Download - Fluorescence a chemiluminiscence
Fluorescence a
chemiluminiscence
Skoumalová, Vytášek, Srbová
LuminiscenceEmise záření spontánně nastávajícího při přechodu
molekuly z excitovaného stavu do základníhoFotoluminiscence (fluorescence, fosforescence) - excitace je
způsobena absorpcí záření
Chemiluminiscence – excitace je vyvolána chemickou reakcí
S0 S1 T1
E
Fluorescence a fosforescence
Schéma zářivých a nezářivých přechodů fotoluminiscentní molekuly (Jablonského diagram)
Nezářivé přechody:
VR - vibrační relaxace
IC - vnitřní konverze
ISC - mezisystémová konverze
Zářivé přechody:
Fluorescence - přechod do nižšího elektronového stavu se stejnou multiplicitou S1S0
(FL) spinově povolený přechod
Fosforescence - přechod mezi stavy s různou multiplicitou TFosforescence - přechod mezi stavy s různou multiplicitou T11 SS0 0
(Ph)(Ph) spinově zakázaný přechodspinově zakázaný přechod
E
Stokesův posuvRozdíl vlnových délek absorpčního (excitačního) a emisního maxima
Emitované záření má větší vlnovou délku a tudíž nižší energii
E = h.c/
http://psych.lf1.cuni.cz/fluorescence/soubory/principy.htm
Stokesův posuv
Kvantitativní měření
I0 It
If
intensita fluorescence If
intensita absorpce Ia
f = =
Ia = I0 - It
vzorek
Kvantový výtěžek (f ) < 1
Měření fluorescence• Fluorimetry• Spektrofluorimetry• Fluorescenční skenery• Fluorescenční mikroskopy• Průtokové cytometry
vzorek
emisní monochromátor
detektor
zdrojexcitační
monochromátor
čtecí zařízení
Spektrofluorimetr
Spektrofluorimetr
Analýza neznámého vzorku pomocí fluorescenční spektroskopie
Erytrocyty (pacienti s Alzheimerovou chorobou)
Fluorescenční mikroskopie
Endotelová buňka (mitochondrie, cytoskelet, jádro)
Faktory ovlivňující citlivost fluorescence
1. Intenzita zdroje
2. Účinnost optického systému
3. Štěrbiny monochromátoru
4. Citlivost detektoru
Zdroje interference (chyb)1. Efekt vnitřního filtru
vrstvy vzorku vzdálenější od dopadu excitačního záření (dále v kyvetě) jsou excitovány nižší intenzitou světla, neboť část záření je absorbována povrchovými vrstvami vzorku
2. Zhášení excitovaná molekula se vrací do základního stavu nezářivým přechodem v důsledku srážky s molekulou zhášedla
zhášedla: O2, halogeny (Br, I)3. Ramanovy peaky
vibrační spektra pozorovaná ve viditelné a UV oblasti
Principy fluorescenčních stanovení
1. Přímé metody měříme přirozenou fluorescenci vzorku
2. Nepřímé metody nefluoreskující vzorek přeměníme na fluoreskující derivát
3. Zhášecí metody sledujeme pokles intenzity fluorescence určitého fluoroforu, která v nastává v důsledku zhášecí schopnosti vzorku
Přirozené fluorofory
• Polyaromatické uhlovodíky• Vitamin A, E• FAD, FMN (450/525 nm) x FADH, FMNH• NADH (340/460 nm) x NAD+
• Karoteny• Chinin• Steroidy• Aromatické aminokyseliny• Nukleotidy• Fluoreskující proteiny - GFP (green fluorescent protein )
Nositelé Nobelovy ceny 2008 za chemii
Osamu Shimomura jako první izoloval zelený fluoreskující protein z medúzy Aequorea victoria (GFP)
Martin Chalfie první prakticky využil fluorescenčního proteinu (značení neuronů pro hmatové receptory)
Roger Y. Tsien objasnil fluorescenční mechanizmus GFP a různými modifikacemi rozšířil paletu barev (emitovaného záření)
Fluorescenční značky/sondyLátky jejichž fluorescence se po jejich zavedení do
biologického systému nemění akridinová oranž (DNA)
fluorescein (proteiny)rhodamin (proteiny)GFP
Látky jejichž fluorescence se mění v závislosti na okolí
ANS (1-anilonaftalén-8- sulfonát) - polarita prostředíFura-2 – měření Ca
Příklady využití fluorescenční detekce
• Enzymové reakce• Analýza DNA• Genetické manipulace• Imunochemické metody• Transport membránou, fluidita membrán• Proliferace buněk• Apoptóza
Chemiluminiscence
Luminol před přidáním H2O2
Chemiluminiscence po přidaní H2O2
Chemiluminiscence• Excitace elektronů je vyvolána chemickou reakcí• Při návratu na základní úroveň dochází k vyzáření světla
Bioluminiscencesvětluška
Noctiluca scintillans
ATP + luciferin + O2 AMP + PPi + CO2 + H2O + oxyluciferin + světloluciferáza
Mg 2+
Chemiluminiscenční stanovení
• Stanovení NO
NO + O3 NO2* + O2
NO2* NO2 + světlo
• Stanovení H2O2 nebo peroxidasy
Luminol + H2O2 3-aminoftalát + světloperoxidáza
Ag Ab využití v imunochemii
Shrnutí:
1. Princip fluorescence - Jablonského diagram
2. Využití fluorescence v medicíně - příklady
3. Chemiluminescence - využití