuacionescinéticas. CondicionesCre257p.p.m de amonio, N variable(210 r.p.m.
286
Modelo Cinéticode Célula
Parámetroscinéticosde r12. en simple respuestaexperimentales:T=28
0 C,inicial), al modelode célula.
calculadosporajustede los datosdel experimenton0a diferentes ecuacionescinéticas. CondicionesCN65 p.p.m de amonio, N= variable (210 r.p.m.
Tabla 6.13.-Parámetroscinéticosde r1
2. en simple respuestaexperimentales:T28
0 C,
Cinetica
Valores de los parámetros t Student F Fiseher
5RCMáx Ópt Mm 0W. Teor DM Teor.
k1 C\ k,=0.18 k,=’0,131 k1=0.082 4.3.10~ 211 925 4,38 2.95
k ~‘ c~ k1=0.288 k~=O.lSO k1=0.138 6.3.102 2 11 2432 4,38 0.55
k1=0.178 k1=0.173 k,=0.167 8,lA0~k1 <i~ (~ ~K, K1=0,066 K1=0,063 K,=0.060
212 3,55 0,182
calculadospora diferentes ecuacionescinéticas.CNl3O p.p.ni de amonio,N= variable
inicial), a] modelo de célula.
CinéticaValores de los parametros t Student F Fiseher
SRCMáx Ópt Mía CM. Teor. 0W. flor.
k1 c< k1=0.900 k1=0.900 k1=0,900 2.102 2,069 925 3,68 1,3
k1 cj Ej k1=5,830 k1~5.800 k,=5,770 410’ 2.069 1223 3,68 0.23
(i<+K¡ k1=0,069 k’=0.069 k1=0,069K1=0.010 K,=0,010 K1=0,010 3.102 2.074 1325 3,34 0.12
modelo de célula
Cinética
Valores de los parámetros t Student E Fiseher
SRCMix Ópt Mía CM. flor. CM. flor.
=0.131 k1=0,131 k1=O,131 4,3.10~ 2.080 955 4.30
4,30
0,72
0,11=0.151 k1=0.l50 k~=0,149 6,3.10~ 2,080 2432
k1c~ ~ k~=0.l73 ktO,173 kñ0J738,1.10~
=0,063 K,=0,063 K1=0,0632,086 3331 3,37 0,082
ajustede los datosdel experimenton0
Condiciones(210 r.p.m.
Tabla 6.14.- Parámetrosde r1 calculadospor ajustede los datosdel experimenton
0 2. ensimple respuestaa diferentesecuacionescinéticas.Condicionesexperimentales:T~28O C, CÑ=475 p.p.m de amonio, N= variable (210 r.p.m. inicial), al
287
Tabla 6.12.-
ModeloCinético cte Célula
¡ • ¡ ¡3•~‘ ——-.
2
u
/IP
o
1’ e<u
,141-~-u—-
40 50 60
Figura 6.11.-
Figura 6.12.-
Evolución mostradapor la integralde r1 con el tiempoparael experimenton0
2, realizadoa 280C y 257 p.p.m. de amonio inicial probando diferentescinéticasy sucomparacióncon la función correspondientea proteínas.
(h)
Evoluciónmostradapor la integral r1 conel tiempoparael experimenton
0 4,realizadoa 340C y 257 p.p.m. de amonio inicial probandodiferentescinéticasy sucomparacióncon la funcióncorrespondientea proteínas.
0,30
0.25-
020-
1 IttEnc,a1 12 bn~c,ai2SI bpcrliolica
e-- --u- — -- —
0.15—
0.10-
0,05—
u0.00o lo 20 30
t(h)
0.8
0 0 20 30 40 50
288
ModeloCinéticode Célula
0012
0010
oms
0036
0032
a,50 60
Figura 6.13.- Evolución mostrada por rsi con el tiempo para el experimento n0 2,realizadoa 280C y 257 p.p.¡n.de amonio inicial probandodiferentescinéticasy sucomparacióncon la funcióncorrespondientea proteínas.
t (h)
Figura 6.14.- Evolución mostradapor r51 con el tiempo para el experimenton
0 4,realizadoa 340C y 257 p.p.m. de amonio inicial probandodiferentescinéticasy sucomparacióncon la funcióncorrespondientea proteínas.
0014
O lO 20 30 40O,’)
O lO 20 30 40 50
289
Alodelo Cinético de Célula
Los resultadosobtenidosparala velocidaddc reacción r3 (de formación de RNA),
aplicandoestemétodoy probandolas cinéticasque sehan indicado,se muestranen las Tablas
6.1 5 a ~ 1 donde se observanlos valoresobtenidospara los parámetrosdc cadauna de las
fimoionesprobadas.En todoslos experimentossesuperanlos valoresestadísticosteóricosde lii
Studenty de la E de Fischer, obteniéndosevaloressignificativamentebajos de SRC. La
cinéticapotencial1 es la quemuestravaloresmásaltosde la sumade residuosal cuadrado,lo
queindicaquedescribepeor la formade la funciónparar3, quelasotrasdoscinéticasprobadas.
Los resultadosde la integral de r53 paracadauno de los experimentostomadoscomo
representativos(experimenton0 2 y n0 4), semuestranen las Figuras6.15 y 6.16,mientrasque
la frmnción r3. paradichosexperimentos,aparecenen las Figuras6.17 y 6.18. Dondese puede
observaralgo similar a lo queocurríacon [avelocidadde reacciónr4 - estoes, las cinéticasque
mejor reproducenla forma de la fimción son la hiperbólicay la potencial2, mientrasque la
curvaparala ecuaciónpotencial1, sealejabastantede la formade la función,pueses una línea
descendente.
Tabla 6.15.- Parámetroscinéticosde ¡~3 calculadosporajustede los datosdel experimenton0
1. en simple respuesta a diferentes ecuacionescinéticas. Condicionesexperimentales:T250 C, CNzz257 p.p.m de amonio,N= variable (210 r.p.m.inicial).
Cinética
Valores de los parámetros t Student E Fischer5RC
Máx Ópt Mm 0W. Teor. 0W. Teor.
~< lq=O.O65 k,0.0348 k<0,004 1.5.102 2.086 1120 4,35 0.28
k u, u ,~ k,=0.295 I<~=0.259 k1=0,223 7.3.10~ 2.086 3332 4.35 0.08
A e ~4i¡k—0.035K1=0.112 k1=0.0344K1=0,0396 k1=0.033K1=0.033 4.1.10’ 2.093 4321 438 0.04
290
Modelo Cinéticode Célula
Tabla 6.16.-Parámetroscinéticosde r3 calculadospor ajustede los datosdel experimenton0
2. en simple respuestaa diferentes ecuacionescinéticas. Condicionesexperimentales:T280 C, CN257inicial).
p.p.m de amonio, N variable (210 r.p.m.
Cinética
Valores de los parametros t Student E Fischer
SRC
Mix Ópt Mm Obt. flor. Obt. flor.
k1 c~ k=0,152 k1=0,045 k1=0,148 1,1.102 2,074 1120 4,54 1,8
0,92- - Q k,=0,44 k1=0.129 k1=0,45 8,3.10’ 2.074 1332 4,54
4.60 0,012A1 ~ k,=0,051K1=0.005
k1=0,013K1=0,080
k=0,049K1=0,005
3,1.102 2,080 2331
Tabla 6.17.-Parámetros cinéticosde r33. en simple respuestaexperimentales:T31
0 C,inicial).
calculadospor ajustede los datosdel experimenton0a diferentes ecuacionescinéticas. Condiciones
CN=257 p.p.m de amonio, N= variable (210 r.p.m.
Cinética
Valores dc los parámetros t Student E Fischer
SRC
Mix Ó~>t Mía Oht. flor. Obt. Teor.k o
1 k1=0,052 k1=0,0408 k1=0,028 3,5.102 2,080 820 4,35 0,84
0’ c~ k,=0.224 k1=0,124 k,=0,024 5.3.10~ 2,080 1332 4.35 0.12
Cv4K,k1=0,026K1’~0.076 k1=0.023K1=0,074 k1=0,021K1=0,073 7.l.I0~ 2.086 5221 3,52 0.03
Tabla 6.18.-Parámetroscinéticosde r3 calculadospor ajustede los datosdel experimenton0
4. en simple respuesta a diferentes ecuacionescinéticas. Condicionesexperimentales:T340 C, CN257 p.p.m de amonio,N variable(210 r.p.m.inicial).
Cinética
Valores de los paranietros t Student E Fiseher
5RC
Mix Ópt Mm Oht. flor. Obt. Teor.
k1 c~, k1=0,039 k1=0,039 k1=0,039 1,2.10’ 2,060 725 4.35 2.5
k1 o, - (\, k1=0,455 k1=0,454 k1=0,453 2.3.10’ 2,060 1536 4,35 022
-- (~ #Ñ1
k,=0,049K1=0,057
k1=0,049K1=0.057
k1=0,049K[=0,057
4110’ 2,064 2325 3,52 0,43
29]
Modelo Cinético de Célí.¿La
Parámetroscinéticosde r35. en simple respuestaexperimentales:T=28
0 C,inicial).
calculadospor ajustede los datosdel experimentonoa diferentes ecuacionescinéticas. CondicionesCN=65 p.p.m de amonio, N= variable<210 r.p.m.
Tabla 6.20.-
Valores de los parasnetros t Studeut E Fiseher
Cinética Máx Ópt Mm Obt Teor. Obt Teor. ¡ SRC
k ~ lc~=0,039 k,=O.039 k,=0.039 1,2.10’ 2,11 725 4.38 3.1
¡ti Q ~< k1=0.454 k1=O.454 k1=0,454 2.3.10’ 2,11 1536 4.38 0.22
A, c~ kj0.049 k1=O.049 k1=0.049 4,1.10’ 2,12 2325 3,55 0.43
F,k1 K~ —0,057 K~=0,057 K~=0.057
Parámetros cinéticos de r3 calculados por ajuste de los datos del experimento n
6. en simple respuesta a diferentes ecuaciones cinéticas. Condicione~experimentales: T=28
0 C, CN’43O p.p.m dc amonio, N= variable (210 r.p.m
inicial).
Valores de los parámetros t Studeut E Eischer
Cinética Mix Ópt ] Mm Obt. Teor. Oht. Teor. SRC
k c’¡ - k~=O.O7l k~=O.O7O k,=0.070 3.10’ 2.069 725 3,68 0.98
k o o- - k~=O.l8O k,=l.78 k~=l,76 i.io’ 2.069 1536 3.68 0,12
A1 - ~--‘ Lis k=0.02I3 k~=0.0212 k=0,021 2.10’ 2.074 2325 3.34 0.03
(~ +K~ K1=O,0002 K1=0.0002 K1=0.0002
Parámetros cinéticos de r3 calculados por ajuste de los datos del experimento u
7. en simple respuesta a diferentes ecuaciones cinéticas. Condicione~
experimentales: T280 C, CN~”475 p.p.m de amonio, N variable (210 r.p.m
inicial).
Valores de los parámetros t Studeat E FiseherCinética Mix Ópt Mm 014. Teor. Oht. Teor. SRC
=-lk - k
1=0.0417 k1~0.0417 k,=0,0417 2.10’ 2.080 725 4,30 4,2
k o- Y - Y k,=O.395 k~=0,392 k1=0.289 3.10’ 2,080 1536 4,30 0.33
k,=0.019 k1=0,019 k1=0,019 410’ 2086 2325 3,37 0.11¡ k[ -
0k. ~ -v
K1=O.002 K1=0.002 K~=0.O02
Tabla 6.21.-
Tabla 6.19.-
o
292
ModeloCinéticode Célula
‘
Figura 6.15
~
t (h)
Evolución mostradapor la integral de r3 con el tiempon
0 2, realizadoa 280C y 257 p.p.m. de amonio inicialcinéticasy sucomparacióncon la funcióncorrespondiente.
t (h)
60
parael experimentoprobandodiferentes
O lO 20 30 40 50
O lO 20 30 40 50
Figura 6.16.-Evolución mostrada por la integral de r3 con el tiempo para el experimento
n0 4, realizado a 340C y 257 p.p.m. de amonio inicial probando diferentes
cinéticasy sucomparacióncon la funcióncorrespondiente.
293
ModeloCinético cíe Célula
0014
0012
0.01&
0.038
0.01>6
0.0)4
0032
50 60
Figura 6.17.-Evolución mostradapor r53 con el tiempoparael experimenton0 2, realizado
a 280C y 257 p.p.m. de amonio inicial probandodiferentescinéticasy sucomparacióncon la funcióncorrespondiente.
0.0116
0,004
0,092
O,cr~9
ti (h)
Figura 6.18.-Evolución mostrada por r53 con el tiempo para el experimenton
0 4, realizadoa 340C y 257 p.p.m. de amonio inicial probandodiferentescinéticasy sucomparacióncon la funcióncorrespondiente.
O lO 20 30 40t(h)
O lO 20 30 40 50
294
ModeloCinético¿le Célula
Los resultadosobtenidosparala reacciónr5 (parala formaciónde DNA), aplicando
el método de las velocidadesde reacciónpara determinarlas cinéticasque puedenser
empleadasen el modelo cinéticode célulaplanteado,se muestranen las Tablas6.22 a 6.28,
dondese presentanlos valoresobtenidosparalos parámetrosde cadauna de las funciones
probadas.En todos los experimentossesuperanlos valoresestadísticosteóricosde t Student
y de E de Fischer de los parámetrosde cadacinética, siendo algo peor las estadísticas
obtenidasparalos parámetroscorrespondientesa la ecuaciónpotencial1.
Las formas de las curvas para cadauna de las cinéticas,en comparacióncon la
función se muestranen las Figuras6.19 y 6.20 (para la integral de rs) y las Figuras 6.21 y
6.22 para r5 (derivada).Tal como ocurría en los dos casosanterioresse observaque las
cinéticasque mejor describenla forma de la función (f(Cj)) son las correspondientesa la
ecuaciónhiperbólicay a lapotencial2.
Los resultados que se muestran, como en los casos anteriores, son los
correspondientesa 1 experimenton0 2 (280C, 257 p.p.m. de amonio)y al experimenton0 4
(340C y 25’7 p.p.mj. Al igual que en las dos velocidadesde reacción anterioreslos
resultadosson similaresparatodoslos experimentos,por lo quesemuestranunosresultados
representativos.
Tabla 6.22.-Parámetros cinéticosde r5 calculados por ajuste de los datos del experimento
n0 1 en simple respuestaa diferentes ecuacionescinéticas. Condiciones
experimentales:T250 C, CN257 p.p.m de amonio, N= variable (210r.p.m.inicial).
C¡nética
Valores de los parámetros t Student E Fiseher
SRC
Mix Ópt Mm Oht. Teor. 014. Teor.
k~=0,l52 k1=0,0922 k1—0,148 4.1.102 2,086 850 4,35 0.11
0~ k1=044 k~=0.348 k,=0.45 5.3.10’ 2086 2232 4.35 0,075
k, ~,C1~K1
k1=0,0601<~=0.058 k1=0,060K1=0,058 k1-=0,060K10,0 5,1.10’ 2,093 5241 4,38 0.03
295
ModeloCinético de Célula
Tabla 6.23.-Parámetroscinéticos de r5 calculados por ajuste de los datos del experimenton
0 2 en simple respuestaa diferentes ecuacionescinéticas. Condicionesexperimentales:T280 C, Cre257inicial).
p.p.m de amonio, N= variable (210r.p.m.
Cinética
Valores de los parametros t 5tudent E Fischer
SRCMix Mía Obt. Teor. Obt. Teor.
¡ti Ej k,=0.152 k,=O.0168 k,=0.148 i.í.104 2,074 1120 4.54 0,8
0.44 k,=0,175 k,=0,45 g.s.io 2,074 1332 4.54 0.19
~+K
1
k=o.ossK1=0,005
k,=0.0214K1=0.0075
k,=0,049K1=0,005 3,1.10’ 2,080 2331 4.60 0.01
Tabla 6.24.-Parámetroscinéticosde r5 calculadosporajustede los datosdel experimenton
0 3 en simple respuestaa diferentes ecuacionescinéticas. Condicionesexperimentales:T310 C, CN257inicial).
p.p.m de amonio, N= variable (210 r.p.m.
CinéticaValores de los paranietros t Student E Fischer
SRCMáx Ópt Mía 0W. Teor. Oht. Teor.
u =0.057 k,=0,057 k,=0,057 2,1.10’ 2.080 1750 4.35 0,23
=0.179 k,=0.178 k,=0,176 3.3.10’ 2.080 3232 4,35 0,08
kñO.037~~ K=0,087
k~0.037K,~0,087
kñ0,037K
1=0,037 6.1.10’ 2.086 4241 3.52 0.025
Tabla 6.25.-Parámetros cinéticosde r3 calculados por ajuste de los datos del experimenton
0 4. en simple respuestaa diferentes ecuacionescinéticas. Condicionesexperimentales:T=340 C, CN=257 p.p.m de amonio, N variable (210r.p.m.inicial).
Cinética
Valores de los parametros t Student y Fischer
SRCMáx
ÓptMm Obt. Teor. Obt. Teor.
k=0.057 k,=0.054 k,=0,051 2,1.10’ 2.060 3078 4.35 1.4
c~ lt=O629 k,=0,629 k1=0.629 3.3.10’ 2,060 3282 4.35 0.11
A> <.~CV>KI
k,=0,078I<,=0,063
k=0.078K,=0,063
k,=0.078K,=0.063
7.1.10’ 2.064 2241 3,52 0.12
296
ModeloCinéticode Célula
Tabla 6.26.- Parámetros cinéticos de r3 calculadospor ajuste de los datos del experimenton
0 5. en simple respuestaa diferentes ecuacionescinéticas. Condicionesexperimentales:T280 C, CN65 p.p.m de amonio, N~ variable(210 r.p.m.inicial).
Tabla 6.27.-Parámetros cinéticos de r5 calculados por ajuste de los datos del experimento
n0 6, en simple respuestaa diferentes ecuacionescinéticas. Condiciones
experimentales:T280 C, Crl3O p.p.m de amonio, N variable (210r.p.m.inicial).
Tabla 6.28.-Parámetros cinéticosde r5 calculadospor ajuste de los datos del
n0 7. en simple respuestaa diferentesecuacionescinéticas.
experimentales:T280 C, CN=475inicial).
experimentoCondiciones
CinéticaValores de los paraniefros t Student F Fiseher
SRCMix Ópt Mm 0W. Teor. Oht. Teor.
k=0.054 k1=0.054 k1=0.054 2.1.10’ 2080 3078 4,30 3.4
¡ti u u~ k=0.629 k=0,629 k~0,629 3,3.I0~ toso 3282 4,43 0,8
A1 1Á +K~ k,=0,078K,=O,063 k,=0,078i(,=0,063 k1=0,078K,=0,063 7,1.10’ 2,086 2241 32,37 0,5
p.p.m de amonio, N variable (210r.p.m.
297
Modelo Cinético cíe Célula
0,3-
gro 0.2—
0. 1 -
0.0•O
Figura 6.19.-Evolución mostradapor la integralde r5 con el tiempoparael experimentou
0 2, realizadoa 280C y 257 p.p.m.deamonioprobandodiferentescinéticasy sucomparacióncon la funcióncorrespondientea proteínas.
Jr~
(h)
Figura 6.20.-Evolución mostrada por la integral de r5 con el tiempo para el experimento
n0 2, realizado a 340C y 257 p.p.m. de amonio probando diferentes cinéticas
y sucomparacióncon la funcióncorrespondientea proteínas.
3- 1 Rflo~4 1 - —-—u
2 R,t~,&a1 2
3 H~,al~lica~—1----
1¡
1 11
41
1
<1.
<~
--a>.
lo 20 30 40
(h)50 60
035
O lO 20 30 40 50
298
ModeloCinéticode Célula
0,0100
0,0075 —
te1- 0,0050—
0,0025 —
0,0030
Figura 6.22.-Evoluciónmostradapor r55con el tiempoparael experimenton0 4, realizado
a 340C y 257 p.p.m. de amonio probando diferentes cinéticas y sucomparacióncon la funcióncorrespondienteaproteínas.
O lO 20 30 40 50 60ti (h)
Figura 6.21.-Evolución mostrada por r55 con el tiempo para el experimento n
0 2, realizadoa 280C y 257 p.p.m.de amonio, probando diferentes cinéticas y sucomparacióncon la funcióncorrespondienteaproteínas.
1 Potenc¡a¡ 1 22Potendaj23 H~potóI¡ca
u
o lO 20 30 40 50t(h)
299
ModeloCinético cíe Célula
Los resultadosobtenidospara la reacción r2 (para aminoácidosformadoresde
bases),- válido sólo parala simplificación2, MCC-2-aplicandoel métododc las velocidades
de reacciónparadeterminarlas cinéticasquepuedenseraplicadasen el modeloplanteado,se
muestranen las Tablas6.29 a 6.35, dondese puedenobservarlos valoresobtenidosparalos
parámetrosde cadaunade las funcionesprobadas,en estecasosólo potenciales,asícomo los
valoresestadísticosde dichosparámetros.Como puedeapreciarse,la cinética que permite
obtenermejor resultadoes la potencial 1, es decir, la que viene en función sólo de la
concentraciónde nitrógeno,puescomopuedeapreciarseen las tablas,en la cinéticapotencial
2, el valor del parámetroobtenido(k2) paramuchosde los experimentosincluye cl cero en su
intervalode confianzay la sumade residuosal cuadradotienevaloressignificativamentemas
altos en todoslos experimentos,quelos obtenidoscon la ecuacióncinéticapotencial1.
Las Figuras6.23 y 6.24 muestranlas evolucionesde las curvasparala integral de la
ecuaciónr2 paralos experimentosque sehan tomadoa modode ejemplo(experimentosn0
2 (280C, 257 p.p.m. de amonio) y n0 4 (340C y 257 p.p.m.). Las Figuras 6.25 y 6.26,
muestranestos mismos resultadospara la ecuación correspondientea r2, para los
experimentosu0 2 y n0 4, respectivamente.En estasúltimas figuras sepuedeapreciarla
clara diferencia entre las dos cinéticaspotencialesprobadaspara estaecuación,siendo
significativamentemejor la obtenidacon laecuaciónpotencial1.
Tabla 6.29.- Parámetroscinéticosde r2 calculadospor ajustede los datosdel experimento
n0 1 en simple respuestaa diferentes ecuacionescinéticas. Condiciones
experimentales:T250 C, CN=257 p.p.mdeamonio,N= variable(216 r.p.m.inicial).
Cinética Valores de los parámetros t Student E Eischer SRCMix Ópt Mm 014. Teor. Obt. Teor.
1< u- h=0,094 k>=0,091 k
1=0.088 1.1.102 2,086 1221 2.2 0.5
< Ej u~ k=0.580 k=0.250 k=-0.080 42,1 2,086 825 3.25 1,7
300
ModeloCinéticode Célula
Tabla 6.30.-Parámetroscinéticosde r2 calculadosporajustede los datosdel experimenton
0 2 en simple respuestaa diferentes ecuacionescinéticas. Condicionesexperimentales:T~280C, CN257inicial).
p.p.m de amonio, N variable (210r.p.m.
Cinética
Valores de los parámetros t Studeot E Fiseher
Obt. k Teor. SRCMix Ópt Mm Oht. flor.
¡t, ~ k,~0,152 k1=0,0168 k,~0,148 3,1.102 2.074 1120 2.080 0.18
~> u~- cj k,=0,440 k1=0.175 k,=-0,090 62.5 2,074—
83,5 2,086 1.95—
Tabla 6.31.-Parámetros cinéticosde r2 calculadospor ajustede los datosdel experimenton
0 3 en simple respuestaa diferentes ecuacionescinéticas. Condicionesexperimentales:T310 C, CN=257p.p.m deamonio,N variable(210r.p.m.inicial).
Tabla 6.32.-Parámetroscinéticosde r2 calculadosporajustede los datosdel experimento
n0 en simple respuestaa diferentes
experimentales:T’~340 C, Cre2S7inicial).
ecuacionesp.p.m de amonio
cinéticas.N variable
Condiciones(210 r.p.m.
Cinética
Valores de los parámetros t Student E Eischer
SRC
Mix Ópt Mm Obt flor Oht Teor.
¡t - ¿y k~=0.061 k1=0,055 k,=0,048 1110’ 2060 1225 4,35 0,5
o - ¿y, k,=1.521 k1~0,631 k,=0,259 352 2060 3251 4,35 2,3
30]
ModeloCinético ¿le Célula
Tabla 6.33.- Parámetroscinéticosde r2 calculadosporajustede los datosdel experimenton
0 4 en simple respuestaa diferentes ecuacionesexperimentales:T~2S0C, CN65inicial).
p.p.m de amonio,cinéticas.
N variableCondiciones(210 r.p.m.
Valores de los parámetros t Student E Fischer —
Cinética XIáx ÓiÚ Mm 014. ~Teor. 0W. jnor.
k¡ <y k> =0.560 k>=0,350 k>=0,140 i,i.i03 2,11 552 4.38 0,2
o, o, k1=2.140 k,=l,250 kL=’O.
3S0 8.3.102 2,11 875 4.38 7,2
Tabla 6.34.- Parámetros cinéticos de r2 calculados por ajuste de los datos del experimento
n0 6 en simple respuesta a diferentes ecuaciones cinéticas. Condiciones
experimentales: T=280 C, CN=t30 p.p.m de amonio, N= variable (210 r.p.m.
inicial).
Valores de los parametros t Stndent E Eischer
Cinética Nláx Ópt Mm Obt. Teor. Oht. 1 Teor. SRC
=0,158 k1=0,125 k,=0,092 ij.ío~ 2.069 878 3,68 0,23
ko-o k=1.47 k=0,69 k>=0.19 25,3 2.069 325 3.68 3,5
Tabla 6.35.-Parámetros cinéticos de r2 calculados por ajuste de [os datos del experimenton
0 7 en simple respuestaa diferentes ecuacionescinéticas. Condicionesexperimentales:T=280 C, CN=475 p.p.m de amonio, N variable (210 r.p.m.inicial).
302
ModeloCinéticode Célula
Figura 6.23.-
60
Evolución mostradapor la integralde r2con el tiempoparael experimenton
0 2, realizado a 280C y 257 p.p.m. de amonio probando diferentescinéticasy sucomparacióncon la funcióncorrespondientea proteínas.
0,150
0,125
0, l03 -
r, ~
a~o
a(25
0,030
t (h)
Figura 6.24.-Evoluciónmostradapor la integralde r2 con el tiempoparael experimento
n0 4, realizadoa 340C y 257 p.p.m. de amonioprobandodiferentescinéticas
y sucomparacióncon la funcióncorrespondientea proteínas.
O iO 20 30 40 50
t (h)
o io 20 30 40 50
303
ModeloCinético de Célula
0,
(>035
0,030
0.025
0+0,020
(9,015
0,0>0
0,C05
0(1190
ti (h)
Figura 6.25.- Evolución mostrada por r52 con el tiempo para el experimento no 2, realizadoa 28
0C y 257 p.p.m. de amonio probando diferentes cinéticas y sucomparacióncon la funcióncorrespondientea proteínas.
016
0,14
0,12
0,10
: 0.08
0,06
0.04
0.02
0.09
t (h)
Figura 6.26.-Evolución mostradapor r52 con el tiempo para el experimento n
0 4, realizadoa 340C y 257 p.p.m. de amonio probando diferentes cinéticas y sucomparacióncon la funcióncorrespondienteaproteínas.
0 lO 20 30 40
O lO 20 30 40 50
304
ModeloCinéticode Célula
De todo lo visto, se puedeconcluir que el método aplicado para obtener las
velocidadesde reaccióndel modelo de célula planteado permite discernir qué tipo de
cinéticasepuedeemplearparacadaunade las reaccionesdel esquemaelegido.
Sehaobservadoque las ecuacionesreaccionescinéticasr1, r3 y r5 (válidastanto para
el modelo MCC-l como parael MCC-2), presentanmejoresresultadoscon ecuaciones
cinéticasde tipo hiperbólico (ecuación[6.38]) o tipo potencial 2 (ecuación[6.37]), no
siendoposiblediscriminarmediantecriteriosestadísticoscuálde las dos ecuacionespuede
ser la másadecuadaparael modeloplanteado.Porestetipo de criterio se hadesechadola
ecuaciónpotencial 1 (ecuación [6.361) paraestasreaccionespues, aunquecumplía las
restriccionesestadísticasimpuestaspara sus parámetros,presentabavaloresde la t de
Studenty de la E de Fischersignificativamentemásbajos,y valoresde sumade residuosal
cuadrado(SRC) másaltos, lo queindica un peorajustea la funcióncon la que serealizala
comparación;esto último se veía corroboradoa la vista de las formas de las curvas
correspondientespara cada velocidad de reacción, donde la tendenciaen el error es
evidente.Quedó patenteque con la cinéticapotencial 1 se obteníancurvas con forma
descendentey no la curvasigmoidalquepresentanestasfuncionesf(C,) paracinéticastipo
hiperbólicoy potencial2.
Parala reacción2 (r2), correspondientea la velocidadde formaciónde aminoácidos
no formadoresdebases,sólo presenteen la simplificación2 (MCC-2), seha mostradoque
los resultadosmejoreshan sido los obtenidospara la cinéticapotencial 1, presentándose
valores estadísticosde los parámetrossignificativamentemejoresque con la cinética
potencial2. En cuantoa la formapresentadapor las curvasen comparacióna la función, se
observaclaramenteel mejorresultadode laecuaciónpotencial1, tantoen las figurasen las
que la aparecer2 integradacomo en las que apareceen diferencial, siendomás clara la
diferenciaen esteúltimo caso.
Se va a procederahora a realizar el ajuste en múltiple respuesta,empleando
regresiónno lineal paracadauna de las simplificaciones(MCC-1 y MCC-2) y probando
las cinéticasobtenidasen simple respuestaen esteapartado,con el fin de continuarcon la
discriminacióny llegaraobtenermodelocinéticode célulamásadecuado.
305
Modelo Cinético de Célula
6.2.3- Obtención de Parámetros por Ajuste en Múltiple Respuesta
El ajustede los datos experimentalesal modelocinéticode célulaha sido realizado
empleandoregresiónno lineal en múltiple-respuestaparacadauna de las simplificaciones
propuestasen el apartadoanterior. Se va a probar cada una de las ecuacionescinéticas
paralas velocidadesde reacciónque han resultadoconvenientesen el apartadoanterior,y
paralas dossimplificacionessupuestas,estoesparaMCC-1 y MCC-2.
Ajuste en Múltiple Respuestaparala Simplificación1 (MCC-1)
Las velocidadesde producciónde este modelo, como ya fue visto en apartados
anteriores,vienendadaspor las expresionesindicadasen las ecuacionesde la [6.27] a la
[6.30].
Las ecuacionescinéticasa probaren primer lugar seránlas de tipo potencial2, de
acuerdoa lo visto en el apartadoanteriory vienendadaspor las siguientesexpresiones:
A, C,- - CV [6.39]
= A,’ - [6.40]
El modelo MCC-1, considera3 respuestas(RNA, DNA y proteínaintracelular)y tres
parámetros(kí, k,’, k5).
Los parámetrosobtenidos, por ajuste al MCC-1 con cinéticas dadas por las
ecuaciones[6.39] a [6.41], para el experimenton0 1 realizadoa 250C y 257 p.p.m.,
cumplenlas restriccionesestadísticasimpuestas(Tabla 6.36),si bienpresentanun valorde
SRC (sumade residuosal cuadrado)relativamentealto, indicativo de que la reproducción
de datosexperimentalesespoco aceptable,tal como puedecomprobarse,a la vista de la
evoluciónde componentes,en la Figura6.27.
El ajustedel experimenton0 2 (280C y 257 p.p.m.)al MCC-1 permite la obtención
de los parámetrosque seindican en la Tabla6.3 7. Los parámetrosobtenidospor ajusteal
MCC-1 con las cinéticaspotenciales,superanlos valoresteóricosde la t de Studenty la E
306
ModeloCinéticode Célula
de Fischer. El valor de la sumade residuosal cuadrado,indicativo de la calidad de la
reproducciónestambiénun valor elevado,lo cualescorroboradopor la malareproducción
de los datosdel experimentorealizadoen estascondiciones,tal como indica la Figura
6.28.
Losparámetrosobtenidosparael experimenton<’ 3 realizadoa 310C y 257 p.p.¡n.,
de nuevo cumplen las restricciones estadísticas impuestas (Tabla 6.38), pero la
reproducciónde los datosexperimentales(Figura6.29)no esbuena.
Para el experimentorealizado a 340C y 257 p.p.m. de amonio inicial (experimento
no 4). los valoresfisicos y estadísticosde los parámetrossemuestranen la Tabla 6.39,
dondeseapreciaque secumplenlas condicionesestadísticasteóricas,y en la Figura6.30
muestra,a diferenciade los experimentosanterioresunabuenareproducción
El ajusterealizadoal MCC-1 con cinéticaspotencialespara el experimenton0 5
realizado a 28C y 65 p.p.m., muestraque los parámetrosobtenidos cumplen las
restriccionesestadísticasimpuestas(Tabla 6.40), si bien el valor de SRC (sumade
residuosal cuadrado)es significativamenteelevado,por lo que no seobtiene una buena
reproducciónde los datosexperimentales,tal comomuestrala Figura6.31.
Parael experimenton0 6, realizadoa 280C y 130 p.p.m., los parámetrosobtenidos
cumplenlas condicionesestadísticas,como semuestraen la Tabla 6.41, en cambio, es
incapaz de reproducir de forma adecuada los datos experimentales obtenidos, tal como
muestra la Figura 6.32.
Los parámetrosobtenidospor ajusteal MCC-1 con cinéticaspotenciales para el
experimenton0 7 realizadoa 28C y 475 p.p.m., tambiéncumplen las restricciones
estadísticasimpuestas(Tabla6.42)pero no pennitenunabuenareproducciónde los datos
experimentales,tal como muestralaFigura6.33.
307
ModeloCinético de (Álula
Tabla 6.36.- Parámetroscalculadospor ajuste de los datos del experimento n0 1.Condiciones experimentales:T=250 C, CN~=25I p.p.m de amonio, Nvariable(210 r.p.m. inicial), al modeloMCC-1.
ParámetroValores de los parametros
t Student F FischerMáx Ópt Mm
0,129 0,129 0,129 l,i.i03
377,20,169 0,149 0,129 7,l.l0~
y 0,714 0,706 0,697 2,3.102de Student(95%confianzar 2,080
E de Fischer(95% deconfianzaft2,49SRC=4.3
• AnuloA RNá7O
• Iixx~a
A—’ •~
u
¡
•u ,‘
a
• 0000
uO,Q~7
~ •~•• 50 ~
e. a- ¡
0 10 20 30
o
~AAA A
1~~~ ~
40 50 60
t (ti)
Figura 6.27.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste delexperimenton0 1 (250C y 257 p.p.m.deamonioinicial) al modeloMCC-1.
308
‘.5
1,0u
Modelo Cinéticode Célula
Tabla 6.37.- Parámetroscalculados por ajuste de los datos del experimento n0 2.Condiciones experimentales:Th280 C, CN257 p.p.m de amonio, N=variable(210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-1.
1~
Figura 6.28.- Evoluciones de los componentesexperimenton0 2 (280Cy 257 p.p.m.
del sistema obtenidos por ajuste deldeamonioinicial) al modeloMCC-1.
t de Student ( 95% confianza~2,080F de Fischer ( 95%de confianzar 2,49
t(h)
309
ModeloCinético de Célula
Tabla 6.38.- Parámetroscalculadospor ajuste de los datosCondiciones experimentales: Th310 U, CN=257variable (210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-1.
del experimento n0 3.p.p.ni de amonio, N
ParametroValores de los parámetros
t Student F F¡scherMáx Ópt Mm
0,098 0,088 0,078 1,1.102
573,250,014 0,012 0,010 5,i.i03
0,317 0,315 0,313 l,3.10~de Student( 95% confianzaft2,080
E deFischer( 95% dc confianzat2,49
Figura 6.29.- Evoluciones de los componentedel sistema obtenidos por ajuste delexperimenton0 3 (310Cy 257 p.p.m.deamonioinicial) al modeloMCC-!.
310
SRC=1,05
(12
O lO 20 30 40
1(h)
Modelo Cinéticode Célula
Tabla 6.39.- Parámetroscalculadospor ajuste de los datos del experimento n0 4.Condiciones experimentales:T340 C, CN=257 p.p.m de amonio, N=variable(216r.p.m.inicial), al modeloMCCI.
ParámetroValores de los parametros
t Student F FiscberMix Ópt Mm
0,226 0,176 0.126 3,1.l0~
~7,1.10 361,5k3 0,255 0,247 0,239
0,0759 0,0759 0,0759 2,3.10~-deStudent(95%confianza»2,080
FdeFischer(95% de confianza)=2,49
1,2
Lo
1QS
QÓ
Q4 -
00
t(b)
Figura 6.30.- Evoluciones de los componentedel sistema obtenidos por ajuste delexperimenton
0 4 (340Cy 257 p.p.m.deamonioinicial) al modeloMCC-1.
311
SRC=0,85
O lO 20 30 40 50
ModeloCinético de Célula
Tabla 6.40.- Parámetroscalculadospor ajuste de losCondicionesexperimentales:T280 C, CN=65(210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-1.
datos del experimento n0 5.p.p.m de amonio,N variable
ParámetroValores de los parámetros
t Student F FiseherMáx Ópt Mm
0,580 0,577 0,574 3,1.10~
92,330,818 0,804 0,790 7,1.10~
1,375 1,375 1,375 2,3.102de Student( 95% confianza»2,080
F de Fischer(95% deconfianza»2,49
0,8
04-
(12—
00O
u •~. u• AmiioA RN~
y DN~o• l1r~a
o
• <
A~A A
- -v• A
lo 20 30
t(li)40 50
SRC=4,11
60
au
Figura 6.31.- Evoluciones de los componentedel sistema obtenidos por ajuste delexperimento n0 5 (28 oc y 65 p.p.m.deamonioinicial) al modeloMCC-1.
312
1
ModeloCinéticode Célula
Tabla 6.41.- Parámetroscalculadospor ajuste de los datos del experimento n0Condiciones experimentales:Th280 U, CN=l30 p.p.m de amonio,variable(210 r.p.m. inicial), al modeloMCC-1.
6.
1Parámetro
Valores de los parámetrost Student F Fiseher
Máx Ópt Mío
0,286 0,23 0,174 8,1.10
723,750,326 0,324 0,322 2,l.10~
Y 0,761 0,761 0,761 5,9.10~deStudent(95% conflanzay2,O&O
F de Eischer( 95% deconfianza»2,49
i
¡
SRC=0,92
60
Figura 6.32.- Evoluciones de los componentedel sistema obtenidos por ajuste delexperimenton0 6 (28 ocy 130 p.p.m.deamonioinicial) al modeloMCC-!.
313
0 10 20 30 40 50
t (h)
ModeloCinético de Célula
Tabla 6.42.- Parámetroscalculadospor ajuste de los datos del experimenton0 7.Condiciones experimentales:T280 C, CN=475 p.p.ni de amonio, Nvariable (210 r.p.m. inicial), al modeloMCC-1.
ParámetroValores de los parametros
1 Student F FiseherMáx Ópt Mm
0.052 0,0414 0,030 1,1.102
382,150,057 0,054 - 0,051 7,l.10~
Y 0,294 0,294 0,294 1,9.l0~de Student (95% confianza»2,080
E de Fischer ( 95% de confianza»2,49
1
t (h)
Figura 6.33.- Evoluciones de los componentedel sistema obtenidos por ajuste delexperimenton0 7 (28 ocy 475 p.p.m.deamonioinicial) al modeloMCC-!.
314
SRC=0,62
25
O lO 20 30 40 50
ModeloCinéticode Célula
De todo lo visto en este apartado,podemosconcluir que, en vista de los resultados
obtenidoscon MCC- 1 en múltiple respuesta,no se ha conseguidoun buenresultadoen el
ajuste de los datos de los experimentosrealizados,si bien hay algún experimento
(experimenton0 5), donde se ve una buena reproducciónde las evolucionesde los
componentesdel sistema.
Aunqueen todos los casosse superanlos valoresteóricosde la t de Studenty de la
E de Fischer,encasi todos los ajustesel valor de SRC (sumade residuosal cuadrado)ha
sido significativamenteelevado,lo cual indica la mala calidadde la reproducciónde los
datosexperimentalescon elMCC-1.
Como ya sevió en apartadosanteriores,los criteriosestadísticospuedensuponeruna
forma de discriminarentremodelos.Por lo que se puededescartarel modelo MCC- 1, de
acuerdoa estecriterio.
A pesarde quelos resultadosestadísticosdel ajustede las reaccionesindividualesal
aplicar simple respuestaeranindicativos de que el MCC-l era un modelo, en principio,
adecuadopara la descripcióndel sistema,no esasí cuandose aplica estasuposiciónen
múltiple respuesta,por lo que, en adelanteya no se consideraráestasimplificación y se
tendráen cuentasólo la simplificación 2 (MMC-2), que, comoseverá, es la que mejor
resultadopermiteobtenerparala reproducciónde los datosexperimentalesdel crecimiento
de Xánthomonascan-ipestris.
AjusteenMúltiple Respuestaparala Simplificación2 (MCC-2)
Las velocidadesde producciónde estemodelo, como ya fue visto en apartados
anteriores,vienen dadaspor las expresionesindicadasen las ecuaciones[6.26] para el
amonio, [6.28] parael RNA, [6.29] parael DNA y [6.30]paralas proteínasintracelulares,
El modelo MCC-2 considera4 respuestas(RNA, DNA, proteína intracelulary
amonio),pero el númerode parámetrosdependede la cinética que se pruebeparacada
reacción,puessepueden considerarecuacionescinéticashiperbólicasen algunasde las
reaccionesdel modelo(2 parámetros)y cinéticaspotenciales(1 parámetro).
31~5
Modelo Cinético ¿le Célula
Comoya se ha comentado—y seva a exponera continuación-el modelo MCC-2 es
el que mejor resultadoestadísticoproporciona,pero se debellegar a la discriminación
entre los modeloscinéticosgeneradosal teneren cuentadiferentesecuacionescinéticas,
mediantealgunode los criterioscomentadosanteriormente.
Ya semostróque la ecuacióncinéticacorrespondientea la velocidadde aminoácidos
formadoresde bases,r2, respondíaa unacinéticapotencial1, mientrasque la velocidadde
reacciónparaaminoácidosno formadoresde bases(rj), y las velocidadescorrespondientes
a la formación de RNA (y3) y de formación de DNA (rs), podrían respondertanto a
cinéticashiperbólicascomopotencialesdel tipo quedenominamospotencial2.
De la combinaciónde estascinéticas, en las reaccionesr1, r,’ y r5, se pueden
considerar,teniendoen cuentala simplificación2, cuatromodelos:
• MCC-3, suponey1, r3, r5 comoecuacionespotenciales2 yr2potencial1.
• MCC-4 suponer1, r3, r5 como ecuacioneshiperbólicasy r2 potencial1.
• MCC-5 suponepara r1 cinéticapotencial2; para r3, r5 cinéticashiperbólicasy r2
potencial 1.
• MCC-6 suponeparar1 cinéticahiperbólica;parar,’, r5 cinéticaspotenciales2 y r2
potencial1.
• MCC-3
En estecaso,el modelo MCC-3, se consideran4 respuestasy 4 parámetros.El ajuste
esrealizadoempleandoregresiónno lineal en múltiple respuestade la forma ya indicada.
Los resultadosdel ajustea estemodelosemuestrana continuación.
Los parámetrosfísicos y estadísticosobtenidos por ajuste al MCC-3, para el
experimentoni (250C y 257 p.p.m.deamonio),semuestranen la Tabla6.43,dondese
puedeobservarque sesuperanlos valoresteóricosde la t de Studenty E de la Fischercon
un 95~~ de confianza.Además, en la Figura 6.34 se representanlas evolucionesde los
componentesdel sistema,tanto los valoresteóricoscomolos reproducidospor el MCC-3,
pudiendoapreciarseel buenajusteentreambos.
El ajustedel experimenton0 2 (280C y 257 p.p.m.)al MCC-3 permitela obtención
de los parámetrosque se indican en la Tabla6.44. Los parámetrosobtenidospor ajusteal
316
ModeloCinéticode Célula
modelo superanlos valoresteóricosde la t de Studenty la F de Fiseherreproduciendode
formaadecuadalos datosdel experimentorealizadoen estascondiciones,tal como indica
la Figura6.35.
Los parámetrosobtenidosparael experimenton0 3 realizado a 310C y 257 p.p.m.,
tambiéncumplen las restriccionesestadísticasimpuestas(Tabla 6.45), permitiendo,de
nuevo,unabuenareproducciónde los datosexperimentales,como muestralaFigura6.36.
Parael experimentorealizadoa 340C y 257 p.pan.de amonio inicial (experimento
n0 4), los valoresfísicos y estadísticosde los parámetrossemuestranen la Tabla 6.46,
dondeseapreciaque los valoresteóricosde t de Studenty F de Fischersonsuperadosen
todos los casos, y la Figura 6.37 muestra la buena reproducción de los datos
experimentalesobtenidosparaesteexperimentoconel MCC-3.
El ajustede los datosexperñnentalesal MCC-3 con las cinéticasprobadasen esta
caso parael experimenton0 5 realizadoa 28C y 65 p.p.m.,muestraque los parámetros
obtenidos cumplen las restriccionesestadísticasimpuestas(Tabla 6.47) pero no se
consigueuna buenareproducciónde los datosexperimentales,tal como muestrala Figura
6.38,probablementedebidoa que,en esteexperimento,la estequjometriasupuestano debe
serciertaen estecaso.
El ajuste del experimenton 6, realizado a 28C y 130 p.p.m., muestraque los
parámetrosobtenidoscumplenlas condicionesestadísticasteóricas,como semuestraen la
Tabla6.48, y reproducede formaadecuadala evoluciónde los componentesdel sistema
conelMCC-3, tal como indica la Figura6.39.
Los parámetros obtenidos por ajuste al MCC-3 paraelexperimenton0 7 realizadoa
280C y 475 p.pan., de nuevo cumplen las restricciones estadísticasimpuestas (Tabla
6.49); la reproducciónde los datosesaceptable,como indica la Figura 6.40, si bien es
significativamentepeor que la obtenidaen el testo de experimentos,con los que seha
logrado reproducirperfectamentela evolución de cadauno de los componentes.Esto
podría ser debido a que la concentraciónde amonio es tan elevadaque podría estar
produciendoun ciertoefectotóxico en las células,por lo que existiríaunacierta inhibición
del crecimiento del microorganismo.
317
ModeloCinético de Célula
Tabla 6.43.- Parámetroscalculados por ajuste de los datos del experimento n0 1.Condiciones experimentales:Th250 C, Crc257 p.p.m de amonio, Nvariable(210 r.p.m. inicial), al modeloMCC-3.
ParámetroValores de los parametros
t Siudent ¡ F FiseherMix Ópt Mm
0,577 0,547 ¡ 0,517 2,2.l0~
1823,10,162 0,151 0,140 i,i.í03
0,234 0,225 0,216 1,2.l0~
0,040 0,035 0,030 3,2.10~de Student( 95% confianza»2,080
E’ deFiseher( 95%deconfianza»2,49
-o
-tQ)
los componentesexperimenton0 1 (25 0C y257p.p.ni. de amonioinicial) al modeloMCC-3.
318
SRC=0,088
t (h)
Figura 6.34.- Evoluciones de del sistema obtenidos por ajuste del
ModeloCinéticode Célula
Tabla 6.44.- Parámetroscalculadospor ajuste de los datos del experimento n0 2.Condiciones experimentales:T280 C, CN=257 p.p.m de amonio, Nvariable(210 r.p.m. inicial), al modeloMCC-3.
ParámetroValores de los parámetros
t Stiident F FiseherMáx Ópt Mía
0,573 0,57 0,567 5,2.10~
2725,10,155 0,152 0,149 4,l.10~
0,200 0,199 0,197 2,2.10~
0,040 0,038 0,036 8,2.10~deStudent(95%confianza»2,080
F deFischer( 95% deconfianza»2,49
1(5
t(h)
Figura 6.35.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste delexperimenton0 2 (28 oc y 257 p.p.m.deamonioinicial) al modeloMCC-3.
319
SRC=0,060
60
ModeloCinético de Célula
Tabla 6.45.- Parámetroscalculadospor ajuste de los datos del experimenton0 3.Condiciones experimentales:Th310 C, C~~257 p.p.m de amonio, N=variable(210r.p.m. inicial), al modeloMCC-3.
ParámetroValoresde los parámetros
t Student F FiseherMix Ópt Mm
0.378 0,375 0,371 3,2.10~
3825,10,104 0,103 0,102 3.1.10~
0,148 0,147 0,146 1,2.l0~
0.054 0,052 0,050 5,2.l0~deStudent( 95% confianza»2,080
F de Fischer( 95% deconfianza»2,49
1,25
1,00
c
o
0,75
0,50
025
0,00
Figura 6.36.- Evoluciones de los componentesdel sistema obtenidos por ajuste delexperimenton0 3 (31 ocy 257 p.p.m.deamonioinicial) al modeloMCC-3.
320
SRC=0,008
20
t (Ii)
Modelo Cinéticode Célula
Tabla 6.46.- Parámetroscalculadospor ajuste de los datos del experimento n0 4.Condiciones experimentales:T340 C, CN257 p.p.m de amonio, N=variable(210r.p.m. inicial), al modeloMCC-3.
ParámetroValores de los parámetros
t Student F FiseherMáx Ópt Mm
0,229 0,221 0,213 2,2.l0~
3895,10,083 0,082 0,081 s,i.io40,112 0,112 0,112 8,2.10~
0,024 0,022 0,020 7,2.l0~de Student(95%confianza»2,080
Fde Fiseher( 95% deconfianza»2,49
nEe3
SRC=0,031
Figura 6.37.- Evoluciones deexperimenton0 4
los componentesdel sistema obtenidos por ajuste del(340C y 257 p.p.m.deamonioinicial) al modeloMCC-3.
321
t (h)
ModeloCinético de Célula
Tabla 6.47.- Parámetroscalculadospor ajuste de los datos del experimento n0 5.Condicionesexperimentales: Th280 C, C~’65 p.p.m de amonio,N variable(210r.p.m. inicial), al modelo MCC-3.
ParámetroValores de los parámetros
t Student F FiseherMáx ópt Mm
0,614 0,610 0.606 2,2.l0~
325,10,185 0,182 0,178 5,1.10’
Y 0,206 0.202 0.198 3,2.l0~
0,066 0,065 0.064 7,2.l0~de Student (95% confianza»2,080
F de Fischer( 95% deconfianza» 2,49 SRC=1,89
15u
30
t(h)Figura 6.38.- Evoluciones de los componentesdel sistema obtenidos por ajuste del
experimenton0 5 (28oc y 65 p.p.m.deamonioinicial) al modeloMCC-3.
322
ModeloCinéticode Célula
Tabla 6.48.- Parámetroscalculadospor ajuste de los datos del experimento n0 6.Condiciones experimentales:T280 C, CNl3O p.p.m de amonio, Nvariable(210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-3.
ParámetroValoresde los parámetros
t Student - F FiseherMáx Opt Mm
0,591 0,571 0,551 2,2.l0~
986,20,141 0,141 0,141 í,í.ío4Y 0,195 0,195 0,195 1,2.lO~
0,042 0,039 0,035 3,2.102tdeStudent(95%confianza»2,080F de Fischer( 95% de confianza»2,49
E
1~
Figura 6.30.- Evoluciones de los componentesdel sistema obtenidos por ajuste delexperimenton0 6 (28 0Cy 130 p.p.m.deamonio inicial) al modeloMCC-3.
323
SRC=0,75
t (h)60
ModeloCinético de Célula
Tabla 6.49.- Parámetroscalculadospor ajuste de los datos del experimenton0 ‘7.Condicionesexperimentales:T280 C, Ge475 p.p.m de amonio, N=variable<210 r.p.m. inicial), al modeloMCC-3.
Paré metroValores de los parametros
t Student F FischerMáx Ópt Mm
0,613 0,610 0,607 2,2.102
295,10,184 0,182 0,180 s,í.ío~
0,212 0,202 0,192 3,2.10~
7.2.l0~0,067 0.065 0,062de Student ( 95% confianza» 2,080
E de Fischer( 95% de confianza»2,49
Ee
o2)
SRC=0,75
Figura 6.40.- Evoluciones de los componentesdel sistema obtenidos por ajuste delexperimenton0 7 (28 0C y 475 p.p.m. de amonio inicial) al modeloMCC-3.
324
t (h)
Modelo Cinéticode Célula
• MCC-4
En estecaso,el modeloconsidera4 respuestasy 7 parámetros,debidoa las cinéticas
supuestasen cadavelocidadreacción,esdecir las reaccionesr1, it3 y r5. que se consideran
hiperbólicas,mientrasque la r2 seconsiderapotencial1, comoen los modelosanteriores.
El ajuste es realizadoempleandoregresiónno lineal en múltiple respuesta.Los
resultadosdel ajusteaestemodelo(MCC-4) semuestrana continuación.
El ajustedel experimento n0 1 (250C y 257 p.p.m.)al MCC-4 permitela obtención
de los parámetrosque se indican en la Tabla 6.50. Los parámetrosobtenidospor ajusteal
modelo superanlos valoresteóricosde la t de Studenty la F de Fischerreproduciendode
forma adecuadalos datosdel experimentorealizadoen estascondiciones,tal como indica
la Figura 6.41.
Los parámetrosfisicos y estadísticos,obtenidos por ajuste al MCC-4 para el
experimenton0 2 (280C y 257 p.p.m. de amonio),se muestranen la Tabla6.5 1, dondese
puedeobservarque sesuperanlos valoresteóricosde tía Studenty de la F de Fisclier con
un 950o de confianza.Ademásen la Figura 6.42 se representanlas evolucionesde los
componentesdel sistema,tanto los valoresteóricoscomo los reproducidosporel MCC-4,
mostrándoseel buenajusteentreambos.
Parael experimentorealizadoa 310C y 257 p.p.m.de amonio inicial (experimento
n0 3), los valoresfisicos y estadísticosde los parámetrosse muestranen la Tabla 6.52,
dondese apreciaque los valoresteóricosde t de Studenty F de Fisclier son superadosen
todos los casos, y la Figura 6.43 muestra la buena reproducción de los datos
experimentalesobtenidosparaesteexperimentocon el MCC-4.
Los parámetrosobtenidosparael experimenton0 4 realizadoa 340C y 257 p.p.m.,
cumplen las restriccionesestadísticasimpuestas(Tabla 6.53),permitiendo,tambiénuna
buenareproducciónde los datosexperimentales,comomuestrala Figura6.44.
325
Moú cío Cinético de Célula
Los parámetrosobtenidospor ajusteal MCC-4 con las cinéticasprobadasen esta
caso para el experimenton0 5 realizadoa 280C y 65 p.p.m., también cumplen las
restriccionesestadísticasimpuestas(Tabla6.54)pero no permitenuna buenareproducción
de los datosexperimentales,tal comoocurríacon el modelo anteriora éste,y se muestra
en la Figura6.45.
Parael experimenton0 6, realizadoa 280C y 130 p.p.m., Los parámetrosobtenidos
cumplen las condicionesestadísticasteóricas, como se puede ver en la Tabla 6.55, y
reproducede formaadecuadala evoluciónde los componentesdel sistemacon el MCC-4,
tal corno indica la Figura 6.46.
Los parámetrosobtenidosporajusteal MCC-4 parael experimenton0 7, realizadoa
280C y 475 p.p.m., cumplen las restriccionesestadísticasimpuestas(Tabla 6.56) y la
reproducciónde datoses aceptable(Figura 6.47), como ocurríaen el caso anterior,pero
peorque si se comparacon el restode los experimentos,lo que parececonfirmar el efecto
tóxico del amonio aelevadasconcentraciones,antescomentado.
326
ModeloCinéticode Célula
Tabla 6.50.- Parámetroscalculadospor ajuste de los datosCondiciones experimentales:T250 C, CN~2S7variable (210r.p.m. inicial), al modelo MCC-4.
del experimentop.p.nl
ParámetroValores de los parámetros
t Student F FiseherMáx Ópt Mm
- 0,11 - 3,1.1O~
2225,3
0,005 0,005 0,005 7,8.l0~
0,045 0,044 0,043 7,1.10~
0,049 0,048 0,047 6,2.10~
- 0,076 - 2,3.10~
0,0802 0,0801 0,080 5.102
- 0,05 - 5,23.10~deStudent(95%confianzat2,12
F de Fiscber( 95%deconfianza>’2,66
1,75
1,50
1,25
e
o
1,00
0,75
0,50
025
0,00
SRC=’ 0,091
Figura 6.41.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste delexperimenton0 1(25oc y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-4.
327
on 1.de amonio, N
t (Ii)
ModeloCinético de Célula
Tabla 6.51.- Parámetroscalculados por ajuste de los datos del experimentou0 2.Condiciones experimentales:T280 C, CN=257 p.p.m de amonio, Nvariable (210 r.p.m. inicial) al MCC-4.
Parán etroValoresde los parámetros
t Student F FiseherMix Ópt Mm
- 0,10 - 9,2.10~
3825,3
0,133 0,131 0,128 8,8.i03
0,203 0,203 0,203 l,i.i04
0,047 0,049 0,048 4,2.10~
- 0,039 - 1,12.102
0,12 0,112 0,10 2.119
0,054 2.23.102de Student(95%confianza>’2,12
F de Fischer(95%deconfianza>’2,66
u
t (h)
SRC= 0,055
Figura 6.42.- Evoluciones de los componentes del sistema obtenidos por ajuste delexperimentono 2 (28oc y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-4..
328
60
ModeloCinéticode Célula
Tabla 6.52.- Parámetroscalculadospor ajuste de los datos del experimento n0 3.Condiciones experimentales:T310 C, C,~257 p.p.m de amonio, Nvariable (210r.p.m. inicial), al modeloMCC-4.
ParámetroValores de los parámetros
t Student F FiseherMáx Ópt Mm
- 0,102 - s,i.io~
14825,3
0,069 0,069 0,069 6,8.10~
0,022 0,022 0,022 2,l.10~
0,475 0,0513 0,0511 7,2.10~
- 0,0411 - 1,5.l0~
0,11 0,11 0,11 6.2.10~
- 0,113 - 5,23.10~deStudent( 95%confianza>’2,080
Fde Fischer(95% deconfianza>’2,49
1,25
1,00
¡8
0,75
0,50
0,25
0,00
t (h)
SRC= 0,0045
Figura6.43.-Evoluciónde los componentesdel sistemaobtenidosporajustedel experimenton0 3 (31 0C y 257 p.p.m. de amonioinicial) al modeloMCC-4.
329
40
ModeloCinético de Célula
Tabla 6.53.- Parámetroscalculadospor ajuste de los datos del experimento n0 4.Condiciones experimentales:T340 C, CN257 p.p.m de amonio, Nvariable(210r.p.m. inicial), al modelo MCC-4.
ParámetroValores de los parámetros
t Student F FiseherMáx Ópt Mm
- 0,106 - 3,1.1O~
1131.3
0.002 0,002 0,002 2,8.l0~
0,036 0,036 0,036 í,i.ío4
0,0503 0,0502 0,0501 2.2.10~
0,0542 0,0541 0,054 4,2.l0~
- 0,058 - 8.23.10~de Student ( 95% confianza>’ 2,12 SRC= 0,061E de Fiseher ( 95% de confianza>’ 2,66
‘75
1,50
.25
u
1,00
0,75
0,50
0,25
0,00O lO 20 30 40
t(h)
Figura 6.44.- Evoluciones de los componentesdel sistema obtenidos por ajuste delexperimenton0 4 (34 0C y 257p.p.m.de amonio inicial) al modeloMCC-4..
330
ModeloCinéticode Célula
Tabla 6.54.- Parámetroscalculadospor ajuste de los datos del experimento n0 5.Condicionesexperimentales:T2S0 C, CN65 p.p.m de amonio, N= variable(210r.p.m. inicial), al modeloMCC-4.
ParámetroValoresde los parámetros
t Student F FiseherMáx Ópt Mm
0,133 0,131 0,129 3,1.102
135,3
0,112 0,11 0,11 2,8.10~
0,029 0,026 0,023 1,1.10~
- 0,037 - 2,2.102
0,0479 0,0478 0,0477 4,2. ío3
0,099 0,099 0,099 5,1.10~
0,07 0,07 0,07 8,2.102de Student(95%confianza»2,179
E de Fischer( 95% deconfianza»2,70
fi
e!
Figura6.45.- Evoluciónde los componentesdel sistemaobtenidosporajustedel experimenton0 5 (28 0C y 65 p.p.n¡. de amonio inicial) al modeloMCC-4..
33’
SI4C=2,18
30
t (ti)
ModeloCinético de Célula
Tabla 6.55.- Parámetroscalculados por ajuste de los datos del experimento u0 6.Condiciones experimentales:Th280 C, C\130 p.n.m de amonio, N=variable (210r.p.m. inicial), a] modelo MCC-4.
ParámetroValores de los parámetros
t Student ¡ F Fischer
Máx ÓptM
Mm
0,152 0,150 0,148 3,1.10
1925,3
0,090 0,089 0,088 7,g•J93
0,029 0,029 0,029 7,1.l0~
0,039 0,035 0,033 6,2.l0~
0,06 0,06 0,06 2,3.10~
0,083 0,080 0,077 3.102
- 0,05 - 5,23.10~deStudent( 95% confianza»2,179 SRC= 0,52
60
E deFischer( 95% deconfianza»2,70
o
Figura 6.46.-
30
t (ti)
Evoluciones de los componentesdel sistema obtenidos por ajuste delexperimento n0 6 (28 0C y 130 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-4.
332
ModeloCinéticode Célula
Tabla 6.56.- Parámetroscalculados por ajuste de los datos del experimento n0 7.Condicionesexperimentales:T280 C, C,r475 p.p.m de amonio,N= variable(210 r.p.m. inicial), al modeloMCC-4.
ParámetroValores de los parametros
t Student F FiseherMáx Ópt Mm
0,130 0,130 0,130 3,1.10~
185,3
0,112 0,11 0,10 2,8.10~
0,026 0,026 0,026 i,1.104
0,037 0,037 0,037 2,2.10~
0,0478 0,0478 0,0478 4,2.10~
Kl5 0,100 0,099 0,098 5,i.i0
4
- 0,07 - 8,23.10~deStudent(95%confianza>’2,12
Fde Fischer(95% deconfianza»2,66
1
SRC= 0,95
Figura 6.47.- Evolucionesexperimento n0
t(h)
de los componentes7(280C y 475 p.p.m.
del sistema obtenidos por ajuste deldeamonioinicial) al modeloMCC-4.
333
1,75
Modelo Cinético de Célula
• MCC-5
Ya se hacomentadoque, debido a que podíanserempleadastanto las ecuaciones
cinéticaspotencialescomohiperbólicasen las velocidadesde reacciónparaproteínas(rí),
paraRNA (r3) y para DNA (r5), se han realizadoajustesconcinéticapotencialesen estas
tresreacciones(MCCI) y concinéticashiperbólicas(MCC-4). Se va a procederahoraa
realizaruna combinaciónde estascinéticasen estasreacciones,de formaque puedenser
planteadosdosmodelosmás,tal comoseha indicadoanteriormente.
En esteapartadose analizael modeloMCC-5, dondese suponecinéticahiperbólica
parala reacciónr1 y potencial2 para las correspondientesa ácidosnucleicos,estoespara
RNA y paraDNA. Paraestasúltimas, sehacela misma suposiciónpueses lógico pensar
que las velocidades de reacción de estos dos componentesestén estrechamente
relacionadas,esdecirrespondanal mismo tipo de cinética.
El modelo considera,al igual que en los dos casosanteriores,4 respuestas,pero
constade 5 parámetros.El ajusteesrealizadoempleandoregresiónno lineal en múltiple
respuesta.Los resultadosdelajusteaestemodelo(MCC-5) semuestranacontinuación.
En este caso no se va a considerarel experimenton0 5 (28C, 65 p.p.m. de
amonio), puescomo ya seha visto no se obtienenbuenasreproduccionesde los datos
experimentalescon ningunode los modelosanteriores,debido,probablemente,a que la
estequiometríasupuestano esválidaparaestaconcentracióntanbajade amonio.
El ajustedel experimenton0 1 (250C y 257 p.p.nt) al MCC-5 permite la obtención
de los parámetrosque seindicanen la Tabla 6.57. Los parámetrosobtenidosporajusteal
modelo superanlos valoresteóricosde la t de Studenty la F de Fischerobteniéndoseuna
adecuadareproducciónde los datosexperimentales(Figura 6.48),muy similar a los dos
modelosanteriores(MCC-3 y MCC-4).
Los parámetrosfisicos y estadísticosobtenidos por ajuste al MCC-5 para el
experimenton02 (280C y 257 p.p.m. de amonio),se muestranen la Tabla6.58, dondese
puedeobservarque sesuperanlos valoresteóricosde t de Studenty F de Fischercon un
95% de confianza.Además,en la Figura 6.49 seobservala buenareproducciónobtenida
conel modelo MCC-5 con los datosexperimentales.
334
ModeloCinéticode Célula
Los parámetrosobtenidosparael experimenton0 3 realizadoa 310C y 257 p.p.m.,
cumplenlas restriccionesestadísticasimpuestas(Tabla 6.59), pennitiendo,tambiénuna
buenareproducciónde los datosexperimentales,como muestrala Figura6.50.
Parael experimentorealizadoa3QCy 257 p.p.m. de amonio inicial (experimento
no 4), los valorestisicos y estadísticosde los parámetrossemuestranen la Tabla 6.60,
donde se apreciaque los valores teóricos de la t de Studenty de la F de Fischer son
superadosen todos los casos, y en la Figura 6.5 1, se aprecia también la buena
reproducciónde los datosexperimentalesobtenidosparaesteexperimentoconel MCC-5.
Para el experimento n0 6, realizadoa 280C y 130 p.p.ni., sepuedeobservarquelos
parámetrosobtenidoscumplenlas condicionesestadísticasteóricas(Tabla6.61). El MCC-
5 permite,tambiénparaesteexperimento,la reproducciónde formaadecuadalos datosde
esteexperimento,tal como indica la Figura6.52.
Los parámetrosobtenidosporajustealMCC-5 parael experimento n0 7 realizadoa
280C y 475 p.p.m., cumplen las restriccionesestadísticasimpuestas(Tabla 6.62) la
reproducciónesaceptable(Figura6.53), como ocurríaen el caso anterior,pero peor si la
comparamoscon el resto de experimentos,lo que parececonfirmar el ya citado efecto
tóxico delamonioaelevadasconcentraciones.
335
ModeloCinético de Célula
Tabla 6.57.- Parámetroscalculados por ajuste de los datosCondiciones experimentales:T250 C, CN=2S7variable (210 r.p.m. inicial), al modeloMCC-S.
del experimento n0 1.p.p.m de amonio, N
ParámetroValores de los parametros
t Student 1? FiseherMáx Ópt Mío
0,101 0,101 0,101 3,l.l0~
1525.3
0,02 0,02 0,02 4,2.l0~
0,189 0,189 0,189 í,í.ío5
Y 0,200 0,200 0,200 l,12.l0~
- 0,048 - 5,23.l0~de Student ( 95% confianza>’2,13
Fde Fischer( 95%deconfianza»2,60
1,75
1,50
1,25
-4
eu
11)0
0,75
0,50
0,25
0,00
Figura 6.48.- Evoluciones de los componentesdel sistema obtenidos por ajuste delexperimento n0 1 (250C y 257 p.p.m.deamonioinicial) al modeloMCC-5.
336
SRC= 0,15
t (ti)
ModeloCinéticode Célula
Tabla 6.58.- Parámetroscalculadospor ajusteCondiciones experimentales:T=280variable (210 r.p.m. inicial) al modelo
de los datosC, C~=257MCC-5.
del experimento n0 2.p.p.m de amonio, N=
ParámetroValores de los parámetros
t Student F FiseherMix Ópt Mm
0,102 0,102 0,102 2,2.10~
2325,3
0,183 0,182 0,181
0,080 0,080 0,080 3,1.l0~
0,119 0,119 0,119 2,12.l0~
0,0384 0,0382 0,0300 8,23.l0~deStudent(95%confianza>’2,131
E de Fischer( 95%deconfianza»2,60
8
SRC=0,102
Figura 6.49.- Evoluciones de los componentesdel sistema obtenidos por ajuste delexperimento n0 2 (280C y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modeloMCC-5.
337
t (ti)
ModeloCinético de Célula
Tabla 6.59.- Parámetroscalculadospor ajuste de los datos del experimento n0 3.Condiciones experimentales:T=310 C, CN=257 p.pan de amonio, Nvariable (210 r.p.m. inicial) al modelo MCC-5.
ParámetroValores de los parametros
t Student F FiseherMáx Ópt Mm
0,080 0.080 0,080 9,l.1O~
3985,3
‘ffi
0,0640 0,0639 0,0638 5,3.l0~
0,119 0,119 0,119 2,1.lO~
0,1702 0,1701 0,1700 3.I2.10~
- 0,0949 - l,23.10~deStudent(95%confianza>’2,12
E de Fischer(95% deconfianza>’2,85
.4
u
SRC= 0,010
Figura 6.50.- Evoluciones de los componentesdel sistema obtenidos por ajuste delexperimenton0 3 (31 ocy 257 p.p.m. de amonioinicial) al modeloMCC-5..
338
20
t (ti)
40
ModeloCinéticode Célula
Tabla 6.60.- Paranietroscalculados por ajuste de los datos del experimento n0 4.Condiciones experimentales:Th340 C, CN=257 p.p.m de amonio, Nvariable (210 r.p.m. inicial) al modeloMCC-5.
ParámetroValores de los parámetros
t Student 1’ FiseherMáx Ópt Mm
0,10 0,10 0,10 5,l.i05
2112,8
0,0459 0,0458 0,0457 8,3.10~
0,113 0,113 0,113 9,1.10~
0,16 0,16 0,16 7,2.10~
0,0775 0,0773 0,0772 4,23.10~
de Student( 95%confianza»2,080Fde Fischer(95%deconfianza»2,49
1,75
1,50
1,25
E
1~1,00
0,75
0,50
0,25
0,00
L
Figura 6.51.- Evoluciones de los componentesdel sistema obtenidospor ajuste delexperimentono 4 (34 C y 257 p.p.m.deamonioinicial) al modeloMCC-5..
339
SRC=0,12
t (ti)
ModeloCinético de Célula
Tabla 6.61.- Parámetroscalculados por ajuste de los datos del experimento n0 6.Condiciones experimentales:T280 C, CN=13O p.p.m de amonio, N=variable(210 r.p.m. inicial) al modelo MCC-5.
ParámetroValores de los parámetros
t Student ¡ F FischerMáx Ópt Mm
0,105 0,10 0,095 3,l.l0~
1125,3
0,045 0,042 0,039 4,2.l0~ ¡
0,302 04302 0,302 i,i.ío~ ¡
0,440 0,440 0,440 l.12.l0~ ¡
0,0553 0,0553 0,0553 5,23.l0~de Student( 95% confianza»2,080
E de Eischer ( 95%de confianza»2,49
O.
0.50
025
O.’
SRC= 0,96
60
Figura 6.52.- Evoluciones de los componentesexperimenton0 6 (280C y 130 p.p.m.
del sistema obtenidos por ajuste deldeamonioinicial) al modeloMCC-5..
30
t (ti)
340
ModeloCinéticode Célula
Tabla 6.62.- Parámetroscalculados por ajuste de los datos de] experimento n0 7.Condiciones experimentales:T=280 C, CN=475 p.p.m de amonio, N=variable(210 r.p.m. inicial) al modeloMCC-5.
ParámetroValores de los parámetros
t Student F FiseherMáx Ópt Mm
0,102 0,10 0,098 5,i.i03
211,8
Kl1 0,063 0,062 0,061 5,3.l0~
0,199 0,199 0,199 2,1.10~
0,201 0,200 0,199 3,2.10~
- 0,059 - 5,23.102deStudent(95%confianza>’2,12
F de Fiseher( 95% de confianza»2,85
1,75
1,50
1,25
E
1~1,00
0,75
0,50
0,25
0,00
SRC=1,2
t (ti)
Figura 6.53.- Evoluciones de los componentesdel sistema obtenidos por ajuste delexperimenton
0 7 (28 0C y 475 p.p.m. de amonio inicial) al modeloMCC-5..
34’
ModeloCinético de Célula
• MCC-6
Este modelo constade 4 respuestas,y 6 parámetros,debido a que las cinéticas
supuestasenestecasoparacadareacciónsonunacinéticapotencial2 pararj, hiperbólicas
parar3 y r5, y la mismaque encasosanteriores,cinéticapotencial1, parar2.
El ajusteha sido realizadoempleandoregresiónno lineal en múltiple respuesta.Los
resultadosdel ajustea estemodelo(MCC-6) semuestranacontinuación
Los parámetrosfisicos y estadísticosobtenidos por ajuste al MCC-6 para el
experimenton01 (250(2 y 257 p.p.m. de amonio),semuestranen la Tabla6.63, dondese
puedeobservarque sesuperanlos valoresteóricosde la t de Studenty de la F de Fischer
con un 95%de confianza.Además,en la Figura6.54 serepresentanlas evolucionesde los
componentesdel sistema,tanto los valoresteóricoscomo los reproducidosporel MCC-6,
mostrándoseel buenajusteentreambos.
El ajustedel experimenton0 2 (280(2 y 257 p.p.m.)al MCC-6 permite la obtención
de los parámetrosque se indicanen la Tabla6.64. Los parámetrosobtenidospor ajusteal
modelo superanlos valoresteóricosde la t de Studenty la F de Fiseherobteniéndoseuna
adecuadareproducciónde los datosexperimentales(Figura 6.55),muy similar a los dos
modelosanteriores.
Los parámetrosobtenidosparaelexperimenton0 3 realizado a 310(2 y 257 p.p.mde
nuevo cumplenlas restriccionesestadísticasimpuestas(Tabla 6.65),permitiendotambién
unabuenareproducciónde los datosexperimentales,como muestrala Figura6.56.
Parael experimentorealizadoa 340(2 y 257 p.p.m. de amonio inicial (experimento
n0 4), los valoresfisicos y estadísticosde los parámetrosse muestranen la Tabla 6.66,
donde se apreciaque los valoresteóricosde la t de Studenty de la F de Fischerson
superadosen todos los casos,y la Figura6.57 muestrala buenareproducciónde los datos
experimentalesobtenidosparaesteexperimentoconel MCC-6.
342
ModeloCinéticode Célula
Parael experimento n0 6, realizado a 280(2 y 130 p.p.m.,los parámetrosobtenidos
porajustealMCC-6 sonmostradosen laTabla6.67, dondesepuedeapreciarquesuperan
los valoresteóricosde la t de Studenty de la F de Fischer.La reproducciónde los datos
experimentalesconel MCC-6 essignificativamentebuena,tal como indica la Figura6.58.
Los parámetrosobtenidosporajusteal MCC-6, paraelexperimenton0 7 realizadoa
280(2 y 475 p.p.m., cumplen las restriccionesestadísticasimpuestas (Tabla 6.68),
superandolos valores teóricos de la t de Student y F de Fischer, y obteniéndoseuna
reproducciónaceptablede los datosexperimentalesde esteexperimento(Figura6.59).
343
ModeloCinético de Célula
Tabla 6.63.- Parámetroscalculados por ajuste de los datos del experimento n0 1.Condiciones experimentales:T250 (2, C~=257 p.p.m de amonio, N=variable (210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-6.
ParámetroValores de los parámetros
t Student F FiseherMáx Ópt Mío
0,673 0,67 0,667 2,2.l0~
1921,3
0,0311 0,0311 0,0311 2,5.l0~
Kl3 0,045 0,045 0,045 3,2.l0~
0,0575 0.0572 0.0569 2,1.l0~
Kl5 0,085 0.085 0,085 9,3.l0~
- 0,044 - 7,23.102
de Student( 95%confianza»2,093E de Fiseher( 95% deconfianza»2,63
u
SRC=0,11
60
Figura 6.54.- Evoluciones de los componentesdel sistema obtenidos por ajuste delexperimento n
0 1(250(2y 257 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-6.
344
t (ti)
ModeloCinéticode Célula
Tabla 6.64.- Parámetroscalculadospor ajuste de los datos del experimento n0 2.Condiciones experimentales:T280 (2, (2N’C57 p.p.ni de amonio, N=variable (210 r.p.m. inicial> al modelo M(2(2-6.
ParámetroValores de los parámetros
t Student F FiseherMix Ópt Mm
0,302 0,30 0,298 2,2.10~
1989,3
0,018 0,018 0,018 7,5Á0~
0.0502 0,05 0,05 l,2.10~
0,039 0,039 0,039 3,3.10~
0,11 0,11 0,11 5,3.l0~
0,078 0,076 0,074 5,3.102
deStudent(95%confianza»2,093E de Fiseher( 95% deconfianza»2,63
175
1.50
125
-4
E
u
1,00
0,75
0,50
0,25
0,00
SR(2= 0,095
O
Figura 6.55.- Evoluciones de
345
t (ti)
los componentesdel sistema obtenidos por ajuste delexperimenton0 2 (2S 0(2 y 257 p.p.m.de amonioinicial) al modeloM(2(2-6.
Modelo Cinético de Célula
Tabla 6.65.- Parámetros calculados por ajuste de los datos del experimenton0 3.Condiciones experimentales:T310 (2, CN=257 p.p.m de amonio, N=variable(210 r.p.m. inicial) al modeloM(2(2-6.
ParámetroValores de los parametros
t Student F FiseherMáx Ópt Mm
0,402 0,401 0.400 4,2.10~ ¡
3899,3
0,018 0,018 0,018 í,5.i04
0,051 0,051 0,051 5,2.10~
0,036 0,036 0,036 7.2.10~
0,11 0,11 0,11 6.3.10~
- 0,076 - 1,23.102deStudent( 95%confianza»2.101
F de Fisctier ( 95%deconfianza»2,66
1,75
1,50
1,25
E
u
1,00’
0,75
0,50
0,25
0,00
Figura 6.56.- Evoluciones de los componentesdel sistema obtenidos por ajuste delexperimenton0 3 (31 0(2 y 257 p.p.m. deamonioinicial) al modeloMC(2-6..
346
SRC=0,005
t (ti)
ModeloCinéticode Célula
Tabla 6.66.- Parámetroscalculadospor ajuste de los datos del experimento n0 4.Condiciones experimentales:T=340 (2, (2r~e2S7 p.p.m de amonio, Nvariable (210r.p.m. inicial) al modeloM(2(2-6.
ParámetroValores de los parametros
t Student F FiseberMáx Ópt Mm
0,54 0,53 0,52 3,2.l0~
3911,2
0,0173 0,0172 0,0171 2,7.10~
0,05 0,05 0,05 4,3.10~
0,0359 0,0359 0,0359 5,3.l0~
0,103 0,10 0,101 4,3.l0~
- 0,0604 - 9,23.l0~de Student ( 95% confianza>’2,01
E de Fisetier( 95%deconfianza»2,66
1u.
SR(2= 0,011
Figura 6.57.-t(b)
Evoluciones de los componentesdel sistema obtenidos por ajuste delexperimenton0 4 (34 0(2 y 257 p.p.m.deamonioinicial) al modelo M(2C-6..
347
1,25
ModeloCinélico de Célula
Tabla 6.67.- Parámetroscalculados por ajuste de los datos del experimento n0 6.Condiciones experimentales:T280 (2, (2N=130 p.p.m de amonio, Nvariable(210 r.p.m. inicial) al modeloMC(2-6.
ParámetroValores de los parámetros
t Student F Fiseher
0,801 0,800 2,2.l0~
1399,3
0.0271 0,0270 2,5.l0~
0,042 0,042 3,2.l0~
0,054 0.054 0,054 2,.10~
0.079 0.079 0,079 9,3.l0~
0,036 0,035 0,034 7,23.102
de Student ( 95% confianza»2,086E de Fischer(95%deconfianza»2,60
1 flO
‘-4
u
0.75
0.50
025
ono
SRC=0,894
Figura 6.58.- Evoluciones de los componentesdel sistema obtenidos por ajuste delexperimenton0 6 (280(2y 130 p.p.m.deamonioinicial) al modeloM(2(2-6..
t (ti)
348
M’odelo Cinéticode Célula
Tabla 6.68.- Parámetroscalculados por ajuste de los datos del experimentoCondiciones experimentales:T~’280 (2, (2N475 p.p.m de amonio,variable (210 r.p.m. inicial) al modelo M(2(2-6.
ParámetroValoresde los parámetros
t Student F FischerMix
O
Opt Mm
0,532 0,531 ¡ 0,530 3,2.I0~
611.2
0,017 0,017 0,017 2,7.10~
1(3 0,055 0,05 0,05 4,3.1O~
0,03595 0,0359 0,3585 5,3.10~
0,10 0,10 0,10 4,3.10~
- 0,0604 - 9,23.10~deStudent( 95%confianza>’2,080
E de Eisctier(95% deconfianza»2,49
13
1,50
1,25
ne
1,00
0,75
0,50
0,25
0,00
SR(2= 0,93
Figura 6.59.- Evolucionesexperimenton~
de los componentes7 (280(2y 475p.p.m.
del sistema obtenidos por ajuste deldeamonioinicial) al modelo M(2(2-6.
349
on 7.
t(h)
Modelo Cinético nc Célula
6.2.4. Discriminación entre ModelosCinéticos
En el apanadoanteriorsehan mostradolos ajustesde los datosexperimentalesa los
diferentesmodelospropuestosparael crecimientode la bacteriaXanthomonascampestris,a
continuación se va a tratar de seleccionarel modelo de acuerdo a los criterios antes
comentados.
6.2.4.1.CriteriosEstadísticos
Entre los dosesquemasde reacciónsimplificadospropuestos,que correspondena los
modelos MCC-l y MCC-2, se ha observadoque el primero no permite obteneruna
reproducciónde las velocidadesde producciónde los diferentescomponentesclave de los
distintosexperimentosrealizados,por lo cual el citado modeloha sido descartadosegúnun
criterio estadístico,considerandoque el valor de SRC essignificativamentealto, lo que se
traduceen una mala reproducciónde los datos experimentalesde todos los experimentos
ajustadosconel MCC- 1-
Para MCC-2. se plantearondiferentesposibilidadesen función de las ecuaciones
cinéticasprobadasen rl, r3 y r5. La velocidadr2, en todos los modelosha sido potencial1,
pues,como ya sevió, pareceser la única cinéticacon la que seobtienenparámetroscon
valoresestadísticosaceptables.
Así pues, se realizó el ajuste con distintas suposicionesen las cinéticasde estas
reacciones,tal como se ha indicado en el apanadoanterior. Se han propuestoasí cuatro
modelos,cuyasvelocidadesde produccióncorrespondena la indicadaparala simplificación
2 (MCC-2), perovariandolas cinéticasde las velocidadesde reaccióny efectuandodiversas
combinacionesentre ellas <MCC-3, MCC-4, MCC-5 y MCCÓ). Como se ha podido
apreciar, estos cuatro modelos permiten, para todos los experimentos,obtener unos
parámetroscon valores estadísticossignificativamentebuenos.En todos los casos, los
valoresestadísticosde los parámetrosobtenidossuperanlos valoresteóricosde F dc Fischer
y de t de Student, obteniéndoseen todos los casosunos intervalos de confianza muy
estrechos.Por otro lado, los valoresde SRC(sumade residuosal cuadrado)parecenser
3S0
ModeloCinéticode Célula
indicativos de las buenasreproduccionesque se han obtenido en todos los ajustes; no
obstante,puestoque este valor es una forma de medir la reproducibilidadde los datos
experimentales,se muestranen la Tabla 6.69 los distintosvaloresde SRC obtenidosen cada
uno de los experimentos,paralos cuatromodelos,con el fin de analizarsi estepuedeserun
criterio de discriminaciónentreellos.
Tabla 6. 69.- Valoresde SRC (sumade residuosal cuadrado)obtenidosen los ajustesadiferentesmodelosde célulaparacadauno de los experimentosrealizados.
Experimento Experimento Experimento Experimento Experimento Experimento
n”1 n02 n~3 n04 n06 n~7
MCC-3 0,088 0,060 0,008 0,030 0,075 0,750
MCC-4 0,091 0,055 0,005 0,061 0,520 0,950
MCC-5 0,150 0,102 0,010 0,120 0,960 1,200
MCC-6 0,110 0,095 0,005 0,011 0,894 0,930
Se puede observarque los valoresmás bajos de SRC, indicativos de un mejor
ajuste,seobtienenpara los modelosMCC-3 y MCC-4, cumpliéndoseesto paratodos los
experimentos,lo que podríasuponerun criterio aceptablepara discriminar respectoa los
otros dosmodelospropuestos(MCC-5 y MCC-6). Estosúltimos dan buenresultadodesde
un punto de vista estadístico,y además,permitenobteneruna buenareproducciónde los
datosexperimentales,no obstantesegúnel criterio de discriminaciónpor el valorde SRC se
podríandescartarrespectoa los otrosdos.
En comparaciónal modelo MCC-3, que tiene 4 parámetros,los modelosMCC-5 (5
parámetros)y MCC-6 (6 parámetros)ajustanpeor, estoes, se obtienenvaloresde la suma
de residuosal cuadrado(SRC) másaltosa pesarde tenerun mayornúmerode parámetros,
lo cual permite un mejor ajustedebido a que, desdeun punto de vista matemáticose le
proporcionaal sistemaun mayor gradode libertad, lo que deberíapermitiruna mejoraen el
ajuste,esdecirvaloresmenoresde SRC.
35’
ModeloCinético de Célula
Por otro lado, el modelo MCC-4 que posee Y parámetros,no presentavaloresde
SRC significativamenteinferiores a los obtenidoscon MCC-3, a pasarde que seríade
esperarun mejor ajustedebido a que estemodelo disponede más gradosde libertad. Los
valores de la suma de residuos al cuadrado,presentadosen la Tabla 6.69, son muy
semejantesentre ambosmodelos,solo se obtiene un valor inferior de SRC respectoal
modelo MCC-3 parael experimenton06, en el resto,son superioresa los presentadosporel
MCC-3.
En vista de esto, se podría discernir entre ambos modelosdecantándonospor el
MCC-3, no obstantey dado la similitud en los valoresde sumade residuosal cuadradose
van a compararlos cuatro modelosmediantecriterios físicos, por si estospudieranaportar
datosparallegar a unaconclusiónmásclara.
Como se comentóal principiode estecapítulo,un criterio físico de discriminaciónes
la evoluciónde los parámetroscon las variablesestudiadas
Es necesariocomentarqueel experimentorealizadocon 65 p.p.m.deamonioinicial,
no ha sido consideradocomoexperimentocomparativocon los demás. A pesarde obtener
valores estadísticosaceptablespara este experimento,la reproducción de los distintos
componentesdel sistemano ha sido buena,observándosevaloresde SRC significativamente
elevados.Esto, como ya ha sido comentadoa lo largo de la exposiciónde este apartado
pareceser debido a que la estequiometríasupuestano sería la adecuadaen el caso de
concentracionestan bajasde sustratonitrogenado.Al principio de este capítulo, se pudo
observarque, al efectuarel balancede nitrógenoparalos componentesdel sistemaen este
experimento,“faltaba” nitrógeno,es decir la cantidadde nitrógenoque se adicionabaal
medio, era inferior a la encontradaen los componentes.Todo esto parece indicar que la
composicióndel microorganismocambialigeramentecon la composicióndel medio. Por lo
que, a ciertas concentracionesde sustratonitrogenado, la suposiciónefectuadapara el
modelo propuestopuedeno ser adecuadaen ciertos casos. Más adelantese volverá a
comentaresteaspectoy se realizaráun cambiode estequiometríapara verificar lo que se
acabade comentar.
352
ModeloCinéticode Célula
6.2.4.2.- Discriminación por Criterios Físicos: variación de los parámetros con lasvariables
En esteapartadose comparanlas distintastendenciasquepresentanlos parámetros
en función de las variables:temperaturay concentracióninicial de nitrógeno. Se van a
analizar las tendenciaspara cada una de los parámetrosen los modelos que han sido
finalmente considerados:MCC-3 y MCC-4, aunquetambién se incluyen los otros dos
modelosMCC-5 y MCC-6.
• Variacióndeparámetrosdel MC(2-3 con la temperatura
Como ya ha sido expuesto,estemodelo constade cuatroparámetros,debido a las
cinéticaspotencialessupuestasenestecaso.En las Figura 6.60 se muestranlas evoluciones
de los parámetroscorrespondientesa cadaunade las velocidadesde reacción.
La línea continua es la curva real obtenida del valor de los parámetros,la
discontinuaindica la tendenciade la función matemáticaa la que podría serajustadaa la
vista de dichaevolución.
Como se apreciaen la Figura 6.60, el parámetrok1, correspondientea la reacciónr1
(proteínas),muestra una tendencia descendentecon la temperatura. Los parámetros
correspondientesa las reaccionesde velocidadde ácidosnucleicos(Y y k5) muestranuna
tendenciamáso menosconstantecon la temperatura,Figuras6.áOby 6.60c.Aunque parece
quehayunaciertatendenciadescendente(líneacontinua),no sonvaloressignificativamente
distintos,por lo que se podríaconsiderarqueel valor esconstantecon la temperatura.
Finalmente el parámetrok2, correspondientea la velocidad de reacción de los
aminoácidosno formadoresde bases(r2), muestraunatendenciacon un máximo, lo cual
podría ser ajustado a una función tipo Ratkowsky, como ya se ha visto en capítulos
anteriores.
353
ModeloCinético de Célula
• Variación de parámetros del MC(2-4 con la temperatura
En cuantoa la evoluciónde parámetroscon estavariable,parael modeloMCC-4. se
aprecia que la tendenciapresentadapor los parámetrosde la reacciónr[ es distinta. El
parámetrok1, que es el parámetrodel numerador presentaun valor constantecon la
temperatura,mientras que el parámetrodel denominadorK1, presentauna tendencia
pasandopor un máximo,comoseindica en la Figura6.61 a.
Los parámetroscorrespondientesa las ecuacionescinéticas r3 y y5 presentan
tendenciassimilares con la variable en amboscasos,tal como indica la Figura 6.61b y
6.61c;sepuedeasumirque tanto los parámetrosdel numeradorcomodel denominadorde la
ecuacióncinéticacorrespondienteno varían con [atemperatura.
Por último, el parámetrok=correspondientea la reacciónr2, muestrauna tendencia
similar al casoobservadoen el modeloMCC-3, tal como indica la Figura6.61d.
• Variación deparámetrosdel MCC-5 con la temperatura
En estemodelo se consideróla velocidadde reacciónpara r1 como una cinética
hiperbólica,esdecircon dosparámetros,cuyaevoluciónse muestraen la Figura 6.62a. En
ella se apreciaque, al igual que en el casoanterior,el parámetrodel numerador(k1) presenta
una tendenciaconstantecon la temperatura,mientrasque el del denominadorpasapor un
máximo (Kí). Los parámetroscorrespondientesa r3 y r5 tienentendenciasconstantescon la
variable,como indican las Figuras6.62by 6.62c.
El parámetrok2 correspondientea la reacciónr2 no muestrala tendenciahiperbólica
observadaen el modelo MCC-3 y MCC4. En estemodelo,el parámetrok2 no parecetener
una tendenciaclara con la temperatura,lo que podríaser un criterio de discriminaciónde
estemodeloMCC-5, frentea los dosanteriores.
354
Modelo Cinético de Célula
• Variación de parámetros del M(2(2-6 con la temperatura
En este modelo se consideró la velocidad de reacción para r1 como una cinética
potencial tipo 1. Como se apreciaen la Figura6.63, el parámetro k1, muestra una tendencia
similar a una hipérbola invertida. Función muy diferentea la obtenidaen los modelos
anterioresy pocoexplicable
Los parámetroscorrespondientesa u y r5 tienen tendenciasconstantescon la
variable,como indica la Figura 6.63by 6.63c, al igual que ha sido observadoen el restode
los modelos,con independenciade quelas cinéticasfresenpotencialeso hiperbólicas.
El parámetrok2, correspondientea la reacciónu no muestrala tendenciahiperbólica
observadaen el modelo MCC-3 y MCC-4. La curvaesalgo mássuavea lo visto en estos
dosmodeloscomentados,tal como se apreciaen la Figura6.63b.
Denuevopuedeafirmarseque los modelosMCC-5 y MCC-6 no aportannadasobre
el MCC-3, ya que [a variacióndc parámetroscon la temperaturaes más razonableen [os
modelosMCC-3 y MCC-4.
355
ModeloCinético de Célula
0 6 -ia
:61o 1— 0½ vi.
06
1 ________________________
:4 26
1~
3 6161~1
II 60
TOTIVCntIta
¾
.
SO II 60
[oir cnt ira
(03<
O
420-j
630.]
0101
6.’ -
0.10-
0440.
1
o :6 SO lo
1.011, criC
c -
Figura 6.60.- Variación de los parámetrosdel modelo cinético de célula MCC-3 con laTemperatura.a) parámetroparalavelocidadr~ ti) parámetroparala velocidadr3c) parámetroparala velocidady5 d) parámetroparala velocidadr2
-0
Ienhientllra
356
Modelo Cinético de Célula
26 28 30 32 34
Tenperatra
36 28 311
renperawa
Figura 6.61.-Variación deTemperatura.a) parámetroparala velocidadr1c) parámetroparalavelocidadr5
los parámetrosdel modelo cinético de célula MCC-4 con la
b) parámetroparalavelocidadr3d) parámetroparalavelocidadr2
——u
— .--...
— -~1 ~~~—>-
//Y’ a
4
0,12
ojo—
0,08—
2 0,08-
11,04-
0.02-
0.00-
0.12
0.10
O .08
o .ió
¡¡.04
0.02
090
24
020
0.1 11
ti
•—
32 34
E0.10-
0,05
0.00-
Tenvedira
j 0.03 -
23 16 SO 30 32 34
TeripcriC ir a
357
;t’Iodeio Cinético de Célula
14.:¡J o —¡
¡26 j¡5 ¡¡
¡25
¡4.140.]
0.456
0,454
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-a--O
~-61
~0 —2
¡2-.. o’
24 28 14 ¡2 44
Icnpert ura
Figura 6.62.- Variación de los parámetrosdel modelo cinético de célula MC(2-5 con laTemperatura.a) parámetroparala velocidad~L ti) parámetroparala velocidadr3c) parámetroparala velocidadr5 d)parámetroparala velocidadr2
358
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26 28 30 33 34
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24 26 28 30 32 34
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0. ‘Co
44015-
4.050-
•1
—• k
A
24 28 28 30 32 34
Tenperaira
Figura 6.63.- Variación dc los parámetrosdel modelo cinético de célulaMCC-6 con laTemperatura.a) parámetroparala velocidadr1c) parámetroparala velocidadr5
b) parámetroparalavelocidadr3d) parámetroparalavelocidadr2
Modelo Cinéticode Célula
0»—
0.8 —
0?—
0.6
¡¡.5—
~ :7310.2-]
0.!
0.0
006-
o 004
¡3 0’
000
0.00, —
lenvenhira
E 0.04—
—.— k
¡ -—A— 4
--—A —-. —.
A——
—u— —.--.———0.02
4400
10.025
359
Xh)cle¡o <jinético (le (‘élula
• Variación de parámetros del MCC-3 con la Concentración Inicial de Amonio
En cuantoa la evoluciónde parámetroscon estavariable,parael modelo MCC-3, se
apreciaquela tendenciapresentadapor todoses similar.
En la Figura 6.64 semuestraque, paratodos los parámetrosde estemodelo, no hay
una tendencia,el valor es constante.Es decir, su valor no varia con la concentraciónde
amonio inicial, por lo que se concluyequela concentraciónde amonio inicial no influye en
la variaciónde los parámetrosdel modelo,tal como cabíaesperar.
• Variación deparámetrosdel MCC-4 con la ConcentraciónInicial deAmonio
En estecasosepuedeasumirque la tendenciade los parámetroscon la variaciónde
la concentracióninicial de amonioesconstante,al igual queen el casoanterior.
En la Figura6.65, aparecenrepresentados[osparámetrosen funciónde estavariable
paracadaunade las velocidadesde reacción.
• Variación de parámetros del M(2C-5 con la Concentración Inicial de Amonio
En estecaso, [a tendenciade los parámetroscon la variaciónde la concentración
inicial de amonio es también constante,al igual que en los dos casosanteriores.No
obstante,si observamosla Figura 6.66, los parámetrosk; y k5, Figuras 6.66b y 6.66c
respectivamente,muestrancierta tendenciahacia un mínimo con la concentraciónde
amoniode 257 p.p.m.
• Variaciónde parámetrosdel MC(2-6 con la ConcentraciónInicial de Amonio
Como se apreciaen la Figura 6.67, la tendenciade todos los parámetrosdel modelo
es constante,es decir, el valor de los parámetrosno cambia significativamentecon la
concentracióninicial de amonio,al igual queen los casosanteriores.
360
Modelo Cinéticode Célula
¡‘40 24>0 300 404 400
CM(P.P.m)
—. — 6,
b
=040 300
C~(pp.m)44>0 400
[r,7
¡ 4>..
c
_________ 4
¡00 =00 300 400 600
C<ppno)
rn4d
¡¡10 =00 304>
no)400 500
Figura 6.64.- Variación de los parámetrosdelconcentracióninicial de amonio.a) parámetroparalavelocidadr1c) parámetroparalavelocidadr5
modelo cinético de célula MCC-3 con la
b) parámetroparad) parámetropara
lavelocidadr3la velocidadr2
~—.—. ———.¡
• .-——-~ •L____ -
a
4< -
08.-
¡.4 4 —
¡¡.4 —
4.3 -
41-
0.4
:145.
II0.2
¡4,1
4-4II O
0.4
4.6
0.4 —
1 0.4 —
0.3
02 -
0. ¡
0.4
0,——
0.20—
4.45—
0-lo—
0.05
0-.,—
36]
Modelo Cinético de Célula
¡¡ 6 6
ti - —Ajo’
a¡4 1 •i-~- -~- - -~ - A
<i~1 .9-”’ - 1:4444 44>44 4444 440
4>’ ¡A—K ¡
b
4444
.¡61
140 144>
Qj(P p no>
604
- —2
e
tuis
¡444
4-¡04>
¡<¡<4
4>.->
<44>76
4,4)50
--4>240 =00 -4>44> 6<44>
4? ¡9pm>~6. -
de los parámetrosdel modelo cinético de célula MCC-4 con laconcentracióninicial de amonto.a) parámetroparala velocidadr1 b) parámetroparalavelocidadr3c) parámetroparala velocidadr5 d) parámetroparalavelocidadr2
--4——A -—
11
‘¡¡44
Figura 6.65.- Variación
362
4>35
a
4.14>
~
~
¡¡¡<0
4.140—404> ¡40
4.50
415
304>
C>4ppm)
400 4030
4>4.3,
b
4434
4” —
4=44
0.35
0,44>
44.45
441¡.4¡40 200 44>0 4410 400,
<¡--4
9.03,
446 e0.5
¡3--’
4>-;
0.2
0.4
0.0400 200
442
3110
C~<p.p.m)
400 500
-—E —— 4>,
d
230 400 4303 500
modelo cinéticode célula M(2C-5 con la
b) parámetrod) parámetro
parala velocidadr3paralavelocidadr2
C%(P.P.J30)
Figura 6.66.- Variación de tos parámetros delconcentracióninicial de amonio.a) parámetroparala velocidadr1c) parámetroparala velocidadr5
0=4
<0—
ModeloCinéticode Célula
e-
1
1
1 0.4
4440
363
3—leUdo (‘¿‘zétíco de Célula
4--~~~~~‘2-
4-
114>4 44>>>
¡¡
¡ —•— y¡_ a-
ti
<¡5A——-—
¡44444<> =41<>
¡4=41
~ — AA
4444> 4=4 $4144
¡ -.
Liii
c
.,--.4<—
A—
--A—-~
- A
0——--~
¡454--¡44 2450
44,1
--1
lOO -400 6<34=
,
¡¡.418
41.410‘-c—
4>2
d
½
44.44=
240 300 400 444
p no~
Figura 6.67.- Variación de los parámetrosdel modelo cinético de célula MCC-6 con laconcentracióninicial de amomo.a) parámetropara[a velocidadrj b) parámetrospatala velocidadr3c) parámetrosparalavelocidadr5 d) parámetroparala velocidadr2
364
.7’
- I-.k>
a
40
.5
¡¡46
ModeloCinético cíe Célula
Al aplicar, por tanto, los diferentes criterios de discriminación sobre los cuatro
modelosconsiderados,se concluyeque los modelosMCC-3 y el MCC-4 parecenser los que
mejorresultadopermitenobtener.
A pesar de que todos los modelos presentanuna tendenciaaceptablede los
parámetroscon las variables, hay que destacarque el MCC-6 presentael parámetro
correspondientea r2 con una tendenciacon la temperaturaque no parecemuy clara. El
MCC-~5, en la variaciónde parámetroscon el amoniopresentamínimospara r3 y r5, lo cual
no parecesermuylógico.
Por tanto, la evoluciónde parámetrosde los modelosMCC-5 y MCC-6 no parece
aportarningunaventajaque permitaconsiderarque estosmodelosmejoranla reproducción
de los datosexperimentalesrespectoa los otrosdosmodelosplanteados.
Hay que recordarque ambosmodelosposeenun númeromáselevadode parámetros
que el MCC-3, en cambio los valoresde SRC eranmayoresy, como se acabade ver, la
evolución de parámetrosde estos modeloscon las variablesno es indicativa de que se
mejoreel resultadoobtenidocon MCC-3 y MCC-4.
En cuantoal MCC-3 y MCC-4, presentanuna evolución razonablede todos sus
parámetroscon la temperaturay con el amonio.Porello resultamásdificil discriminarentre
ambos. No obstante,y como ya se comentó anteriormente,a pesarde que MCC-3 es el
modelo que presentamenor número de parámetroses con el que se obtienen menores
valoresde SRC. Si bienesteno esun criterio de discriminaciónmuy claro, seva a utilizar
paraelegir el MCC-3 frentea los demás,debidoa queesel modeloen el que el númerode
parámetroses menor (4 parámetros),lo cual simplifica mucho el problema, aspecto
fundamentalen ingeniería.
Por tanto, y debido a que se ha optadopor el MCC-3, se puedenplantearahora
parámetroscomo funcionesde la temperaturaparaestemodelo. Las funcionesse pueden
obtenerpor observaciónde la forma de las curvas de la Figura 6.62; tanto k3 como
presentabanunatendenciaconstantecon la variable,mientrasquer2 parecerespondera una
funcióntipo Ratkowsky,y r1 unavariaciónlineal descendente,de la siguienteforma:
365
ModeloCinético ¿le Célula
k1(T)= C1 ~2 ~ [6.42]
k3(T)= C3 [6.43]
k3(T) C5 [6.44]
r-(T) =1 C’,(T- T’,,03,)[l-exp(C’,.(T- T,ica))i)~ [6.45]
En cuantoal amonio,dadala tendenciaconstantede los parámetroscomo indica la
Figura 6.65, no ha sido necesarioplantearfunciones de los parámetrosen relación a esta
variable.
6.2.5.-Mejora de las DeficienciasObservadasen el ModeloCinético deCélula
A lo largo del apartadoanteriorse han ido exponiendolos resultadosobtenidosal
aplicar diferentesmodelospara la descripcióndel crecimientode Xanthornonascan-ipestris.
Se ha decidido discriminarel MCC-3 frenteal resto de los modelosplanteados,los cuales
también permitían obtener buenos resultados en la reproducción de los datos
experimentales
También se comentéque el experimentollevado a cabo con una concentración
inicial de amoniode 65 p.p.m.(experimenton0 5) no permitíaunaadecuadareproducciónde
los datos experimentalescon ninguno de los modelos planteados.Por otro lado, el
experimentorealizadocon 475 p.p.m. de amonio inicial seconsiguecon una reproducción
aceptable,si bien no tanbuenacomo la obtenidaparael restode experimentosrealizados.
Por tanto, en este apartado se comentaránlas deficiencias encontradasde la
aplicaciónde los modeloscinéticosde célula,y cómo es posiblerealizaruna mejorade estas
deficiencias. Estas mejoras han sido comprobadaspara los dos modelos que han
proporcionadomejoresresultados,estoesel MCC-4 y el MCC3.
366
ModeloCinéticode Célula
•Mejora del ajuste del experimenton0 5 (280 C y 65 p.p.m. de amonio inicial)
La principal deficienciadel modelo cinético de célula planteadoes la encontrada
parael experimentorealizadocon 65 p.p.m. de amonio inicial. Comoseindicó al principio
de estecapítulo, al realizarel balancede nitrógenocon la estequiometríasupuesta,no se
podía cerrar el balancede estecompuesto.Es decir, se encontrómayor concentraciónde
nitrógenoen formade componentesde la biomasa(DNA, RNA y proteínas)quela añadida
comoamonioen el medio de cultivo. Sepuedepensarquela estequiometríaconsideradano
seala adecuadaparaestecaso.
Es sabido que la composiciónde los microorganismoscambiacon la composición
del medio, de forma que la bacteriacon concentracionesmuy bajasde amonio puedeestar
produciendocomponentescon diferente composiciónque cuando la concentraciónde
amonio es máselevada.
Estecambioen la
para la formación de
correspondienteal grupo
nitrógeno(ci del grupoaminodel carbonoa y conotrols nitrógeno/sen [acadenalateral).
composiciónsereflejaráen el tipo (y proporción)de aminoácidos
proteínas. Existen aminoácidos con un solo nitrógeno (el
amino del carbonoa) y otros aminoácidosque poseenmás de un
Es evidenteque el microorganismodebeconsumirmásamonio cuandotengaque
produciraminoácidoscon másde un nitrógenoque cuandoel aminoácidoposeasolo uno.
Ante un cambioen la composicióndel medio, fundamentalmenteen ¡a fuentenitrogenada,
el microorganismoformará aminoácidosde un tipo y de otro, pero no en la misma
proporción. Debido a que no ha sido posible el análisis de dicha proporción entre los
diferentes aminoácidosque constituyenla biomasa,pues se escapaal alcancede este
trabajo, seha realizadounasuposicióncon el fin de verificar si estehechopuedeexplicar
[osresuLtadosencontrados.
La suposiciónefectuadaesque los aminoácidosformados
proteínas, en el experimento realizado con 65 p.p.m de
mayoritariamenteaminoácidoscon un sólo nitrógeno,por lo que
paralos aminoácidosformadoresde basesdadapor la ecuación[6.1
lasiguienteexpresión:
para la producción de
amonio inicial, son
la relación de filiación
5] vienedadaahorapor
367
Modelo Cinético de Célula
0,833C<~H~ O~ ±NH4t±]NAD’—+0,]4CoASH+ATPrt
7’
C5[1 ~5O,5NS0J4-4—i’NADI—J,W )+0.I4CoA±2.491-1,0±ADP±~ [6.46]
En cuanto a las ecuacionesdiferencialesparalas velocidadesde producciónde cada
uno de los componentesdel sistema,la únicaqueseve modificadaporel cambioefectuado
en la estequlometriaes la expresióndadapor la ecuación [6.26], correspondientea la
velocidadde consumode amonio,quedandoahorade la siguienteforma:
dC = 18 (——6 3 [6.47])—2,75•
de - /70,5 /03,5 - 491/6 486,4
El cambio en la estequíometríaha sido realizadoen los dos modelosque daban
mejoresresultados,estoesparael MCC-3 y el MCC-4.
Al efectuar el ajuste en múltiple respuestacon este cambio y considerandolas
cinéticasplanteadaspara MCC-3, seobtienenlos parámetrosque aparecenen la Tabla6.70,
donde puede observarseque los valoresestadísticossuperanlos valores teóricosde t de
Studenty F de Fischercon un 95 % de confianza.Ademásse obtienen valoresde dichos
parámetrossuperioresa los obtenidoscon la estequiometriaanterior. En la Figura 6.68 se
muestrala reproducciónde los datos experimentalescon el MCC-3, modificadoparaeste
caso, observándosela clara mejora en la reproducciónde los datos experimentalessi se
comparacon lo observadoanteriormenteen la Figura6.38.
Parael MCC-4, seobtienenresultadossimilares.En la Tabla 6.71 semuestranlos
valores de los parámetrosasí como las estadísticasobtenidasdel ajuste al modelo,
observándosequesesuperanen todos los casoslos valoresteóricosde t de Studenty de la F
de Fischer.En la Figura 6.69 semuestrala buenareproducciónde los datosexperimentales
con el MCC-4 modificado en comparacióna lo observado,paraestemismo modelo en la
Figura6.45.
368
ModeloCinéticode Célula
Tabla 6.70.- Parámetroscalculadospor ajuste de los datos del experimento n0 2.Condicionesexperimentales:T=280 C, CN=65 p.p.m de amonio, N variable(210 r.p.m. inicial), al MCC-3
Valores de los parámetrost Student F Fischer
0,59 0,58 7,1.102
24300,158 0,155 7,1.10~
0,25 0,24 9,8.10~
0,05 0,049 7,3.10~deStudent( 95%confianza) 2,080
E de Fischer( 95%deconfianza»2,49
8
SRC=0,025
Figura 6.68.- Evoluciones de los componentesdel sistema obtenidos por ajuste delexperimenton0 5 (28 0C y 65 p.p.m.deamonio inicial) al modelo MCC-3,concambioen laestequlometríade los componentes.
369
t(h)
Modelo Cinético de Célula
Tabla 6.71.- Parámetroscalculados por ajuste de losCondicionesexperimentales:1=280C, CN=óS(210 r.p.m. inicial), al MCC-4.
datos del experimento n0 2.p.p.m de amonio, N variable
ParámetroValores de los parámetros
t Student F FiseberMáx Ópt Mm
0,089 0,088 0,088 y,i.io~
4430
0,014 0,013 0.012 5,3.lO~
0,083 0,082 0,081 9,1.l0~
0,052 0,052 0,052 8,5.l0~
0,171 0,17 0,169 6,2.l0~
0,095 0,095 0,095 9,1.1 o~
0.013 0,013 0.013 6.23.10~
deStudent( 95% confianzar2,080F de Fiseher( 95%de confianza»2,49 SRC~ 0,012
—o OtO ~
20
Figura 6.69.- Evoluciones de los componentesdel sistema obtenidos por ajuste delexperimentoit 5 (28~Cy 65 p.p.m. de amonio inicial) al modelo MCC-4con cambioen la estequiometríade los componentes.
370
125
1,00
J.4
• AnunioA RNAy DNAO Pruteina• n¡on~a
.s u0,75-~
030-
-4
1.o
0,25-
0,000 0 30
t (h)
r40
~~1
50 60
ModeloCinéticode Célula
eMejora del ajuste del experimento n0 7 (28~ C y 475 p.p.m.deamonioinicial)
Como ya ha sido expuestoanteriormente,para el experimentorealizadocon una
concentración inicial de amonio de 475 p.p.m., se obtenían valores estadísticos
significativamentebuenosde los parámetros y una aceptablereproducciónde los datos
experimentalescon los modelos MCC-3 y MCC-4, esto es, los que pareceque mejor
describenel crecimiento de la bacteria.No obstante,si comparamoslas reproducciones
obtenidaspor ajustea los citadosmodeloscon las obtenidasparael restode experimentos,
se puedeobservarque la reproducciónde los datosexperimentalesde esteexperimentoes
significativamentepeor.
Una explicación a lo observado,podría ser el efecto tóxico del amonio para el
crecimientodel microorganismoa partir de ciertaconcentración.En la literatura aparecen
referenciassobreel efectotóxico de estecompuestoen el crecimientode microorganismos
(Cid y col., 1996).
La inhibición del crecimiento del microorganismopor la presencia de alguna
sustancia—que puedeser sustratoo producto-en ciertacantidad,ha sido consideradapor
muchosautores,pero la expresiónmáscomúnde inhibiciónporsustrato,esla propuestapor
Waymany Tseng(1976).Estosautoresconsideranque existeunaconcentracióncrítica del
sustrato(Cs~), por debajode la cual no produceinhibición del crecimiento,empleandola
expresión:
dC~ _ p14C5
ch — Q :. 678 = [6.48]
dC~ Fji_.c 1tít LKÑ-c?8 k/ (C~ Csc))jCx :. C~ =C~ [6.49]
Para el caso concretodel experimentorealizado a 475 p.p.m. se ha tomado el
término de inhibición de la ecuación [6.49] y se ha incluido en la expresióndadapor la
ecuación[6.30] correspondienteal términode aminoácidosno formadoresde bases,esdecir
aquellosqueformaránpartede las proteínas,las cualesformaránpartea suvez de la propia
biomasa,quedandolaexpresiónsiguiente:
371
Modelo Cinético de Cétu/a
— (p <i’p~~~ )—k1 ~
67.-Vc )‘ [6.50]
tít
La concentraciónde sustratonitrogenadocrítica (CNG), no se conoceen estecaso,
pero paracomprobaresteefecto inhibitorio se ha supuestoque este valor esde 350 p.p.m
de amonio.
Se ha realizadoel ajustede los datosexperimentalescon el modeloMCC-3 teniendo
en cuentaestamodificación.Los parámetrosobtenidosse muestranen la Tabla6.72, donde
se observa,además,el valor del nuevo parámetroconsiderado.k1 que es la constantede
inhibición por amonio. Los valores estadísticosde los parámetros superan los valores
teóricosde t de Studenty F de Fischer.En la Figura 6,70 semuestrala reproducciónde las
velocidades de los componentesdel sistema. Si se compara con la Figura 6.40,
correspondienteal ajuste de este mismo experimentocon el MCCI, se observa la clara
mejoraobtenidaal considerarel términode inhibición.
Para el ajuste con el modelo MCC-4, los valoresde los parámetrosobtenidosse
muestranen la Tabla 6.73, Los valoresestadísticosde los parámetrossuperanlos teóricos
de la t de Studenty de la E de Fisclier. La Figura6.71 muestrade nuevola claramejoríaen
la reproducciónde los datosexperimentalesal incluir el términode inhibición por sustrato,
al compararcon la Figura 6.47 correspondienteal ajusterealizadocon estemismo modelo
(MCC-4) sin considerarla inhibición por sustrato.Además se consigue un significativo
descensodel valor de SRC.
La tendenciade los nuevos parámetrosobtenidos al considerar el término de
inhibición en fimción de la variable concentraciónde amonio inicial se muestranen las
Figuras6.64 y 6.65, dondeaparecerepresentadoestevalor indicadopor un punto. Ambas
Figuras corresponden a la tendenciade los parámetrosobtenidos por ajuste de los
experimentosrealizadoscondiferentesconcentracionesinicialesde amonio,al MCC-3 y al
IvICC-4, y como sepuedecomprobar,dichatendenciano cambiacuandose incluye este
nuevotérminoal modelo parael experimentorealizadocon 475 p.p.m..
372
ModeloCinéticode Célula
Tabla 6.72.- Parámetroscalculadospor ajuste de los datosCondiciones experimentales:T’280 C, C,e475variable(210 r.p.m. inicial), al modelo MCC-3 con
del experimento n0 7.p.p.n¡ de amonio, Ntérmino de Inhibición.
ParámetroValoresde los parametros
t Student F FiseherMix Ópt Mm
0,53 0,52 0,51 2,1.10~
4635,3
0,154 0,15 0,147 8,2.10~
0,22 0,19 0,16 5,2.102
0,055 0,05 0,045 9,3.102
0,081 0,08 0,079de Student ( 95% confianza»2,080
E de Fischer ( 95% de confianza»2,49
1,75
1,50
1,25
1~u
1,00
0,75
0,50
0,25
0,00
SRC=0,05
50
obtenidospor ajuste delinicial) al modelo MCC4,
373
t (b)
Figura 6.70.- Evoluciones de los componentes del sistemaexperimento n0 7 (28 0C y 475 p.p.m. de amoniocon término de inhibición.
ModeloCinético de Célula
Tabla 6.73.- Parámetroscalculadospor ajuste de los datosCondiciones experimentales:T280 C, CN475variable(210r.p.m. inicial), al modelo MCC-4 con
del experimento n0 7.p.p.m de amonio, N=término de inhibición.
ParámetroValoresde los parametros
t Student F FiseherMáx Ópt Mm
0,122 0,121 0,12 5,í.104
5635,3
K1 0,102 0,101 0,10 7,1.10~
0,022 0,020 0,018 3,1.l0~
0,045 0.045 0,045 5,2.l0~
0,08 0,08 0,08 9,2.10~
0,082 0,078 0,074 3,1.l0~
- 0,05 - 9,23.l0~
0,067 0,067 0,067 9,5 io~de Student ( 95%conflanzat2,93
E de Eischer( 95%deconfianza»2,54
1.75
1,50
1,25
ou
1,00
0,75
0.50
0,25
0,00
SRC= 0,042
50
obtenidos por ajuste delinicial) al modelo MCC4,
t(h)
Figura 6.71.- Evoluciones de los componentes del sistemaexperimento n
0 7 (28 0C y 475 p.p.m.de amoniocon término de inhibición.
374
ModeloCinético de Célula
A lo largo de estecapítulose ha ido desarrollandoel planteamientoy ajustea datos
experimentalesde un Modelo Cinético de Célula para la descripcióndel crecimientodel
microorganismoobjeto de estudio, esto es la bacteria Xanthomonascampestris. De la
aplicación de toda la metodologíadesarrolladaen estecapítulo,seha llegado a dos modelos
que son capaces de describir adecuadamenteel crecimiento del microorganismo, no
observándose,en principio, diferenciassignificativasentreambos.
Se va ahoraa unir estemodelo de célula,con la partecorrespondientea la producción
del polisacárido.Concretamenteseha elegidoel MCC-3 pararealizarla última etapade este
trabajode investigación.De acuerdoa los criteriosde discriminaciónindicadosanteriormente.
Es necesarioahoraunir estemodelode célula -el cual permite predecircambiosen la
composicióndel medio considerando el metabolismodel nitrógeno estructuradoen la
biomasa(DNA, RNA y proteínas)-con el modelo cinético metabólico, el cual aportó
resultadosmuy buenosparala partecorrespondientea produccióndel polisacárido,tal como
se vió en el Capítulo 5 de la presenteMemoria.
Por tanto, en el próximo Capítulo se abordaráel planteamientode un modelo
QuímicamenteEstructuradoparala ProduccióndeXantano,el cual serárealizadocomo
sumade los dos modeloscomentados:el Modelo CinéticodeCélula y el Modelo Cinético
Metabólico.
375
7.- MODEL O CINÉ ricoQUÍMICAMENTE ESTRUCTURADO
Modelo CinéticoQuímicamenteEstructurado
7.- MODELO CINÉTICOQUÍMICAMENTE ESTRUCTURADO
Los Modelos QuímicamenteEstructuradosdescribenel metabolismocomo una red de
reacciones,empleandoparaello esquemassimplificadosde reacción,de la mismamaneraque
en los modelosmetabólicosy en los modelosde célulaya descritosanteriormente.
Un modelode estetipo se puede plantearmediantela unión de modelosmetabólicos
en los quese describela producciónde un productode interésconsiderandoestructuracióndel
sustratocarbonado,dentrode la redsimplificadade rutasmetabólicas-,con modeloscinéticos
de célula- que describenel crecimiento del microorganismoconsiderando la estructuración del
sustratonitrogenado,dentro de la red simplificada del metabolismo del microorganismo
productor-.
Los modelosmáscomplejosvistoshastaahorahan sido los modelosdecélula,con los
que podía realizarseuna buenadescripcióndel crecimientodel microorganismoteniendoen
cuentala evoluciónde unaseriede componentesintracelularesqueconstituyenla biomasadel
mismo. En la literatura existe escasainformación sobre este tipo de modelos, solo se han
realizadointentos por describirel crecimientoutilizando estos modelossobresistemasmuy
conocidos como Escherichia coli o Bacillus subtillis y, en ningún caso, sobre
microorganismosde interésindustrial.
377
ModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado
Porestarazón,esnecesariala propuestade los modelosquímicamenteestructurados,es
decir, que considerenpor un lado los principios del modelo de célula, pero ademáslos del
modelo metabólico tratando de hacerposible la descripción de una producciónde interés
industrialy. con ello, utilizar la informaciónen el cambiode escaladel proceso.
A pesar de las grandes ventajas que pueden ofrecer los modelos químicamente
estructurados,no existeen la literaturaningúnprecedenteen la líneaindicada.La modelización
más complejavista hastaahorase ha quedadoal nivel de modelosde célula,dondetampoco
existen muchos trabajos. y donde se realiza únicamente,como ya se ha comentado,la
estimaciónde parámetrossin ajustede datosexperimentales.
En el capítulo5 de la presentememoriaseaplicó un modelo cinéticometabólicopara
la descripciónde la produccióndexantano.En estemodelo se estructuróel metabolismodel
sustratocarbonado,sin diferenciarpartesde la biomasa,ya que éstaera descritamediantela
ecuaciónlogística, es decir, se considerabano estructurada.Como ya fue comentado,los
resultadosobtenidoscon estemodelo fueronsignificativamentebuenosparala descripciónde
los componentesdel sistema,como xantano,fuentecarbonada(sacarosa)y oxigenodisuelto.
Además se planteó un modelo en función de una de las variables estudiada,esto es [a
temperatura.Las ecuacionesparalas velocidadesde producción,las ecuacionescinéticaspara
estemodelo,juntocon el valorde los parámetrosobtenidossemuestranen la Tabla7.1.
Por otro lado, en el capítulo anterior se planteó un modelo más complejo para el
crecimientodel microorganismo,dadoquesu descripciónhabíasido realizadahastaahorasolo
de forma no estructurada.Se trataahorade estructurarel metabolismodel sustratonitrogenado
parala descripciónde la partecorrespondienteal crecimientodel microorganismo,uniéndolo,
en este caso, con el metabolismocorrespondientea ¡a producción. Del planteamientoy
posterioraplicación del modelo cinético de célula, se obtuvo un modelo cuyos parámetros
pudieronserpuestosen función de la variabletemperatura, pero ademásno variaban con
relación al nitrógeno inicial puestoen el experimento;con lo que este modelo permite la
predicciónde cambiosen el sistemafrente a cambiosen la composicióndel mediode cultivo,
algo sin precedentesen la literatura,como ya seha explicado.Las velocidadesde producción
de los componentesdel sistemajunto con las ecuacionescinéticasde este modelo cinético
vienendadaspor las ecuacionesde la Tabla7.2.
378
ModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado
Tabla 7.1. Ecuacionescorrespondientes al Modelo Cinético Metabólico planteadopara ladescripciónde la producciónde xantano.
MODELO CINÉTICO METABÓLICO
Para la biomasa:
dC~ ~ ~
diCx
+
[7.!]
4.
Velocidadesde
Producción
EcuacionesCinéticas
Para el azúcar:
¿1C~
di
5,94 dCp~180L 923,2 di
1 ¡<j
12 K4±C0,
Cx ji 3.5818
1 dC~
Yv~ d~Para el producto:
dC1. — 923,2
di +
1 + 4 L~8+4
7A 7?!’
¡<(7’) 1 094- (7’ -19,45)11- exp<’l,399 . IT - 34,24))112 [7.10]
Parámetros¡<(7’) = —2,913+2,0487’ [7.11]
con la {0597~<7’ -24,35)1!- expi—0,205(7’- 37,16)flí [7.121¡ Temperatura = ÚL340+(6 ,/ . 10’)•T [7.13]
Para la evoluciónde oxigeno disuelto:
dr 923,2 di +
l~
+ Co2
1 k4C0,r 12 K,, + C0,
y —¡yrp
E $~
~y +I<LCIV .(c—c0, )~ 1>‘ox
CxC ±1’
Y u NN
l+4Y;p jY
3~~8~44Á7P)
C
ti —3,581 1 + 4 YrpA ~3,58+ 4~ Li TPP
Co,
+
Li TPP~34
ji
[7.2]
[731
dCx
di[7.4]
[7.5]
[7.6]
[7.7]
[7.8]
[7.9]
379
Modelo CinéticoQuímicamenteEstructurado
Tabla 7.2. Ecuacionescorrespondientesal Modelo Cinético Metabólico planteadopara ladescripciónde la producciónde xantano.
MODELO CINÉTICO de CÉL ULA
Velocidadesde
Producción
Para La biomasa:
RNA
DNA
Proteínasintracelulares
dCA. — RNA dCD4tA+ +
di tít <It tít
di
dc /~j4.\•,.j
= y.
dr
dCPPJ=y1~ dC~~tít di
Para el amonio:
dC~~4. =181—1,4 1$ — 12
dt 136,5 103,5
,..,
275 ~)478,6 491,;
EcuacionesCinéticas
Parámetroscon la
Temperatura
C.C
= ¡<3 C,~
r3 =Ic~ C~ C<
=k2 CN
k~(T) 1,49—0,0367’
kg’1’) = 0,150
k~(T)=0.198
k,(77) = ( 0,041 iT - 21)/I -evxp(O,352 (T- 3508)4<
[7.14]
[7.15]
[7.16]
[7.17]
[7.18]
[7.19]
[7.20]
[7.21]
[7.22]
[7.23]
[7.24]
[7.25]
[7.26]
380
ModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado
7.1.-PLANTEAMIENTO DEL MODELO
Se trataahorade plantearun Modelo QuímicamenteEstructurado(MQE) que, comoya
se ha indicado, se va hacercomo sumade un modelo cinético metabólicoy de un modelo
cinético de célula.
Se realizará, por tanto, la unión de los dos modelosde este tipo que ya han sido
aplicadosen el presentetrabajo.Al unir ambosmodelos,la partecorrespondientea biomasadel
modelo metabólico(ecuación[7.1]) quedaahoradesglosadaen las expresionesdel modelo
cinético de célula (ecuaciones[7.14] a [7.17]). Además,es necesariocambiar el término
correspondienteal rendimientode azúcaren biomasa(Yxs)de la ecuación[7.2], que debe ser
ahoradesglosadoen los términos correspondientesal azúcarque va a parara biomasa,de
acuerdoa las relacionesestequiométricasentreel azúcary los componentesdel sistema,vistas
en el capítuloanterior(ecuaciones[6.15]a [6.19]),los cambiossedestacanen negrita:
dC8 5,94 dCl, 1 kjC0 [ (1 + ~dr —180<— 923,2 dr 12 Ki + C0, . Cx .[I~3.58j3s8+ ~. Y,~JJJ
—0,933< ,> 0,5< )-.- 1,08< ) J,12.( [7.27]136,5 103,5 491,87 486,7
De estaforma, el modelo químicamenteestructuradopropuestoparala producciónde
xantanoconsta de 7 respuestas:las correspondientesa la biomasa,es decir, DNA, RNA,
proteínasintracelulares,la correspondienteal nitrógenoy lasde la partede producción,esdecir
xantano, sustrato carbonadoy oxígeno disuelto. Incorporando las ecuacionescinéticas
propuestasen anteriorescapítulos, el modelo propuestoconstade 18 parámetros,tal comoha
sido indicadoen lastablasanteriores.
En estecaso,no se va a realizarel cálculo de los parámetrospor ajustede datos
experimentalesdebido a que este modelo cinético es, en realidad, la suma de los dos
modeloscitados, cuyos valoresde parámetrosya habíansido obtenidospor ajustede datos
experimentales.Por otro lado, el abordajematemáticode un modelo de este tipo, con tan
elevadonúmerode parámetros,seríamuy complejo.
381
;VfodeloCinético Oi¡hnicamenreEsuz¿cturado
Por tanto, se van a emplearlos parámetrosobtenidosde cadauno de los modelos,
con el fin de observarsi el Modelo CinéticoQuímicamenteEstructuradoplanteadoescapaz
de reproducirlos resultadosexperimentalesde cadauno de los experimentosllevadosa cabo
en estetrabajo. En la Tabla 7.3 aparecenlas ecuacionescon el valor de los parámetrosdel
modeloen función de la temperatura.
Tabla 7.3.-Valor de los parámetrosen funciónde la temperaturaempleadosQuímicamenteEstructurado.
parael Modelo
kIT,) 0,94 (T -19,45) [1- exp(1,399 •<T -34,24»j}2 [7.28]
kYT} = —2,913 + 2,048 T [7.29]
y0~ IYD = 0,597.iT -24,35)11-exp<—0205 <7’- 37,16)< [7.30]
Y,\%(T)= 0,3404(—6,1103)T [7.31]
Ic~(T) = 1,49 —0,0367’ [7.32]
kjT) = 0,150 [7.33]
<(7’) = 0,198 [7.34]
k,(T)={0,041(T-21)fI-exp(0.352(T-3S,O8))] [7.35]
382
ModeloCinéticoQuimicamenteEstructurado
7.2.- APLICACION DEL MODELO CON DATOS EXPERIMENTALES
Paraaplicarestemodelo, seha realizadola reproducciónde los datosexperimentoa
experimento,empleandolos parámetrosindicados, y se han comparadotanto con los
resultadosexperimentalescomo con ¡a reproducciónobtenidapor el modelo metabólico,
con el fin de observarqué mejoraspuedeaportar el Modelo Cinético Químicamente
Estructurado.
En las Figuras7. 1 y 7.2 semuestranlos resultadosde las reproduccionescon ambos
modelosparael experimentou0 1, llevado a caboa 250 C y con 257 p.p.m.de amonio
inicial. En la Figura 7.1 secomparanestosresultadosparala evoluciónde la biomasay de
amonio. Se puedeapreciar que el MQE (línea continua) predice una concentraciónde
biomasaen la fase estacionariaalgo inferior a la obtenidacon el MMET. Además,se
observala clara mejoria que introduce el MQE en la reproducciónde la evolución de
amonio. En la Figura 7.2 aparecela reproduccióncon ambosmodelosde la velocidadde
formaciónde xantano,de consumode azúcary evoluciónde oxígenodisuelto. En la citada
figura se puedever que el MQE predice una concentraciónde xantanoinferior a la que
predice el MMET, con lo que se explica la menor velocidadde consumode azúcar y
oxígenocon estemodelo en comparacióncon el modelo metabólico.Estasdiferenciasson
seguramentedebidasa la inferior cantidadde biomasaqueprediceel MQE.
En las Figuras 7.3 y 7.4 semuestranestosmismos resultadosparael experimento
u0 2, realizadoa 280 C y con 257 p.p.m. de amonio inicial. En la Figura 7.3 se observa
que MQE (línea continua), de nuevo, predice una concentraciónde biomasaen la fase
estacionariade crecimientoalgoinferior a la obtenidacon el MMET, no siendoasí durante
la fase exponencial.Ademásseobservala mejor reproducciónde la evolución de amonio
introducidaporel MQE. En la Figura 7.4 aparecela reproducciónconambosmodelosde la
velocidadde formación de xantano,de consumode azúcary la evolución de oxígeno
disuelto. El MQE predicetambiénen estecasouna concentraciónde xantanomásbajaque
la que seobtienecon el MIPvIIET y, en consecuencia,una menorvelocidadde consumode
azúcary oxígeno.
383
ModeloCinéticoQuiniicamenteEstructurado
Las Figuras7.5 y 7.6 muestranlas reproduccionesde los datosexperimentalesobtenidas
con ambosmodeloscomentados,parael experimenton0 3. llevado a caboa 3I~ C y con
257 p.p.m. de amonio inicial. Los resultados obtenidos para la biomasa y la evolución de
amonio aparecenen la Figura 7.5. En estecaso las diferenciasentreambasvelocidadesde
formación de biomasa no son muy significativas, si bien es ligeramente mayor la
concentraciónde la biomasaque prediceel MMET. Además,se observala clara mejoría
que introduce el MQE en la reproducciónde la evolución de amonio. En la Figura 7.6
aparecela reproduccióncon ambosmodelosde la velocidadde formación de xantano,de
consumode azúcary evoluciónde oxigenodisuelto. En la citadafigura se puedever que la
evolución de los componentescitados es muy similar, siendo ligeramente inferior la
velocidadde formaciónde xantanoen el MQE.
En las Figuras 7.7 y 7.8 se muestranestosmismos resultadoscon el experimenton0
4, llevado a cabo a 340 C y con 257 p.p.m. de amonio inicial. En la Figura 7.7 sepuede
ver que no hay diferenciassignificativasen la evoluciónde biomasaque predicen ambos
modelos;sin embargo,hay ciertadiferencia,como se ha ido viendo,en la reproducciónde
la evoluciónde amonio introducidapor el MQE. En la Figura 7.8 apareceLa reproducción
con ambosmodelosde la velocidadde formaciónde xantano,de consumode azúcary la
evoluciónde oxígenodisuelto.Sepuedeapreciarque apenashaydiferenciasen la evolución
de estoscomponentesen los dosmodelosque seestáncomparando.
En las Figuras7.9 y 7.10 se muestranlas reproduccionesde los datosexperimentales
parael experimenton0 5, realizado a 280 C y con 65 p.p.m. de amonioinicial. Hay que
destacarque, en estecaso,se empleael cambiode estcquiometríaparael amonio (ecuación
[6.47]), que ya fue visto en el capituloanterior.En la Figura 7.9 seobservaque la biomasa
obtenidacon el MQE es significativamentemenorque la obtenidacon e] MMET. En la
Figura 7.10 aparecela reproduccióncon ambosmodelosde la velocidadde formación de
xantano, de consumode azúcar yla evolución de oxigeno disuelto, observándoseque
tambiénla producciónde xantanoesmenoren el casodel MQE queen el MMET, lo que de
nuevoparecerelacionadocon la infraestímaciónde biomasa.
384
ModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado
En las Figuras 7.11 y 7.12 se muestran las reproduccionesde los datos
experimentalespara el experimentoo’ 6, llevado a caboa 280 C y con 130 p.p.ni. de
amonio inicial. En la Figura 7.11 se observaque apenashay diferenciaentre la evolución
de biomasaobtenidapor el MQE y la obtenidacon el MMiET, si bien, en estecaso, la
concentraciónde biomasaen la faseestacionariade crecimientoobtenidacon el MQE es
mayorquecon el modelometabólico.En la Figura7.12 aparecela reproduccióncon ambos
modelosde la velocidadde formaciónde xantano,de consumode azúcary la evoluciónde
oxígenodisuelto,observándosequeno haydiferenciasdestacables.
En las Figuras 7.13 y 7.14 se muestranestos mismos resultadospara el
experimento n0 7, llevado a cabo a 280 C y con 475 p.p.m. de amonio inicial. En este
caso,el ajusteesrealizadocon el MCC-3 modificado,es decir, el que tiene en cuentael
término de inhibición del crecimientocon estaconcentraciónde sustratonitrogenado.En la
Figura7.13 seobservaque MQE (líneacontinua)prediceunaconcentraciónde biomasaen
la fase estacionariade crecimiento algo inferior a la obtenidacon el MMIET. Ademásse
observa,de nuevo, la mejor reproducciónde la evoluciónde amonio con el MQE. En la
Figura 7.14 se ha representadola reproduccióncon ambos modelosde la velocidadde
formaciónde xantano,de consumode azúcary la evoluciónde oxígenodisuelto.El MQE
predicetambiénenestecasounaconcentracióndexantanomásbajaa la que seobtienecon
el MJvIET y, en consecuencia,una menor velocidadde consumode azúcary oxígeno.
Si bien las diferenciasen las reproduccionesde los datos de cada uno de los
experimentosno son muy significativas, se observa que el modelo químicamente
estructurado predice, salvo en el experimento n0 6, una menor concentracióndel
polisacárido.Esto pareceser debido a que la biomasaque prediceel MQE es también
inferior a la queprediceel MIEMy ala obtenidaexperimentalmente.Como ya seha visto, la
curva de evolución de biomasa obtenida con el Modelo Cinético Químicamente
Estructuradoes, en casi todos los experimentos,inferior a la obtenida con el Modelo
CinéticoMetabólico. Estapequefladiferenciaen la biomasaeslaqueprovoca,por tanto, la
diferenciaen la predicciónde algunosotros componentes(xantanoy azúcar) en la parte
correspondientea laproducción.
385
ModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado
2,0
Figura 7.1-
.4
ti.
=9
‘5’
Figura 7.2-
1,0
0,5
Ox)60
Comparaciónde la reproducciónde la evolución de biomasay amoniodelexperimenton0 1 (25 0C y 257 p.p.m. de amonio inicial) entre el ModeloCinéticoMetabólico(líneadiscontinua)y el ModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado(líneacontinua).
25
2.0
15
1.0 t
05
0~O
Comparaciónde la reproducciónde la evolución de sacarosa,xantanoyoxigenodisueltodel experimenton0 1(250C y 257 p.p.m.deamonioinicial)entreelModeloCinéticoMetabólico(líneadiscontinua)y el ModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado (líneacontinua).
t(h)
40
O lO 20 30 40 50 60
(h)
386
ModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado
~0
5’.4
=9zu
Figura 7.3-
(5.
a
0,6
0,4
0,2
0,060
Comparaciónde la reproducciónde la evolución de biomasay amonio delexperimenton0 2 (28 0C y 257 p.p.ni. de amonio inicial) entre el ModeloCinético Metabólico (línea discontinua) y el Modelo Cinético QuímicamenteEstructurado(líneacontinua).
2,5
2,0
o
lo ~‘u
0,5
0,0
t (h)
Figura 7.4.- Comparación de la reproducciónde la evolución de sacarosa,xantanoyoxígeno disuelto del experimenton0 2 (28 0C y 257 p.p.ni. de amonioinicial) entreel Modelo CinéticoMetabólico(líneadiscontinua)y el ModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado(líneacontinua).
1,2
1,0
0
30
t(h)
0 10 20 30 40 50 60
387
ModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado
‘9=9u
=9u
Figura 7.5-
-4
(1‘-4
=95’
Comparaciónde la reproducciónde la evolución de biomasay amoniode]experimento n0 3 (31 0C y 257 p.p.m. de amonio inicial) entre el ModeloCinético Metabólico (línea discontinua) y el Modelo CinéticoQuímicamenteEstructurado (líneacontinua).
2,5
2,0
x1,0
u
0,5
0,003
Figura 7.6.- Comparaciónde la reproducciónde la evolución de sacarosa,xantanoyoxigenodisueltodel experimenton0 3 (31 0C y 257 p.p.m.deamonioinicial)entreel ModeloCinéticoMetabólico(línea discontinua)y elModeloCinéticoQuimicamenteEstructurado(líneacontinua).
388
t(b)
45
ModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado
2,0
1,5
0,5
O.
Figura 7.7-
(5-
5’
Figura 7.8.-
Comparación de la reproducción de la evolución de biomasa y amonio delexperimento n~ 4 (34 0C y 257 p.p.m. de amonio inicial) entreel ModeloCinéticoMetabólico(líneadiscontinua)y el Modelo CinéticoQuímicamenteEstructurado(líneacontinua).
2,5
2,0
I,5~
t.
lo‘1
0,5
0,0
Comparación de la reproducciónde la evolución de sacarosa,xantanoyoxigenodisueltodelexperimenton0 4 (340C y 257 p.p.ni. deamonioinicial)entreel ModeloCinéticoMetabólico(líneadiscontinua)y elModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado(líneacontinua).
389
‘5’.4
=95’
O lO 20 30 40
t(h)
t (h)
ModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado
2.0
.5—
O
5u
1.0
0.5
0.0o I0 20 30 40 50 60
t (h)
Figura 7.9.- Comparaciónde la reproducciónde la evolución de biomasay amonio delexperimento n0 6 (28 0C y 65 p.p.m. de amonio inicial) entre el ModeloCinéticoMetabólico(líneadiscontinua)y el ModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado(líneacontinua).
(5-
u”
2,5
z0
“5;
t
toQ=
cts
QO
Figura 7.10.- Comparaciónde la reproducciónde la evolución de sacarosa,xantanoyoxígenodisueltodel experimenton0 5 (28 0C y 65 p.p.¡n.deamonioinicial)entreel ModeloCinéticoMetabólico(líneadiscontinua)y el Modelo CinéticoQuímicamenteEstructurado (líneacontinua).
390
• •
• c~•
I~ U u
a
tu —e— —
t (h)
ModeloCinéticoQuímicamente Estructurado
2,0
1.5
5’
=96<
1,0
0.5
0,060
Figura7.11.-Comparaciónde la reproducciónde la evolución de biomasay amonio delexperimenton0 6 (28 0C y 130 p.p.m. de amonio inicial) entreel ModeloCinéticoMetabólico(líneadiscontinua)y el ModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado (líneacontinua).
(5.
.4
=9u”
2,5
2,0
1,5o
u1,0
0,5
0,0
Figura 7.12.- Comparaciónde la reproducciónde la evolución de sacarosa,xantano yoxigenodisueltodelexperimenton0 6 (28 0C y 130 p.p.m. de amonio inicial)entreelModeloCinéticoMetabólico(linea discontinua)y elModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado (líneacontinua).
t(h)
t (h)
391
2,0
ModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado
á5’.4
4u
Figura 7.13-
40
35
30
4
rs
25
20
I5
Comparaciónde la reproducciónde la evolución de biomasay amoniodelexperimenton0 7 (28 0C y 475 p.p.ni. de amonio inicial) entreel ModeloCinético Metabólico ([inea discontinua) y el Modelo CinéticoQuímicamenteEstructurado <línea continua).
lo.
O
2,5
24
E5
o
CF
cts
00
Figura 7.14.- Comparaciónde la reproducciónde la evolución de sacarosa,xantanoyoxígenodisuelto del experimenton0 7 (28 oc y 475 p.p.m. de amonio inicial)entreel ModeloCinéticoMetabólico (líneadiscontinua)y el Modelo CinéticoQuímicamenteEstructurado (líneacontinua).
0 lO 20 30 40
t(h)
O lO 20 30 40 50L (h>
392
Modelo CinéticoQuímicamenteEstructurado
7.2.1. Meiora del Modelo QuímicamenteEstructurado
En vista de los resultadosobtenidos con el Modelo Cinético Químicamente
Estructurado,sepuedeconcluir que los resultadosobtenidosson,como cabíaesperarmuy
semejantesa los obtenidoscon el Modelo Cinético Metabólico. No obstante,en todos los
experimentoscon la excepcióndel experimentorealizadoa 130 p.p.m, seobservaque el
?vIQE predice una concentraciónde biomasaalgo inferior a la experimental,y también
inferior a la que prediceel modelo metabólico.Estadiferenciaen la biomasaserefleja en la
evolución de xantanoy azúcar, de forma que la concentraciónde xantanotambiénes
inferior en el MQE y por tanto también es menor el consumode azúcary de oxígeno
disuelto.
La diferenciade laconcentraciónde biomasacon el MQE respectoa la experimental
ya fue observadaen el capituloanterior.Esto puedeserdebidoa que estemodelo considera
la biomasacomo la suma de tres componentesintracelulares,es decir la suma de la
concentraciónde DNA, de RNA y de proteína intracelular en cada momento de la
fermentación,y puedeserque hayaotro componenteque tengaun pesoapreciableen dicha
biomasa.
Puede ser que el microorganismo,segúnlas condicionesen las que se realice el
proceso.acumuleotro compuestointracelularmente,probablementehidratosde carbono,los
cualesno hansido analizadosexperimentalmente.De esta forma, segúnLas condicionesa
las que se hayarealizadola fermentación,la diferenciaentre la biomasateórica(sumade
DNA, RNA y proteínasintracelulares)y la experimentalpuedesermayoro menor.
Porello, sehapensadoen realizarajustescon el ModeloQuímicamenteEstructurado
de los datosexperimentales,incluyendo un nuevotérminoen la ecuacióncorrespondientea
la evolución de biomasa,que corresponderáal componenteintracelular que se acumula
(hidratos de carbono), en la ecuación correspondientea biomasa.Así la velocidad de
producciónde biomasavienedadaahorade la siguienteforma:
cIC~ — dCP~PJA + dCDNA + dCppj Q%~. [7.36]
dt dt dt tít +kHc
393
¡VIoc/eleCinéticoQuímicamenteEstructurado
Ya se ha comentadola grandificultad, desdeun puntode vista matemático,de realizar
ajustesen múltiple respuestacon un modelo con un númerotan elevadode parámetros.Por
ello, los ajusteshansido realizadosfijando el valorde los parámetrosyacalculadosde la forma
explicada, y dejandoflotar únicamenteesteparámetrocorrespondientea hidratosde carbono
(kHc).
En la Tabla 7.4 se muestranlos valoresobtenidosdel parámetrokHc por ajuste en
múltiple respuestacon el modelo MQE paracadauno de los experimentosrealizadosen este
trabajo.
Tabla 7.4.- Valor del parámetro kuc obtenido por ajuste del MQE a los datos de losexperimentosllevadosa caboen estetrabajo. ________________
Panámetro t Student
¡ Experimento Max. Opt. Mm Obt. Teor
¡ 4.2. í04 TÑo”’ ““TéTif”’5,1.i0~ 2.9
2 302.10” 3.0110” TbéiÁ0’t5IO~ 2,92
3 1.51.10’
‘7717101
TIbio’ 1,49.10~ 4.2.1O~ 2.73
4 l,52.Iff’ ?,51.lO~ 6,1.10 3.25
5 2,7.I0~’ 2,71.10’ 2,71.10’ 5,1W 2,70
6 2,8.10~’ 2,8.10~ 2,8.10~ 7,2.10~ 2,92
7 3.21.10” ‘ 3.2.10’ 3,19.10’ 2.2.10~ 2,9
En las Figuras 7.15 a 7.28 se muestranlos resultadosobtenidosde la reproducción
de los datosexperimentalescon el Modelo QuímicamenteEstructuradoteniendoen cuenta
el término de hidratos de carbono en la evolución de biomasa. Al igual que en el caso
anterior, se muestranlos resultadosobtenidos con este modelo, indicados con línea
continua, y su comparacióncon el modelo cinético metabólico, indicado por línea
discontinua.Como puedeobservarseen las citadas figuras se obtiene una si~íflcativa
mejora en la reproducción de los datos experimentales,especialmenteen aquellos
experimentosdonde la diferencia entre la biomasateórica y la experimental era más
significativa.
Por tanto, se concluyeque al incluir el término de hidratosde carbonocomo otro
componentemás de la biomasase mejorasignificativamentela reproducciónde los datos
experimentalescon el ModeloQuímicamenteEstructurado.
394
ModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado
2,0
1,5
u”-4
=96<
1,0
0,5
0,060
t(h)
Figura 7.15-
(3.4.59u”
Comparaciónde la reproducciónde la evolución de biomasay amonio delexperimenton0 1 (25 ‘C y 257 p.p.m. de amonio inicial) entreel ModeloCinético Metabólico (línea discontinua) y el Modelo Cinético QuímicamenteEstructuradocon el términode hidratosdecarbono(líneacontinua).
2.5
2.0
1.5;
t.1.0 .s
0.5
0.0O lO 20 30 40 50 60
t (ti)
Figura 7.16.- Comparaciónde la reproducciónde la evolución de sacarosa,xantanoyoxígenodisuelto del experimenton0 1(250C y 257 p.p.m.deamonioinicial)entre el Modelo Cinético Metabólico (línea discontinua) y el Modelo CinéticoQuímicamenteEstructuradocon el termino de hidratos de carbono (líneacontinua).
rO lO 20 30 40 50
395
¡Viodelo CinéticoQuímicamenteEstructurado
2.0
“y
5’
.4
Figura 7.17-
LO
0,5
0.060
Comparaciónde la reproducciónde la evolución de biomasay amonio delexperimenton0 2 (28 0C y 257 p.p.mn. de amonio inicial) entreel ModeloCinético Metabólico (línea discontinua) y el Modelo Cinético QuímicamenteEstructuradocon el términode hidratosde carbono(líneacontinua).
(5.
=9cf
2,5
2,0
1<
o
IOy
0,5
0,0
tQ,)
Figura 7.18.- Comparaciónde la reproducciónde la evolución de sacarosa,xantanoyoxigenodisueltodel experimenton0 2 (28 oc y 257 p.p.m.deamonio inicial)entreel ModeloCinéticoMetabólico(líneadiscontinua)y el ModeloCinéticoQuímicamente Estructurado con el término de hidratos de carbono (líneacontinua).
t(h)
0 lO 20 30 40 50 60
396
ModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado
5’.4
.59.5’
40
Figura 7.19- Comparaciónde la reproducciónde la evolución de biomasay amoniodelexperimenton0 3 (31 0C y 257 p.p.m. de amonio inicial) entre el ModeloCinéticoMetabólico(líneadiscontinua)y el Modelo CinéticoQuímicamenteEstructuradoconeltérminode hidratosde carbono(líneacontinua).
14.59u”
2,5
2,0
l,5
o
‘CF
0,5
0,040
t (ti)
Figura 7.20.- Comparación de la reproducción de la evolución de sacarosa,xantano yoxígenodisuelto del experimento n0 3 (31 0C y 257 p.p.n. de amonio inicial)entreel ModeloCinético Metabólico (línea discontinua) y el Modelo CinéticoQuímicamenteEstructuradocon el término de hidratos de carbono (líneacontinua).
O lO 20 30
t(h)
-y-0 10 20 30
397
Modelo CinéticoQuímicamenteEstructurado
2.5
5’
.59
.4
0,5
0.0
ci..4
.59u”
2.5
2,0
I,5’9
o4
1,0 ~u
0,5
0,0
Figura 7.22.- Comparación de la reproducción de la evolución de sacarosa,xantano yoxígenodisueltodel experimenton0 4 (34 0C y 257 p.p.m. de amonio inicial)entreel ModeloCinéticoMetabólico(líneadiscontinua)y elModeloCinéticoQuímicamente Estructurado con el término de hidratos de carbono (líneacontinua).
398
2,0
t(l¡)
Figura 7.21- Comparación de la reproducción de la evolución de biomasa y amonio delexperimento n0 4 (34 0C y 257 p.p.m. de amonio inicial) entre el ModeloCinético Metabólico (línea discontinua) y el Modelo Cinético QuímicamenteEstructurado con el término de hidratos de carbono (líneacontinua).
(lii
ModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado
30T
40 50 60
Comparaciónde la reproducciónde la evolución de biomasay amoniodelexperimento n0 5 (28 0C y 65 p.p.m. de amonio inicial) entre el ModeloCinéticoMetabólico (línea discontinua) y el Modelo Cinético QuímicamenteEstructuradoconel términode hidratosde carbono(líneacontinua).
4Q4
30-
u”20 J
lO-,
o1> 10 20 30 40 50
2,5
2,0
LS;
ao60
jo,)
Figura 7.24.- Comparación de la reproducción de la evolución de sacarosa,xantano yoxígenodisuelto del experimenton0 5 (28 ‘C y 65 p.p.m. de amonio inicial)entreelModeloCinéticoMetabólico(líneadiscontinua)y el ModeloCinéticoQuímicamente Estructurado con el término de hidratos de carbono (líneacontinua).
2,5
2.0-
‘.5
1.0-
u
0.0
• ¡
- r~4f~—.~ .- — n9•mp •mp 3 —
o lo 20
Figura 7.23-
a’;;a’;,
4 u 44
u.U
¡ u4 4 5
44 AA
.. e”‘0
aA
nfl..-& .A..’......A-- - -
399
ModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado
lo 20 30
t(h)40 50
Figura 7.25- Comparaciónde la reproducciónde la evolución de biomasay amoniodelexperimento n0 6 (28 0C y 130 p.p.m. de amonio inicial) entreel ModeloCinético Metabólico (línea discontinua) y el Modelo Cinético QuímicamenteEstructurado con el término de hidratos de carbono (línea continua).
40
35
(Y-4
=9cf
30
25
20
‘5.
lo
5
2,5
2,0
1,5o
u
0,5
0 0,00 10 20 30 40 50 60
Figura 7.26.- Comparación de la reproducció¡v’~tle la evolución de sacarosa,xantano yoxigenodisueltodel experimenton0 6 (28 0C y 130 p.p.m. de amonio inicial)entreel ModeloCinéticoMetabólico(líneadiscontinua)y el ModeloCinéticoQuímicamenteEstructuradocon el término de hidratos de carbono (líneacontinua).
2,5
2.0 —
cftt
=96<
1,0
u
•
U.U
-<él0.SJ
0,0 ‘1~
o 60
400
ModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado
5’
=9
6<
Figura 7.27- Comparación de la reproducción de la evolución de biomasa y amonio delexperimento n0 7 (28 0C y 475 p.p.m. de amonio inicial) entre el ModeloCinético Metabólico (línea discontinua) y el Modelo CinéticoQuímicamenteEstructuradoconel ténninode hidratosde carbono(líneacontinua).
2,5
2,0
ti(Y
u”
A‘0A.
‘0
AA A-r QO
0 10 20 30 40 50 60
o,)Figura 7.28.- Comparación de la reproducción de la evolución de sacarosa,xantano y
oxigenodisueltodel experimenton0 7 (28 0C y 475 p.p.m. de amonio inicial)entreel ModeloCinético Metabólico(líneadiscontínua)y el ModeloCinéticoQuímicamenteEstructuradocon el término de hidratos de carbono(líneacontinua).
2.5
O lO 20 30 40
t(h)
401
ModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado
En vista de la importantemejora en los resultadosal incluir el componentede
hidratos de carbono en el modelo, es necesario ahora observar si el parámetro
correspondientea estecomponentetiene tendenciacon las variables, para llegar de esta
maneraa un Modelo QuímicamenteEstructuradodefinitivo.
En la Figura 7.29, se muestrala tendenciadel parámetrokHc con la temperatura
(líneacontinua); la línea discontinuaindica la forma de la curva(función) a la que podría
serajustadala evoluciónde esteparámetro,estoesunafunciónlinealdescendente.
En laFigura‘730 aparecerepresentadala evolucióndel parámetrokHc con respectoa
la concentracióninicial de amonio. Como se puede apreciar,se puedeasumir, que la
tendenciaesaun valor máso menosconstante,como indica la líneadiscontinua.
Por tanto, el Modelo QuímicamenteEstructuradoviene dado por las ecuaciones
[7.15] a [7.17] para DNA, RNA, proteínasintracelulares,respectivamente.Para la parte
correspondientea la producción, las ecuaciones[7.2] a [7.4] expresanla evolución de
sacarosa,xantanoy oxígenodisuelto. Finalmentela biomasavendrádadapor la ecuación
[7.35~¡, donde, a su vez, el parámetrokHc viene, en función de la temperatura,por la
siguienteecuación:
kuc(T)~ [7.36]
402
ModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado
5
4
o3
‘1
o24
Tenperaura
7.29.- Variación del parámetro kHc delEstructuradocon la Temperatura.
3
co
z12
It
Oloo 200 300
Modelo Cinético Químicamente
400 500
S(Ppm)7.30.- Variación del parámetro kHc del Modelo
Estructuradoconla concentracióninicial de amonio.Cinético Químicamente
• 1 ¡
—e--Kl.
u
Figura
¡ 1 1 • ¡
26 28 30 32 34
u
ue
-J
Figura
403
ModeloCinético QuímicamenteEstructurado
7.3.-SIMULACIÓN CON EL MODELO CINÉTICO QUÍMICAMENTEESTRUCTURADO
Una vezplanteadoel modelo MQE definitivo, con los valoresde los parámetrosen
función de la temperatura, se puede emplear para realizar simulación de distintas
operaciones.Como ya se ha comentadoa lo largo de esta Memoria, las simulaciones
permiten estudiar la influencia de ciertos factores sobre el sistema consideradosin
necesidadde realizarla experimentaciónoportunaparaello.
La forma más adecuadade realizarsimulacionesesteniendoen cuentala influencia
de las variablesen los parámetrosdel modelo cinéticoplanteado. Estoha sido posiblepara
los experimentosrealizadosa diferentes temperaturas.Para los experimentosllevadosa
cabo con diferentes concentraciones iniciales de nitrógeno, no fue necesario tal
planteamiento,puespresentabanuna tendenciaconstantecon la concentraciónde nitrógeno
inicial, debidoa que las expresionesde las ecuacionescinéticasya incluyenel términode la
concentraciónde nitrógenoen dichasecuaciones.
Esto último no habíasido conseguidohastaahora,esdecir, ni con el modelo cinético
no estructuradoni con el modelo cinético metabólico se pudo obtener relación de
parámetroscon la variable concentracióninicial de amonio. La razón de ello es que el
sustratonitrogenadoeraabordado,en amboscasos,de forma no estructurada,por lo que
estosmodelosno erancapacesde predecirla influenciade cambiosen la composicióndel
medio, como,por ejemplo, de la concentracióninicial de amonio sobrela produccióndel
polisacárido.
El modeloquímicamenteestructuradoescapazde predecirlo mismo que sehabía
visto parael modelo cinéticometabólico(ver capítulo5 de estaMemoria),pero introducela
posibilidad de predecir la influencia de cambios en la composicióndel medio, en la
producciónde xantano,aspectosin precedentealguno. Por ello, únicamentesepresentaen
estecapitulo la principal mejoraen la predicciónque introduceel Modelo Químicamente
Estructuradoplanteado.
404
ModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado
Se han realizado, por tanto, simulacionesvariando la composicióndel medio,
concretamenteen lo que respectaa la concentraciónde nitrógeno inicial. Han sido probadas
4 concentracionesiniciales: 70 p.p.m., 200 p.p.m., 250 p.p.m y 350 p.p.m., no se han
realizado simulaciones con concentraciones más elevadas debido al posible efecto
inhibitorio de amonio a partir de cierta concentracióncrítica, que se ha estimadoen el
mayorde los valoresanteriores.
En la Figura 7.31 se muestrala evolución de la biomasay de amonio con las
diferentes concentracionesiniciales de amonio. Se observa que cuanto mayor es la
concentraciónde amonio mayores la concentraciónde biomasaalcanzada,y que,portanto
laconcentraciónde sustratonitrogenadoinfluye notablementeen la velocidadde formación
de biomasa.
Aunque solo se muestralaevoluciónde biomasa,no hay que olvidarque éstaes,en
realidad,la suma de componentesintracelulares:DNA, RNA, proteínas intracelulares e
hidratosde carbono,cuyasevolucionesconel tiempo de fermentación puedenser predichas
conestemodelo.
La Figura 7.32 muestrala influenciade la concentracióninicial de amonio en la
produccióndel polisacáridoy enel consumode azúcar.Seobservaqueexisteun máximo en
la producción,de forma que la concentraciónen la que la velocidad de formación de
xantanoesmayorescon la concentraciónde 200 p.p.m, con concentracionessuperioreso
inferioresaéstalavelocidaddeproduccióndel polisacáridoes menor.Es decir, el modelo
químicamenteestructuradopermitepredecirun máximo en la produccióndel polisacárido
dependiendodela concentracióninicial deamonio,aspectoobservadoexperimentalmente.
En la Figura ‘7.33 semuestra la evolución de oxígeno disuelto para estasmismas
condiciones.Como ya seha visto, la concentraciónde oxígenodisuelto encadamomento
está fúndamentalmente relacionada con la concentracióndel polisacárido,esto es,cuanto
mayor seala concentraciónde xantano,mayor serála viscosidady, como consecuencia,
menor la velocidadde transporte y concentración de oxígenodisuelto.
405
ModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado
2.5
2,
4
‘4
=94
1,5
“o
0,5
o.,
Simulación con el modelo MQEconcentración inicial de amonioconsumode amonio.
para observar la Influencia de lasobre la evolución de biomasay
Clave Ce..,¡ C.c 70 pprfl
ZC,.c200ppm C,3 C,.
0.250ppm Cp —
4 C,¡.r 350 ppm
Figura 7.32.- Simulación con el modelo MQE para observar la influencia de laconcentración inicial de amonio sobre la evolución de azúcar yproducción de xantano.
406
Figura 7.31.-
t (h)
¡ • ¡45
40—
35—
30—
~25-c~J,. -
220-00
cf ‘5-
lo—
5—
o
2 —
1~
43
2.
20 40t(h) 60
80
ModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado
25
20
‘5
Y
5
olOO
Figura 7.33.- Simulación con el modelo MQE para observar la influencia de laconcentracióninicial de amonio sobrela evolución de oxígenodisueltoy kLav.
Por tanto, sepuedeconcluir queel modelo químicamenteestructuradopermiteuna
adecuadaprediccióndel procesode producciónde xantano.De la misma maneraque ya
fue vistaparael modelo cinéticometabólico,el MQE permiteunaadecuadareproducción
de la evolución del consumode azúcar,producciónde xantanoy de la evolución del
oxígenodisuelto Se obtieneunasignificativa mejoraen la predicciónde la evolucióndel
sustratonitrogenado,graciasa la estructuraciónde estecompuestoen el crecimientodel
microorganismo.
Parecenecesario,por tanto, estructurarel metabolismo,tanto del sustratocarbonado
(en el modelo cinético metabólico)y comodel sustratonitrogenado(modelocinético de
célula), tanto en la parte correspondienteal crecimiento como en la produccióndel
productode interésindustrial,con el fin de predecirla influenciade cienoscambiosque,
de otra forma,no seriaposiblellevar a cabo.
2,5
t (h)
407
ModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado
La principal mejoraque incluye el modelo cinético químicamenteestructuradoes
que al describir de forma más adecuadael crecimiento también lo hará para la
producción.Así, porejemplo, la variaciónde la concentracióninicial de amonio se verá
reflejadatantoenel crecimientocomoen la produccióndel polisacárido.La influenciade
estavariableen la producciónapareceen la Figura 7.34. En ella sepuedeobservarel
máximo en la producciónque prediceel MQE, con la variaciónde la concentraciónde
amonio enel medio.
La citada Figura representala comparaciónentre la concentraciónde xantano
alcanzadaa las 50 horas de fermentaciónque predice el MQE empleandoparámetros
particulares(línea 1), esdecirlos obtenidosparacadaexperimento,y sucomparacióncon
la prediccióndel mismo modelo pero con parámetrosgenerales,esdecir el modelo en
función de temperatura(línea2). En la Figura, tambiénaparece(indicadapor puntos) la
concentraciónde xantano experimentalobtenida con las diferentesconcentracionesde
nitrógenoa las 50 horasde fermentación.
Paralos tres casosseobservaun máximo en la producciónentrela concentraciónde
amonio de 200 y 250 p.p.m.. La principal diferencia entre ellas estriba en que la
reproduccióndel polisacáridocon los parámetrosparticularesproporcionaconcentraciones
de xantanoinferioresa los valoresexperimentales,mientrasque con la reproduccióncon
los datos particulares se consiguen concentracionesde xantano mayores que la
experimental,si bien hay que comentarque no son diferenciasmuy significativas, de
apenas1-1,5 g/L de diferencia.
408
ModeloCinéticoQuímicamenteEstructurado
16
14
12—
lo-.
ti
6—
4—
2—
o- ~
50 lOO 150 200 250 300 350 400 450 500
C~4 (p.p.nv)
Figura 7.34.-Prediccióncon el MQE de la concentraciónde xantanoalcanzadaa las 50horasde fermentacióncon diferentesconcentracionesinicialesde amonio.
Por tanto, el Modelo Químicamente Estructurado consigue la descripción
adecuadade los componentesdel sistemaobjetode estudioy permitepredecirla influencia
en el procesode variablescomo la temperaturay la concentracióninicial de la fuente
nitrogenada,algo que sin dudapuedeabrir el camino de facilitar la laboriosatareadel
cambiode escalaen los procesosllevadosa cabopormicroorganismos,e inclusoel diseño
de los mediosde producción.
&at&W’T paaTnoSpartCWfl
2 Siwu]ao¿T± t*nÚ~s ga1eI~
409
8.- RESUMENY CONCLUSIONES
Resumeny Conclusiones
8.- RESUMENY CONCLUSIONES
8.1-RESUMEN
En el presentetrabajode investigaciónseha llevadoa caboel desarrollode modelos
cinéticos de diferente grado de complejidadpara observarsu capacidadde describir la
influencia de ciertas variablesen un sistemamicrobiano,con el fin de obtenerun modelo
predictivo tantode la evolucióndel sistemaen sí, comode surespuestaa perturbacionesen
las condicionesde operacióndel proceso.Paraello, sehaaplicadola metodologíaempleada
por la IngenieríaQuimica en el campodel desarrolloy aplicaciónde los modeloscinéticos
de redescomplejasde reacciones.
El sistemamicrobianoelegidoen estetrabajo,pararealizarel desarrolloy aplicación
de los modeloscinéticos,ha sido la Producciónde Xantano. La elecciónde este sistemade
producción sedebeaqueesun procesobienconocido,desdeel puntodevistametabólicoy
microbiológico,y hasido ampliamenteestudiadopor el equipode investigaciónen el que se
ha realizadoel presentetrabajo.El xantanoesun biopolisacáridoque seobtiene mediante
fermentaciónsumergida de sustratoscarbonadosen presenciade la bacteria aerobia
Xanthomonascampestrisy otra serie de nutrientes esencialespara el crecimiento del
microorganismo.El citado polisacáridoes ampliamenteutilizado en diferentestipos de
industrias(farmacéutica,alimentaria,textil, etc.) debidoa la propiedadque presentansus
4)’1
Resumeny Conclusiones
disoluciones,una elevadaviscosidaden un amplio intervalo de condiciones,incluso con
unabajaconcentraciónde polisacárido.
El fenómenode transferenciade oxígenocobraespecialimportanciaen estesistema
ya quela bacteriaes aerobiaestricta,esdecirprecisadel mismo parasubsistiry parallevar a
cabo la producción. La viscosidadgeneradaen el caldo durantela fermentación,por la
propiaproducción del polisacárido, dificulta enormementela transferenciade oxígeno al
microorganismo(Gómez,1995).
En trabajospreviosseoptimaronlas condicionesde operaciónnecesariasparaIJevar
a cabo la produccióndel polisacárido(preparacióndel inóculo, temperatura,perfil de
agitación,etc.), asícomo la composicióndel medioa emplearen el proceso(Santos,1993).
Asimismo, se ha observadola influencia de las citadas condicionesde operaciónen las
propiedadesdel producto obtenido (reología de sus disoluciones, peso molecular y
contenidosen acetatoy piruvato)(Casasy Col.. 1999).
En estetrabajo se han propuesto,como se ha comentadoanteriormente,modelos
cinéticosde diferentegrado de complejidad.El primer modelo propuestoesun modelo no
estructurado-nosegregado(MNE), esdecir, la poblaciónmicrobianase ha considerado
como un componenteo reactantemásdel sistema,que sedenomma“biomasa” sin teneren
cuenta las reaccionesque se producen en su interior tanto para el crecimiento del
microorganismocoito para la síntesisdel productode interés.En este modelo setienenen
cuentaobservacionesexperimentalestalescomo que el sustratonitrogenadoesel limitante
del crecimientoy que el xantano es un producto parcialmenteasociadoal proceso de
crecimiento.
El siguientepasoen la complicacióndel modelo es el planteamientode un Modelo
Cinético Metabólico,esdecir, la poblaciónmicrobianase sigueconsiderandode la misma
formaque en el casodel modelo no estructuradoy no setienenen cuentalas reaccionesque
sedan en el interior del microorganismoparala reproduccióndel mismo; sin embargo,las
reaccionesque tienenlugarparala obtencióndel productose han considerado,medianteun
esquemade reacciones con estequiometríadefinida. Se ha propuesto un esquemade
reacciónsimplificado, empleandoherramientasde IngenieríaQuímica, como el lumping o
agrupamientode compuestossimilaresen un únicocompuestotipo y la suposiciónde estado
412
Resumeny Conclusiones
pseudoestacionariopara componentescomo el ATP y los cofactores. Se proponen
relacionesestequiométricassimplificadasconsiderandoque el sustratocarbonadose emplea
para la síntesisde xantanoy parael mantenimientodel microorganismoen estadoviable,
principalmente
Las reaccionesquetienenlugardentrode los microorganismosparaque seproduzca
el crecimientoo reproducciónde los mismos,sehanconsideradoaisladamente,proponiendo
un Modelo Cinéticode Célula;esdecir, seha desarrolladoun modelo en el queno setiene
en cuentala parte correspondientea la producciónde xantano,sino únicamentela parte
correspondienteal crecimiento, considerandola biomasa microbiana constituida por
componentesintracelularescomo son proteínas y ácidos nucleicos (RNA y DNA),
proponiendoun esquemade reacciónsimplificado. Se consideraademásque partede las
proteínasque produce el microorganismovan a ser secretadasal medio, esto es son
proteínasextracelulares.
El último de los modelos que se ha desarrollado es del tipo denominado
QuímicamenteEstructurado,ya que consideratanto las reaccionesintracelularesque dan
lugaral crecimientocomoaquellasque tienencomo resultadola produccióndel compuesto
de interés.Por lo tanto,estemodeloestáformadopor la unión del modelode célulaparala
descripcióndel crecimientoy del modelo metabólicoparaladescripciónde la producción.
La aplicaciónde los citadosmodelosseha llevadoa cabomedianteajusteestadístico
de datos, obtenidos experimentalmenteen diferentes condiciones, al modelo cinético
planteadoen cadacaso,por lo que ha sido necesariotanto el desarrollode programasde
cálculooportunos,comola obtenciónde los datosexperimentales.
Los programasde cálculo aplicados han sido realizados en FORTRAN 77,
empleándosesiempreel algoritmo de regresiónno lineal de Marquardt (1963) tanto en
simple como en múltiple respuesta,acopladoa algoritmos de integración(Runge-Kuttay
Simpson),ya que en todos los casosse ha utilizado el métodointegral parallevar a caboel
cálculode los parámetroscinéticosde los diferentesmodelospropuestos.
El trabajo experimentalse ha realizadoen un bio-reactorcomercial de 1,5 L de
volumen útil tipo tanqueagitado y aireado.Las condicionesde operaciónempleadashan
413
Resumeny Conclusiones
sido las optimadaspreviamente,comoya se hacomentado:un caudalde airede 1 L/L¡min:
un pH inicial de 7, no siendocontroladodurantela fermentación;perfil de agitacióncon una
velocidaddc 210 r.p.m., variablea lo largo del tiempo (Santos1993, García-Ochoay col.,
1997). Como fuente de carbonoseha empleadosacarosaen concentraciónde 40 g/L y el
medio de producciónusadoha sido el propuestopor García-Ochoay col. (1992) como
óptimo para La producciónde xantano. Las variablesestudiadasen el trabajoexperimental
han sido la temperatura (25. 28, 31 y 34 oc) y la concentracióndel nutriente
nitrogenado(amonio: 65, 130, 257 y 475 p.p.m.) en el medio de producción,ya que en
estudiospreviossehaobservadoque ambasvariablesinfluyenen la evolucióndel sistema,
incluso con lapresenciade un máximoen la producciónde xantano.
El Modelo CinéticoNo Estructuradopropuestoestáformado por un sistemade
ecuacionesdiferencialescon cuatro componentesclave o respuestas(biomasa,sustrato
carbonado,productoy oxígenodisuelto) y sieteparámetros(ecuaciones[4.13] a [4.18]).
Se llevó a caboel ajustede Los datosexperimentoa experimentocon estemodelo,
obteniéndosevaloresde los parámetrosparacadauno de dichosexperimentos.Los citados
valores son capacesde describir de forma satisfactoriala evolución de la biomasa,el
sustratocarbonadoy el productoen todos los casos,pero la descripciónde la evoluciónde
oxigeno disuelto y la prediccióndel consumodel sustratonitrogenadoobtenidosno son
aceptables.La simplicidadde estemodelo hacequepresentevariasdeficiencias,ya que con
él no esposibleteneren cuentalas influenciasen la producciónde xantanoni del oxigeno
disuelto,ni de la cantidadde sustratonitrogenadosuministradoal sistemay, además,los
parámetrosobtenidosmedianteestemodelo no son relacionablescon la temperatura.Por
tanto, estemodelo sencillo pareceútil únicamentepara la descripciónde experimentos
aislados.
El Modelo Cinético Metabólico desarrolladopretendesubsanarlas deficiencias
observadasen el ModeloNo Estructurado.Paraello, ha sido necesarioel planteamientode
un esquemade reacciónsimplificado del metabolismodel sustratocarbonadoconsiderando
las rutasmetabólicaspor las quetranscurreel proceso.Es decir, en estemodeloserealizala
estructuracióndel metabolismodel sustratocarbonadoen unaseriede reacciones,el sustrato
nitrogenadono seestructuray, al igual que en el modelo anterior,no esconsideradocomo
respuestaen el esquemade reacción. El modelo consta de relacionesestequiométricas
414
Resumeny Conclusiones
definidasque consideranla producciónde xantano(ecuación[5.1]), el catabolismototal de
la glucosa(ecuación[5.5]), la fosforilaciónoxidativa (ecuación[5.6]) y la energíanecesaria
para el mantenimiento del microorganismo en estado viable (ecuación [5.7]). Para
compuestoscomo ATP y Cofactoresserealizala suposiciónde estadopseudoestacionario,
ya que no hansido medidos.
El modelo metabólicoescapazde describir la evoluciónde todos los componentes
ajustados(biomasa,sustratocarbonado,xantanoy oxígenodisuelto)de forma satisfactoria;
sin embargo,la predicciónde la evolucióndel sustratonitrogenadono esbuena,debido a
que se empleanlas mismasecuacionesparaladescripcióndel crecimientoque en el modelo
anterior, como ya se ha comentado. En cuantoa la influencia de las variablesen los
parámetros,con este modelo ha sido posible proponer expresionesen función de la
temperaturade los parámetrospresentesen la parteque sehabíadesarrollado.Asimismo,
estemodeloes capazde predecirla influenciaen laproduccióny en el consumodel sustrato
carbonadode cambiosen la transferenciade oxígeno(variacionesen la agitacióno en el
caudalde aire suministrado)en el sistema,ya que en las citadasrelacionesestequiométricas
apareceel oxígenocomo un reactantemásy ésteestá incluido en las ecuacionescinéticas
propuestas.ya que se consideracomo nutrientelimitante del proceso.La influenciade la
concentracióninicial de sustratonitrogenadoen la producciónno se puedetener en cuenta
con estemodelo ya quedescribeel crecimientode formamuy simplificada.
Parael planteamientodel Modelo Cinético de Célula fue necesarioel desarrollode
metodologíadebidoa queen la literaturano seencontraronantecedentesde modelosde este
tipo para el sistemadeproducciónde xantano;y aunqueexistenpara otros sistemas,los
parámetrosno secalculanpor ajustede datosexperimentales.
En primer lugar, parala aplicaciónde modeloscinéticosde célula, esnecesarioel
análisisde componentesintracelulares,para lo que fue precisoel desarrollode métodos
de análisis de los citados componentes.Este fue un punto esencialen la realizacióndel
presentetrabajo,debido a la dificultad de realizar el análisis de estoscompuestospor las
técnicasbioquímicasconvencionales,al menosparabacterias.El métodoadoptadoen este
trabajo paratal análisis fue la Citometria de Flujo. Estatécnicade fluorescencia está
siendoempleadacadavez más en Microbiologíadebido a la gran cantidadde información
que permiteobtenersobre un cultivo microbiano(parámetrosestructuralesy funcionales),415
Resumeny Conclusiones
con una elevadaprecisión y rapidez. En este sentido,es necesariorealizar un especial
esfuerzopara la conversiónde los datos obtenidospor estatécnica(datos cualitativos o
semicuantitativos)en datos cuantitativos (necesariospara la aplicación de los modelos
cinéticos), obteniendocurvas patrón, empleandootra técnica de fluorescenciapara el
calibrado:Espectrofluorimetria.En el presentetrabajose ha desarrolladoun procedimiento
parael análisiscuantitativode proteínasintracelulares,RNA y DNA, mediantetinción con
fluoróforos específicos(Isotiocianatode Fluoresceínae loduro de Propidio) y su posterior
análisisen el citómetrode flujo.
Una vez obtenidos datos experimentalesde la evolución de los componentes
intracelulares,es necesariala aplicación de un método para la propuestade modelos
cinéticosde estetipo. Primero debehacerseuna propuestade un esquemade reacción
simplificadodel metabolismomicrobiano(Figura6.1). En este esquemaseproponeque el
sustrato nitrogenadova a ser empleadopor el microorganismopara la formación de
aminoácidosno formadoresde bases,esdecir los que formaránproteinas,dentrode éstas
hay que distinguir aquellas que constituyenla propia biomasa (proteínaintracelular) y
aquellas que serán secretadasal exterior (proteína extracelular). Además, el sustrato
nitrogenadoseráempleadoparala formaciónde aminoácidosformadoresde bases,es decir,
aquellosqueevolucionaránhaciaRNA y DNA.
A partir del esquemaanteriorsehanrealizadodiferentessimplificacionesempleando
¡a hipótesisde estadopseudoestacionarioparadiferentescompuestos,como aminoácidos
formadoresde baseso para RNA mensajero,obteniéndose dos esquemasde reacción
simplificados(MCC-1 y MCC-2).
Unavezplanteadoslos posiblesesquemasde reacción,es necesarioconocerqué tipo
de ecuacionescinéticasson las más apropiadasen cadacaso. El método empleadopara
determinarqué expresionescinéticaspueden ser utilizadas ha sido el método de las
velocidadesde reacción (García-Ochoa y Romero, 1993), en el que se pueden aislar las
citadasexpresionescinéticassiempreque el número de componentesclave del sistema
coincida con el número de relacionesindependientes,es decir, que la matriz de los
coeficientesestequiométricossea cuadrada.En todos los casos,se probaron ecuaciones
tanto tipo potencial de primer y segundoorden como tipo hiperbólico o Monod. Los
resultadosde aplicar el método de velocidadesde reacciónsobrelas dos simplificaciones
416
Resumeny Conclusiones
propuestasllevaron a plantearuna cinéticade primerordenparalavelocidadde reacciónde
aminoácidosformadoresde bases,y cinéticasde segundoordene hiperbólicasparael resto
de las velocidadesde reacción.
La combinación de los dos esquemasde reacción junto con las diferentes
posibilidadesde las ecuacionescinéticas lleva a plantearhasta ocho modeloscinéticos
distintos,asíque sehacenecesarioemplearcriterios dediscriminaciónentreellos. Se han
utilizado criteriosestadísticosy físicos(García-Ochoay col., 1 989ay 1 990a).Los primeros
criterios aplicadosfueron los estadísticoscon el fin de observarla bondaddel ajuste.Los
valoresde la t de Studentde cadauno de los parámetrosobtenidos,así como la F de Fischer
y el valor de la sumade residuosal cuadrado(SRC)obtenidodel ajustede los experimentos
con cada modelo, permitió discriminar cuatro de los ocho modelos propuestos.A
continuaciónseaplicaroncriteriosfisicos, comoel estudiode la evolucióndel valor de los
parámetrosobtenidoscon las variables estudiadas.Aunque todos presentabantendencias
claras,hay dos modelosque parecendar un mejor resultado,concretamentetino de ellos
cuyos parámetrospuedenser puestosen función de la temperaturade acuerdoa las
expresionesdadasporlas ecuaciones[6.42] a[6.45].
El modelo propuestoescapazde reproducirlos datosde componentesintracelulares
obtenidos experimentalmente,en las diferentes condiciones, de forma plenamente
satisfactoria.No obstante,hay dos experimentosen los que los resultadosdeben ser
mejorable,parael experimentorealizadocon 65 p.p.m. de amonio inicial y el realizadocon
475 p.p.m. de estecompuesto.En amboscasos,los resultadosobtenidosno sontan buenos
comoen el restode experimentos.Porello, se introdujeroncambiosen cadacasoconel fin
de superarlas deficienciaspresentadas.En el casodel experimentocon mayor cantidadde
amonio (475 p.p.m.) se observaun efecto de inhibición por estesustrato,por lo que se
incluyó un término capazde predecirloen el modelo planteadoparateneren cuentatal
efecto, y con ello mejorar la reproducciónde los datosexperimentales(ecuación[6.50]).
Para el experimentorealizadocon la concentraciónmás baja de amonio (65 p.p.m.), fue
necesariocambiar la estequiometriaen la producciónde proteínas,pues al realizar el
balancede nitrógenose habíaobservado que “faltaba” nitrógeno,lo que hizo suponerque
el microorganismo estaría produciendo componentes con otra composición en
nitrógeno(ecuación[6.47]).
4/7
Resumeny Conclusiones
Este modelo cinéticode célulapresentauna evolucióncoherentede los parámetros
con las variablesestudiadas.Con la concentraciónde nitrógeno,la tendenciade todos los
parámetroses a un valor constante,con la temperaturapuedenserajustadosa diferentes
funciones,por tantosepuedeobtenerun modelode célulaen funciónde la temperatura.
Una vez obtenido el modelo de célula, se desarrollóel Modelo Químicamente
Estructurado,en el seque unen los últimos dos modeloscomentados:modelo metabólico
y modelo de célula. En estemodelo, tanto el sustratocarbonadocomoel nitrogenadose
estructuranen las diferentesetapasdel metabolismodel microorganismoobjetode estudio.
A] hacerla comparaciónde las reproduccionesde los datos experimentalesobtenidasa
partir de el modelo químicamenteestructuradocon el modelo metabólico,se observaque el
primero predice menos concentraciónde biomasa y de xantano. Para mejorar estos
resultadosse incluyó un término de hidratosde carbonoen la biomasa(ecuación[7.35]),
con ello se consiguetanto la mejoraen la reproducciónde biomasacomo de xantanoy, en
consecuencia,de consumode sacarosay de oxígenodisuelto.
El modelo final, Modelo QuímicamenteEstructurado,es capaz de predecir la
influencia de las mismasvariables que el modelo cinético metabólicopero con la clara
mejorade la influenciade la concentracióninicial de sustratonitrogenado,amonio.
Con ello, es posibletenerun modelo cinético que expliquela influencia, tanto en
crecimientocomo en producción,de variables como la temperaturao cambios en la
composicióndel medio, sobrelaevoluciónde los principalescomponentesdel sistema,algo
sin precedentesen la literatura.
4/8 —
Resumeny Conclusiones
8.2.-CONCLUSIONES
El Modelo Cinético No Estructuradoes capazde predecir la evolución del
sistemaen experimentosaislados.El experimentorealizadoen las condiciones
óptimas(T~ 280C; CNÚO,257g/L; N~2lO r.p.m., variable) se puededescribir
con el siguienteconjuntode ecuaciones:
dCx = 0435 ~ ±cw,[ Cx FC½o+607Cidi 6,073
dCN _ 1 dC
¿It 6,07 ¿It
dcx 1 J(7y
di 0,139 di
dCP=0o147.c .c’
di ~ X
dCo2 k(C~ Co~~ ~ ji —2,02.1< c~
1.1 .- El Modelo No Estructuradoes capazde describir adecuadamentela
evolución del sustratocarbonado,del productoy de la biomasaen cada
experimento. Sin embargo,no es capaz de describir adecuadamentela
evolución del oxígeno disuelto, ni la evolución del sustratonitrogenado
duranteel proceso.
1.2- Los parámetrosobtenidos con el Modelo No Estructurado para
diversos experimentosno son relacionables con la temperatura,ni con
ningunaotravariable.
1.3.- El ModeloNo Estructuradono escapazde predecirla influenciaen la
evolución de los componentesdel sistema (sustrato carbonado,xantano,
biomasa)de cambiosen variablesque afectana la velocidadde transferencia
de oxígeno,como la agitacióny el caudalde aire suministrados.
419
Resumeny Conclusiones
2.- El Modelo Cinético Metabólico es capazde predecirrazonablementebien la
evolución de los componentesdel sistema y está formado por el siguiente
conjuntode ecuacionesdiferenciales:
±CNjJ.CX ¿1—C~0 +Y~\ •C~0 )
dCÑ 5,94r180.{~
di 923,2
1
yUs
dC~
¿It
dC~
dr
dC~ —923,2
¿It
1
12
k4 C~>,
K4 +C<2,,
CY.[1—358Q358t47 j}]}
l+4Y,~
3,587$
dC0,
¿It
0,3 dC~923,2 de
r,=k
—0,5
~ k’—~ ~, ~ 9~ 3,58+4.Y~>j
1 k<C0 (6 1+tYrp•C~ 41—358.1
12 K4 ±C02 y’y 3~58+4.Y1~~))
- yox
dCxdi
C
“? =1,2~ATPP
2.1.- El modelo metabólicopredicede forma adecuadala evoluciónde la
biomasa,el sustratocarbonado,el productoy el oxígenodisueltoen todos los
experimentosrealizados.Sin embargo,no escapazde predecirla evolución
de la concentracióndel sustratonitrogenadoen los diferentesexperimentos.
2.2,- Los parámetrosobtenidos del ajuste al modelo metabólico de
experimentos realizados a diferentes temperaturas son relacionables,
habiéndoseobtenidolas siguientesexpresionesde los mismosen función de
la citadavariable:
dC~ k,<
420
Resumeny Conclusiones
k<”7)={ 0,94 (T- 1945) f1-exp(/,399(T-34,24))]}2
k’<’T) = —2,913+2,0481
Y,~>< (T) = (0,597.(T -24,35)11- exp(—0205-(T -37,16))]»
Y~ftT)=0,340+(—6,1.]0<T
2.3.- El modelo metabólico es capaz de predecir de forma adecuadala
influencia de la temperaturaen el consumo de sustrato, producciónde
xantanoy evolucióndel oxigenodisuelto en el sistema.En la Figura 8.1 se
muestrala influenciade estavariable sobrela produccióndel polisacárido
que prediceel modeloa las 60 horasde fermentación.Seobservaun máximo
aproximadamentea 280C, coincidentecon el observadoexperimentalmente
(Santos,1993; García-Ochoay col., 1997).
30-
20—
lo-
o.
Figura 8.1.- Evolución de la concentración de xantano alcanzada a las 60horasde fermentacióncon diferentestemperaturasde operación.
2.4.- El modelo metabólicoes capazde predecir la influenciade cambios
en las variablesque afectana la transferenciade oxigeno(agitacióny caudal
de aire) en la evolución del sustratocarbonadoy del producto.A modo de
ejemplo se muestra en la Figura 8.2 (a, b y c) la evolución de la
concentraciónde xantanoalcanzadaa las 60 h de fermentacióncon diferentes
valores de porcentajede saturacióndel oxígeno disuelto, de kLav y con
diferentescaudalesde oxígeno,respectivamente.
25 30 35
421
30
>0.4
lo—
10—
a
lO YO
l’¡ ~(h•)
c
00 03 [0 lO 20
0<LiJnin>
Figura 8.2.- Evoluciónde la concentraciónde xantanoalcanzadaa las 60 horasdefermentación con diferentes condiciones que afectan a laconcentraciónde oxígenodisuelto en el caldo.
a) Variacióndel % de oxigenodisueltob) Variaciónde kLavc) Variación del caudal
Resumeny Conclusiones
b
422
Resumeny Conclusiones
3.- La citometriade flujo esunatécnicaexcelenteparael seguimientoy análisisde
componentesintracelulares,tales como DNA, RNA y proteínas,durante una
fermentación.
3.1.- Se puedeafirmar que no esadecuadorealizaranálisisde componentes
intracelularesmediantetécnicasbioquímicasconvencionalescon bacterias
dadala escasareproducibilidadde los ensayos.Esto se debea tres aspectos
fundamentales:
a) La etapade roturade las célulasescrítica, puesno es posiblesabersi
se rompentodaslas células cuyo componenteintracelularse analiza.
Los datosvendránsiemprereferidosa la cantidadde biomasaque se
emplea,por lo que serála primerafrentede error.
b) La etapade extraccióny purificación del componentetambiénes
delicada, debido a las sucesivascentrifugacionesque se deben
realizarpara el análisis. Durante estasoperacionesse puede perder
partedel componenteintracelular.
c) La labilidad de algunoscomponentesprovocaquecuandoserompela
célula,y sucontenidoformapartedel homogeneizado,algunosde los
componentesse degradancon sumafacilidad,como porejemploes el
casodel RNA.
3,2.- La espectrofluorimetriapermiteobtenerbuenosresultadoscuantitativos
de la concentraciónde los componentes intracelulares. La espectro-
fluorimetria es una técnica de fluorescencia que emplea fluoróforos
específicos para cada componente (isotiocianato de fluoresceínapara
proteínasy ioduro de propidio paraácidosnucleicos).Paradiferenciarentre
ambosesnecesariodigerir con RiNAasaparaanalizarDNA y con DNAasa
parael análisisde RNA.
423
Resumeny Conclusiones
a) El protocolode preparaciónde las muestrasen estatécnicano incluye
la rotura celular y, por tanto, tampoco la extracción de los
componentes.con lo que la espectrofluorimetríapermitesolventarlos
problemasencontradoscon las técnicasbioquímicasconvencionales.
b) La espectrofluorimetríapermitela obtenciónde curvasde calibrado
para relacionarla concentracióndel componentey la intensidadde
fluorescencia a una cierta longitud de onda que presenta el
componente a analizar. En este trabajo, para Xanrhomonas
campestris,se han determinadolas siguientes:
C,%0 (g ¡ L) = 1,9310’ LPT ED (Xex%5364xernL623)
C~Jg/L)rz3,68.104 ,rpE ED (xexc=494~xeIflI=520)
C%1(g/L) = 3,46• ~1< . FD (xexc=494; xenh=52o)
3.3.- La citometríade flujo esuna técnicamuy adecuadaparael análisisde
componentesintracelularesduranteun procesocon microorganismos.ya que:
a) El protocolode preparaciónde las muestrases idéntico al realizado
parael análisisporespectrofluorimetria.
b) Se puedenobtenerdatoscuantitativosmediantecitometríade flujo
graciasa las curvasde calibradoparacadacomponente,obtenidas
con el apoyo de la espectrofluorimetría.En este trabajo, para
Xanthomonascampestris.se hanobtenidolas siguientes:
Cm0 (g / L) = (0,25 IP—5,95) ED NC (Xe~c%536;>5=623)
C\ÁRV] (g ¡ L) = 0,11 ED NC (Xex~=494; xern=520)
La gran cantidadde parámetrosanalizablespor citometriade flujo hacende
esta técnica una herramientamuy importante para obtener información
cuantitativa, rápida y fiable de la concentración de componentes
intracelulares,como son: viabilidad celular, tamañoy complejidadde las
células,pH intracelular,actividadmetabólica,contajedel númerode células,
entreotras.
424
Resumeny Conclusiones
4.- En el Capítulo 6 de la presenteMemoria se ha propuesto un método para
desarrollarun modelocinéticode célulabasadoen las siguientesetapas:
a) Proponerun esquemasimplificado de reacciónutilizando lumping de
especiesquímicasy la observaciónde la evolución de los componentes
del sistema.
b) Utilizar el método de las velocidadesde reacciónparaprobar distintas
ecuacionescinéticaspara las reaccionesque figuran en el esquemade
reaccion.
c) Ajustar los datos experimentalespor una regresiónen multi-respuestay
aplicarcriteriosde discriminaciónentremodelos,de carácterestadísticoy
fisico.
El método de las velocidadesde reacciónpermite la individualización (simple
respuesta)de las reaccionescorrespondientesa cada componente,facilitando
muchoel desarrollode modeloscomplejosparamicroorganismos.Permitetambién
obtenerparámetrosiniciales,paracadauna de las ecuacionescinéticasplanteadas,
facilitandoasí el ajusteposterioren múltiple respuesta.
t- El Modelo Cinético de Célula desarrolladoescapazde predecirla evolución
de los componentesintracelularesdel microorganismo,estoesdel DNA, RNA y de
las proteínasintracelulares,que constituyen la biomasa. Está formado por el
siguienteconjuntode ecuacionesdiferenciales:
dC~ = dCp~ + ¿ICDNI
¿It ¿It ¿It ¿It
¿ICR\04
¿It
dCDNA
didCPR¡ ¿ICPRE
¿It ¿It
dCNII4~ = 18(—1,4. —2,75• —2,75 )¿It 136,5 103,5 478,6 491,7
425
Resumen>Conclusiones
Siendo:
rJ=lqC\ C~
/?4.C C.2 .5 ‘ Y
(‘m =k C~
5.1.- El modelo de célulapredicede forma adecuadala evoluciónde la los
componentesque constituyen la biomasa, siendo capaz de predecir la
evolución de la concentracióndel sustrato nitrogenado en los diferentes
experimentosajustadosde formasatisfactoria.
52.- Los parámetros obtenidos del ajuste al modelo de célula de
experimentosrealizados a diferentes temperaturasson relacionablescon
dichavariable,habiéndoseobtenidolas siguientesexpresiones:
1c1(T)= 1,49 —0,0361
k3<’T) = 0,150
k5(T) =0,198
-ykJTt { 0,041 (T-21)11- expj0,352(7’- 35,08))J¡
El modelo de célula es capaz, por tanto, de predecir la influencia de la
temperaturaen laevoluciónde los componentesintracelulares.
5.3.- Los parámetros obtenidos del ajuste al modelo de célula de
experimentosrealizadosa diferentesconcentracionesde nitrógenopresentan
un valor constantecon estavariable.Estoeraprevisibledadaslas cinéticasen
función de la concentraciónde amonio que se pueden observar en Las
ecuacionesdel modelo. El amonio presentaun efecto inhibitorio para el
crecimientoen concentracióninicial de 475 p.p.m., por lo que se debe de
introducir un término de inhibición en el modelo propuestoparadescribirel
sistemabajoestasituación,de forma:
426
Resumeny Conclusiones
=(r1 —CPRE )—k1 •(CN —C~9¿It
El modelo de célula es capaz, por tanto, de predecir la influencia de la
concentraciónde amonioen la evoluciónde los componentesintracelulares.
6.- El Modelo Cinético QuímicamenteEstructuradoes capazde predecir la
evoluciónde los componentesdel sistema,tanto los correspondientesal crecimiento
como a la produccióndel polisacárido.Se ha obtenidoporunión de los dos modelos
anteriores,dondese han realizadodiversasmodificaciones,quedandoel modelo
completoformadoporlas siguientesecuaciones:
dC~ _ tIC RVA tIC DAOA dCppj— +- +
¿Ir ¿It di’ dtdCRVÁ
=
¿It
¿ICDVÁ=
¿IttIC _ ¿IC
PRI¿It —r,— -
¿ItdC
/% it2,75 —2,75 ‘ )
¿It 136,5 103,5 478,6 491,7
F Vil¿IC~180J 5,94 ¿ICp _ 1 k4C0, C’í 358 ( 1±4Ym
¿It —b 923,2 ¿Ir 12 K4±C02 [‘ 3,58+4Y~~)jJ
—0,933( )—0,5( )—1,08( )—1,12•(136,5 103,5 491,87 486,7
¿It K4 ±CQ y3,58+4Y~~~)
¿ICx¿IC0, — _ 0,3 • dC~ ~o,s1c4C0 .Q +k~a< (C * —CQ ‘~--
dr 923,2 ¿Ir + CQ ~ ¿It
k~CK O2CI 1±41%,
~±C 3,58±4.YÁTPJ0,
1 k4C0, ~1—3S8( 1±4Yrp2 = 12K4±C0, 37 . ‘~ 3,58±4Y4~
427
Res¿uneny Conclusiones
= ~ 2
y, ~34•41p1>
Siendo:
r1=k,C C~
r3=k3 C ,~,
r2m =k, C
— N
y el valor de los parámetros:
k1<’T) = 1,49—0,0367’
k, (7’) = 0,150
<(7’) = 0,198
k,1~(T)= 0,00108—0,00003T
k2(TH( 0,041(7’- 21)[1-exp(0,352(T-35,08))]»
k(T~ / 0,94 (7’ -19,45) [1- exp(/,399 (7’- 34,24))ff
kYT) = —2,913±2,0487’
>lw (T) = (0,597(7’ -24,35)11- exp(—0,205 (7’ -37,16 ))]}2
6.1.- El modelo químicamenteestructuradopredice de forma adecuadala
evolución de los componentesintracelulares:DNA, RNA y proteínasen
todos los experimentosrealizados.Esto es evidentepuesestemodelo incluye
las expresionesdel modelo de célula, con lo que también será capaz de
predecirla influenciade la temperaturay de la concentraciónde amonioen la
evoluciónde estoscomponentes.
En la partecorrespondientea la producción,y dado que sehan tomado las
expresionesdel modelo cinético metabólico, el modelo químicamente
estructurado,prediceadecuadamenteen el consumode sustrato,producción
de xantanoy evolucióndel oxígenodisueltoen el sistema.
428
Resumeny Conclusiones
Con estemodelo se considerala evolución de otro componenteintracelular
no consideradoen el modelo cinético de célula. Este componentese ha
denominadohidratosde carbono,y el parámetrode la reacciónde formación
de este compuesto,kHG, puede ser expresadotambién en función de la
temperatura.
6.2.- El modelo químicamenteestructurado predicede forma adecuadala
evolucióndel sustratocarbonado,el productoy el oxigenodisuelto en todos
los experimentosrealizados, siendo capaz de predecir la influencia de
cambiosen las variablesque afectana la transferenciade oxígeno(agitación,
kLav y caudalde aire)en la evolución del sustratocarbonadoy del producto.
Lo mismo queocurreconel modelometabólico(ver Figura8.2).
6.3.- El modelo químicamenteestructuradotambiéntomaen consideraciónla
influenciade cambiosen la composicióndel medio, comopor ejemploen la
concentraciónde nitrógeno, sobrela produccióndel polisacárido.Se puede
observarun máximo de producciónen tomo a las 200 y 250 p.p.m. de
concentracióninicial de amonio indicado en la Figura 8.3. Esta figura está
realizadatomandola concentraciónde xantanoalcanzadaa las 60 horasde
fermentación.Estainfluencia,de nuevo,fue detectadaexperimentalmenteen
un trabajoprevio(Santos,1993; García-Ochoay col., 1997).
30-
25—
20—
5—
‘o—
y—
o.O 00 200 300 400
9.~~,pm>
Figura 8.3.- Evolución de la concentración de xantano alcanzada a las 60 horasde fermentacióncon diferentesconcentracionesinicialesde amonio.
429
9.- NOMENCLA TURA
Nomenclatura
9.- NOMENCLATURA
A : Absorbancia(u.a.).Compartimentoen los modelosde Bijkerk y Hall (1977)(1991ay 1991b).
B : Constantede Blackman(1905).Compartimentodel modelode Bijkerk y Hall (1977).
C : Concentración(kg/m3).
Vectordecompuestosen el estudioestequiométrico
• Concentracióndel compuestoj (mol j/L) (kgj/mfl.
• Parámetrosde la ecuaciónde Ratkowskyy col. (1983).,C2
C2,
Cm
CMiF
d
D
y deNielseny col.
• Parámetrosdel modelode Matsumuray col. (1981).
Parámetrodel modelode Waymany Tseng(1976)(kg~/m3).
• Concentraciónde oxigenoen el momentoen quese inicia la aireación(04).
• Citometríade Flujo.
• Diámetrode lahifa (m).
• Compartimentodel modelode Ramkrishnay col. (1967).
431
Nomenclatura
e : Númerototal de elementoshifalespor volumende reactor(U’).
E : Enzimade la ruta
F : Parámetroestadístico,F de Fischer.
ED : Factorde Dilución.
O : Compartimentode los modelosde Ramkrisnay col. (1967); Hardery Róels(1982) yNielsenycol.(1991ay1991b).
IF : Intensidadde Fluorescencia(unidadarbitraria).
K : Parámetrodelmodelode Hinshelwood(1946), (m3/kg~).• Compartimentodel modelode Williams (1967)y del modelode Hardery
Réels(1982).
• Parámetrodel modeloreológicode Casson(>4”2~ ‘~2m~’)
• Parámetrorepresentativode la inhibición enel modelocinéticode célula(m’.W’ kgj).
: Parámetrorepresentativode la inhibición porsustratoen el modelodeWaymany Tseng(1976),(m311’kgj)
• Constantecinéticade la reaccióni (unidadesdependientesde la funcióncomposición(h’) o ( m311’kgj ).
Constantede saturaciónde la expresiónde Monoddebidoal compuestolimitantej (kg i/m3).
• Constantecinéticade la reaccióni (It’) (m~h’kg’).
1<,, : Constantede saturacióndel compuestoj en la reaccióni (kg i/mt.
kLav Coeficientevolumétricodetransportede oxígeno(<‘) (~-~)
k0, ,k02 Factorespreexponencialesen la ecuaciónde Esenery col. (1983).
Factorespreexponencialesen la ecuaciónde Shuy Yang(1991).
Parámetroecuaciónde Monod(1949,1950)(kg5/m3).
1hgu : Unidadde crecimientohifal referidaa la longitud de la hifa (mlpuntas).
M : Masamediadel elementohifal (g).
m¡igu Unidadde crecimientohifal referidaa la masade la hifa (glpuntas).
Consumode oxígenodebidoal mantenimientocelular(kmol O=Ikg~h).
Consumode sustratocarbonadodebidoal mantenimiento(kgs/kgx.h).
432
Nomenclatura
N : Velocidadde agitación(r.p.m.).
n : Constantede la ecuaciónde Luedeking-Piret(1959)referidoa la producciónasociadaal crecimiento(kgp/kgx).Númeromediodepuntasdel elementohifal.
NA : Velocidadde transferenciade oxígeno(mol 02’h).
NC : Númerode Células.Númerode componentesclave.
Pl : Controladorproporcional-integral.
PID : Controladorproporcional-integral-diferencial
Q : Caudal(cm3/min) (m’/h).
Velocidadespecíficade formacióndel compuestoi (modelode Ponsy col,1989).
q02 : Consumode oxígenodebidoa los microorganismos(kmol O2/kg~h).
1 : Parámetroestadístico,coeficientede correlaciónlineal.
Re : Númerode Reynols(pNT2/~f).
5 : Sustrato.
Sc : Númerode Schmidt(,u/pDL)
SRC : Sumade los residuosal cuadrado.
Tiempo(h).Parámetroestadístico,t de Student.
T : Temperatura(0C).
tlat : Tiempode latencia(h).
Parámetrosdelmodelo de Ratkowskyy col.(1983)(0C).
V : Volumen(L).
Caudalde aire aportadoal fermentador,(IN/l/min) (m3/m3/h).
We : Númerode Weber(pN2T3/a)
433
Ao,nenclatu,a
YE : Extractode levadura.
Y,j : Rendimientomacroscópicodel compuestojen el compuestoi (kgj/kg i).
Y0= : Consumode oxígenodebidoal crecimientode la biomasa(kg~/kmol0=).
: Rendimientomacroscópicodel sustrato.5. respectoal productosintetizado,P, (kg~/kg5).
Rendimientomacroscópicodel sustrato,5, respectoa la biomasasintetizada,X. (kg~/kgj.
Letras Griegas
u : Parámetrode la ecuaciónde Luedeking-Piretmodificada,relativoalconsumode sustratodebidoal mantenimientoy a la producciónnoasociadaal crecimiento(kg~/kg~ h).
3 : Parámetrode la ecuaciónde Luedeking-Piretmodificada,relativaalconsumode sustratodebidoal crecimientodel microorganismoy a laproducciónasociadaal mismo(kg5/kg~).
Y • Coeficienteestequiométricodel compuestoi.
A : Incremento.
2. : Longitud de onda.
Velocidadespecíficade crecimiento(It’).
Viscosidadrelativaal modelode Casson(Pas).
Viscosidadefectivarelativaal modelode Ostwald-deWaele(Pas)
Velocidadespecíficamáximade crecimiento( m3 kgsh’).
p : Densidaddel líquido (kg/mt.
a . Tensiónsuperficial(Km ).
-y
Tensióntangencial(Nm2) (kg/ms).
• Tensióncríticade flujo (Km2) (kg/ms2).
434
Vomenclauua
Subíndices
b
c
O
cnt
DNA
ef
exp
g
m
max
mm
>4
N,A
N,DNA:
N,RNA:
N,T
O,
P
PR
PRE
PRI
PRT
Referidoabiomasa.
Referidoacatabolismo(modelode Ponsy col., 1989).
Condicionesiniciales.
Referidoal valor crítico.
Referidoal DNA.
Eficazo medio.
Experimental.
Referidoa glucosa(modelode Ponsy col., 1989).
• Referidoacondicionesmáximas.• Referidoa mantenimiento(modelode Ponsy col., 1989).
• Referidoal valor o a las condicionesmáximas.
• Referidoal valor mínimo.
Referidoal sustratonitrogenado,amonio.
Referidoal nitrógenoen amonio.
Referidoal nitrógenoen DNA.
Referidoal nitrógenoen RNA.
Referidoalnitrógenototal.
Referidoal oxígeno.
Referidoal producto,xantano.
Referidoa Proteinas.
Referidoaproteínaextracelular.
Referidoa proteína intracelular.
Referidoaproteínatotal.
435
jVomencíaturo
Referido a los cofactores<modelode Ponsy col., 1989).
Referidoal RNA.
Referidoal sustratocarbonado,sacarosa.
Referidoal valor teórico.
• Referidoa la biomasa.Referidoa xantano(modelode Ponsy col., 1989).
Superindices
A
CN4F
E
*
Referidoa absorbancia.
Referidoa Citometríade Flujo.
Referido a Fluorimetría.
Valor de saturacion.
R
RNA:
s
Teor
x
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