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7/28/2019 Cocos Gram Positivos 2006

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIAFACULTAD DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA

PRACTICAS DE LABORATORIO

COCOS GRAM POSITIVOS

Maye Bernal Rivera

Introduccin

Los cocos gram positivos excluyendo las enterobacterias, son los microorganismosms frecuentemente aislados de muestras de pacientes y se han involucrado comoagentes importantes en procesos de enfermedades infecciosas desde el ao 1836.Se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza y forman parte de la floramicrobiana normal de la piel y las mucosas del hombre y de animales. Las

infecciones en el hombre se producen por contacto directo con individuos infectados oportadores sanos, o por penetracin a travs de piel y mucosas mediante objetoscorto punzantes por heridas, trauma o procedimientos quirrgicos o por la accin detoxinas producidas por cepas de algunas especies.

Staphylococcus

Los estafilococos son clulas esfricas gram positivas dispuestas en grupossemejantes a racimos de uvas en medios slidos o en pares, cadenas o ttradas, enmedios lquidos. Crecen bien en medios simples y de acuerdo a la especie producendiferentes pigmentos: blanco, amarillo y dorado y algunas de ellas producen betahemlisis. Son catalasa positivos, inmviles, no esporulados, con raras excepciones,no encapsulados y son aerobios o anaerobios facultativos.

Streptococcus

Los estreptococos son clulas esfricas u ovaladas gram positivas dispuestas enpares o cadenas cortas o largas. Son ms exigentes que los estafilococos, no crecenen medios simples, por el contrario requieren de factores de crecimiento como lasangre y sus derivados. Producen diferentes tipos de hemlisis, caracterstica quepermite clasificarlos en beta hemolticos, alfa hemolticos o no hemolticos. No formanpigmentos, son catalasa negativos, inmviles, no esporulados, con formacin decpsula variable. Son aerobios y anaerobios facultativos.

Enterococcus

Los enterococos clasificados anteriormente como una especie de estreptococos, sonclulas esfricas gram positivas dispuestas en pares o cadenas cortas. Al igual quelos estreptococos requieren de factores de crecimiento como la sangre y susderivados. Son capaces de desarrollarse en medios que contienen altasconcentraciones (6.5%) de NaCl y de bilis (40%). Pueden producir hemlisis de tipoalfa, beta o ser no hemolticos. No forman pigmentos, son catalasa negativos,


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inmviles, no esporulados, con formacin de cpsula variable. Son aerobios yanaerobios facultativos.

PRACTICA DE LABORATORIO

ObjetivoProporcionar al estudiante el conocimiento cientfico y las habilidades prcticas de losmtodos y tcnicas utilizados en Microbiologa Mdica para el aislamiento eidentificacin de las principales especies de cocos gram positivos que afectan alhombre

PARTE I. SIEMBRA

Objetivos especficos

- Establecer la diferencia entre gneros de cocos gram positivos

-Conocer las caractersticas macroscpicas, microscpicas y cambios producidosen el medio de diferentes especies de cocos gram positivos

- Realizar algunas de las pruebas bioqumicas de laboratorio utilizadas para laidentificacin de especies de cocos gram positivos

- Identificar especies de Staphylococcus, Streptococcusy Enterococcus- Aislar e identificar la cepa recibida

Materiales

- Asa curva- Mechero de gas- Cepas

-Caldo BHI

- Agar Sangre- Campana con vela (CO2 ) e incubadora a 37C

Procedimiento

1. Marcar adecuadamente cada uno de los medios.2. Repicar la cepa asignada en caldo BHI y en agar sangre (por agotamiento)3. Incubar a 37C por 24 horas en aerobiosis con atmsfera de CO2

Actividad

1. Investigue 3 caractersticas que diferencien las bacterias gram positivas de lasgram negativas

2. Escriba que pruebas se debe realizar para diferenciar Staphylococcus deStreptococcus

3. Cules son las especies de Staphylococcus, Streptococcus y Enterococcusms importantes en patologa humana?


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PARTE II.

LECTURA E INTERPRETACION PARA LA DIFERENCIACION E IDENTIFICACINDE GNERO Y ESPECIE

Sthaphylococcus. Diagnstico de Laboratorio

Las colonias de estafilococo son fciles de reconocer, relativamente son grandestienen de 2 a 3 mm o ms, dependiendo de la edad del cultivo. Las colonias soncirculares, convexas, de superficie lisa, bordes enteros, cremosas, blancas oamarillas o doradas. Para iniciar la identificacin adems de las caractersticas decrecimiento tanto en medio lquido como slido y la coloracin de Gram, se utiliza laprueba de la catalasa que permite diferenciarlos del gnero estreptococo, el cualcarece de esta enzima. Para identificar especies se utilizan diferentes pruebas dentrode las cuales estn las siguientes.

Pruebas Bioqumicas

CATALASAPrincipioLa catalasa es una enzima que descompone el perxido de hidrgeno (H2O2) enagua y oxgeno segn la siguiente reaccin:

2H2O2 2H2O + O2 (burbujas de gas)La prueba catalasa se usa con mucha frecuencia para diferenciar miembros de lafamilia Micrococcaceaede miembros de la familia Streptococcaceae.

Materiales- Cepa a estudiar- Perxido de hidrgeno al 3%

Procedimiento1. Con un palillo de madera, transferir parte del centro de una colonia a la

superficie de un portaobjetos.2. Agregar una gota de perxido de hidrgeno al 3% y observar la formacin de

efervescencia o burbujas.

Resultados- Positiva: Una prueba positiva esta dada por la aparicin rpida y sostenida de

burbujas o efervescencia.- Negativa: Unas pocas burbujas pequeas despus de 20 a 30 segundos se

considera un resultado negativo..

- Falsas Positivas: Los eritrocitos poseen catalasa, por lo cual debe tenersecuidado de no tomar eritrocitos del agar sangre junto con el material de lacolonia.

COAGULASA

Principio


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La coagulasa es una protena de composicin qumica desconocida, que tieneactividad similar a la protombina, capaz de convertir el fibringeno en fibrina, lo queda como resultado la formacin de un cogulo visible en los sistemas apropiados. Seutiliza para identificar Staphylococcus aureusde otras especies. La coagulasa sepresenta en dos formas, ligada y libre y para determinarlas se utiliza dosprocedimientos: en lmina y en tubo; si la prueba en lmina da positiva, no hay

necesidad de hacer la prueba en tubo.

Prueba en lmina ( Coagulasa ligada )

Materiales- Cepa en estudio- Lmina- Plasma de conejo

Procedimiento- Colocar 1 gota de plasma sobre la lmina- Agregar la colonia en estudio- Mezclar

Resultados- Positivo: La presencia de aglutinacin o formacin de grumos- Negativo: No se observa aglutinacin, permanece emulsionada la colonia

Prueba en tubo ( Coagulasa libre )

Materiales- Cepa en estudio- Tubo de ensayo con 0.5 ml de plasma de conejo

Procedimiento- Agregar la colonia en estudio al tubo de ensayo- Incubar a 35C por 4 horas; si no se ha formado el cogulo, reincubar por 24

horas a temperatura ambiente

Resultados- Positivo: La formacin de un cogulo- Negativo: No se observa formacin de coagulo, permanece lquido el plasma

MANITOL

PrincipioAl utilizar el microorganismo al manitol como sustrato e incorporarlo al sistemaEmbden-Meyerhoff-Parnas, que tiene como productos finales cidos que provocan ladisminucin del pH en el medio de cultivo, que se detecta mediante el viraje delindicador rojo de fenol a amarillo.

Materiales- Cepa en estudio


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- Caldo de Manitol

Procedimiento- Sembrar la colonia en el caldo- Incubar a 35C por 24 horas

Resultados- Positivo: cuando el indicador del medio vira a amarillo- Negativo: cuando conserva su color rojo

DNAsa

Principio

Se basa en la presencia de la enzima termoestable DNAsa que es capaz de clivar losenlaces fosfodiester internos de la molcula de DNA. Para evidenciar la presencia dela enzima, se inunda el medio con cido clorhdrico normal, el cual precipita lamolcula del cido pero no sus polmeros.

Materiales- Cepa en estudio- Agar DNA- Acido clorhdrico 1 Normal

Procedimiento- Sembrar por estra gruesa la colonia en estudio, en el agar DNA- Incubar a 35C por 24 horas

- A las 24 horas: Inundar la superficie del medio con HCL 1N, esperar 2 minutos

Resultados- Positivo: La formacin de un halo transparente alrededor de la siembra indica

presencia de DNAsa.- Negativo: La formacin de un precipitado alrededor de la siembra indica

ausencia de la enzima

NOVOBIOCINA

Principio

Los estafilococos coagulasa negativos pueden dividirse en especies sensibles yresistentes a la novobiocina. Staphylococcus saprophyticus es de las especiesresistentes, la ms frecuente en humanos, causante de infecciones de el tractourinario. Por lo tanto esta prueba proporciona una identificacin presuntiva confiablede esta especie.

Materiales- Cepa en estudio- Disco de novobiocina de 5ug


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- Agar sangre de carnero

Procedimiento- Preparar una suspensin (equivalente al estndar 0.5 de McFarland) del

microorganismo en agua destilada.- Sembrar con escobilln en forma masiva sobre la placa de Mueller Hinton- Colocar con la pinza un disco de novobiocina en el centro

- Incubar a 35C durante por 24 horas

Resultados- Sensible: Halo de inhibicin mayor a 16 mm- Resistente: Halo de inhibicin menor a los 12 mm

Tabla de identificacin gnero Staphylococcus

Prueba S. aureus S. epidermidis S. saprophyticus

Coagulasa + - -

DNAsa + - -

Manitol + - -

Novobiocina S R

Streptococcusy Enterococcus. Diagnstico de Laboratorio

Las colonias de estreptococos y enterococos son variables, dependiendo de laespecie; Para iniciar la identificacin adems de las caractersticas de crecimiento

tanto en medio lquido como slido y la coloracin de Gram, se utiliza la prueba de lacatalasa que permite diferenciarlos del gnero estafilococo, el cual produce estaenzima. Para identificar especies se utilizan diferentes pruebas dentro de las cualesestn las siguientes.

Pruebas Bioqumicas

BACITRACINA

Principio

Streptococcus pyogenes es sensible a bajas concentraciones (0.04U) deBacitracina.

Materiales- Cepa en estudio- Agar sangre- Discos de Bacitracina

Procedimiento:


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- Sembrar la colonia masivamente en cuadrcula sobre una placa de agar sangre- Colocar un disco de Bacitracina y presionar suavemente- Incubar a 35C por 24 horas

Resultados- Sensible: La aparicin de cualquier halo de inhibicin alrededor del disco- Resistente: Crecimiento alrededor del disco

CAMP

Principio

Se basa en que Streptococcus agalactiaeproduce un factor llamado CAMP (factorde monofosfato de adenina cclica) que aumenta la zona de hemlisis producida poralgunas cepas de Staphylococcus aureusproductoras de lisina.

Materiales- Cepa en estudio- Agar sangre- Cepa de Staphylococcus aureus lisina positivo

Procedimiento:- Sembrar sobre la palca de agar una estra de estafilococo lisina positivo- Perpendicular al estafilococo, hacer una estra con la colonia en estudio- Incubar a 35C por 24 horas

Resultados- Positivo: Presencia de una zona de hemlisis en forma de flecha- Negativo: Ausencia de la hemlisis en flecha

OPTOQUINA

PrincipioEl clorhidrato de etildihidrocuprena (optoquina) a muy bajas concentraciones, inhibeen forma selectiva el crecimiento de Streptococcus pneumoniae. La optoquinapuede inhibir a otros estreptococos del grupo viridans, pero solo a concentracionesms altas.

Materiales- Cepa en estudio

- Agar sangre- Discos de Optoquina 5 ug.

Procedimiento:- Sembrar la colonia masivamente en cuadrcula sobre una placa de agar sangre- Colocar un disco de Optoquina y presionar suavemente- Incubar a 35C por 24 horas

Resultados


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- Sensible: La aparicin de un halo de inhibicin mayor a 16 mm de dimetro- Resistente: Crecimiento alrededor del disco o halos menores a 16 mm

KF

Principio

Determinar la capacidad de un microorganismo de crecer en un medio inhibidor yfermentar un carbohidrato produciendo un cambio de color.

Materiales- Cepa en estudio- Agar KF

Procedimiento:- Sembrar por doble picadura y estra en la superficie- Incubar a 35C por 24 horas

Resultados- Positivo: El medio vira a amarillo- Negativo: el medio permanece del color original


PARTE II. LECTURA E INTERPRETACION DE LOS CULTIVOS


- Estudiar las caractersticas macroscpicas de las colonias de cocos gram

positivos- Diferenciar los tipos de hemlisis- Observar las caractersticas microscpicas de los diferentes gneros- Conocer diferentes pruebas bioqumicas utilizadas para la identificacin de

cocos gram positivos

Materiales

- Cultivos bacterianos- Lminas, asas, mecheros, marcador de vidrio, papel absorbente- Colorantes para Gram- Microscopio y aceite de inmersin-

Reactivos y medios para las diferentes pruebas bioqumicas

Procedimiento

1. Describir las caractersticas macroscpicas de la colonia2. Clasificar el tipo de hemlisis3. Observar las caractersticas microscpicas mediante la coloracin de Gram


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4. Realizar las pruebas bioqumicas especficas, de acuerdo con los hallazgosanteriores y la instruccin de su profesor

Actividad

1. Dibuje las diferentes morfologas, tipo de agrupacin y afinidad con respecto alGram, de los cocos gram positivos

2. Defina los diferentes tipos de hemlisis3. Realice un flujograma para la identificacin de la bacteria que le fue asignada


PARTE III. LECTURA E INTERPRETACION DE LAS PRUEBAS


- Leer e interpretar las diferentes pruebas bioqumicas

-Conocer las tablas de identificacin bacteriana

- Identificar gnero y especie

Materiales

- Cultivos bacterianos- Pruebas bioqumicas- Reactivos especficos cuando fuere necesario- Tabla de identificacin

Procedimiento

1. Leer las pruebas bioqumicas2. Con base en los resultados obtenidos buscar en la tabla de identificacin3. Informar gnero y especie

Actividad

1. Escriba 5 enfermedades infecciosas que produzca cada una de las especiesde cocos gram positivos importantes en patologa humana

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