DNA recombinante in a nutshell

Biologia Molecular Aplicada A tecnologia do DNA recombinante

Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

Teoria bem fundamentada• Por volta do início da década de

70, os fundamentos básicos da teoria já haviam sido propostos solidamente por Crick, Watson e C&A

• Assim, os cientistas passaram a se perguntar: será que o material genético e o processo de expressão podem ser manipulados?

• Ciência X (Bio)Tecnologia

A descoberta da DNA ligase• 1960: recombinação de

DNA ocorre em células– Reparo de danos ocorridos

por luz UV

• 1967, Martin Gellert– Extratos de E. coli produziam

fagos lambda circulares– Purificação da DNA ligase!

• Circularização de genomas

Paul Berg• Reuniu o fago SV40 ao bacteriófago lambda

– Queria cortar o SV40 e inserir pedaços do fago lambda nele

• Usou enzimas de restrição para cortar os fagos e incubou-os juntos, utilizando DNA ligase– Criou uma técnica, segundo ele mesmo, para ligar covalentemente

moléculas de DNA• Como o bacteriófago era de E. coli e esta bactéria habita nossos

corpos, ele teve medo de gerar um novo e letal vírus

• Posteriormente sugeriu moratória aos estudos em biologia molecular

• Nobel, 1980: “por seus estudos fundamentais em bioquímica de ácidos nucléicos, particularmente com relação ao DNA recombinante”

Paul Berg, 1926-

Fago λ

SV40

Endonucleases de restrição• 1968, Paul Arber sugere a existência de

enzimas existentes em bactérias que atuassem como proteção à infecção por fagos– Essas enzimas cortariam o DNA do fago em sítios

específicas– Endonuclease R

• 1968– Meselson & Yuan: EcoRI

• 1970– Smith & Kelly: nova endonuclease descoberta

em H. influenzae -- HindIII– Confirmação da hipótese de Arber, enzima corta

DNA exógeno mas não DNA celular– Descoberta do sítio específico de corte pela

enzima (AAGCTT)

Mapa de restrição• 1971 - Kathleen Danna and Daniel

Nathans

• Ensaio de digestão: Usam a endonuclease R (EcoRI) para cortar o DNA do fago SV40

• Fragmentos tinham tamanho constante e, logo, podiam ser facilmente separados em uma eletroforese!– Verificado o fato de que a enzima

corta em sítios específicosEc

oRI

EcoR

I

EcoR

I

EcoR

I

EcoR

I

EcoR

I

Hind

III

De novo, Berg• 1972, Berg’s lab

– Janet Mertz and Ronald Davis descobrem que a endonuclease R1 produzia quebras espaçadas entre as duas fitas, gerando extremidades coesivas idênticas e complementares

• Extremidades unidas e encubadas com DNA ligase poderiam gerar moléculas de DNA híbridas!

Extremidades cegas

Extremidades coesivas

Ensaio de digestão• Adicione DNA + tampão +

endonuclease de restrição

• Deixe digerindo num banho a determinada temperatura por determinado tempo

• 1 unidade de enzima de restrição digere 1 μg DNA em 1h00

• Caixa de truques do biólogo molecular contém: DNA ligase + enzimas de restrição + ...

Vetores de clonagem• ~1970: Trabalho com plasmídeos

• Peças de DNA circulares e não cromossomais encontradas em bactérias– E às vezes trocadas por elas

• 1970Descobriu um método segundoo qual uma E. coli adquiriria um plasmídeo conhecido como pSC101

• pSC101: contém um gene que confere resistência ao anti-biótico tetraciclina

Stahen Cohen, 1936-

Plasmídeo encontra Endonucleases

• Cohen junta-se a Boyer, especialista em enzimas de restrição

• Trabalharam com dois plasmídeos, – P1 confere resistência a tetraciclina– P2 confere resistência a kanamicina

• Experimento– Corte os dois plasmídeos com enzimas de restrição– Incube-os com DNA ligase– Teste a presença de bactérias duplamente

resistentes no meio• Este talvez tenha sido obtiveram o primeiro

organismo recombinante feito propositalmente por um ser humano

Herbert Boyer, 1936

P1

P1/2

P2

EcoR

I

EcoR

I

EcoR

IEc

oRI

K

K

T

T

Digestão + ligação

Cohen & Boyer• 1973– Inseriram genes de Xenopus laevis em E. coli e

verificaram que os genes estavam ativos nas bactérias depois de várias gerações

– Como as bactérias reproduziam-se rapidamente, poderiam ser utilizadas para produzir genes de grandes mamíferos em larga-escala

– Constroem um organismo capaz de combinar e replicar a informação genética de diferentes espécies!

O que, então, era possível fazer?• Era possível pegar o DNA de

qualquer espécie, picotá-lo e inseri-lo em uma bactéria que o amplificaria milhões de vezes

• A era da engenharia e da manipulação genética tem início...

• Mas o que se pode fazer? Até onde podemos chegar?– Verdade seja dita: ninguém sabe

ao certo...

Engenharia genética• Pode-se aumentar a expressão de

um gene bacteriano• Pode-se fazer bactérias produzir

genes de qualquer espécie– Expressão em levedura, células

de mamíferos• Produzir vírus transgênicos,

produzir vírus contendo toxinas

• Terapia gênica, knockout gênico• Que medo!?

Discussões éticas• 1974

– Paul Berg (juntou SV40 com fago lambda ese arrependeu) alerta para o perigo da biotecnologia e sugere uma moratória

• 1975– Conferência Asilomar– Moratória de 16 meses ao DNA recombinante– Bomba atômica da biologia?

• Watson acha que a natureza já fez muitos mais experimentos, por muito mais tempo e muitos mais jeitos do que podemos imaginar e nada de muito significativo aconteceu...

– Se fosse causar algum dano, a natureza per se já teria causado...

Joshua Lederberg

• 1958, Nobel com Beadle e Tatum (um gene, uma enzima) • 1960

Enquanto as discussões giravam sobre clonagem humana, sugeriu que a biotecnologia se desenvolveria através da microbiologiaLederberg defendia a terapia gênica e a engenharia de fenótipos

• 1974, AsilomarDefendia a tecnologia para diagnose de doenças, medicina terapêutica, produção de proteínas humanas em larga escala, processos de fermentação, produção maciça de antibióticos

• 1978, GenentechProdução da primeira insulina humana

O DNA recombinante hoje• Há centenas de vetores de clonagem comerciais, cada um

com vantagens específicas (encontrar promotores, descobrir interações entre genes, expressar proteína em larga escala, etc)

• DNAs das mais variadas espécies são clonados a todo instante em laboratórios de biologia molecular em todo o mundo

• Parece que nada de muito anormal aconteceu... Ainda...– Será que Watson está certo?

Plantas transgênicas• Genes de resistência a patógenos

– Resistência a inseticidas (Roundup)– Aumento da produtividade, desequilíbrio

ecológico

• Aumento nutricional– Adição de determinado aminoácido torna

alimentos mais nutritivos– Banana vacina

• Rotulação!• Prejuízo ecológico da monocultura

– A maior parte do prejuízo ecológico vem da simples monocultura

– A engenharia genética adiciona um nível de prejuízo ecológico ligeiramente maior

• É preciso diferenciar a tecnologia de transgênicos de seu abuso pela indústria do capital– Produção de insulina, hormônio de

crescimento, etc.

Clonagem de genes

Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

Pra quê clonar genes?• Amplificar milhares de vezes apenas este gene• Realizar um estudo individual da função de genes• Identificar mutações que modifiquem a função deles• Entender a ação enzimática da proteína produzida • Verificar com quais outros genes ele interage• Produzir a proteína em larga-escala• Montar genomas completos• Produzir organismos transgênicos de interesse• Etc etc etc etc

Clonagem de fragmentos de DNA• Enzimas

– enzimas de restrição– DNA polimerases– DNA ligase/Topoisomerases– Fosfatases

• Vetores– Plasmídios– Fagos– Cosmídeos– BACS/YACS– Vírus, bacteriófagos

• Hospedeiros– Escherichia coli– Levedura– Células animais– Células vegetais

Vetor plasmidial• Origem de replicação• Gene repórter• Sítio múltiplo de clonagem

Ligação do DNA exógeno ao plasmídeo

• Produção da molécula de DNA recombinante

• Plasmídeo + DNA cortado do organismo de interesse

• Ligação das extremidades coesivas

DNA Ligase• Realiza a ligação fosfodiéster• E agora, quem dirá de qual organismo é esta molécula?

Ensaio de digestão e subclonagem

Kb 1 2 PM

0,5

1,0

2,0

Clivagem do inserto clonado no vetor com enzima de restrição

- + EcoRI

Clonagem de fragmentos de DNAINSERTO: Fragmento de DNA

VETOR ou veículo de clonagem:-plasmídeo-bacteriófago-cosmídeo-cromossomo artificial de bactéria (BAC)-cromossomo artificial de levedura (YAC)

Ligação enzimática: Ligase de DNA

Amplificação do clone em bactérias

insertofragmento de DNA ligado ao vetor

bactéria transformada

introduzir nas células: transformação e seleção

construção

Objetivo:Obter muitas Cópias do gene pretendido

Transformação

• Inserção do plasmídeo em bactérias

• Replicação bacteriana

• Produção em massa da proteína recombinante!

Métodos de transformação bacteriana

A transformação natural descrita por Griffiths, em 1928, e por Avery e colaboradores, em 1944, é um evento raro.

Permeabilização com CaCl2-- Choque térmico

Eletroporação-- Choque elétrico

Gene gun-- Bombardeamento

• Plasmídeos pequenos são mais facilmente incorporados pela célula bacteriana competente.

• DNA linear é pobremente incorporado, talvez pelo fato de sofrer degradação pelas enxonucleases presentes no espaço periplasmático.

Seleção de clonesSerá que entrei?

• Bactérias são colocadas em meio nutritivocom antibiótico para que cresçam e amplifiquem nosso DNA do inserto

• Gene repórter– Reporta se a

transformação aconteceu

– Bactérias não-transformadasnão sobrevivem

– Gene de resistênciaa algum antibiótico

Seleção de recombinantesDurante a clonagem de fragmentos, a DNA ligase pode fechar o plasmídeo sem que nenhum inserto tenha sido clonado. Para evitar a análise de um vetor fechado é preciso um novo teste de gene repórter.

Keywords

• Conceitos-chave para a tecnologia do DNA recombinante:– Vetor

• Sítio múltiplo de clonagem• Genes repórteres

– Inserto– Endonucleases de restrição sítio-específicas– Digestão, ligação, clonagem

http://www.youtube.com/watch?v=acKWdNj936o&feature=related

Material Suplementar• Várias técnicas de biomol podem ser escolhidas aqui para a

realização do trabalho de fim de curso: http://www.genomenewsnetwork.org/resources/timeline/

• http://www.nature.com/milestones/miledna/timeline.html

• http://en.wikipedia.org/wiki/History_of_biotechnology• http://www.nature.com/scitable/topicpage/Recombinant-

DNA-Technology-and-Transgenic-Animals-34513

• http://www.nature.com/scitable/topicpage/Restriction-Enzymes-545