Contributo à diferenciação de leveduras de interesse
enológico por perfis isoenzimáticos
Nuno Pedro Herculano Pimentel
Objectivos do trabalhoObjectivos do trabalho
Focou-se a aplicabilidade da análise isoenzimática na identificação de
espécies de levedura relevantes ao processo de vinificação. Para tal:
• Visou-se dar continuidade a estudos anteriores, complementando a
base de dados de perfis isoenzimáticos de leveduras existente na EVN.
Estirpes em estudoEstirpes em estudo
Efectuou-se uma pesquisa bibliográfica de espécies de leveduras encontradas em ambientes vínicos, e assim:
• Fez-se a selecção de espécies de leveduras relevantes ao processo de vinificação, não presentes na base de perfis isoenzimáticos de leveduras da EVN.
Os diversos ambientes vínicos presentes nas diferentes etapas de fabrico do vinho podem ser (Sponholz, 1993):
Vinha
Adega:
processos pré-fermentativos
fermentação alcoólica
processos pós-fermentativos
Vinha•Dispersão entomófila
Em microbiotas associados com abelhas (género Apis) foram identificadas as espécies de leveduras:
– géneros Metschnikowia e Wickerhamiella;
– Wickerhamiella domercqiae.
•UvasEm microbiotas associados com uvas foram identificadas as espécies de leveduras:– Candida pulcherrima (Metschnikowia pulcherrima);
– Hanseniaspora uvarum / Kloeckera apiculata;
– Hanseniaspora osmophila;
– Kloeckera apis (Hanseniaspora guilliermondii);
– Saccharomyces veronae (Pichia mexicana);
– Lodderomyces elongisporus.
•Uvas infectadas por Botrytis cinereaEspecialmente em más condições de vindimas, vindimas com pluviosidade.
– Torulopsis bacillaris (Candida stellata);
– Candida vini (Pichia fluxuum);
– Pichia carsonii.
Adega • Fase pré-fermentativa
As espécies Metschnikowia pulcherrima e Kloeckera apiculata (anamorfo de Hanseniaspora uvarum) tratam-se das espécies mais encontradas no microbiota proveniente das uvas, nas fases pré-fermentativas e de início de fermentação (Rosini et al.,1982).
– Candida pulcherrima (Metschnikowia pulcherrima);– Hanseniaspora uvarum / Kloeckera apiculata;– Kluyveromyces thermotolerans;– Torulopsis bacillaris (Candida stellata);– Candida vini (Pichia fluxuum).
• Fase fermentativa
– Torulopsis bacillaris (Candida stellata) - no início / durante a primeira fase fermentativa);
– C. mycoderma (Pichia fluxuum);
– C. pulcherrima (Metschnikowia pulcherrima);
– Debaryomyces hansenii;
– Hanseniaspora uvarum / Kloeckera apiculata;
– Kloeckera apis (Hanseniaspora guilliermondii);
– Kluyveromyces thermotolerans;
– Lodderomyces elongisporus;
– Saccharomyces veronae (Pichia mexicana);
– S. exiguus;
– Saccharomycodes ludwigii.
Em vinificações especiais como é o caso do vinho Xerez, foi identificada a espécie:
– Saccharomyces exiguus.
Em linhas de engarrafamento ou em vinhos
engarrafados foram isoladas as espécies:
Adega• Fase pós-fermentativa
Em vinhos armazenados foram detectadas as espécies:
– géneros Dekkera / Brettanomyces;• Kloeckera apiculata (anamorfo de Hanseniaspora uvarum);• Torulopsis bacillaris / Torulopsis stellata (Candida stellata);• Torulopsis domercqii (Wickerhamiella domercqiae); • Candida mycoderma (Pichia fluxuum);• Saccharomycodes ludwigii.
― Torulopsis stellata (Candida stellata);― Candida pulcherrima (Metschnikowia pulcherrima);― Candida mycoderma / C. vini (Pichia fluxuum);― Lodderomyces elongisporus;― Saccharomyces baillii var. baillii (Zygosaccharomyces baillii ).
Métodos de identificação de levedurasMétodos de identificação de leveduras
Análise de perfis electroforéticos:
Proteína total
Isoenzimas
Sequenciação da região D1/D2 do rDNA 26S
Em leveduras a sequenciação do rDNA 26S (D1/D2) tem sido usada: No estudo dos relacionamentos filogenéticos entre as espécies de leveduras;
Na identificação de leveduras ao nível da espécie;
Em leveduras a análise isoenzimática tem sido aplicada:
Em estudos taxonómicos:
• na delimitação de espécies
• na descrição formal da espécie
• no esclarecimento de relações anamorfo/ teleomorfo
No estudo de populações
Em estudos epidemiológicos
Candida cantarellii (2); Candida stellata (2); Candida vanderwaltii (1); Pichia mexicana (1); Pichia fluxuum (2); Kluyveromyces thermotolerans (3); Metschnikowia pulcherrima (3); Pichia carsonii (3); Saccharomyces exiguus (3); Wickerhamiella domercqiae (2); Lodderomyces elongisporus (1); Debaryomyces hansenii var. fabryii (1); Dekkera naardenensis (1); Hanseniaspora guilliermondii (1); Hanseniaspora occidentalis (1); Hanseniaspora osmophila (1); Hanseniaspora uvarum (2); Saccharomycodes ludwigii (1); Schizosaccharomyces pombe (1).
Material e métodos Material e métodos
Espécies de leveduras analisadas
Total:Total: 32 estirpes; 19 espécies e 12 géneros
Material e métodos Material e métodos
Análise isoenzimática
Crescimento das células
Crescimento das células
Electroforese (PAGE-nativa)Electroforese (PAGE-nativa)Extracto proteícoExtracto proteícoRebentamento
das célulasRebentamento
das células
Solução de revelação de actividade enzimática
(EST, LDH, ADH, ACP e G6PD)
•Mobilidade electroforética relativa (Rm)
a b RRm m = a / b= a / b
a – distância da migração da banda de actividade enzimática
b – distância da migração do corante de referência
(37ºC, ao abrigo da luz)
NotaNota
Foram efectuados duplicados
de crescimento em 10 %
das estirpes analisadas,
que foram submetidos à
análise isoenzimática
juntamente com as estirpes
em estudo.
Material e métodos Material e métodos
•Análise numérica dos resultadosAnálise numérica dos resultados
Matriz dos resultados Matriz de semelhanças - coeficiente de DICEoeficiente de DICE
Dendrograma
Método de aglomeração com Método de aglomeração com médias não-ponderadas (UPGMA)médias não-ponderadas (UPGMA)
...
…E0.48E0.42E0.40E0.32E0.28E0.21
Rm
Estirpes
0
0
0
0
1
0
10000EVN 370
00000EVN 369
00000EVN 368
00000EVN 367
00000EVN 366
10000EVN 365
… ………………
…
…
…
…
…
…EVN 369
EVN 368
EVN 367
EVN 366
EVN 365
…
…EVN 369
…………EVN 368
…SkkSkjSkiEVN 367
…SjkSjjSjiEVN 366
…SikSijSiiEVN 365
...
…
Material e métodosMaterial e métodos
Sequenciação da região D1/D2 do rDNA 26S
Extracção do DNA
Extracção do DNA
Amplificação DNA por PCR primers ITS5 e LR6
Amplificação DNA por PCR primers ITS5 e LR6
Purificação do produto PCR
Purificação do produto PCR
Reacção de sequenciação,
primers: NL1 NL4
Reacção de sequenciação,
primers: NL1 NL4
Observação do DNA extraído
Observação do prod. PCR
Observação do prod. PCR purificado
Sequenciação no sequenciador
automático CEQ 8000
Sequenciação no sequenciador
automático CEQ 8000
5S NTS2 ETS 17 – 18 S ITS1 5.8S ITS2 NTS1 5S25 – 28 S
D1 / D2
NL1 NL4ITS5 LR6
Esquema dos genes do rRNA com indicação da localização dos primers utilizados e da região sequenciada.
Resultados obtidosResultados obtidos
Análise isoenzimática – perfis isoenzimáticos obtidos
ESTEST 384T 392 385 395T
365T 369T 381NT 381a 382 383 391T 375T 376 377 396T
368T 386T 394T 367NT 393T 378T 380 378a 379 379a 370NT 371 390T 389T 373 387T 374 372T 388T 366
384T 392 385 395T
365T 369T 381NT 381a 382 383 391T 375T 376 377 396T
368T 386T 394T 367NT 393T 378T 380 378a 379 379a 370NT 371 390T 389T 373 387T 374 372T 388T 366
G6PDG6PDLDHLDH
384T 392 385 395T
365T 369T 381NT 381a 382 383 391T 375T 376 377 396T
368T 386T 394T 367NT 393T 378T 380 378a 379 379a 370NT 371 390T 389T 373 387T 374 372T 388T 366
384T 392 385 395T
365T 369T 381NT 381a 382 383 391T 375T 376 377 396T
368T 386T 394T 367NT 393T 378T 380 378a 379 379a 370NT 371 390T 389T 373 387T 374 372T 388T 366
ADHADH 384T 392 385 395T
365T 369T 381NT 381a 382 383 391T 375T 376 377 396T
368T 386T 394T 367NT 393T 378T 380 378a 379 379a 370NT 371 390T 389T 373 387T 374 372T 388T 366
ACPACP
Candida stellata
Wickerhamiella domercqiae
Resultados obtidosResultados obtidos
Análise isoenzimática – análise numérica (EST+LDH+ADH+ACP+LDH)
r = 0.88
365T
375T
395T
396T
389T 390 371 370NT 387T 373 368T
385 386T 392 384T 391 383 382 381a 381NT 377 376
379 379a
378T 378a 380
394T 393 367 388T
372T 374
369T 366
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00Índice de semelhança
Candida cantarellii
Pichia mexicana
Kluyveromyces thermotolerans
Kluyveromyces thermotolerans
Candida stellataDebaryomyces hansenii var. fabryii
Hanseniaspora uvarum
Pichia carsonii
Metschnikowia pulcherrima
Saccharomyces exiguus
Hanseniaspora occidentalis
Pichia fluxuum
Wickerhamiella domercqiaeLodderomyces elongisporusHanseniaspora osmophila
Saccharomycodes ludwigiiCandida vanderwaltii
Hanseniaspora guilliermondiiDekkera naardenensisSchizosaccharomyces pombe
Resultados obtidosResultados obtidos
Análise isoenzimática – análise numérica (EST+LDH+ADH+ACP+LDH)
r = 0.88
Candida cantarelii 365T
375T
395T
396T
389T 390 371 370NT 387T 373 368T
385 386T 392 384T 391 383 382 381a 381NT 377 376
379 379a
378T 378a 380
394T 393 367 388T
372T 374
369T 366
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00Índice de semelhança
Kluyveromyces thermotolerans
Kluyveromyces thermotolerans
Candida stellata
Wickerhamiella domercqiae
Candida stellata
Resultados obtidosResultados obtidos
Sequenciação da região D1/D2 do rDNA 26S
EVN 372TEVN 373
0,2 % dissemelhança
EVN 384TEVN 385
0,4 % dissemelhança
EVN 365TEVN 366
1,1 % dissemelhança
EVN 387TEVN 367
9,0 % dissemelhança
EJ1EVN 367 10-372
0,0 % dissemelhança
EJ1 – Candida
10-372 – Candida cf. stellata
A variabilidade intraespecífica ≤ 1% de substituições nucleotídicas (Kurtzman e Robnett, 1998)
r = 0.88
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00
260 253 255 256 251 167 262 166 267 237 263 258 261 264 257 265 266 268 254 252NT
259 216 230 382 383 381NT 329T
222 284T 285 299 302 292 293 298 301 290 291 303 287 269 271T
270 272 273 274 276 277 275NT 278 235 355 242T 243 244 245 248 246 247 249 390 279NT 280 281 283 282 370NT 371 378T 380 379 212 223 217 219213 215 218 224 229 227 220 221 225 228 226T 312NT 310 311 340 341 342 384T
392T
391T
345 346NT
231T
368T
373 387T
354T
348 349 395T 339 394T
393 367NT
305 308 307 388T
168 350 351 396T
294 288 289 300 295 336 337 338T 326NT
327 372T
374 232 234 233 241NT
238 239 333T 334 335 330T 331 332 385 236 375T 376 377 343 344 386T 389T
296 369T
304 306 297 286 309 365T 366 325
Índice de semelhança
IV
V
VI
VIII
I
II
III
VII
Agrupamento I
Agrupamento II
Agrupamento III
Agrupamento IV
Agrupamento V
Agrupamento VI
Agrupamento VII
Agrupamento VIII
• Saccharomycodes ludwigii
• Hanseniaspora uvarum
• Schizosaccharomyces pombe
• Lodderomyces elongisporus
É necessário efectuar uma comparação de mobilidades electroforéticas (Rm) similares no mesmo gel.
ConclusõesConclusões
A análise dos perfis isoenzimáticos obtidos na generalidade conseguiu efectuar a distinção das 19 espécies de leveduras em estudo.
• Verificou-se que 4 das 32 estirpes analisadas, não agruparam com as estirpes tipo da sua espécie
Com os resultados da sequenciação do rDNA 26 S (D1/D2), verificou-se que:• Para 2 das 4 estirpes analisadas a sequenciação do rDNA confirmou uma incorrecta identificação na
espécie (EVN 366- Candida cantarellii e 367- C. stellata); • Para as restantes 2 estirpes confirmou a sua classificação (EVN 373 - Kluyveromyces thermotolerans
e 385 - Wickerhamiella domercqiae). Assim: É necessário o estudo de sistemas enzimáticos adicionais para permitir a identificação e
discriminação das espécies Kluyveromyces thermotolerans e Wickerhamiella domercqiae).
A inclusão dos resultados obtidos, na análise isoenzimática, na BD de perfis isoenzimáticos de leveduras existente na EVN, permitiu a diferenciação da generalidade das 50 espécies de leveduras associadas com a indústria de vinificação.
• Para algumas espécies é necessário focar outros sistemas enzimáticos adicionais para permitir a sua diferenciação mediante a análise electroforética.
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