Fluorescence a

chemiluminiscence

Skoumalová, Vytášek, Srbová

LuminiscenceEmise záření spontánně nastávajícího při přechodu

molekuly z excitovaného stavu do základníhoFotoluminiscence (fluorescence, fosforescence) - excitace je

způsobena absorpcí záření

Chemiluminiscence – excitace je vyvolána chemickou reakcí

S0 S1 T1

E

Fluorescence a fosforescence

Schéma zářivých a nezářivých přechodů fotoluminiscentní molekuly (Jablonského diagram)

Nezářivé přechody:

VR - vibrační relaxace

IC - vnitřní konverze

ISC - mezisystémová konverze

Zářivé přechody:

Fluorescence - přechod do nižšího elektronového stavu se stejnou multiplicitou S1S0

(FL) spinově povolený přechod

Fosforescence - přechod mezi stavy s různou multiplicitou TFosforescence - přechod mezi stavy s různou multiplicitou T11 SS0 0

(Ph)(Ph) spinově zakázaný přechodspinově zakázaný přechod

E

Stokesův posuvRozdíl vlnových délek absorpčního (excitačního) a emisního maxima

Emitované záření má větší vlnovou délku a tudíž nižší energii

E = h.c/

http://psych.lf1.cuni.cz/fluorescence/soubory/principy.htm

Stokesův posuv

Kvantitativní měření

I0 It

If

intensita fluorescence If

intensita absorpce Ia

f = =

Ia = I0 - It

vzorek

Kvantový výtěžek (f ) < 1

Měření fluorescence• Fluorimetry• Spektrofluorimetry• Fluorescenční skenery• Fluorescenční mikroskopy• Průtokové cytometry

vzorek

emisní monochromátor

detektor

zdrojexcitační

monochromátor

čtecí zařízení

Spektrofluorimetr

Spektrofluorimetr

Analýza neznámého vzorku pomocí fluorescenční spektroskopie

Erytrocyty (pacienti s Alzheimerovou chorobou)

Fluorescenční mikroskopie

Endotelová buňka (mitochondrie, cytoskelet, jádro)

Faktory ovlivňující citlivost fluorescence

1. Intenzita zdroje

2. Účinnost optického systému

3. Štěrbiny monochromátoru

4. Citlivost detektoru

Zdroje interference (chyb)1. Efekt vnitřního filtru

vrstvy vzorku vzdálenější od dopadu excitačního záření (dále v kyvetě) jsou excitovány nižší intenzitou světla, neboť část záření je absorbována povrchovými vrstvami vzorku

2. Zhášení excitovaná molekula se vrací do základního stavu nezářivým přechodem v důsledku srážky s molekulou zhášedla

zhášedla: O2, halogeny (Br, I)3. Ramanovy peaky

vibrační spektra pozorovaná ve viditelné a UV oblasti

Principy fluorescenčních stanovení

1. Přímé metody měříme přirozenou fluorescenci vzorku

2. Nepřímé metody nefluoreskující vzorek přeměníme na fluoreskující derivát

3. Zhášecí metody sledujeme pokles intenzity fluorescence určitého fluoroforu, která v nastává v důsledku zhášecí schopnosti vzorku

Přirozené fluorofory

• Polyaromatické uhlovodíky• Vitamin A, E• FAD, FMN (450/525 nm) x FADH, FMNH• NADH (340/460 nm) x NAD+

• Karoteny• Chinin• Steroidy• Aromatické aminokyseliny• Nukleotidy• Fluoreskující proteiny - GFP (green fluorescent protein )

Nositelé Nobelovy ceny 2008 za chemii

Osamu Shimomura jako první izoloval zelený fluoreskující protein z medúzy Aequorea victoria (GFP)

Martin Chalfie první prakticky využil fluorescenčního proteinu (značení neuronů pro hmatové receptory)

Roger Y. Tsien objasnil fluorescenční mechanizmus GFP a různými modifikacemi rozšířil paletu barev (emitovaného záření)

Fluorescenční značky/sondyLátky jejichž fluorescence se po jejich zavedení do

biologického systému nemění akridinová oranž (DNA)

fluorescein (proteiny)rhodamin (proteiny)GFP

Látky jejichž fluorescence se mění v závislosti na okolí

ANS (1-anilonaftalén-8- sulfonát) - polarita prostředíFura-2 – měření Ca

Příklady využití fluorescenční detekce

• Enzymové reakce• Analýza DNA• Genetické manipulace• Imunochemické metody• Transport membránou, fluidita membrán• Proliferace buněk• Apoptóza

Chemiluminiscence

Luminol před přidáním H2O2

Chemiluminiscence po přidaní H2O2

Chemiluminiscence• Excitace elektronů je vyvolána chemickou reakcí• Při návratu na základní úroveň dochází k vyzáření světla

Bioluminiscencesvětluška

Noctiluca scintillans

ATP + luciferin + O2 AMP + PPi + CO2 + H2O + oxyluciferin + světloluciferáza

Mg 2+

Chemiluminiscenční stanovení

• Stanovení NO

NO + O3 NO2* + O2

NO2* NO2 + světlo

• Stanovení H2O2 nebo peroxidasy

Luminol + H2O2 3-aminoftalát + světloperoxidáza

Ag Ab využití v imunochemii

Shrnutí:

1. Princip fluorescence - Jablonského diagram

2. Využití fluorescence v medicíně - příklady

3. Chemiluminescence - využití