1
BELANČEVINE
UvodUvod
� Belančevine ili proteini su visokomolekulski
prirodni proizvodi (prirodni makromolekuli)
izgrañeni od α-aminokiselina, koje su
meñusobno povezane peptidnim vezama u
makromolekulske nizove.
� Naziv PROTEINI potiče od Grčke reči proteios,
što znači PRVI
� čine osnovu života, ulaze u sastav svih živih bića
2
Peptidi
� Amidna veza, -NHCO-, se ovde zove peptidna veza
� Peptidi su amidi dobijeni reakcijom amino-grupa i karboksilnih grupa aminokiselina
� Peptidi se dele na dipeptide, tripeptide ... polipeptide
� Polipeptidi su molekuli sa MM do 10000
� Proteini su molekuli sa MM preko 10000
H2N-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-
R1 R2R3 R4 R5
-NH-CH-COOH
Rn
. . .
u izgradnji učestvuje svega oko 20 prirodnih αααα-aminokiselina
3
� U izgradnji belančevina, sem amino kiselina, mogu da učestvuju i druga jedinjenja, manje ili više složena, gradeći na taj način složene sisteme u kojima su makromolekulski polipeptidni nizovi spregnuti sa neproteinskimdelovima, koji se opštim imenom nazivaju prostetske grupe.
� Prostetske grupe mogu da budu veoma raznolike i složene, kao što su nukleinske kiseline, bojene materije, lipidi, ugljeni hidrati, fosfatna kiselina ili, pak, metali, tako da se sreće niz tipova složenih belančevina ili, kako je to uobičajeno da se kaže – konjugovanih proteina.
Aminokiselinski sastav belančevina
� l. Sve aminokiseline koje se pojavljuju u belančevinama, bez izuzetka, su α -aminokiseline.
� 2. Sa izuzetkom najjednostavnije aminokiseline koja se pojavljuje u belančevinama (glikokol, glicin, α-aminosirćetna kiselina), sve ostale prirodne aminokiseline sadrže najmanje tri C atoma, koji sačinjavaju jedan zasićeni niz.
� 3. Isto tako, sa izuzetkom glikokola, drugi C atom prirodnih aminokiselina je asimetričan, tako da su sve optički aktivne i sve imaju L-konfiguraciju.� u prirodi - manji broj aminokiselina koje imaju D-konfiguraciju
4
C
CH X
HNH2
R
COOH
C HNH2
COOH
R
I II
X = H, CH3 ili hetero grupaR = H ili organski ostatak
Pregled aminokiselina
Alifatske zasićene nesupstituisane monoamino-monokarbonske kiseline
5
Alifatske oksiamino-monokarbonske kiseline
6
Tioaminokiseline
Aromatske aminokiseline
7
Heterociklične aminokiseline
Diamino-monokarbonske kiseline
8
Iminokiseline
Monoamino-dikarbonske kiseline
9
C HH3N
COOH
R
C HH3N
COO
R
C HNH2
COO
R
+
katjon (I) dipol-jon (II) anjon (III)
+- -
..
Fizičko-hemijske karakteristike amino kiselina
1. Slobodne aminokiseline sadrže jednu kiselu i jednu baznu grupu, koje se meñusobno neutralizuju, tako da se aminokiseline praktično pojavljuju isključivo u obliku dipol-
jona.2. Rastvaranjem slobodnih aminokiselina u vodi, dolazi do
uspostavljanja ravnoteže izmeñu slabo kisele NH3+ grupe,
slabo bazne COO- grupe i H+ jona iz vode, a pH vrednost na kojoj dolazi do uspostavljanja ove ravnoteže naziva se izoelektrična tačka.
3. Aminokiseline su amfoterna jedinjenja i mogu da grade soli kako sa kiselinama tako i sa bazama, te im stoga i odgovaraju dve konstante disocijacije, kisela i bazna, koje odgovaraju kiselosti NH3
+ grupe i baznosti COO- grupe (a ne konstantama disocijacije COOH odnosno NH2 grupe).
I= ½ (pKa-pKb + 14)
10
NH2
O
R
O NH2
O
R
O
Cu+
Kompleks αααα-aminokiseline sa jonom bakra
4. Stvaranje dipol-jona kod aminokiselina može se sprečiti samo u slučaju da se blokira bilo karboksilna bila amino grupa.
5. α-aminokiseline su sposobne da grade komplekse sa teškim metalimatipa helata →način za izdvajanje i prečišćavanje aminokiselina
O
O
OH
OHR C COOH
H
NH2
O
O
OH
HR C O
H
+ + + +NH3 CO2
ninhidrin redukovani ninhidrin
6. Aminokiseline su poznate po brojnim bojenim reakcijama: ninhidrinska reakcija ima opšti značaj ovu reakciju ne pokazuju aminokiseline: prolin i oksiprolin (imino, a ne amino grupa)
11
O
O
OH
OH
O
O
H
OH
O
O
N
O
OH
+
+
NH3
3H2O
ninhidrinoksidovani oblik
ninhidrinredukovani oblik
plavo-ljubičasti kompleks
+
Stereohemijske karakteristike
N C
R
C N
H
C
R
CO
H H H
O1 2. . . . . .
Peptidna veza
Peptidna veza i njene karakteristike
12
a) trans b) cis
Valentni uglovi i rastojanja peptidne veze
(retko)
CC'
ON
H
C
CC'
ON
H
Cα
α ..
α
α +
I II
_
•C-N veza za 0,015 nm kraća od uobičajene jednostruke C-N veze
•C—O veza za 0,002 nm duža od C=O veze (aldehidi ili ketoni)
� kod kristalnih sistema sa jednom ili više peptidnih veza - hibridna struktura,
� učešće granične strukture I sa približno 60%
� i granične strukture II sa oko 40%,
� Iako ne postoji mogućnost slobodne rotacije oko same peptidne
veze, rotacija oko veza Cα-C’ prvog, kao i N-C
αdrugog ostatka
aminokiseline nije ograničena, što znači da planarni fragmenti mogu meñusobno zauzimati različite prostorne rasporede.
13
Prostorni odnos planarnih fragmenata peptidnih veza, koji se sučeljavaju na istom αααα-C atomu.
� Ravni dveju susednih planarnih peptidnih veza koje se sučeljavaju na
istom α-C atomu mogu da zauzmu različite prostorne rasporede, a u zavisnosti od vrednosti azimutalnih uglova ϕ i ψ, koji inače definišu rotaciju oko veza C
α-C' odnosno N-C
α.
Cαααα
N
C’
14
Prostorni raspored peptidnih veza i aminokiselinskih ostataka R
� Mogućnost da planarni fragmenti peptidnih veza zauzimaju različite rasporede u odnosu na α-C atome, i meñusobno, s jedne strane, kao i sposobnost karakterističnog ostatka aminokiseline R sa α—C atomom, s druge strane, pruža velike mogućnosti meñusobnog prostornog podešavanja i planarnih fragmenata i karakterističnih ostataka.
Definisanje peptida
Definisanje belančevina – složeno
� 20 aminokiselina
� aminokiselinski sastav-kvalitativan i kvantitativan -nedovoljno
� struktura i prostorni oblici makromolekulskih nizova
1. Odreñivanje krajnjih aminokiselina
2. Postupna odgradnja pojedinih aminokiselina
15
Odreñivanje krajnjih aminokiselina
NedostatakRazlaganje peptida pase ne može više koristiti
DNP derivat aminokiseline je karakteristično žuto obojen,dok dansil derivat intenzivno fluorescira
Samo podaci o jednoj grupi!
16
Postupna odgradnja pojedinih aminokiselina
� Reakcija po Edmanu
� Reakcija sa bromcijanom
� Ostale specifične reakcije raskidanja peptidne veze
Reakcija po Edmanu (Edman)
Fenilsenfno ulje
17
Do 100 a.k. ostatakaOgraničenje-gubitak supstance
Reakcija sa bromcijanom
R
CH2
CH2 S CH3
N C Br
R
CH2
CH2S CH3
C N
O
R'-NHN CH-CO-...
HR
N
O
R'-NHO
R
R'-NH-CH-CO-NH-CH-CO-... R'-NH-CH-CO-NH-CH-CO-...
+
+
+ CH3-S-C
+ H2N-CH-CO-...
Lakton homoserina
metionin
•Dobijanje manjih fragmenata•Lakša analiza
slično reaguje i I-CH2-CONH2
18
Pregled peptidnih veza koje se razlažu pod dejstvom pojedinih enzima
G1y-G1n;Cys-SO3H-Ser; Gln-Leu; Gly-Asn7,0Papain
X-Tyr; X-Phe; X-Leu-X;
X-Gly-X1-2Pepsin
Phe-X; Tyr-X8,0Himotripsin
X-Lys-X; X-Arg-X7,8Tripsin
Peptidne veze koje
enzim specifično
razlaže
Optimalna pH vrednost
dejstva enzimaEnzim
Ostale specifične reakcije raskidanja peptidne veze
RR
R CH
NH2
C
O
RN
CH
COOH
H
N
N
R
O
O
R
H
H
H2N-CH-COOH
1
1
1 2
2
H2N-CH-COOH2+
dipeptid
diketopiperazin
Uspostavljanje peptidne veze
•Biosintetski - enzimski•Hemijski - acilovanje ili zagrevanje
19
20
Sinteza peptida
-C6H5CH2OCOCl + H3NCH2COO
C6H5CH2OCO-NHCH2COOH
C6H5CH2OCO-NHCH2COCl
SOCl2
karbobenzoksi-hlorid
karbobenzoksiglicin
hlorid karbobenzoksiglicina
+
Sinteza peptida
CH3
CH3
-+ H3NCHCOO
C6H5CH2OCO-NHCH2CO
C6H5CH2OCO -NHCH2COCl
-NHCHCOOH
karbobenzoksiglicilalanin
+
21
Sinteza peptida
CH3
CH3
C6H5CH2OCO-NHCH2CO -NHCHCOOHH2,Pd
+ -H3NCH2CO -NHCHCOO + C6H5CH3 + CO2
Gly-Ala
Zaštitne grupe pri sintezi peptida
• neophodno je da se zaštitna grupa lako uspostavlja, pri čemu je poželjno dai odgovarajući reaktivi budu pristupačni.
• zaštitna grupa mora da bude stabilna za vreme reakcije uspostavljanja peptidne veze.
• posle obavljenih reakcija poželjno je da se zaštitna grupa otcepi pod blagimuslovima, i to tako da ne doñe do narušavanja tek uspostavljene peptidne veze.
22
R R
R R
NH-CO-NH
N C N
Z-NH-CH-COOH + H2N-CH-CO-Y
Z-NH-CH-CO-NH-CH-CO-Y +
1
1 2
2 (DCC)
zaštićeni peptid dicikloheksilkarbamid
dicikloheksilkarbodiimid (DCC)
Aktivacija COOH grupe pri sintezi peptida
� Najčešće-prevoñenje u hlorid kiseline – nije uvek pogodna, nepoželjne sporedne reakcije
� Upotreba dicikloheksilkarbodiimida
CH2Cl
R
CH3
CH3
CH3
O
O
CH2-O-CO-CH-NH-t-Boc
R
P + H3C-O-CH2Cl
kopolimer stiren-divinilbenzen
hlormetil-metiletar
SnCl4/hlormetilovanje
P + O-CO-CH-NH-t-Boc
1
t-Bochlormetilovana smola t-Boc-aminokiselina
_
P
1
t-Boc-aminoacil polimer
HCl/CH3COOHili CF3COOH/CH2Cl2
odstranjivanjet-Boc grupe
Uspostavljanje peptidne veze na čvrstom nosaču (Merifildov postupak)
•prednost-velika brzina (6 ak u danu)•nema problema po pitanju rastvorljivosti•operacije su jednostavnije i lako se izvode•proces može da se automatizuje
(t-butiloksikarbonil)
23
CH2-O-CO-CH-NH3
R
P
1+
Cl_
Et3N/CH2Cl2neutralizacija
CH2-O-CO-CH-NH2
R
R
P
1
+ t-Boc-NH-CH-COOHDCC/CH2Cl2
2uspostavljanje peptidne veze
CH2-O-CO-CH-NH-CO-CH-NH-t-Boc
R R
CH2Br
R R
t-Boc-dipeptidil polimer
HBr/CF3COOH/HF
P
1 2
otcepljivanjesintetizovanog peptida sa polimera
P + H2N-CH-CO-NH-CH-COOH
12
brommetilovani polimer dipeptidNedostaci•otežano razdvajanje•reakcije ne idu do kraja, ostaju pratioci
Efekat faznog prinosa na ukupan prinos u sintezi peptida
82111,7100
90321351
94512931
96644421
98806611
99,8%98%96,8%
Ukupan prinos finalnog peptida (%),
kada je prinos svake faze:Broj ostataka a.k.
u finalnom
polipeptidu
Sinteza u ćeliji – belančevina od 100 a.k. za 5 s, uz potpunu tačnost
Za par dana
24
sinteza glukagona (proteinski hormon pankreasa), Vinš
fragment l: AK 1-6 His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phefragment 2: AK 7-15 Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Aspfragment 3: AK 16-21 Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Aspfragment 4: AK 22-26 Phe-Val-Gln-Trp-Leufragment 5: AK 27-29 Met-Asn-Thr
Sinteza polipeptida iz fragmenata
Za uspostavljanje peptidnih veza izmeñu pojedinih fragmenata korišćena je kombinacija dicikloheksilkarbodiimida i N-oksisukcinimida
Z1-NH-AK 22-26 COOH + H2N-AK 27-29 COO-t-Bu
fragment 4 fragment 5
Z1-NH-AK 22-29 COO-Y
Z1-NH-AK 16-21 COOH + H2N-AK 22-29 COO-t-Bu
fragment 3
Z1-NH-AK 16-29 COO-Y
Z1-NH-AK 7-15 COOH + H2N-AK 16-29 COO-t-Bu
Z1-NH-AK 7-29 COO-Y
fragment 2
25
Z2-NH-AK 1-6 COOH + H2N-AK 7-29 COO-t-Bu
fragment 1
Z2-NH-AK 1-29 COO-t-Bu
H2N-AK 1-29 COOH
glukagon
zaš. polipeptid
otcepljivanjezaš. grupa
Z1 – 2-nitrobenzensulfonil ostatak, Z2 – N-diadamantiloksikarbonil ostatak,
t-Bu – terc- butil ostatak.
(CF3COOH)
fragment 2fragment 1
1 5 10 15H2N-His-Ser-G1n-G1y-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-
fragment 3 fragment 4 fragment 5
20 25 29-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-COOH
� Dejstvom trifluorsirćetne kiseline otcepljene su zaštitne grupe i kao krajnji proizvod je dobijen sirovi glukagon, koji odgovara sledećoj strukturi:
•izbegnuta otežana rastvorljivost i usporavanje brzine reakcije•opasnost od racemizacije povećana
26
Definisanje belančevina
Saznanja o aminokiselinskom sastavu su neophodna, ali ne i dovoljna da bi se na osnovu samo ovih podataka mogla definisati bilo koja belančevina.
� Da bi se došlo do odgovora, neophodno je poznavanje � veličine molekula, � njihovih struktura i
� meñusobnih odnosa svih prisutnih aminokiselinskih ostataka, kao i
� prostornog oblika u celini, ali i u pojedinostima.
Odreñivanje molekulske veličine
Krioskopska i ebulioskopska metoda, su praktično
neprimenljive za utvrñivanje mase zbog slabe
rastvorljivosti belančevina
� Od hemijskih metoda za odreñivanje veličine
makromolekulskog sistema često se koristi
metoda kvantitativnog odreñivanja krajnjih grupa
� MALDI/MS (matrix assisted laser
desorption/ionisation mass spectrometry)
� ESI MS (electron spray ionisation mass
spectrometry)
27
S S
S
S
S
S
G-I-V-E-Q-C-C-A-S-V-C-S-L-Y-Q-L-E-N-Y-C-N
F-V-N-Q-H-L-C-G-S-H-L-V-E-A-L-Y-L-V-C-G-E-R-G-F-F-Y-T-P-K-A
niz A
niz B
5 10 15
5 10 15
20
25 3020
Primarna struktura insulina
Odreñivanje primarne strukture belančevina
� Senger - metodom obeležavanja slobodnih NH2 grupa krajnjih aminokiselina dinitrofenil- (DNP-) ostatkom, utvrdio krajnje amino grupe kod insulina – Gly i Phe
� Parcijalnom hidrolizom i identifikacijom a.k. utvrñen sastav insulina
Odreñena kombinacijom hemijskih i enzimskih metoda
MM=5733 g/mol
Razlike u aminokiselinskom sastavu niza A insulina različitog porekla
– Cys – Thr – Ser – Ile –Kit
– Cys – Thr – Gly – Ile –Konj
– Cys – Ala – Gly – Val –Ovca
– Cys – Thr – Ser – Ile –Svinja
– Cys – Ala – Ser – Val –Goveče
7 8 9 10
Aminokiseline u položajima 7-10 niza A insulinaPoreklo insulina
28
Potpuno prostorno definisanje belančevina
� primarna struktura- regulisana kovalentnim vezama- nedovoljna za definisanje belančevina;
� prostorno definisanje pravilno izgrañenih fragmenata – sekundarna struktura;
� prostorno definisanje jedinstvenih makromolekulskih nizova, uključujući i pravilno i nepravilno izgrañene fragmente – tercijarna struktura;
� prostorno definisanje makromolekulskih sistema, izgrañenih od više nizova meñusobno povezanih u agregate nekovalentnim vezama – kvaternerna struktura.
29
Prostorno definisanje pravilno izgrañenih fragmenata –sekundarna struktura
� primarna struktura - regulisana kovalentnim vezama
(dužina i uglovi)
� sekundarna struktura – regulisana diedralnim uglovima ϕi ψ
� vrednosti ovih uglova su pozitivne za rotaciju u smeru kretanja kazaljke na satu i negativne ukoliko je rotacija suprotna.
� Spirala - okarakterisana
� korakom zavojnice, p, i
� brojem aminokiselinskih ostataka po jednom koraku zavojnice, n(→visina pojedinog a.k. ostatka, d)
Prostorno definisanje pravilno izgrañenih fragmenata –sekundarna struktura
�kod α-keratina,
�miozina u zbijenom stanju,
�hemoglobina.
dve intramolekulske
vod. veze
30
31
Strukturni parametri najvažnijih prostornih oblika spirala belančevina
vrednosti u zagradi su iz drugih izvora
0,6950,9360,5600,6000,541p,nm
0,3470,3120,2800,2000,150d, nm
2,003,002,003,003,61n
315°326°250°154° (176°)123° (136°)ψ
40°103°105°131° (106°)132° (113°)ϕ
antiparalelni β-naborani
niz
spirala poliproli-
na2 γ-traka310-spira1a
α-spirala
32
� α-spirala, za koju je tipičan predstavnik vlakno vune, (i epidermin, miozin i fibrinogen pojavljuju se u ovom obliku, kao i većina keratina),
� β-naborani list, ranije poznat i kao β-keratinska struktura, predstavlja sledeći prostorni oblik belančevina, čiji je najtipičniji predstavnik fibroin svile (u ovom obliku susreće i keratin ptičjeg perja kao i neki skeletni delovi životinja koje ne pripadaju sisarima) i
� kolagen kože i vezivnih tkiva koji pripada trećoj grupi fibrilarnih belančevina za koje je karakteristična trojna spirala (poliprolin).
Kod fibrilarnih belančevina se najčešće susreću tri tipa struktura:
Način uspostavljanja vodoničnih veza kod β-naboranog niza.
Karakteristični aminokiselinski ostaci R su orijentisani upravno na pravac
rasprostiranja niza.
Struktura ββββ-naboranog lista i fibroin
� Fibroin svile je izgrañen od antiparalelno orijentisanih polipeptidnih nizova, koji uspostavljanjem intermolekulskih vodoničnih veza obrazuju strukturu naboranog lista kako su to definisali Poling i Kori, 1951. g.
Gly:Ala:Ser=3:2:1
33
Šematski prikaz naizmeničnog prostornog uklapanja ostataka glikokola i alanina, antiparalelno orijentisanih slojeva fibroina svile
Obezbeñena maksimalna zbijenost reda→minimalna elastičnost i izduženje, velika jačina na kidanje
Beta strukturaAntiparalelna
Paralelna
34
αααα-Keratin
desna
10 protofibrila
u vlaknu vune, u kosi
stotine mikrofibrila
vlakno
• vuneno vlakno može da istegne na gotovo dvostruku dužinu zahvaljujući postojanju
spirala, i tom prilikom, umesto strukture α-spirale uspostavlja se izdužena struktura β-naboranog lista• elastičnost –disulfidni mostovi
makrofibrile (200 nm)
8 nm 2 nm
Trojna spirala kolagena
� kolagen je čvrst i slabo istegljiv
� fibrile kolagena - mogu da budu na veoma raznovrsne načine povezane u celine� u koži govečeta
� u rožnjači oka
� osnovna strukturna jedinica kolagena je tropokolagen � MM 285000 g/mol
� u obliku štapića dužine 300 nm i prečnika 1,5 nm.
35
Primarna struktura fragmenata kolagena (ostaci aminokiselina su označeni usvojenim sistemom sa jednim simbolom)
G-Y-D-E-K-S-A-G-V-S-V-P-G-P-M-G-P-S-G-P-R-G-L-P-G-P-
-P-G-A-P-G-P-Q-G-F-Q-G-P-P-G-E-P-G-E-P-G-A-S-G-P-M-G-
-P-R-G-P-P-G-P-P-G-K-N-G-D-D-G-E-A-G-K-P-G-R-P-G-Q-R-
-G-P-P-G--P-Q-A-R-G-L-P-G-T-A-G-L-P-G-M-K-G-H-R-G-F-
-S-G-L-D-G-A-K-G-N-T-G-P-A-G-P-K
10 20
30 40 50
60 70
80 90 100
110 120
Trojna spirala kolagena
� makromolekul se sastoji iz trojne spirale -tri pojedinačne spirale koje se meñusobno obavijaju i koje su povezane vodoničnim vezama�dve meñusobno identične - α1-nizovi
� treća slična - α2-niz
�MM nizova 95000 g/mol
� uspostavljanja spirale poliprolinskog tipa
36
Šematski prikaz isečka trojne spirale kolagenaPojedinačne poliprolinske spirale se uvijaju ulevo,
dok se trojna spirala uvija udesno
Trojna spirala kolagena
� svi ostaci glikokola orijentisani ka unutrašnjosti trojne spirale � omogućeno gušće pakovanje pojedinačnih makromolekulskih
nizova
� ostaci prolina okrenuti ka spoljašnjosti trojne spirale
� dva tipa levih spirala� spirala - poliprolin I (10 a.k. na tri zavoja, cis peptidna veza)
� spirala – poliprolin II (3 a.k. po zavoju – trans peptidna veza) →poliprolinska spirala izduženija od α-spirale
37
Etapno obrazovanje kolagenskih vlakana
Prostorno definisanje makromolekulskih nizova –tercijarna struktura belančevina
Prostorna struktura fibrilarnih belančevina
� kod vlakana vune, svile i kolagena kože → uspostavljanje αααα-spirale, ββββ-naboranog lista ili poliprolinske spirale
� ni kod jedne od ovih belančevina nije zapažena potpuna pravilnost prostorne grañe makromolekulskih nizova.
� na osnovu hemijskih istraživanja - makromolekulski nizovi nisu
izgrañeni jedinstvenim načinom smenjivanja pojedinih aminokiselina ili pojedinih fragmenata, već se susreću kraći, pravilno izgrañeni fragmenti čiji ukupni udeo obično ne prelazi 60% od ukupne mase belančevine, dok ostatak makromolekulskih nizova predstavljajunesreñena područja.
38
Prostorna struktura globulastih belančevina
Dva tipa ββββ-pregiba (I i II)
II
� Pravilno izgrañeni fragmenti se pojavljuju, sem kod fibrilarnih, i kod globulastih belančevina.
� Za razliku od fibrilarnih, kod globulastih belančevina u istom polipeptidnom nizu mogu da se sresti i različiti tipovi sekundarnih struktura (α-spirala, 310- i π-spirala, β-naborani list), pored nesreñenih područja.
Prostorni raspored lizozima koji sadrži 6 spiralnih fragmenata (40% mase belančevine) i 2 ββββ-naborana sloja sa
6 antiparalelnih ββββ-nizova i 6 ββββ-pregiba
39
Primarna struktura lizozima belančevine kokošijeg jajeta sa uspostavljenim disulfidnim vezama u položajima 6-127, 30-115, 64-80 i 76-94
Uprošćeni prikaz tercijarne strukture molekula lizozima koji obuhvata samo αααα-C atome
40
� Dejstvom rastvarača se narušavaju kontakti izmeñu pojedinačnih makromolekulskih nizova pri čemu se uspostavljaju novi kontakti makromolekula belančevina sa molekulima rastvarača.
� Zadržavaju svoj karakteristični prostorni aranžman, u neutralnim rastvaračima (dimetilformamid, hloroform, etilendihlorid itd.), ili pak u vodenim rastvorima odreñene pH vrednosti.
� Delovanjem na belančevine rastvarača sposobnih za interakcije, kao što su npr. dihlor- ili trifluorsirćetna kiselina, zatim promenom pH vrednosti vodenih rastvora ili promenom temperature, pokazalo se da su moguće i takve promene koje se pripisuju promenama prostornog rasporeda.
Ponašanje globulastih belančevina u rastvorima
Denaturisanje belančevina
narušavanjem sekundarnih veza → slučajni raspored -denaturisane belančevine
Denaturisanje može da se ostvari različitim uticajima, kao što su
� organski rastvarači,
� soli,
� karbamid,
� guanidin-hlorhidrat,
� LiCl,
� KSCN,
� CaCl2,
� NaClO4,
� promena vrednosti pH,
� detergenti,
� joni teških metala, kao i pod
� uticajem toplote;
� usled oksidacione ili redukcione razgradnje disulfidnih veza,
� oksidacijom -SH u -SO3H grupe ili pak supstitucijom funkcionalnih grupa.
41
Denaturacija∆∆∆∆
Nativni protein
Parcijalno denaturisan
Nativni protein
Hlañenje pod kontrolisanim uslovima
Neaktivan
Denaturisan
Nekontrolisanohlañenje
∆∆∆∆
Denaturisanje i regenerisanje ribonukleaze
Primarna struktura ribonukleaze (levo) i tercijarna (desno)sa disulfidnim vezama u položajima
26-84, 40-95, 58-110 i 65-72
42
Šematski prikaz denaturisanja i regenerisanja ribonukleaze
t=10 h
sati
Prostorna organizacija belančevina i biološka aktivnost
� Naziv ,,domen" za karakteristične, manje ili više složene funkcionalne fragmente.
� Funkcionalni domeni se odlikuju svojom biološkom aktivnošću, iako ne moraju da budu strukturno potpuno definisani, dok su strukturnidomeni strukturno potpuno definisani (αααα-spirala, ββββ-struktura), bez obzira na njihovu biološku aktivnost.
� Kako funkcionalni domeni mogu da premašuju veličinu strukturnih domena, nije isključena mogućnost da jedan funkcionalni domenobuhvata više od jednog strukturnog domena.
� Čest je slučaj da se ,,aktivni centar" funkcionalnog domena nalazi na granici dva strukturna domena.
Glutation reduktaza
43
Agregati. Kvaternerna struktura
� meñusobno povezivanje različitih polipeptidnih nizova� disulfidni mostovi (keratin i druge belančevine), � estarske ili veze slične estarskim (kolagen), � Vodonične veze, � Vandervalsove sile � jonske veze
� osnov meñusobnog povezivanja pojedinačnih polipeptidnih nizova u molekulske agregate: � dimere, � trimere, � tetramere, � heksamere – oligomere, i � multimere.
� makromolekuli belančevina se samo izuzetno pojavljuju kao izolovani nizovi
Agregati. Kvaternerna struktura
� Fibrilarne belančevine – makroskopski vidljivi oblici – vlakno vune, fibrion svile, kolagen kože
�definisane – dužinom, prečnikom, debljinom
vlakna, jačinom na kidanje, izduženjem...
� Globulaste belančevine – sferne ili manje ili više izdužene čestice
44
Kvaternerna struktura
Uporedni šematski prikaz oblika i veličina nekih globulastih belančevina
Molarne mase nekih belančevina odreñene merenjem brzine sedimentacije u ultracentrifugi
Belančevina Molarna masa, g/mol M/17500
Mioglobin Mlečni albumin Citohrom c Pepsin Kazein Hemoglobin Edestin Serum-albumin
16900 17400 15600 35500 33600 34300 49500 70000
~1 ~1 ~1 ~2 ~2 ~2 ~3 ~4
A. Molarne mase belančevina koje se pokoravaju Svedbergovom pravilu
B. Molarne mase belančevina koje se ne pokoravaju Svedbergovom pravilu
Belančevina Molarna masa, g/mol M/17500
Gliadin Hordein Zein Lakto-globulin Albumin jajeta Žuti ferment Serum-globulin
27500 27500 40000 41500 44000 82000
167000
~1,5 ~1,5 ~2,5 ~2,5 ~2,5 ~4,5 ~9,5
Svedbergovo pravilo - prosečne veličine osnovnih jedinki koje izgrañuju složene sisteme belančevina
su približno iste i odgovaraju umnošcima molarne mase od oko 17500 g/mol.
45
Hemoglobin
Disocijacija molekulskih kompleksa belančevina
� Belančevina koja se sastoji samo od dva polipeptidna niza može da se razloži (disocira) na pojedinačne polipeptidne nizove.
� Ukoliko je broj polipeptidnih nizova koji su ugrañeni u kompleksni sistem belančevine veći od dva, disocijacija ovakvih sistema može da se odigra i na različite načine: � da se kompleks odmah razloži do pojedinačnih polipeptidnih
nizova,
� da razlaganjem složenog sistema nastaju manji, ali još uvek složeni sistemi-subjedinice, koji se u narednom stupnju razlažu do pojedinačnih polipeptidnih nizova,
� da razlaganjem složenog sistema nastaju kako subjedinice tako i pojedinačni polipeptidni nizovi, pri čemu subjedinice i dalje mogu da se razlažu.
46
Disocijacija molekulskih kompleksa belančevina
kompleks belančevine = x polipeptidnih nizova
kompleks belančevine = y subjedinica = y · x polipeptidnih nizova
kompleks belančevine = y subjedinica + z polipeptidnih nizova
y subjedinica = y · x polipeptidnih nizova
� Samo razlaganje je povratna reakcija, što znači da otklanjanjem uzroka razlaganja dolazi do ponovne asocijacije polipeptidnih nizova u subjedinice odnosno kompleksnu belančevinu.
� Ovaj proces poznat je i pod imenom agregacija, a samo razlaganje bi prema tome bilo dezagregacija.
Veze koje održavaju kvaternernu strukturu
47
Kvaternerne strukture značajnih belančevina
Za proučavanje i definisanje kvaternerne strukture koriste se sledeće metode:
� Rentgenostrukturna analiza koja pruža mogućnost čak i pri manjoj moći razlaganja da se u prostornom razmeštaju uoče pojedine subjedinice, čak i polipeptidni nizovi.
� Elektronska mikroskopija omogućava da se prostorni rasporedi pojedinih subjedinica učine vidljivim.
� Analiza krajnjih grupa pruža mogućnost da se odrede krajnje grupesvakog polipeptidnog niza.
� Metoda parcijalne enzimske hidrolize ili selektivne razgradnjemetodom sa bromcijanom omogućuje da se utvrdi broj polipeptidnih nizova.
� Denaturisanje i utvrñivanje broja subjedinica ili peptidnih nizova nastalih posle denaturisanja Svedbergovom metodom odreñivanja brzine sedimentacije u ultracentrifugi, omogućava da se utvrdi broj subjedinica ili polipeptidnih nizova.
� Ukoliko su polipeptidni nizovi meñusobno različiti, postoji mogućnost da se posle denaturisanja izvrši razdvajanje metodom elektroforeze, protivstrujne raspodele ili hromatografski.
� Broj subjedinica može se utvrditi i primenom metode izotopa.� Razjašnjenju kvaternerne strukture enzima može se doprineti odreñivanjem
broja mesta vezivanja supstrata.
48
.
α niz – 141 a.k.
β niz – 146 a.k.osim α2β2 postoje i α2δ2 i α2γ2
visoka konc.soli
pH>9.0/pH<<4.7
Transportne belančevine
� Najbolje proučene: hemoglobin i mioglobin
49
Kontakti izmeñu subjedinica oksihemoglobina i dezoksihemoglobina
Indeksi 1 i 2 predstavljaju redne oznake nizova.
1--α2β2
2--α2β2
-1
51
9869
α2β2α2β2
Dezoksihemoglobin
--
--
--
α2β2α2β2
--
51
11080
α2β2α2β2
Oksihemoglobin
Broj
jonskih
veza
Broj
vodoničnih
veza
Broj hidro-
fobnih veza
Kontaktne
subjediniceVrsta hemoglobina
vezivanjem kiseonika dolazi do promene kvaternerne strukture oksihemglobina u
odnosu na dezoksihemoglobin → alosterija
50
Složene belančevine (konjugovane belančevineili proteidi)
Podela prema hemijskoj strukturi neproteinskogdela:
� Glikoproteidi
� Lipoproteidi
� Nukleoproteidi
� Fosfoproteidi
� Metaloproteidi
� Hemoproteidi
� Flavoproteidi
Glikoproteidi
� sadrže polisaharide
� ulaze u sastav vezivnog i koštanog tkiva kao i u
sastave ćelijskih membrana
� na primer, fibronektin i proteoglikani su značajne
komponente ekstracelularnih prostora koji okružuju ćelije mnogih tkiva životinja.
� sastavni deo i drugih složenih prirodnih
proizvoda kao što su biljne sluzi, lektini, ricin,
arabin i sl.
51
Lipoproteidi
� sadrže lipidne molekule
� imaju važnu biohemijsku ulogu u organizmu
� ulaze u sastav krvne plazme mitohondrija,
plastida, ribozoma i drugih ćelijskih struktura
Nukleoproteidi
� sadrže nukleinske kiseline
� imaju veliku ulogu u skladištenju i prenosu
genetskih informacija
� nalaze se uglavnom u jezgru ćelija
� virusi, pa čak i hromozomi su kompleksne
nukleo-proteinske strukture
� pojedini enzimi su nukleoproteidi
52
Fosfoproteidi
� proteinska organska jedinjenja pri čemu je
fosfatna grupa najčešće esterifikovana
hidroksilnim grupama serina, treonina ili tirozina.
� na primer, kazein, osnovna belančevina mleka, sadrži mnoge fosfatne strukture i služi kao izvor fosfora pri
rastu dece.
Metaloproteidi
� kompleksna jedinjenja belančevina i jona metala
(gvožñe, cink, bakar)
� često se nazivaju enzim-proteini
� ulaze u sastav nekih enzima kao što su
katalaza, peroksidaza i sl.
katalaza
53
Hemoproteidi
� sadrže porfirinski prsten i predstavljaju u suštini podklasu metaloproteida
� prostetska grupa hem se najčešće sreće kod hemoglobina, mioglobina i citohroma.
� hem se sastoji od protoporfirina i gvožñe(II)-jona.
N
N
N
N
COOCOO
Fe2+
__
mioglobin153 a.k.
Flavoproteidi
� sadrže flavin
� imaju značajnu ulogu u oksido-redukcionim
procesima u organizmu
� spadaju u grupu koenzima
� najvažniji flavinski koenzimi su
� flavin-mononukleotid i
� flavin-adenin-dinukleotid
� najznačajniji flavoproteidi su oni koji sadrže
riboflavin.