2013.02.15.
1
Fluoreszcencia anizotrópia,
Fluoreszcencia Rezonancia Energiatranszfer
és
Fluoreszcencia kioltás
2013. február 12-14. PTE ÁOK Biofizikai Intézet
Biofizika szeminárium
Ujfalusi Zoltán
Lumineszcencia
A molekuláknak azt a fényemisszióját, amelyet a valamilyen módon (például fénnyel való besugárzással) gerjesztett molekula a hőmérsékleti sugárzáson kívül kibocsát, gyűjtőnéven lumineszcenciának nevezzük.
Síkban polarizált fény Síkban polarizált fény
Polarizáció
Malus törvény
2
max cos Párhuzamos állás:
Θ = 0°, I = Imax
Merőleges állás
Θ = 90°, I = 0
Polarizátor
y
x θ
I
Imax
z
(Étienne-Louis Malus)
1. Gerjesztés: dipólusvektor jön létre – abszorpciós momentum
Fluoreszcencia polarizáció
Vertikálisan
sikpolarizált
gerjesztő fény
Fotoszelekció:
random populációból az elektromos
vektorral párhuzamos abszorpciós
vektorú molekulák kiválasztása
Csak a megfelelő orientáltságú abszorpciós momentummal rendelkező fluorofórok gerjesztődnek a mintában!
2013.02.15.
2
2. Fluoreszcencia emisszió: polarizált fény – emissziós momentum
Polarizációfok: abszorpciós és emissziós momentum különbsége
Oka: gerjesztés időtartama (τ) alatti elmozdulás (ns)
Abszorpciós momentum Emissziós momentum
z
y
x
z
y
x
τ A E
Polarizált fény Részben polarizált
fény
Rotációs diffúzió
Az emissziós momentum vektor nem esik egybe a az abszorpciós momentum vektorral a fluorofórok rotációs diffúziós mozgásának következtében!
Fluoreszcencia polarizáció
vv vh
vv vh
I GIp
I GI
fény polarizált fény minta Nicol prizma vertikális detektor
horizontális detektor
Polarizációfok
Iv
Ivh
Ivv
Példa: ha Ivv = Ivh → p = 0
ha Ivh = 0 → p = 1
Intenzitásvektorok különbsége
normálva az eredő intenzitás vektorra
Fluoreszcencia polarizáció
Fluoreszcencia Anizotrópia
Izotróp rendszer: Irányultság szempontjából homogén rendszer.
Anizotróp rendszer: olyan rendszer melyben vannak kitüntetett irányok.
Fluoreszcencia anizotrópia: Polarizált fény segítségével
az izotróp fluorofór populációt anizotrópá alakítjuk át.
2
vv vh
vv vh
I GIr
I GI
Emissziós anizotrópia
v
Intenzitásvektorok különbsége
normálva az teljes intenzitásra
Különböző fluorofórok
anizotrópiája összeadható
z
y
x
E
A vertikális és horizontális síkban mért intenzitások segítségével lehet meghatározni az anizotrópiát!
Fluoreszcencia Anizotrópia
Perrin egyenlet
Stokes-Einstein összefüggés
Rotációs korrelációs idő
Határ anizotrópia
Rotációs korrelációs idő a molekulák rotációs diffúziós képességéről ad információt!
V: objektum térfogata
η: közeg viszkozitása
T: abszolút hőmérséklet
R: egyetemes gázállandó
r0: határérték anizotrópia („mozdulatlan
molekula”, ha r = r0 → φ végtelen)
τ: fluoreszcencia élettartam
φ: rotációs korrelációs idő
(„mozgékonyság”)
Jean Baptiste Perrin,
Nobel díj, 1926 Alkalmazás
Molekulák rotációs diffúziójának meghatározása
Molekulák közti interakciók detektálása
Konformácós változások észlelése
Membránok fluiditásának meghatározása
Előnyök:
alacsony detektálási küszöb (< nM)
real-time mérések
koncentráció független
2013.02.15.
3
Polarizáció,
Anizotrópia
Gerjesztődik,
abszorbeál, fényt
emittál
Monokromatikus,
polarizált fény
Fluoreszcencia
polarizáció
Emittált
fényintenzitás
Gerjesztődik,
abszorbeál, fényt
emittál
Monokromatikus
fény
Fluoreszcencia
spektroszkópia
Intenzitás-
csökkenés
Gerjesztődik,
abszorbeál
Monokromatikus
fény
Abszorpciós
fotometria
Elforgatás Optikailag aktiv Monokromatikus,
polarizált fény Polarimetria
Detektor Minta Fényforrás
Módszerek összehasonlítása Fotonok és molekulák ütközése
Fotonok és molekulák ütközése
Fény (foton) ütközése a molekulákkal
fényszóródás
abszorpció
Fényelnyelés:
-Egy foton energiája -> molekula energiája (E = h/).
-Az elnyelt energia átalakul:
- Hő
- Fluoreszcencia
- Foszforeszcencia
- Fluoreszcencia kioltás és fluoreszcencia rezonancia energia transzfer
Fluoreszcencia Rezonancia Energiatranszfer
(FRET) - Theodor Förster, 1948
• „A Förster típusú energiatranszfer a gerjesztett állapotban lévő fluoreszkáló molekula (donor), valamint egy megfelelő spektroszkópiás követelményeket kielégítő molekula (akceptor) között dipól-dipól kölcsönhatás révén, sugárzás nélküli energiaátadás formájában jön létre.”
• A gerjesztett donor relaxációja az akceptor molekula emissziója révén valósul meg!
kt~1/R6
E
R
A FRET feltételei
• Fluoreszcens donor és akceptor molekula.
• A donor és akceptor molekula közötti távolság 2-10 nm!
• Átfedés a donor emissziós spektruma és az akceptor abszorpciós spektruma között.
A FRET molekuláris mechanizmusa Spektrális átfedés
26f
4t κRk)nJ(konst.k
J= átfedési integrál
n= közeg törésmutatója
R= donor-akceptor távolság
κ= orientációs faktor
Hullámhossz
2013.02.15.
4
Fluoreszcencia Rezonancia Energia Transzfer
kt: az energia transzfer sebességi állandója, tD : a
donor molekula fluoreszcencia élettartama az
akceptor hiányában, R: a donor és az akceptor
molekula közötti távolság, R0: Förster távolság a
donor és az akceptor molekula között.
kt = (1/tD) * (R0/R)6
kt~1/R6
E
R
kt= konst. * J(λ) n-4kfR-6κ2
J(λ): átfedési integrál, n: törésmutató (1.33-1.6),
kf: a fluoreszcencia emissziójának sebességi
állandója, R: a donor és az akceptor molekula
közötti távolság, κ: orientációs faktor (2/3)
Kritikus Förster-távolság
Az a távolság melyen a FRET hatásfok a felére csökken (transzferhatásfok 0.5).
RR
RE
66
0
6
0
FRET hatásfok
R0 = 0.211 • [h-4Q0k2J()]1/6
k2 (k-négyzet) = orientációs faktor, a donor emissziós vektorának és az akceptor abszorpciós vektorának relatív orientációjáról tudósít
•várható érték 0 – 4 között •általában a k2 = 2/3 (gyors mozgások miatti átlagolódás következtében)
η = a közeg törésmutatója (1.33-1.6) Q0 = a donor kvantumhatásfoka akceptor hiányában J(l) = átfedési integrál
Kritikus Förster-távolság
Dt
tICicf
t kkkkk
kE t
Az energia transzfer hatásfoka
1: „steady-state” mérések
E = 1 – (FDA / FD)
2: időfüggő mérések (fluoreszcencia élettartam)
E = 1 – (τDA / τD)
RR
RE
66
0
6
0
тDA : élettartam az akceptor jelenlétében
τD : élettartam az akceptor hiányában
FDA : fluoreszcens intenzitás az akceptor jelenlétében
FD : fluoreszcens intenzitás az akceptor hiányában
Távolságmérés FRET segítségével
(Molekuláris mérőszalag)
RR
RE
66
0
6
0
FRET hatásfok
5 10 15 20 25 30 35
1.0
1.5
2.0
2.5
No
rmál
t f
'
[Hőmérséklet] (°C)
Hőmérséklet-függő FRET mérések
2013.02.15.
5
Összefoglalás
• FRET távolságok meghatározására alkalmas megfelelő donor akceptor párok esetén.
• Molekulák közötti kölcsönhatások tanulmányozása.
• Molekulákon belüli szerkezeti változások tanulmányozása.
Fluoreszcencia kioltás
• A fluorofórok által kibocsátott fény intenzitásának csökkenése olyan molekulák vagy ionok jelenlétében melyek elektronszerkezete megfelelő ahhoz, hogy a gerjesztett állapotban lévő fluorofórral „ütközve” annak gerjesztési energiáját átvegyék, majd azt valamilyen formában disszipálják (például hő).
• Versengés a fluoreszcencia kibocsátása és a nem sugárzásos átmenet között csökkent fluoreszcencia emisszió.
Kioltás típusai Statikus : A kioltó és a fluorofór még a gerjesztés előtt egy
komplexet (sötét komplex) alkot, mely komplex nem képes fényt emittálni. A gerjesztett állapotban lévő molekulák száma csökken.
- Diffúzió által nem befolyásolt!
- Fluoreszcencia élettartam nem érzékeny rá!
+ : Nincs emisszió
Sötét komplex (a gerjesztés előtt jön
létre) Gerjesztés
Fluorofór Kioltó h*υ
Kioltás típusai Dinamikus : A kioltó és a fluorofór molekulák diffúziós folyamatok
révén egymás közelébe kerülnek, egy ütközési komplexet hoznak létre, majd a gerjesztett fluorofór átadja az energiáját a kioltónak.
- Diffúzió által befolyásolt!
- Fluoreszcencia élettartamot csökkenti!
+ :
Kioltó Fluorofór
Gerjesztés
Ütközési komplex
+ Fluorofór Kioltó
(a gerjesztés után jön létre)
h*υ
Hogyan dönthető el, hogy milyen típusú kioltásról van szó?
Dinamikus kioltás Statikus kioltás
• Semleges kioltók: Akrilamid,
nitroxidok sztérikus viszonyok
monitorozása.
• Töltéssel rendelkező kioltók:
jodid, cézium, kobalt
elektrosztatikus viszonyok
monitorozása [a fehérje töltése
fontos (Lys, Arg, His, Asp, Glu)].
Kioltók típusai
2013.02.15.
6
A fluorofórok hozzáférhetőségét tükrözi a Stern-Volmer állandó (KSV). A bimolekuláris sebességi állandó (kq) szintén a kioltás eredményességét, azaz a fluorofórok hozzáférhetőségét tükrözi. kq = 1 x 1010 M-1s-1 diffúzió kontrollált kioltás kq < 1 x 1010 M-1s-1 sztérikus elfedettség kq > 1 x 1010 M-1s-1 kötés kialakulása
Eredmények értékelése Stern-Volmer egyenlet
(a kioltás mértékének kvantifikálása)
Otto Stern (1888-1969)
Fizikai Nobel díj (1943)
Max Volmer (1885-1965)
Stern-Volmer egyenlet
][10 QKF
Fsv
F0 : fluoreszcencia intenzitás
a kioltó hiányában
F : fluoreszcencia intenzitás
a kioltó jelenlétében
Ksv : Stern-Volmer állandó
[Q] : kioltó koncentrációja
Módosított Stern-Volmer egyenlet (Lehrer-egyenlet)
A kioltó számára nem egyformán hozzáférhető fluorofórok esetén!
KSV= 5 M-1
meredekség: 1/(αKSV)
metszéspont: 1/α
α : a kioltó által hozzáférhető fluorofór aránya
Triptofán fluoreszcenciájának kioltása akrilamiddal
350 400 450 500 550 600 650
0
50
100
150
Flu
ore
szce
nci
a in
ten
zitá
s
Hullámhossz (nm)