Aminoácidos e a Ligação Peptídica: Aminoácidos e a Ligação Peptídica: a base estrutural das proteínasa base estrutural das proteínas
Os assuntos abordados:
Aminoácidos: - Propriedades gerais- Classificação- Ionização e carácter anfotérico- Ligação peptídica
1
A B C D
E F
Gráfico de Ramachandran
Na década de 1950, o físico Ramachandran fez uma teoria sobre os ângulos possíveis de torção da ligação peptídica. Sua teoria previa que somente nas áreas sombreadas sombreadas no gráfico abaixo poderia ocorrer um enovelamento estável das proteínas.
Posteriormente, com a determinação experimental dos ângulos e (pontos no gráfico) em diversas proteínas, a sua teoria foi comprovada.
Nas regiões de A a F ocorrem algumas formas tridimensionais típicas de proteínas.
A B
Folha paralela
C
F
Colágenotripla hélice
Anel
D E
-hélice(esquerda)
-hélice(direita)
Folha antiparalela
Observe no gráfico que nas regiões indicadas pelos círculos vermelhos, em que
Ramachandram previu que não seria possível existir estruturas estáveis, até hoje
não se descobriu nenhuma proteína.
12
3 4
2
Ângulos de rotação da cadeia polipeptítica em torno de um carbono alfa
Algumas das restrições de rotação da ligação peptídica implicam em colisão da nuvem eletrônica do O ou N (ex: 2 e 4), ou ainda no posicionamento dos
átomos de tal modo que não possibilita a formação de pontes de H (ex: 1 e 3).
- (psi ) – ângulo de rotação entre o C e o C (fi) – ângulo de rotação entre o C e N
=180o, =0o =0o, =0o =0o, = -180o = -60o, =180o
(1) (2) (3) (4)
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Os assuntos abordados:
Aminoácidos protéicos: - propriedades gerais- classificação- isomeria óptica- ionização - comportamento ácido-base e tamponamento
Ligação peptídica versus ligação amida: - ressonância e coplanariedade- gráfico de Ramachandran
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Proteínas: estrutura tridimensional e Proteínas: estrutura tridimensional e forças envolvidasforças envolvidas
- Modelos de estrutura proteica
- Forças estabilizadoras da estrutura de proteínas
- Métodos de estudo da estrutura de proteínas
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Iniciaremos essa aula relembrando os conceitos de níveis organizacionais da estrutura de uma proteína, como visto na aula anterior:
A Hemoglobina é um heterotetrâmero formada por 2 tipos de cadeias polipeptídicas
Subunidades alfa
Subunidades betaHeme
(grupo prostético)
6
Estrutura quaternária:• Associação de mais de uma
cadeia polipeptídica • No modelo, um tetrâmero
composto de 4 cadeias polipeptídicas
x 4
Para entender a estrutura 3D das proteínas, vamos “dissecá-la” em níveis organizacionais para facilitar o estudo:
Estrutura terciária:• Enovelamento de uma cadeia
polipeptídica como um todo.• Ocorrem ligações entre os
átomos dos radicais R de todos os aminoácidos da
molécula
.
Estrutura secundária:• Enovelamento de partes da
cadeia polipeptídica• Formada somente pelos átomos da ligação peptídica,
através de pontes de H.• Ex: alfa-hélices e folhas beta.
Estrutura primária: é a sequência dos aminoácidos na cadeia polipeptídica;
mantida por ligações peptídicas
aminoácido
É o esqueleto covalente (fio do colar), formado pela seqüência dos átomos (-N-C-C-)n na proteína.
Para entender a estrutura 3D das proteínas, vamos “dissecá-la” em níveis organizacionais para facilitar o estudo:
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O primeiro passo para se estudar a estrutura de uma proteína é obtê-la de forma purificada.
Geralmente a proteína que se deseja estudar é um componente minoritário (0,01 a 1%) em uma complexa mistura de outras proteínas
que estão presentes em qualquer tipo de tecido ou célula.
Purificar uma proteína significa separar a proteína de interesse das outras presentes na fonte de origem, de modo a ter somente ela no meio.
Muitas vezes purificar uma proteína é a etapa limitante no estudo de suas características estruturais e propriedades biológicas.
Em uma próxima aula estudaremos os métodos disponíveis para purificação de uma proteína 8
Estrutura primária: é a sequência dos aminoácidos na cadeia polipeptídica.aminoácido
Para determinar a estrutura primária de uma proteína, é necessário primeiro conhecer a composição (número
e tipos) de seus aminoácidos.
A posição do pico no cromatograma identifica o aminoácido. A área do pico quantifica o aminoácido.
A proteína pura é tratada com HCl 6N fervente para quebrar
(hidrólise) as ligações peptídicas.
A mistura resultante é submetida a métodos cromatográficos (fase
reversa, troca iônica) para separar os diferentes aminoácidos. Tempo de retenção (min)
fluor
escê
ncia
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Existem vários métodos para se determinar a sequência de aminoácidos de uma proteína. Aqui veremos como funcionam os dois métodos
atualmente mais utilizados:
a) Método de Edman: reação do aminoácido N-terminal da proteína com
fenil-isotiocianato . A proteína modificada é submetida a
hidrólise ácida liberando o aminoácido N-terminal modificado, e este é
identificado por cromatografia. Segue-se novo ciclo de reação com o
próximo aminoácido na proteína, que se tornou o novo N-terminal.
b) Espectrometria de massa: determinação das massas de fragmentos
correspondendo a aminoácidos, retirados sequencialmente da proteína.
Veremos mais sobre esse método na aula sobre eletroforese e
proteômica.
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Método de Edman - sequenciamento de proteínas com
PITCPITC (fenil-isotiocianato)
ciclo 1
ciclo 2
hidrólise com ácido trifluoroacético
hidrólise ácida
vai para novo ciclo
análise cromatográfica (troca iônica ou fase reversa)
(1)
(2)
(3)
acoplamento
acoplamento
Cada ciclo de reação compreende 3 etapas:
1. Reação da proteína com PITC, que se acopla ao grupo amino NH2- livre do
aminoácido 1 (no exemplo, uma lisina, K);2. Hidrólise ácida da proteína conjugada
com PITC libera a feniltiohidantoína (PTH) do aminoácido 1 e o restante da proteína, tornando o aminoácido 2 o novo resíduo N-terminal (no exemplo uma serina, S);
3. Análise cromatrográfica do PTH-aminoácido e novo ciclo de reação com o
novo N-terminal da proteína.
Sequenciadores automatizados fazem todas as etapas, com capacidade
para realizar 30 ciclos por dia, a partir de 100-200 picomoles de proteína.
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Quando uma proteína possui mais de 20-30 resíduos de aminoácidos, não é possível sequenciá-la diretamente pelo método de Edman.
Para obter a sequência completa de uma proteína, é necessário sequenciar vários peptídeos da mesma proteína, obtidos por diferentes tipos de quebra da cadeia, até haver sobreposição
de suas sequências.
ProteínaTotal 150 a.a
sequência obtida a partir da proteína intacta
30 aa
Diferentes métodos são utilizados para obter-se diferentes peptídeos da proteína: A) enzimas proteolíticas, como tripsina (quebra em resíduos de Lys ou Arg) e quimotripsina (quebra em
resíduos de Phe); B) tratamento com brometo de cianogênio (quebra em Met); e outros.
proteína inteira
peptídeos método A
peptídeos método B
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Estudos da estrutura tridimensional de proteínas tiveram grande impulso na década de 1950 com Linus Pauling, e o uso de raios-X para analisar cristais de proteína.
Na queratina (proteína da lã de carneiro), Pauling viu um padrão repetitivo de
zonas claras (eletrondensas) e escuras na difração de raios X.
-hélice
Filmefotográfico
Raio XPara explicar esse padrão, foi proposto o
modelo da -hélice, com as seguintes caracterísiticas:
• esqueleto covalente C-C-N-C-C-N da proteína assume a forma de espiral ou mola, enrolada para a direita, com
um espaçamento de 3,6 resíduos de aminoácido por volta;
• o enovelamento é estabilizado por pontes de hidrogênio entre átomos das
ligações peptídicas de qualquer aminoácido, exceto prolina;
• as cadeias laterais dos aminoácidos voltam-se para fora da hélice. 13
Linus Pauling também propôs o modelo da folha pregueada ou estrutura para explicar o padrão de difração de raios X pela -queratina, proteína presente na
unha, chifres e cascos de animais.
Na folha pregueada as cadeias polipeptídicas dispõem-se lateralmente (em paralelo) e fazem
pontes de H entre os átomos da ligação peptídica.
As cadeias laterais R dos aminoácidos voltam-se para cima ou para baixo do plano da folha
Vista lateral
Folha anti-paralela
-N C
-C NFolha paralela
-C N
-C N
Pontes de H14
Folhas paralelas e antiparalelas podem se formar em uma proteína através de pequenas torções da cadeia polipeptídica.
antiparalela
Paralela, torção à direita
Paralela, torção à esquerda
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Dobra
A -hélice e a folha são os tipos de estrutura secundária mais comum entre as proteínas, por que não dependem da composição e sequência de aminoácidos, sendo estabilizadas apenas por pontes de H dos átomos da ligação peptídica.
Entre os 20 aminoácidos, apenas a prolina não pode fazer nenhuma das duas estruturas, por formar uma ligação peptídica mais rígida em torno do C
Existem outros tipos de estruturas secundárias conhecidas, como a dobra ou “alças” (domínios) de ligação a íons, como Ca2+ ou Zn2+.
tipo 1 tipo 2
hélice-dobra-hélice“Zinc-finger” 16
Beta-alfa-beta Só beta Só alfa
Barril betaBarril alfa-beta
Alguns modelos de organização estrutural, como os barris e , aparecem em vários tipos de proteínas, às vezes não relacionadas.
A estrutura terciária descreve a forma tridimensional final de uma cadeia polipeptídica, resultando da associação de partes organizadas da molécula,
chamadas de “domínios” ou “motivos” proteicos.
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Proteínas com estrutura quartenária são composta de mais de uma cadeia polipeptídica, que podem estar associadas covalentemente
(pontes dissulfeto) ou não.
Subunidade (uma cadeia polipeptídica)
Proteína (biológicamente ativa; dímero não covalente )
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Algumas definições importantes:
- Por serem conceitos didáticos, frequentemente é difícil distinguir em uma proteína os níveis secundário e terciário de organização estrutural.
- Para evitar tais ambiguidades utiliza-se o termo conformação proteica, que se refere aos aspectos da estrutura tridimensional de uma proteína acima de
sua sequência de aminoácidos.
- Os termos conformação e configuração não são sinônimos. Configuração refere-se à estrutura tridimensional de uma molécula
determinada por ligações covalentes, como por exemplo, as formas L- e D- de um aminoácido.
Conformação refere-se à estrutura tridimensional de uma molécula decorrente da somatória de ligações fracas, não covalentes.
Conformação nativa de uma proteína refere-se à estrutura tridimensional em que a molécula apresenta suas propriedades biológicas naturais.
Desnaturação refere-se a alterações da conformação nativa de uma proteína, podendo resultar em perda parcial ou total, reversível ou irreversível, de sua
atividade biológica. 19
FORÇAS NÃO COVALENTES
Pontes de H-Aminoácidos polares
Ligações iônicas- Aminoácidos carregados
Interações hidrofóbicas-Aminoácidos apolares
Forças de Van der Waals-Qualquer aminoácido
ProteínaProteína
NH
— CH2 — OH ... O — C — CH2 — CH2 —
2
ProteínaProteína
O—CH
Ponte de Hidrogênio
Interações hidrofóbicas e Forças de van der Waals
2
CH —CH3
CH3 CH3
CH3 — CH — CH2 —
— CH — CH3 H3C — CH —
CH3 CH3
++—CH2—CH2—NH3 OC —CH2—CH2—Ligação Iônica
Quais são os tipos de forças que mantém a estrutura tridimensional de
uma proteína ?
Quais são os tipos de forças que mantém a estrutura tridimensional de
uma proteína ?
20
ProteínaProteína
NH
— CH2 — OH ... O — C — CH2 — CH2 —
2
ProteínaProteína
O—CH
Ponte de Hidrogênio
Interações hidrofóbicas e Forças de van der Waals
2
CH —CH3
CH3 CH3
CH3 — CH — CH2 —
— CH — CH3 H3C — CH —
CH3 CH3
++—CH2—CH2—NH3 OC —CH2—CH2—Ligação Iônica
Quais são os tipos de forças que mantém a estrutura tridimensional de
uma proteína ?
Pontes de H ocorrem:
- entre os átomos da ligação peptídica (por exemplo, a
-hélice e a folha );
- entre cadeias laterais de aminoácidos polares, carregados ou não;
- para os grupos –NH3+ e
–COO- dos aminoácidos N- e C-terminal, respectivamente.
Ponte de Hidrogênio
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Ligações iônicas:
- ocorrem entre as cadeias laterais de aminoácidos com
cargas contrárias;
- dependem do estado de ionização dos aminoácidos e
do pH do meio;
- são menos frequentes do que as pontes de H.
ProteínaProteína
NH
— CH2 — OH ... O — C — CH2 — CH2 —
2
ProteínaProteína
O—CH
Ponte de Hidrogênio
Interações hidrofóbicas e Forças de van der Waals
2
CH —CH3
CH3 CH3
CH3 — CH — CH2 —
— CH — CH3 H3C — CH —
CH3 CH3
++—CH2—CH2—NH3 OC —CH2—CH2—Ligação Iônica
Quais são os tipos de forças que mantém a estrutura tridimensional de
uma proteína ?
Ligação Iônica
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ProteínaProteína
NH
— CH2 — OH ... O — C — CH2 — CH2 —
2
ProteínaProteína
O—CH
Ponte de Hidrogênio
Interações hidrofóbicas e Forças de van der Waals
2
CH —CH3
CH3 CH3
CH3 — CH — CH2 —
— CH — CH3 H3C — CH —
CH3 CH3
++—CH2—CH2—NH3 OC —CH2—CH2—Ligação Iônica
Quais são os tipos de forças que mantém a estrutura tridimensional de
uma proteína ?
-Interações hidrofóbicas:
- ocorrem entre as cadeias laterais de aminoácidos
apolares;
- radicais apolares são repelidos pela água, aproximando-se uns
dos outros;
- não é uma força de atração real, resultando da repulsão pela
água;
- como consequência, em meio aquoso o interior de proteínas
globulares é hidrofóbico.Interações hidrofóbicas
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ProteínaProteína
NH
— CH2 — OH ... O — C — CH2 — CH2 —
2
ProteínaProteína
O—CH
Ponte de Hidrogênio
Interações hidrofóbicas e Forças de van der Waals
2
CH —CH3
CH3 CH3
CH3 — CH — CH2 —
— CH — CH3 H3C — CH —
CH3 CH3
++—CH2—CH2—NH3 OC —CH2—CH2—Ligação Iônica
Quais são os tipos de forças que mantém a estrutura tridimensional de
uma proteína ?
Forças de Van der Waals
- é uma força eletrostática que ocorre entre dipolos temporários;
- dipolos temporários (duração de nanosegundos) são criados devido
à órbita errática dos elétrons;
- pode envolver qualquer tipo de aminoácido;
- geralmente coincidem com as regiões da proteína onde ocorrem as interações hidrofóbicas, pois a
aproximação dos radicais apolares facilita a interação entre os dipolos.
e Forças de van der Waals
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O hormônio insulina é composto por duas subunidades, A e B, unidas por duas pontes dissulfeto intercadeia. Além disso, a cadeia B possui uma ponte dissulfeto intracadeia
A
B
Quais são os tipos de forças que mantém a estrutura tridimensional de
uma proteína ?
Além dos laços não covelentes, uma proteína pode ter pontes dissulfeto formada a partir
de dois resíduos do aminoácido Cys (cisteína).
Pontes dissulfeto são covalentes e só podem ser
rompidas por agentes redutores, como
2-mercapto-etanol.
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* O valor indicado para cada ligação refere- se à quantidade de energia necessária para rompê-la.
Tipo deligação
Energia *(Kcal/mol )
Tipo deligação
Energia *(Kcal/mol )
LIGAÇÃO SIMPLES LIGAÇÃO DUPLA
O — H 110 C O 170H — O 104 C N 147P — O 100 C C 146
C — H 99 P O 120N — H 93 LIGAÇÃO TRIPLA
C — O 84
C — C 83S — H 81 PONTE DE HIDROGÊNIOC — N 70 NH ...OC — S 62 OH ... NN — O 53 NH ... N S — S 51 OH ... O
4 - 5
C C 195
A ligação peptídica é muito forte e só se rompe em condições químicas drásticas, como 6N HCl a 100ºC.
A tabela mostra que a força das ligações entre os átomos do esqueleto covalente de uma proteína C-C-N-C-C-N é da ordem de 70 a 80 kcal/mol. (Não esquecer que a ligação C-N tem
carácter parcial de dupla ligação C=N, por causa da ressonância da ligação peptídica.)
A conformação proteica depende basicamente de forças fracas, como a ponte de H e interações hidrofóbicas.
A ponte dissulfeto (-S-S-) é relativa- mente rara entre as proteínas. Por
ser um laço covalente, não se rompe quando uma proteína desnatura em
meio ácido ou por calor.
Proteínas são moléculas frágeis e podem ser desnaturadas, com perda de suas propriedades biológicas, por
pequenas variações do pH ou da temperatura do meio. A ponte de H é uma das principais forças envolvidas
na estabilidade da conformação nativa. 26
As interações que as proteínas estabelecem com o meio são importantes na determinação de sua conformação.
A bacteriorhodopsina é formada por 7 segmentos de -hélices apolares, que delimitam um canal interno de natureza polar.
27
O índice hidropático dos aminoácidos reflete a tendência que as suas cadeias laterais têm para interagir com o meio aquoso.
Quanto mais negativo esse índice, mais polar é o aminoácido.
O perfil hidropático de uma proteína é calculado como a soma dos índices hidropáticos a cada 9 resíduos de aminoácidos
na cadeia polipeptídica.
Permite prever regiões da proteína que interagem com a membrana plasmática ou com os meios interno/externo.
O perfil hidropático da bacteriorhodopsina prevê 7 regiões hidrofóbicas e 3 regiões hidrofílicas.
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A bacteriorhodopsina (bR) da arqueobactéria
Halobacterium salinarum, é o sistema
fotossintético mais simples conhecido,
permitindo a sobrevivência do organismo
em situações de baixo O2, ao converter luz
solar em energia química. Quando a
molécula de bR absorve um fóton, ela se
torna uma bomba de prótons, bombeando H+
do meio intracelular para o exterior da
célula. A energia do gradiente eletroquímico
formado é então utilizada para síntese de
ATP por uma ATP sintase. citoplasma
meio externo
canal de H+
Bacteriorhodopsina inserida em uma porção da membrana
Para ter esse tipo de estrutura, a proteína apresenta as cadeias laterais de seus
aminoácidos apolares voltadas para “fora”, em contacto com os lipídeos da membrana
da célula. Aminoácidos polares estão voltados para “dentro”, delimitando o canal
de prótons da molécula. 29
O pesquisador sueco Cristian Anfisen foi um pioneiro no estudo da estrutura 3D de proteínas, e
recebeu o Prêmio Nobel (195..) por suas descobertas.Anfisen estudou a Ribunuclease (14.000d), proteína
com 8 cisteínas formando 4 pontes dissulfeto.
Ele demonstrou que era possível fazer uma desnaturação reversível da proteína, adicionando
uréia e 2-mercaptoetanol para abrir as suas 4 pontes dissulfeto. Ao retirar lentamente (por diálise), esses reagentes, a proteína volta a ter atividade biológica,
mostrando que voltou à sua conformação nativa.
Esse fato é surpreendente pois as 8 cisteínas, combinadas 2 a 2, dariam 28 = 256 possibilidades,
de formar diferentes pontes dissulfeto, mas apenas o arranjo original de pontes se forma.
A conclusão de Anfisen foi a de que a sequência dos aminoácidos (não alterada na desnaturação) é o
que determina a estrutura 3D das proteínas.
Por que diferentes moléculas de uma proteína apresentam sempre a mesma estrutura 3D ? De onde vem a informação para a estrutura tridimensional de uma proteína ?
30
A conformação nativa de uma proteína representa o estado de menor energia do sistema.
A energia que estabiliza a estrutura 3D de uma proteína vem do aumento da entropia da água, representando “desorganização” da água à medida
que interagem com a proteína.
In vivo conformações intermediárias das proteínas são estabilizadas por chaperonas durante o processo de síntese proteica.
Como é possível termodinamicamente que as proteínas tenham estruturas tão altamente organizadas ?
De onde vem a energia que estabiliza a estrutura 3D das proteínas ?
entropia
ener
gia
Estrutura nativa
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• Níveis de organização estrutural das proteínas
• Modelos de estrutura proteica
• Métodos de estudo da estrutura primária de proteínas
• Forças estabilizadoras da estrutura de proteínas
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O QUE FOI VISTO:O QUE FOI VISTO:
A PARTIR DISTO É IMPORTANTE RELACIONAR A ESTRUTURA TRIDIMENSIONAL COM AS
PROPRIEDADES BIOLÓGICAS DAS PROTEÍNAS!
UM ABRAÇO!