ALUMNO :
MATRICULA : 91333127
TELEFONO :
LCENCIATURA :
DIVISION :
5633-57-74
Ingeniería Bioquímica Industrial
Ciencias Biológicas y de la Salud
ktapalapa UNIDAD.
TRIMESTRE LECTIVO. 00-1
NOMBRE DEL PROYECTO : AISLAMIENTO Y CARACTERIZAC ON DE I kS PRINCIPALES ENZIMAS WOGENAS QUE INTERVIE EN Eh EL MECANISMO DE MAWRACION-PUTREFACCION i LA CAPNE.
TITüLO DEL TRABAJO Mgdiünrirnto de la hid proteína de pescado en un
ores inhibitoriw.
LUGAR DE REALIi4CION : Planta Piloto No 4
13 de Noviembre de 1997
21deonerode2000
FECHA DE INICIO :
FECHA DE TERMINACION : - _u_--
. _ - . - 2
CLAVE DE REGISTRO. i IBI 06297
. - 4:
r . I - , / .- I c
1)
3
53
3
3)
a 3
1,
NOMBRE DE LOS ASESORES
DRA. LlLlA ARELY PRADO BARRAGÁN PROFESOR TITULAR C. DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA.
DR. SERGIO HUERTA OCHOA. PROFESOR TITULAR C. DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA.
FIRMAS
c JORGE CESAR GALVAN VkQUEZ. ALUMNO.
DRA LlLlA ARELY -00 B A W N . PROFESOR TITULAR C.
DR. SER010 HUERTA OCHOA. PROFESOR TITULAR C.
a
w . , ’ *
1,
Casa abierta al befnpo
UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA CIENCIAS BlOLOGlCAS Y DE LA SALUD DEPARTAMENTO DE ElOTECNOLOGtA 3 1 de enero de 2000.
DR JOSE LUIS ARREDONDO FIGUEROA PRESIDENTE, CONSEJO DIVISIONAL C.B.S. P R E S E N T E
Por este conducto le informamos a Usted que el alumno Jorge Cesar ,Gaixáq Vázqem, Matricula No. 91333127 de la licenciatura de hg. Bioquímica industrial. concluyó satisfactoriamente el trabajo denominado ‘MODELAMIENTO BE LA HIDIIÓLISIS E f f i % N f & ” B S . C a RúiW%h D# PESCADO EN
como fecha de inicio el 13 de noviembre de 1997 y fecha propuesta de terminación del 13 de noviembre de 1999.
üN REACTOR €NZXMATlCO BE MEMBRANA SUdTO A FA€TOlUS~INH1aITORKB”. El cual tuvo
Asimismo, le notificamos que el motivo por el que la entrega del informe final del Servicio Social. no fue concluido en la fecha sefíalada, sino hasta 21 de enero del año en curso se debió fundamentalmente a que el interesado labora en el sector industrial y de manera conjunta realizaba el proyecto terminal de su licenciatura, lo cual le impedía llevar una secuencia en la continuidad de la escritura del proyecto.
Sin otro motivo por el momento aprovechamos la oportunidad para enviarle un cordial saludo.
Dra. Li~3/Arcty Prado Barragán Profesor titulir B Dcpa-tamento de Biotecaología
UNIDAD IZTAPALAPA
ATENTAMENTE ‘Casa abierta al tiempo”
Br Profesoi titular C Departamento de Biotecnología
RESUMEN
ALUMNO : MATRICULA : 91333127 LlCENClATURA : Ingenietia Bqulmica Industred
PROYECTO : AiSlAMENiO Y CARACTERIUCION DE Us PRiNCIP#LES ENZYUS
Jaoa cewn Gelven vdzqrnr
EXOGENAS QUE INTERWENEN EN EL MEcLi#(8uo PuiREFACClON M LA CARNE.
REGISTRO : IBI al3297
ACESORES : 0nUiaAf.lyRaQBarragBn. PmlaorTMrC. D.partanentodeBiotscrobgia
Dr. S ~ I O Huerta ochos PrdesofTmilirC. CbpmtunentodeBjotecndogia
PMbíaiJrso-
INDICE
1.
2.
3. 4. 5. 6.
7. 8. 9.
IfltIUduCaón I .I Modelamiento matemático 1.2 Reactores I .3 Proceso de membrana I .4 HiMsis prOteiCa 1.5 Enzimas 1.6 Inhibiaón enzimatica objetivos generales y específicos 2.1 Objetivogeneral 2.2 Objetivos especificos Metodología utilizada Actividades realizadas Oqetivos y metas alcanzados Resultados 6.1 Esquema 6.2 Fadores del sistema
6.2. I F&-S ConOadOS 6.2.2 FadüWSdesconoci 'dos 6.2.3 Factores flexibies del sistema
6.3 Balance general del sistema 6.3.1 B a l m de ftujos 6.3.2 ~alance de sustrato 6.3.3 Balance de producto
Balances en el punto de mezcla 6.5.1 Balance de flujos 6.5.2 Balance de sustrato
6.6 Balances en el ultrafiltro 6.6. I Balance de flujos 6 6.2 Balance de sustrato
6.7 Balana, general de sustrato 6.8 Teoría de ultrafiltración 6.9 Inhibición competitiva 6.10 Inhibición no Competitiva 6.11 Inhibición por sustrato Discusiones y recomendaames conclusiones Bibñograiía
6.4 Consideraciones 6.5
1 1 1 2 5 7 10 14 14 14 15 I S . 15 16 16 17 17 17 18 18 18 18 18 19 19 20 20 20 20 21 22 24 26 29 32 36 37 39
a
1. INTRODUCCION
1.1 Modeiamiento matemático
Un modelamiento es la elaboración de una descripción o representación
matemática de un proceso o sistema, este modelo se utiliza para estudiar el
comportamiento del proceso o sistema, o para controlarlo variando las condiciones del mismo. El desarrollar un método de estructuración y adisis de procesos, siempre que sea posible por medio de modelos matemáticos, permite un an&i#s
riguroso así como obtener Criterios de decisión metódicos y completos (1).
Una premsa fundamental en todo análisis de procsaos, es que el proceso global se
puede descomponer en subastemas diferentes y que existen relaciones enúe éstos, de tal f m a que arando se integran en un todo pueden simular el proceso. El
dividir el proceso en partes para el anátisis, tiene su justificación en el hecho de que
el proceso puede resultar tan complejo que no sea posible conocedo y desaiirlo
con propwidad de acuerdo a un todo Así mediante una adecuada manipulacih y
4uste de los subsistemas se intenta obtener una representación correcta del
proceso total, basada en principios relativamente sencillos y ConoUdos de las partes
(1 )
1.2 h8aofes
poGtanosd.iínir un reiwior cano una 'Cya-w.gpia", donde io que sntre ssoo~vierie
en otra 'cosa', a través de una nwcaón promovida por 'aigo'. En el caso de un
reactor enrim8tic0, la aja r»grin seríe un tanque agitado, lo que e m w i a un wstrato, el cuai se convertirb por medio de una reacción en un producto, siendo esta roBQcj6n promovida por una enrime (2).
Una keve cl8súiceCrán de trpas da r.pDtoT88 nos permite describir tres modelos idaale9, los aralesson los maraprgunrdos a los reactores reales.
s
En primer iugar esia el reactor intermitente, el cual tiene una composición uniforme
en cualquier posición del reactor, pero por supuesto la composición cambia con el
tiempo.
El reactor de flujo pistón, en el cual el fluido pasa a través del reactor sin mezclarse
el fluido enirante anterior con el postaior y sin adelantamientos, como si el fluido se
moviera en una fila única a través del reactor.
Por ultimo, el reactor de tanque continuo agitado o flujo mezclado, mantiene una
composición del medio, igual en cualquier posiá6n dentro del reactor y a la salida.
Esto es un cultivo en el que se introduce continuamente medio fresco a una
velocidad uniforme, el volumen del cultivo se mantiene constante por extracción
también uniforme de ese cultbo. Idealmente el mezclado debe ser perfecto, es decir
que cuando una gota del medio entre al rector, instantáneamente deberá quedar
uniformemente distribuida en el cultivo (3).
1.3 Reactor de membrana
Un reactor con membrana, es un reactor con VI sistema acoplado el cual involucra
un proceso de separación mecánico. Esta separación se da en soluciones o
suspenciones de partículas que van desde 0.2 hasta 10,ooO nm, dependiendo del
sistema de membrana que se utilice.
El sistema de membrana acoplado a un reactor, permite tener en el sistema un
proceso de recirculación, esta recirculación puede ayudar a un control del grado de
hidrólisis deseado, a un mejor aprovechamiento del sustrato, y a un proceso continuo si es que se desea.
2
Actualmente existen vanos procesos que emplean una membrana para lograr una
separación dada. Estos procesos se pueden caracterizar en forma general en base
a:
La fuerza impulsora del proceso
El tipo de membrana que emplean
El rango de tamaño de partícula que retienen sus membranas
De acuerdo al tipo de fuerza impulsora los principales procesos de membrana se
pueden clasificar de la siguiente forma :
Gradmte de presión
Ultrafdtreción
Midtltración
Osmosis Inversa
G r a d i i e de concentración
Diálisis
Al igusl gue culydo hebbmJs de tlaiZ5ks enZi&ica, ahora en el proa580 de niarmbrwie tenemos que plantear y sekcaonar el método mbs adeouedo para
realizado. La tearía especieilizade dice que el gradienie de concmtr& que Uaüza la dibiisis como hierza impulsora le resta ventajas de rapidez de seperación. Y por
acUBÍcJ0 ai tamall0 de partícuia que daeemos sepam, pues reüenen un tameA0 de
partíada muy grade o muy pequei\l> tIñpec2ivamente para una seporación de
proteinas. De esta forma tenemos ta uhf&rción como el prowso adearsdo de
s e p a r d n para pohsaceridos, proteínas, virus o doides.
otra psrte 19r técnba de miemWac& . ytrsrnooisinvrwsanosonlasadsaiadasd3
La ultrafiltrpaón es una optmdón que empise membranas especiales en difcKentes
tiposde armgiospera sepersr m en sotwcióndeotras mspequelias,
por medio de un gradiente de presión, las macromoleculas que pueden ser
3
separadas por ultrafiltración tienen tamafios que oscilan entre los 2 y los 1 ,o00 nm, dependiendo cid peso molecular de corte o diámetro de carte de la membrana, el cual es el peso molecular del soluto, que dependiendo de varios fadores es retenido en un 90 % por la membrana (4).
La teoría de la ufbafiltración está orientada a tratar de predecir el flux en un sistema
dado en función de los parámetros de oparación cano son presión, temperatura, concentración de la solución y velocidad tangencial.
El principal parámetro de disefio para un sistema de ultrafiltracih para concentrar una solución, es el área necesaria para lograr una concentración determinada en un
tiempo dado. La predicción del flux o la interpretación y extrapolación correcta de
las mediciones experimentales de este, se enfocan a resolver este problema de
diseiio (4).
La ultrafiltración puede ser utilizada en la etapa de purificación de caldos biológicos
como es el caso de microorganismos, dispersiones coloidales de arcillas ó
macromoléculas, mezclas de proteínas, polimeros, almidones y partículas de látex.
En este proceso los caldos sujetos a purificación contienen al soluto de interés en
forma más concentrada y pura que el caldo original, debido a esto, los volúmenes a
tratar son menores que los correspondientes a las principales etapas del proceso
(4).
En el caso específico de una mezcla de proteínas de diferente peso molecular, la
ultrafiltración puede utilizarse para separar la enzima de un caldo de cultivo,
recuperándola para reuülizaria. El diámetro de corte de peso molecular de la
membrana se define para este caso en particular como el peso molecular de
proteínas globulares, las cuales son retenidas en un 90 % de la membrana (5).
En todo sistema de filtración se producen gradientes de concentración de los
solutos en la proximidad de la membrana, causados por las diferentes velocidades
4
8
&
8
8
&
8
8
8
8
8
8 D D 8
D 8
D B B D D b
de transporte de cada uno de ellos. Este es CQnOddO como "Polerización de
la Concentración" .Esta polarización proáuce una mayor concmtmción de solutos
en la proximidad de la membrana, lo cual por un lado puede incrementar el flux de
soluto y por otro disminuir el flux del solvente debido a un aumento de la resistencia
ai flujo producida por esta barrera de concentración Así mismo, puede ocasionar
una resistencia adicional debido a que puede estimular la interdón del sduío con
la membrana, si el soluto se incrusta en los poros de esta.
En los sistemas de uitrañitmcih el tlux de solvente a través de la membrana se incrementa signrficetivamente utilizando tbjo cruzado o tangencia1 en lugar del flujo
convencionel. En los sistemas de fiujo <xuzacIo la alimentacibn fluye en forma
paralela a la membrana minimizando el efecto de la polarización de la
concentración, ya que el esfuerzo cortante del fluido estimula el desplazamiento de las partículas de la Supemcie de la membrana.
El tm ino hk%Jisis se refiere a una reacción en la que interviene a$ua y un
cablizador con el oójetivo de "partir" ulwl mokula orghica, una repreeeniación
generaldeestetipodereaccioneooerialesigiriente: -5
R-X + Hfl --% R-OH + X-H
' e í a a una reacción química, la cual se Waría a
8 ácidas o ak;aiünas para p m v e r la reacción. -rcrprescntaaón caboencondiaione
. .
Exlatr,adomasdb,eJ@a cual 88 tendríía una emima como catelizedo r.
8 química, q-a reac&tn de hidróhsis enzidica en la
a rn
a
a
Y
8
D
8
B’ m
B B B
Cuando se plantea el desarrollo de un proceso, se adquiere de inmediato la
responsabilidad de seleccionar las técnicas y tecnologías más adecuadas para
realizarlo, este caso, hablando de la hidrólisis proteica no es la excepción, pues se
puede y se debe escoger entre los dos tipos de hidrólisis.
Las ventqas de la hidrólisis enzimática se manifiestan de manera importante en un
proceso de hidrólisis proteica, ya que el nitrógeno contenido en los alimentos se
en- en su mayor parte en las proteínas. Las proteínas para ser aprovechadas
a m o fuente de nitrógeno primero deben ser hidrdizadas por enzimas a
polipeptidos, después a peptidos y finalmente a aminoácidos, teniendo siempre una
gran espeaficidad del producto al que se desea llegar, lo cual no siempre es posible con medios químicos. Además, los productos de recuperación por hidrólisis
d e s t i s para la industria farmadutica o alimentaria deben cumplir con un alto
grado de pureza, lo cual pude lograrse satisfactoriamente por medio de una
hidrólisis emimática o.
otra de las ventajas que la hdrólisis enzimática presenta sobre la hidrólisis química,
es el permitir mantener un control sobre el grado de hidrólisis de les moléculas a las
que se desea llegar. En muchos casos, se busca una mejora en las proteínas
alimenticias mediante el uso de una proteólisis limitada o masiva mediante
proteasas, ejemplos de esto son el ablandamiento de la carne utilizando papaina, la
preCipitaaón de caseínas por quimiosina o proteasas de hongos, la mejora de la
textura de quesos por proteasas bacterianas o de hongos, el evitar la turbidez de la
cerveza con papaina o proteasas microbianas y finalmente la preparación de
hidrdizados proteicos solubles a basa de proteínas y de pescado como se pretende
utilizar en este modelamiento. Otro ejemplo de la utilización de la pmteólisis parcial
es la mejora de las propiedades emulsificantes y espumantes de proteínas
desnaturalizadas por calor, estos efectos provienen del aumento de la solubilidad del hibdiredo, que facilita la difusión y extensión de las interfaces aceite/agua y
aire/agm (8).
6
por último, pero no por ello menos importante, en muchos casos la recuperación y
purificación posterior a la hidrólisis resulta difícil y costosa para procesos de
hidrólisk quimica, to cual en términos económicos resulta como un factor
determinante en relación de la viabilidad de un proyecto.
1.5 EMmwr
Una eriijme es una proteína sintetizada por una célula viva, esta enzima cataliza o
acelera ww reaxión termodinámicamente posible (9).
Las erpimas poseen tres cgraderís5ieas que las hacen notables sobre otros
cateliwdorea: el poder cateütico, su eep&&¡dad y la capacidad para regular su
a d i W CatalEtiCa por UM variedad de compuestos naturales. Cuando se
comparan las velocidades de catafisis mire una reacción catalizada por una enzima
y otra con un catelizador químico, la primera se lleva a cabo más rápidamente y a
temperaturas m8s bajas. Como consecuencia de su naturaleza proteica la actividad
7
Las enzima8 son los catalizadores que emplean los seres vivos en una mayoría de
r e w s , es por esto que es de gran importancia conocer cuales son las leyes
que rigan la ant5tica de estos biocatalizadores y que variables afectan la velocidad
de r d h , pues este conocimiento permite predecir, diseñar y operar procesos
enzimáticos, lo cual provee de justificación y objetivo al presente trabajo (3).
Cuando una mdecula de susirato se acerca lo suficiente a una enzima, este
suotfato es m i d o y atraído por diferentes grupos de la enzima. Las cadenas
ssltentes de amino&cidos de la enzima, lo atraen al mismo tiempo que otros grupos
pueden atraer otra porción de esta misma molécula provocando una reacción A lo
anterior se le denomina reacuón enzimática, ya que los sitios reactivos de una
enzima (llarnodos sitios activos) catalizan una reacción, un sitio activo de una
enzima 89 el iugar de la enzima donde se realiza una reacción mediante la cual una
mo[ecukr es wnvertida en otra (e).
7
catalítica de las enzimas depende del pH y de la temperatura de reacción. La
eficiencia catalíüca de las &mas es muy alta a temperaturas que resultan bajas
comparadas con las requeridas por un catalizador químico. Esto significa que es
posible tratar o modifica con enzimas los alimentos con temperaturas moderadas
sin que los productos alimentarios experimenten grandes cambios.
La seguida característica importante de la actividad enzimática es la espeaficidad
de las reaccjOnes catalizadas por enzimas. Muchas enzimas son espeaficas tanto
en la nahraleza del sustrato que utilizan como en la reacción que catalizan. Esta
eqxmíiadad enzimática permite modificar selectivamente componentes
individuales sin afectar a otros. La tercera caraderistica importante de
las enzimas es que su actividad catalítica puede ser regulada por pequeños iones u
otras mdearlas (10).
Existe una gran variedad de enzimas, y cada una de ellas cataliza una reacción
especifica, la primera clasificación marca los principales grupos de enzimas:
1. Clxkkxn?áuctasass: catalizan reacciones de óxido reducción
2. Transtbrasas catalizan reacciones de transferencia de grupo
3. Hidrdasas: catalizan reacciones hidroliticas
4. LnBsas: catalizan reacciones de eliminación, en las cuales se forma un
doble enlace
5. Isomerasas catalizan reacciones de isomerización
6. f&asas: catalizan reacciones en las wales dos moléculas son unidas con un gasto energético
Las hidrolasas son enzimas que catalizan reacciones en las cuales participa agua
en el rompimiento de los enlaces covalentes de los compuestos, con la adición de
los elementos del agua a los participantes de estos enlaces (11).
Dentro de bs hidrolasas existe un grupo de enzimas proteoliticas o proteasas,
dentro de este grupo están induidas las proteinasas y las peptidasas. La hidrólisis
de proteínas a peptidos está a cargo de las proteinasas, estos peptidos pueden dar
lugar a cierto sabor amargo al producto de esta hidrólisis, wrno parte
complementaria del proceso de hidrólisis (y para eliminar si se desea este sabor amargo) las peptidasas se encargan del mismo proceso pero para polipeptidos y
peptidos hasta aminoácidos 0.
Las enzimas proteolíticas preparadas a partir de microorganismos pueden tener dos
origenes: baderiano o fúngico.
Las enzímas proteolítices de origen bacíen'ano, en su mayoría se preparan a partir
de Bacilkrs sdtüis, aunque existen diferentes bacterias que producen proteasas.
Las proteasas badenanas son utilizadas en la liberación de aceite de hígado de
pescado, en los procesos de ablandamiento de carnes, y en los de maduración y
chfkd6n de bebidas malteadas.
Las proteasas también se producen a partir de hongos, pues aunque los
vew- de a partir de egta fuente tienen a b conterudo de otras
enztmas, se puede tiacm una selección de cepas para obtener altos rendimientos
de proteasa y baja producción de otras enzimas. Además los hongos pueden ser
seleoaormkrs con base a la actrvidad de su8 proteesas en medio ácido o básico.
Las proteasas de origen fungico se emplean en la producción de productos de soja,
como salsas y otros alimentos fermentados orientales, al añadirse a la masa de pan
le aorga coneistñpnaa. También se utilizan en los procesos de elaboración de
cerveza y "ale", para eliminar la turbidez que provocan las proteínas, como agente
de disnrinución de viscosidad de la chra de huevo facilitando la filtración antes de la
dawicsción, para abkndar cames, y como se propone en este traba~o, para
hidrdizar el maten'd proteico de los rasiduos de pescado, facilitando así su
concentración y desecación o.
9
Cuai.idc se hablo le enzimas, se mencionaron sus cara3erísticas de catálisis,
espc c:rfi:idad y cap jadad ai3 regulación, estas características además proveen do
com:ileliiJad, tanto c 1 las enzjmas como al proceso mzimático en si. Así, no es dc?
extriiiíal que mucios parámetro afecten la velocidad de reacción, algunas
sust,iinuas llamadas inhibidores reducen la velocidad de una reacción enzimática al
prodi.icir la inhibiciori de dicha reacción (2).
Exis:w ?res tipos dc inhibicih: competitiva, no comp13ttitiva, y por sustrato (2).
Exis:w #aportes dl : que algunas enzimas proteolí1:icas SE, enaientran sujetas a
efecios inhibitorios ,JOT sustancias presentes en huevo, hariria de trigo, semillas de
maí:, I.., qermen ._ de tri 30, soja papa, secreciones pancreáticaa, y algunos órganos de
bovi'io Mas es1 ecíficamente las metaloprotensas (una dasificación de
endri(x!;tidasas), si )n inhibidas por agentes fuertemente quelantes como el EDTA.
Estcir, crfactos inhib,torios, al ser originados por una sustancia ajena a la reacción
print:ipai son ciasifi ados como competitivos y no competitivos (12, 13).
La iiihh :ión compí titiva y la no competitiva , se pueden ver como una inhibición
que w Dresenta a causa de la presencia de una sustancia extraña, Cuando la
presiiirma de la si stancia provoca la detención de la reacción enzima-sustrato
entoi-ici?; se denom na como un inhibidor (I). Se tiene inhibición competitiva cuando
el inhibidor I, y el s istrato S, atacan el mismo sitio en la enzima. Se tiene inhibición
no c:txyetitiva cuendo I ataca un sitio diferente de la eiizima, pero al hacerlo
detiwx! a acción d : S en la reacción, de forma sencilla se puede explicar que al X
estar 5:hre la supeificie de E, S no puede entrar o salir. Fig 'I.
INHlBlClON INHlBlClON NO COMPETITIVA COMPETITIVA
Fig. 1
Un twWo cirhtico de estos tipos de inhibición, nos permite tener una descripción
matemOtiEe de la velocidad con que Ocurren estas reacciones.
Inhñbicicln C0II)petM
Con S e I compitiendo por el mismo lugar en la enzima se tiene.
S+E&X-% P + E
k4
I + F a Y ks
kz
Donds
11
De acuerdo a un desamoiio semejante at que se sigue para la ecuación de
Michaelis-Menten, se obtiene la f m u l a para la velocidad de reacción para el caso
de inhibición competitiva.
Inhibición no competitiva
En este caso S ataca un sitio de la enzima, I ataca otro, pero al hacerlo detiene la
acción de S :
ki k S + E e X + P + E kz
I + X b Z %- Donde
K , =- k* + k 3 Constante de Michaelis-Menten k,
K, =- k5 Constante de inhibicih k,
Constante de inhibición k K =7
I2 '6
k, , k,, k3, k,, k5,k6, k, Constantes cinéticas para cada una de las reacciones
correspondientes.
AI igual que en el caso anterior, de acuerdo a un desarrollo semejante al que se
sigue para la ecuación de Michaelis-Menten, se obtiene la formula para la velocidad
de reacción
12
Para stmplificpr, se cOnsidOTO qua K, = K,2, de esta forma t e r n s para el a s o
de inhibición 110 competitiva:
s, Y,
Y = (I+$) K M +SI 1
Estudios de reaiperación de probina ds slesechos de pollo y pescado por medios enzimaticos, rgportan efedos en el grado de hidr6lisis de proteína de acuerdo a la
relación entre el substrato y la sdwidin Rulier en la que se suspende este substrato,
esto nos indica que la concentración de subsaato a la que ocurre la reacción
enzimOtica, provoca cierta tendencia a mejorar o dificultar la rsacción, pudiendo
estar un efedo de mbibicibn por substrato (14, 15)
- La inhibiaón por substrato, se presmta porque en algunas ocasiones el excaso de \
substrato provoca interferenca en las sitios activos de la enzima y disminuye la
velocidad de reacción (2)
Donde
S + E e X --+ k3 P + E
k4
k S + X I Y
13
B
I
k, k4
K, = - Constante de inhibición
k, , k, , k3, k, , k3 CmStanteS aneticas para cada una de las reacciones
correspondientes.
Una vez mas de acuerdo a un desarrollo semejante al que se sigue para 18
ecuación de Michaeiis-Menten, se tiene la fUmula para la velocidad de reacción
para el caso de inhibición por sustrato.
2. OBJETIVOS GENERALES Y ESPECIFICOS
2.1 objetivo general
Modelamiento de la hidrólisis enzimática de proteína de pescado en un reactor
enzimático de membrana sujeto a factores inhibitorios.
2.2 Objetivos espedíicos
1. Realizar el balance de masa del sistema
2. Establecimiento de la unética de hidr6lisis sujeta a diferentes factores inhibitorios
3. Definición del sistema matemático de resolución
4. Análisis de sensibilidad paramétrica
5. Simulaciones anéticas bajo condiciones de operación
O Concentración de susirato
O Concentracidn de inhibidor
I
14
3. METODOLOGIA UTILIZADA
El sistema se resolvió a traves de balances de masa en los diferentes puntos dave
del sistema, como el reactor, ultrafiltro, punto de mezcla y el mismo sisferna global.
El software utilizado fue Microsoft Word para PC, versión 98, 1998 y Microsoft Excel para PC, versión 98, 1998. Se utilizo una computadora PC con procesador Pentium.
Se realizaron simulaciones de operacih así como análisis de sensibilidad, para
esto se utilizaron datos teóricos y experimentales (4.16).
4. ACTIVIDADES REALIZADAS
Se realizó una revisión bibliogr8fca referente a las ctdtices de los diferentes tipos
de nhibición y sobre la teoría de ultraf~ltraaón, despues se realizaron balances de
materia, y posteriormente se llevó a cabo un modelamiento consistente en.
definición de sistemas matemáticos, anáiisis de sensibilidad, así como simulaciones
de operación, todo esto dentro de un marco teórico de respuasta. Finalmente se
realizó el presente reporte final, dentro del cual se pretende mostrar los resultados
obtenidos.
5. OBJETIVOS Y METAS ALCANZADOS -i
Los obptivos tanto el general como los específicos, f w o n -0s. Se logró el
m a m dola enzimtWa&ie proteína de RQscado en un reador
enzimáti de membrana sujeto a factores inhibitorios. Este modelamiento se
realizó a través de los baiences de masa del sistema, del establecimiento de la
cinética de hiWisis sujeta a diferentes factores inhibitwiw, de la definición del
sistema matemeti de reQduabn . , Y W prrrpmetrica con
simulaciones cineticas.
15
6. RESULTADOS
El resultado final de los balances realizados se presenta a continuación,
presentandose primero una parte COmÚn para los tres tipos de inhbicibn de una
moción enzimática (puntos 1 al 8). posteriormente, para cada uno de estos tipos
de inhibiaón se presentan un balance particular (puntos 9 , l O y 1 I), el cual al unirlo
a la primera parte nos da el resultado total para el sistema correspondiente a cada
caso de inhibición.
Rl Esquema
I I r I I -I ------ I
I I I
PI. Cn. Fm I
I I
R W C O r I I I Ua.Nb0 I I Rodudo - I -1 I I
L------- I L - - - _. - I - _ _ _ _ - _ _ _ - _ _ _ - - - _ _ - _ _ _ - - - I
F = FlW Subindices Volúmenes de contml S = Concentración de sustrato O : Entrada de la alimentadón al sistema Sistema P = Concentración de producto 1 : Salida del raador o entrada al ultnifih. Reactor VR = Vdumen úoI del reactor R : Recirwlaaón o s a l ¡ ¡ del ultrafiltro. Ultrafiltro
Punto de Mezda M : Entrada al reactor F : Final o salida del ultrafiltro.
16
LOS factores que intervienen en el sistema son los valores de las concentraciones de swatmato y pradudo, así como los diferentes flujos que están presentes en los di voiíunecres de control, y los valores del volumen del reactor y el área de ultrdiitreción.
6.2.1 F m COWLWOS
Estos fadores son lo9 que tienen valores conocidos, y constantes durante todo el proceso.
Po.- Producto en la corriente de entrada SF.- Sustrato en la corriente de salida PR.- Producto en la comente de recirculación Pu.- Producto en la corriente de entrada al reactor
p ~ a explicada mas adelarte.
trpbpjo Pa sf, PR, y PM son consideFados igual a cero c o m ~ será
6.2.2 F.ctoni,
En este caso referimos factores con valores demmwiidss, *debido a que estos están en función del proceso, y para conocerlos es rme%smo ’ rcNdver arl bcdence genmd del sistema.
b
b
b
b
b
b
b
b
b
SI.- Susírato an ei reactor SR.- W a t o 8n la aoniente de recirculación %I.- Sustrato en la Comwíe de entrrnda ai reactor PI.- plodudo en el reactor PF.- Producto en la corriente de salida F0.- Flujo de la Comente de entrada FI .- Flujo de fa axrimte CM reactor al ultrafiltro FR.- Fb~o de la mmnte sk, reciraikón Fu.- Fly0 ~n ler FF.- F h j O drk drsawe
de enkeda al reactor
Estos son los fadores que deben para poder conocer a deW8 todo el sistema, las concentfaa ‘ones de producto y sustfaio son las mismas en el reactor y en el flujo Fl.
17
.:, 3 K',tlñ ,. , gtineral del si? i .?Mia
;:.l;3:
:.t'
!pmtral m s I:M? Tit)? plantear las primeras condcioneia del sistema, a ::I t h s pode-i. :I! ..txener las sduciones para cad8 volumen de w:i!trol.
3: C 3 a 1, <:E deflUjOS
,4 =umulación = Entrada - salida .. :,I . wioc; una acmx I -+ciÓn de flujo igual a cero, de exa f m a s3 obticine:
Entrada = Salida
Fo = FF ' IC tanto:
a , ( I 'irración = Enmada - salida - Con nimo
8.3.1
. 1 I l i t ' I !ación = Enhaah - salida f Prtd I zión
Se desea una acumulación de producto en el sistema igual a cero, por lo tanto todo el producto del sistema saldrá en la comente final o de salida Además se considera que la entrada de producto es cero:
p, = O 6.3.3
6.4 Consideraciones
Y = ywsl Ecuación de Michdis-Menien 6.4.1 Kbi +SI
y21 Ecuación para inhibición competitiva 6.4.2 ~
K,, (I + NI) + S, Y =
-- y- s, (’ + Eaieición pata inhibición no competitiva 6.4.3
Y = Ecuación para inhibición por substraío 6.4.4 K, + S, + S,’N
R = 5 = 5 Tasa de Recirculación 6.4.5 FF F,
_- 6.4.6
6.4.7
19
6.5.1 Balance de Flujos
F, + FR = Fu
Sustituyendo por 6.4.6
Fo +R& = Fu
~ , ( i + R)= F~
6.5.2 Balance de Sustrato
FOSO + FRSR = FuSu
Sustituyendo por 6.4.6
FOSO i RFoSR = FuSu
Sustituyendo pw 6.5.1.3
&So + WJR = Fo(l + R)SM
.A
6.6 Balances en el ultrafiltro
6.5.1.1
6.5.1.2
6.5.1.3
6.5.2.1
6.5.2.2
6.5.2.3
6.5.2.4
6.5.2.5
Acumulacion = Entra& - Salida - Connrnio
Debido a que en este punto solo se realiza un proceso de separacih mecánico, no existe consumo de sustrato y la acumulación es cero, por lo tanto
Entra& = Salida
6.6.1 Balance de Flujos F, =Ffl+FF 6.6.1.1
20
F' - , - c;, +E;
Sustituyendo por 6.4.6
E;=F,+RF,
F; =E,(l+R)
4 F, = __ 1+R
6.8.2 -me de Sustrato &SI = FRSR + FFSF
De 6.3.2 se sabe que S, = O , por lo tanto.
&SI = FRSR
Sustituyendo por 6.6 1 1
+ F F ) = FRsR
Del balence global se sabe que FF = Fo , por io tanto
AI sustituir erta eamción en la $OUPOión 6.5.2.5 tenemos
6.6.1 2
6.6.1.3
6.6.1.4
6.6.1.5
6.6.2.1
6.6.2.2
6.6.2.3
6.6.2.4
- 6.6.2.5
6.6.2.6
6.6.2.7
6.6.2.8
6.5.2.5
21
-=S, l+R
So + SI(] + R) l + R
-=Su
6.7 Balance geneml de swtraío
La fracción de conversión en el reactor se define como:
SI = Su(1- X)
Sustituyendo por 6.5.2.5
Sustituyendo por 6.6.2.8
So + Sl(l + R) 'I=( i + R
SI(-) = So +S,(l+R) 1-x
l + R I-X SI( ~ - (1 .+ R)) = So
6.6.2.9
6.6.2.10
6.7.1
6.7.2
6.7.3
6.7.4
6.7.5
6.7.6
6.7.7
22
sll = (I + R(&)
AI sustituir esta ecuación en la ecuación 6.6.2.10 tenemos
So + S,(i + R) 1+R
s, =
SO sM = ( I+R)x
6.7 8
6.7.9
6.7.10
6.7.1 1
6.6.2.10
6.7.12
I
6.7.13
6.7.14
6.7.15
6.7.16
23
6.8 Teorla de ultrafiltración
6.7.17
La ecuación de flux del Modelo de polarización en pellcula y capa de gel ~8 define como :
donde:
J : Flux de permeado Ce : Concentración de soluto (sustrato SI) en la alimentaci6n del ultrafiltro. & : Concentraci6n de límite (constante) Ks : Coeficiente de transferencia de masa
Los úitimos dos valores son constantes para una solución en particular, para poder resolver el sistema y aplicarlo hay que encontrar estos valores de acuerdo a experimentos de ultrafiltraci6n, se recomienda un experimento parecido al reportado por Tejeda (1 995).
Una vez realizados estos experimentos encontramos el valor del flux para una concentración determinada, y tenemos que
Flujo .I =-- 6.8.2 1
Area
El área de la formula es el área de la membrana del ultrafiltro, por lo tanto :
Flujo = FF = J*AREA 6.0.3
FF = ARE4(Ks In 2) 6.8.4
24
EI valor de CB en igual al de SI, expresados ambos en cwicentración de masa en volumen (g/L por ejemplo).
C, = S, 6 8 5
Ya que tenemos que F, = FF tenemos que :
Fo= A+&?)
De la ecuación 6.7.2 se tiene que S, = (1 - X)SM , sustituyendo obtenemos :
Sustituyendo por 6.6.1.7
6.8.6
6.8.7
6.8.8
6.8.9
6.8.7
Sustituyendo por 6.6.2.14
F, = A R E A ( i + R k s h " s, 1 6.8.7
- '((1 + R)X]
6.8.8
26
6.9 inhibición competitiva
üe acuerdo un balance de susirato en el reactor, y a la ecuación para la veloudatj de reacción para el caso de inhibici6n competitiva, se obtiene:
Acumuloch= Entr.ada-Saliab-C~n~~mo
cis dt
V-=F,S,, -F,Sl -V 6.9 ’
Al estar en estado estacionario :
cis - = o dt
Por lo tanto :
6.9 ;I O=F,S,, -F,S,-V
Al considerar F,, = F, , y dividiendo entre V
4 o = -(&YM - SI)- - V 6.9 3
-(s, 4 -SI)= V 6.9.4
Sustituyendo por 6.7.2
6.9.5 -(s, 6 - s, (1 - x)) = V
- (S,X)=- 4 V 6.9.6
Sustituyendo por 6.7.1 1
6.9.7
Sustituyendo por 6.7.17
- 6.9.8
7
6.9.9
6.9.1 O
Sustituyendo por 6.8.8
mtreelvdumendeun Con esta eweaón m 8 C t c T y e l h a wia m ~ ~ ~ ó n de substrato i n b l y la fmcckh de 8 qu se descw, así como una tasa de recirculación propuesta.
I
27
EI siguiente ejemplo ilustra el uso de esta ecuación, para encontrar la relación entre el Mea de ultrafiltración y el volumen del reactor, proponiendo valores teóricos de las siguientes variables, y manteniendo rangos variables de conversión (X), y recirculación (R)
Vmu= 0.2 mgiml'min K 1 ~ 0 . 0 0 8 6 mglmi -5 mglml Ks= 0.0334 ml/cm2'min Cg=m mgiml
I= 2 mgimi Ki=O.5 mgiml
r~ 0.35 ?
I
w i 4 0.25 1 9 I i o.2o 1
1 0 ! 3 0.10 ;
i ' 0.15 1 2
W --.... . ~
a
k. --.h 0.05 j
0.00 O 0.2 0.4 0.6 0.8 1
CONVERSON X
En el caso particular de una conversión de 0.2, para una tasa de recirculacián de 5 se tiene una relación áreaivolumen igual a 0.26276, as¡ teniendo un área de ultrafiltraaón de 120 un2, tendríamos un reactor de 457 mL.
Un análisis de sensibilidad parametria muestra los siguientes resultados al incrementar las variables en un 10 %, de acuerdo a las siguiente formula :
AV V Sensibilidad = - AP P
-
-
28
donde
Variable P Sensibilidad ' vmax 1 O00
Km 0.01 3 so 0.702 Ks 0.909 cg O 207
I 0.010 Ki 0.010
V = Variable de respuesta. es este caso AreaNolumen P = Variable de estudio de sensibilidad
Q.WocrMbici6n no competitiva
De acuerdo un bekKtce de sustrato en el reactor, y a la ecuación para la velocidad de reección Pam d a 8 0 de inhibición no competitiva, se obtiene:
Acumulación = F a t r d - salida - Consumo
6.10.1 -*
6.1Q.2
6.10.3
29
SI Y,
- 4 (s, -. s, ) = (I+$] V KM +SI
6.10.4
Sustituyendo por 6.7.2
6.10.5
6.10.6
Sustituyendo por 6.7.11
1+-
K’f +( ( l+R)X)
6.10.7 -(S,X)=- 4 K, V S A - X )
Sustituyendo por 6.7.17
F V
1 - --
6.10.8
6.10.9
6.10.10
Sustituyendo por 6.8.8
a o V - A J K M +[ (l+R)X
J
Con esta ecumón podemos encontrar la relación adecwda entre el volumen de un reactor y el áma de una txmcmír&ón de Mbrtrodo inicial y la , as¡ como una tasa de recirculación propuesta.
a el uso de esta ecuación, para encontrar la reiación entre y el vdumen del reactor, proponiendo valores teóricos de
las sgumtes variables, y menteni8ndo rangos variabk de conversión (X), y recirculación (R)
aa6n para un de Ndróiisis q
VqmE- 0.2 mg/ml"min Km= 0.0086 mglml s o 0 5 mglml K.rr 0.0334 ml/cm2'min
t 2 mglml Kisi 0.5 mümg
-300 *mi
31
0.08 -
3 0.06 I 3 !
5 . 8 0.04
z i 0 ~
I a
i
3 0.02
+R=lO R=20
O O 0.2 0.4 O .6 0.8 1
CONVERSON X
En el caso particular de una conversión de 0.2, para una tasa de recirculaci6n de 5 se time una relación áreahrolumen igual a 0.05309, así teniendo un área de ultrafinración de 120 un2, tendríamos un reactor de 2,260 mL.
Un análisis de sensibilidad parametrica muestra los siguientes resultados al incrementar las variables en un 10 %.
6.11 Inhibición por sustrato
De acuerdo un balance de sustrato en el reactor, y a la ecuación para la velocidad de reacción para el caso de inhibición por sustrato, se obtiene:
Acumulación = E n í r h - Salida - Consumo
32
AI estar en estado estacionario
Por lo tanto :
O = F,S, -&SI -V- Y,& " 2 4 KM +SI +- KI
AI considerar F, = 4 , y dividiendo entre V o= -(s, 4 -SI)- Y ,SI
V S 2
Kl K, +SI +'
tl.1 1 .I
6.11.2 .-
6.11.3
6.11.4 -(s, 4 -SI)=- /,SI
V SI ?.
KI K , +SI +-
Sustituyendo por 6.7.2
6.1 1.5 1̂ -(sM 4 -S,(l-x))= Y-S,
V SI KI
K, +SI +-
6.11.6 -(s,x)= 4 Y-SI V K, +SI +- 4'
Kl
Sustituyendo por 6.7. I 1
6.1 1.7
33
Sustituyendo por 6.7.17
I - - F -
F 1 - Y-(@+)] -- V So(I-X) SJl-X) 1
KM +( ( I+R)X)+[$z$E) K,
6.11.8
6.11.9
6.11.10
Sustituyendo por 6.8.8
6.11.11 - - V
6.11.12
Con esta ecuación podemos encontrar la relación adecuada entre el volumen de un reactor y el área de uitrafiitración para un sistema, con una concentración de substrato inicial y la fracción de hidrólisis que se desea, así corno una tasa de recirculación propuesta.
El siguiente ejemplo ilustra el uso de esta ecuación, para encontrar la relación entre el Area de ultrafiltración y el volumen del reador, proponiendo valores teóricos de
34
las siguientes variables, y manteniendo rangos variables de conversión (X), y recirculación (R)
Vmax= 0.2 mglrnl'min Km= 0.0086 mglml so= 5 mg/mi Ks= 0.0334 ml/cm2'min Cg=300 mglml Ki-0.5 mllmg
0 1 4 -
0 1 2 I
ii 3 0 1 -
d 2 o.o8 4 3 z 0.06 ~
0 o w 4 0 0 4 : a
0.02 i 1 x R=50
0 - O 0.2 0.4 O .6 0.8 1
CONVERSION X
En el 61180 partiaiierde una c0nwMn de 0.2, para una Wiadereciradación de 5 0.0347, asi tsrysndo un Brea de de 3,4(36ml.
Un an&isis de sensibilidad ica muestra los siguientes resultados al ñcrementer las variables en un 1 O %.
I
35
7. DISCUSIONES Y RECOMENDACIONES
Debido a que la representación global del Proceso real es una aimlach, ,,, natural que se espere una cierta diferencia entre la operación real y la previsb pen
el proceso, aunque esta diferencia puede disminuirse en la medida que la
experiencia nos otorgue criterios que permitan corregir Y mejorar el modelo,
forma que mantengamos y aumentemos su utilidad práctica.
Se remienda para utilizar las ecuaciones desarrolladas antenomiente, realizar 10s
experimentos cinéticos necesarios, para en caso de inhibición, identificar de que
tipo se irata, así axno encontrar los parbmetro cinéticos necesarios para poder
resolver las ecuaciones particulares de cada caso. Así mismo los experimentos de
ultrafiltraaón que permitan encontrar los parámetros especificos de esta operación
unitaria para el sistema.
Como puede observarse existe cierta similitud de tendencia en las Curvas de las
gráficas de inhibición competitiva y no competitiva, no siendo totalmente así en la
de inhibición por sustrato. Esto puede deberse a que en el caso de la inhibición por
sustrato se involucra un termino Cuadrátiw, el cual hace cambiar el comportamiento
de sus curvas, con respecto a los otros dos tipos de inhibición, en los cuales se
presentan ecuaciones lineales. Así mismo se nota una importante semejanza en los
ordenes de magnitud en los resultados de cada caso especmco, lo cual nos
confirma ia lógica de los resultados obtenidos
36
8 . CONCLUSIONES
AI realizar el modelamiento matemático del sistema, obtenemos como resultados
las ecuaciones 6.9.12, 6.10.12 Y 6.11.12. Estas ecuaciones sirven para calcular la
relación optima entre el volumen de un reactor y el área de ultrafiltración para un
reactor enzimático de membrana, bajo condiciones iniciales propuestas, tales como:
una concentración de substrato inicial y la fracción de hidrólisis que se desea, así
como una tasa de recirculación propuesta. Estas ecuaciones se obtuvieron para las
cinéticas con inhibición competitiva, no competitiva y por sustrato respectivamente.
Los valores encontrados para la relación ár&o/umen, en los ejemplos descritos
antenomente se expresan en unidades de cm2/mL, de acuerdo a las unidades de
las variables presentadas en los ejemplos.
AI realizar un ejercicio para cada caso en particular, donde se propuso una tasa de
recircuiación de 5 y una tasa de conversión de 0.2, buscando encontrar el valor de
la relación Wvolumen, sa obtuvieron resultados muy cercanos en magnitud.
El an8ilieis de sen%ibilidad paramtrica nos muestra las variables que mas
provocan en el resultado final de los balances, siendo diferentes las varWes y sus
magnihrdes para cada uno de los dterentes tipos de inhibición. --.
Para el cgso de inhibición competitiva la variable que mayor impacto cam es la
velocidad máxima de reacción. Y la que menor impacto provoca es la W del inhibidor y la constante de inhibición
En el caso de inhibición no competitiva fue la canstante de inhibición la va’¡atple que
mas impacto tuvo en el análisis de sensibitidad, contrario al caso anterior. La
constante de Michaelis y la concentración de limite fueron las variables que menos
impacto tuvieron, llegando al valor de cero en el análisis de sensibilidad.
37
k?
:I . . : .:i~ ! irih bici511 pcir sustrato los iresultados fueron los mismo que en el
. , , , . : , , ' 3ieiii:'o inc:luso del mismi:' brden los resuibados, la constante de
1 . r , A l .iI c~n!itante de Michaetis fugmn las variables que mayor y menor
I : ' 1 , . :r: iron ̂ espectivamente.
I i,:
.. . , . : rw, Ic:c parámetros que inhyor impacto +wan en la relación !,
2 : : ti ' 11:):
( G I I I ~ ri ( ebei 1 ser obtenidos o calc~l&as m n mayor Cuidado o precisih que
: : : j , . I " ( luir que el modelamier1i:ol del sistema se realizo de manera
! , I C . i i m c:uiiiI )lir todos los objetivos ¡planteados iniuelmente, puesto que el
II 8 , , ., :I riit Fá (lbtener resultados ttQjms con una dara aproximación a
'I I ' : :j pt rirrie itale:;.
I , '
38
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