Introdução à Biologia Molecular
Prof. Leonardo Crema
HISTÓRICO
1865 - GREGOR MENDEL
Estudou cruzamento entre
diferentes tipos de
ervilhas demonstrando
que certas características
físicas dessas plantas
eram transmitidas de
geração para geração
através de “fatores”.
HISTÓRICO
1902 – SUTTON e BOVERI
Padrão de herança dos
“fatores” acompanhava a
segregação dos cromossomos
de células em divisão
1909 – JOHANNSEN
Nomeou as unidades
mendelianas da
hereditariedade “fatores” de
GENES
HISTÓRICO
1915 – THOMAS MORGAN
Concluiu que os genes estavam
organizados de maneira linear nos
cromossomos
Propôs, pela 1ª vez, uma correlação
entre um gene = genótipo e uma
característica física = fenótipo
HISTÓRICO
• 1941 – BEADLE e TATUM
• Demonstraram que os genes
agiam através da regulação de
diferentes eventos químicos
• HIPÓTESE:
UM GENE → UMA ENZIMA
HISTÓRICO
• 1952 –Hershey–Chase
Demonstraram que é o ADN a base
do material genético (e não as
proteínas)
Hershey, A. D., i Chase, M. (1952) Independent functions of viral protein
and nucleic acid in growth of bacteriophage. J Gen Physiol. 36:39-56
HISTÓRICO
1953 – JAMES WATSON e FRANCIS CRICK
Descrição da estrutura física do DNA
baseando-se nos estudos de difração de
raio X de Rosalind Franklin e Maurice
Wilkins e em estudos químicos da
molécula
Modelo da dupla fita proposto foi
fundamental para a compreensão do
mecanismo de transmissão e execução
da informação genética
•1953: Watson and Crick
Estrutura do DNA
HISTÓRICO
1955 – JOE HIN TJIO
Definiu como 46 o número exato
de cromossomos humanos
ARTHUR KORNBERG
Isolou a enzima DNA polimerase da bactéria
E. coli
HISTÓRICO
1957 – CRICK e GAMOV
Dogma Central da
Biologia Molecular
DNA → RNA
→ PROTEÍNA
• 1961 – BRENNER, JACOB e MESELSON
• mRNA é a molécula que leva informação do DNA no núcleo para a maquinaria de produção de proteínas no citoplasma
Dogma Central da
Biologia
Molecular
ORGANISMO
CÉLULA
NÚCLEO
CROMOSSOMOS(DNA+PROTEÍNAS)
- Informação das proteínas eRNAs que serão sintetizadaspelas células do organismo aolongo da sua vida.
-Capacidade de se auto-duplicar para originar outras células.
DNA
NOS SERES HUMANOS
1966 – NIRENBERG, KHORANA e OCHOA
Sequências sucessivas de trêsnucleotídeos do DNA (códon)determinam a sequência deaminoácidos de uma proteína
O CÓDIGO GENÉTICO É DESVENDADO!!!
DNA
1. Regulação transcricional
mRNA 2. Regulação no processamento doRNA primário
3. Regulação no transporte do mRNA para o citoplasma
RETÍCULO ENDOPLASMÁTICORUGOSO
4. Regulação dasíntese proteíca
Proteínasintetizada
5. Regulaçãopós-síntese
A CÉLULA
- DIFERENCIAÇÃO- CRESCIMENTO- FUNÇÃO CELULAR- RESPOSTA AO
AMBIENTE
NÚCLEO
DNACromossoma
Gene
Promotor IntronExon
Núcleo
DNA
ÁCIDO DESOXIRRIBONUCLEICO (DNA)
Contém toda a informação genética de um organismo
Esta informação está arranjada em unidades hoje conhecidas como genes
ESTRUTURA DOS ÁCIDOS NUCLEICOS
As moléculas de DNA e RNA são compostas por quatrodiferentes nucleotídeos:
• Adenina, Guanina e Citosina – comum para DNA eRNA
• Timina – encontrada somente no DNA
• Uracila – encontrada somente no RNA
Todos os nucleotídeos
apresentam uma estrutura em
comum:
ESTRUTURA DOS ÁCIDOS
NUCLEICOS
ESTRUTURA DOS ÁCIDOS
NUCLEICOS
2 tipos de bases nitrogenadas.
O grupo hidroxil ligado ao carbono3 da pentose de um nucleotídeoforma uma ligação fosfodiéster como fosfato do outro nucleotídeo
ESTRUTURA DOS ÁCIDOS
NUCLEICOS
DNA
• Duas fitas de polinucleotídeos associadas formando uma estruturade dupla hélice onde as pentoses e os radicais fosfato compõe a fitae as bases projetam-se para o interior da mesma
• As fitas mantêm-se unidas através da formação de pontes dehidrogênio entre as bases, o que contribui para a estabilidade dadupla hélice
. Adenina (A) pareia com Timina (T) através de 2 pontes dehidrogênio
. Guanina (G) pareia com Citosina (C) através de 3 pontes dehidrogênio
DNA
As fitas do DNA estão dispostas em
direções opostas
Antiparalelismo
Cada base de uma fita é pareada com a base complementar da outra fita
Complementariedade
Durante a replicação do DNA as duas fitas velhas
ou mães servem de molde para cada fita
nova ou filhacomplementar, que está
sendo sintetizada.
Fita nova
Fita velha
Complementariedade
Fatores que estabilizam a dupla hélice:
• interações hidrofóbicas• forças de van der Walls• pontes de hidrogênio
• interações iônicas
Entre as bases nitrogenadas
Entre os grupos fosfato do DNA e os cátions (Mg2+) presentes na solução fisiológica
A Dupla Hélice
Sulco menor
Sulco maior
A dupla hélice apresenta dois tipos de sulcos aos quais se ligam as
proteínas da cromatina
A Dupla Hélice
Proteínas:níveis de complexidade estrutural
O Empacotamento do DNA:a estrutura terciária do DNA
DNA em procariontes: DNA circular nas formas não-super-helicoidal (esquerda) e super-helicoidal (direita)
A forma predominante de torção da espiral do DNA é para a direita ou sentido horário
A Dupla Hélice
Propriedades Químicas e Físicas do DNA
REPLICAÇÃO DO DNA
Conservativa ou Semiconservativa?
Unidirecional ou Bidirecional?
REPLICAÇÃO
SEMICONSERVATIVA
Evidência baseada em um experimento clássico de Meselson-Stahl em 1958
• Células de E. coli foram inicialmente colocadas em um meio paracrescimento contendo sais de amônia preparados com 15N (nitrogêniopesado – “heavy”) até todo o DNA celular conter o isótopo.
• As células foram, então, transferidas para um meio contendo 14N(nitrogênio leve – “light”).
• As amostras foram analisadas com gradiente de densidade quesepara as duplas H-H, L-L e H-L em bandas distintas.
•The Meselson-Stahl experiment
A replicação é semi-conservativa
ORIGEM DA REPLICAÇÃO
Experimento com SV40 (Simian Virus)
• DNA viral de células infectadas com SV40 foi cortado com aenzima de restrição EcoRI, que reconhece um sítio único.
• A partir de um “ponto” vai se formando uma bolhachamada bolha de replicação comprovando a existência deum ponto de origem da replicação
Características da origem de replicação:
. estrutura repetitiva
. seqüências ricas em AT
ORIGEM DA REPLICAÇÃO
ORIGEM Sítio de restrição EcoRI
Cromossomo viral circular
EcoRI
Bolha de replicação
ORIGEM DA REPLICAÇÃO
Biologia – Campbell & Cols.
Procariontes vs Eucariontes
Síntese de DNA em Eucariontes: As “Bolhas de
Replicação”
• Nos eucariontes, a replicaçãorequer “múltiplas origens”,devido ao tamanho de seugenoma. A replicação ébidirecional e, em ambas asfitas, simultânea.
• Este processo gera “bolhas dereplicação”.
Região GênicaÉ a porção que codifica para um
produto final, que pode ser uma cadeia polipeptídica ou
um RNA
O DNA é formado por 2 regiões:
Gênicas Intergênicas
Região IntergênicaÉ a porção regulatória, que
sinaliza o início ou o final de um gene, que influencia a
transcrição gênica, ou que é o ponto de início para a
replicação do DNA
Intergênicas Gênicas
Regiões Codificadoras e Não-Codificadoras do DNA
PROCESSO DE REPLICAÇÃO
Os mecanismos celulares responsáveis pelareplicação do DNA foram descobertosprimeiramente em bactérias.
A replicação em eucariotos ocorre através deproteínas análogas e com processos semelhantes àreplicação do DNA de E. coli
PRINCIPAIS ENZIMAS ENVOLVIDAS (SISTEMA DE REPLICAÇÃO DO DNA)
1. DNA Polimerases
2. Endonucleases
3. Helicases
4. Topoisomerases
5. Primases
6. Telomerases
DNA POLIMERASE
• São incapazes de quebrar as pontes de hidrogênioque ligam as duas fitas do DNA
• Só alongam uma fita de DNA/RNA pré-existente
• Catalisam a adição de um nucleotídeo no radicalhidroxil da extremidade 3’ da cadeia que está seformando. Desta forma, as fitas só podem crescer nosentido 5’ 3’
Biologia – Campbell & Cols.
DNA Polimerases
• principais enzimas envolvidas no processo; responsáveis pela adição de nucleotídeos e reparo
• requerem um modelo e um primer (segmento de RNA sintetizado pela primase) complementares para início –alongamento
• 3 tipos principais : I, II e III; existem pelo menos 11
I : importante no sistema de reparo
III: principal e mais complexa (mais de 10 subunidades)
Adição de nucleotídeos
1
2
3
FORQUILHA DE
REPLICAÇÃO
• Fita contínua
“leading”
FORQUILHA DE
REPLICAÇÃO
• Fita descontínua I
“Lagging”
FORQUILHA DE
REPLICAÇÃO
• Fita descontínua II
• “Lagging”
OUTRAS ENZIMAS ENVOLVIDAS NO PROCESSO DE REPLICAÇÃO
HELICASES – constituem uma classe de enzimas que podem se moverao longo da fita dupla de DNA utilizando a energia da hidrólise de ATPpara separar as duas fitas da molécula.
SSB (“single-strand-binding”- proteínas de ligação à fita simples) –ligam-se a cada uma das fitas impedindo o reanelamento das mesmas.
PRIMASE – RNA polimerase que sintetiza pequenas moléculas de RNAutilizadas como iniciadores durante o processo de replicação do DNA.
TOPOISOMERASES – Responsáveis por aliviar a torção na parte da fitaque não está sendo replicada.
PROCESSO DE REPLICAÇÃO
O movimento da forquilha de replicação revela uma fitamolde no sentido 3’ 5’ e outra no sentido oposto 5’ 3’
Desta forma, as fitas novas são sintetizadas em sentidosopostos
FITA “LEADING” – crescimento segue adireção do movimento da forquilhade replicação
FITA “LAGGING” – crescimento nosentido oposto ao movimento daforquilha de replicação
PROCESSO DE REPLICAÇÃO
FITA “LEADING” – sintetizada continuadamente a partir de uminiciador na fita molde 3’ 5’
FITA “LAGGING” – sintetizada descontinuadamente a partir demúltiplos iniciadores
• Sítios descobertos no molde da fita “lagging” são copiados empequenos iniciadores de RNA pela primase.
• Cada iniciador é alongado pela DNA polimerase resultando naformação dos FRAGMENTOS DE OKAZAKI.
•DNA polimeraseI remove o primer do RNA do fragmento adjacentee preenche os “gaps” entre os fragmentos que, então, são unidospela DNA ligase.
PROCESSO DE REPLICAÇÃO
PROCESSO DE REPLICAÇÃO
A síntese de DNA é feita na direção 5´ 3´ e é semidescontínua
ENCURTAMENTO DAS EXTREMIDADES DE
MOLÉCULAS LINEARES DE DNA
ENCURTAMENTO DAS EXTREMIDADES DE
MOLÉCULAS LINEARES DE DNA
TELOMERASE
• Os cromossomos de eucariotos são lineares e apresentamseqüências repetitivas em suas extremidades denominadastelômeros
• A síntese da fita “leading” continua até o término da fitamolde de DNA, no entanto, no telômero a extremidade feitapela primase na fita “lagging” não é digerida.
• Como o iniciador é instável, ele se degrada com o tempodiminuindo, assim, o tamanho do cromossomo.
• Telomerase age evitando a perda do fim do cromossomo.
TELOMERASE
REGULAÇÃO
-única fase regulada da replicação, de forma que só ocorra uma vez por ciclo celular ;
-afetada pela metilação de DNA
-DAM metilase na (5´) GATC sobre a fita parental
Gene
RNA polimerase
hnRNA
mRNA
Citoplasma
Transcrição
Processamento
Núcleo
Tradução
proteína
O RNA ou ARN
• O açúcar é uma Ribose;
• É formado, geralmente, por uma fita simples que pode enrolar-se;
• Não existe a base pirimídica Timina e no seu lugar se encontra a base Uracila.
• Os pareamentos seguem a ordem A-U e G-C).
O Ácido Ribonucléico é um polinucleotídeo que difere doDNA em três aspectos básicos:
A-U
U-A
G-C
C-G
A-T
T-A
G-C
C-G
DN
A
RN
A
RNA - É o ácido ribonucléico; possui a função de síntese protéica. O RNA é encontrado no núcleo principalmente no nucléolo, e no citoplasma (ribossomos). Composição química - é formada por ácido fosfórico, pentose (ribose) e pelas bases nitrogenadas ( A, G, C e uracila (U )).
A molécula de DNA é responsável pela formação do RNA. O RNA apresenta-se constituído por um único filamento de nucleotídeo, cuja seqüência de bases é determinada a partir de um molde de DNA.
1-RNA mensageiro (RNAm) - É formando no núcleo tendo como molde uma das fitas de uma molécula de DNA. A produção de um RNAm, cujas bases são complementares as bases de uma das hélices de uma molécula de DNA, recebe o nome de transcrição. Este fenômeno pode ser definido de forma mais simples como sendo a passagem das bases de uma linguagem do DNA para a linguagem de RNAm. EX:
T - A - C - T - G - A - DNA 3 bases correspondem a um aa, e um
! ! ! ! ! ! conjunto de bases uma proteína.
A - U - G - A - C - U RNAm
Códon início códon proteína
aa A aa B
Tipos de RNA
Síntese Protéica
• A enzima RNA-polimerase abre a dupla hélice do DNA e inicia a produção de uma molécula de RNAm, no sentido 5’ 3’.
• Os nucleotídeos são ligados respeitando a ordem A-U, G-C.
• Ao final da transcrição a RNA-polimerase se desliga do DNA, a molécula de RNAm está formada e segue para o citoplasma onde será traduzida.
A Transcrição
Observe a complementação de uma fita de DNA para RNA
A T A C A T G G G C T A G A A
UU U U U UGG C C CC AAA
Sempre com a adenina se ligando a uracila e a guanina se ligando a citosina.
DNA
RNA
RNAm
2-RNA transportador (RNAt) - é produzidonos cromossomos a partir de DNAespeciais. É uma molécula cadeia curta, (éo menor RNA) que transporta os aa queestão dispersos no citoplasma até osribossomos. O RNAt tem formato de“folhas de trevo” e contém outros tipos debases, além das comumente encontradasnos outros RNAs. Cada RNAt é capaz dereconhecer um determinado aadeterminado códon, no RNAm. Todo RNAttem um filamento livre de sua moléculacomposta pela seguinte seqüência debases: ACC. É nesse local que ocorre aassociação com o aa. Em cada região damolécula existe uma seqüência de 3 basesdenominadas anticódon, que reconhece aposição do aa no RNAm.
Tipos RNAs (2/2)
RNA TRANSPORTADOR
3-RNA ribossômico (RNAr) é o RNA que ocorre emmaior quantidade nas células. Esse RNA é encontradono nucléolo, onde é produzido, e no citoplasma,associado às proteínas, formando os ribossomos.
Tipos de RNA
• RNAm O RNA mensageiro é formado no núcleo e contém a
“mensagem” - o código transcrito a partir do DNA - para a síntese das proteínas. Cada conjunto de três nucleotídeos no RNAm é chamado de CÓDON.
• RNAt O RNA transportador está presente no citoplasma e é
responsável pelo transporte dos aminoácidos até os ribossomos para a síntese protéica. No RNAt existe uma seqüência de nucleotídeos correspondente ao códon chamada de ANTI-CÓDON.
• RNAr O RNA ribossômico ou ribossomal faz parte da
estrutura dos ribossomos e participa do processo de tradução dos códons para construção das proteínas.
SÍNTESE DE PROTEÍNAS:
A síntese começa quando ocorre a transcrição das bases de DNA para RNA. Essa transcrição é o código genético. O RNAm formado no núcleo passa para o citoplasma, deslocando-se para os ribossomos. Os RNAtque estão no citoplasma, através de suas moléculas, unem-se ao aa livre levando até o ribossomo. Lá o anticódon do RNAt reconhece no códon do RNAm o aa, que será codificado. Assim, ocorrendo sucessivamente, até dar origem a uma proteína.
Núcleo
DNA RNAm RNAm Transcrição Proteínas TraduçãoNúcleoDNA-RNAm
A síntese completa de uma proteína leva de 20 a 60 seg, e o mesmoRNAm pode ser traduzido por vários ribossomos, que mantêm uma Distância entre si de aproximadamente 80 nucleotídeos.
Os Íntrons e os Éxons
Nos eucariontes, o RNA transcrito pelo gene é normalmente chamado de pré-RNA, no sentido de que ele ainda não está pronto para ser traduzido, produzindo proteínas. O pré-RNA seria, assim uma versão ainda não acabada do RNAm, que precisa ser primeiro processado no núcleo para, em seguida, migrar ao citoplasma.
A
Éxon Íntron Éxon ÉxonÍntron Íntron
Os Íntrons são retirados e os éxons são soldados um ao outro
Síntese Protéica
• O RNAm transcrito no núcleo chega ao citoplasma e se liga a um ou mais ribossomos.
• O ribossomo “lê” o primeiro códon e um RNAt com o anticódon correspondente transporta um aminoácido e se liga ao códon.
• O ribossomo se desloca, no sentido 5’3’ e lê o próximo códon.
• Os aminoácidos são unidos por ligações peptídicas.
• Ao final da tradução o polipeptídeo se desliga e se constituí na proteína.
A Tradução
O ribossomo acomoda dois tRNAs carregados
4. Terminação
Dogma Central da Biologia Molecular
• Foi estabelecido em 1956 por Francis Crick.
• Postulava que o sentido da construção das moléculas é sempre de DNA à Proteína – fluxo unidirecional da informação.
• O DNA é o “molde” para formar DNA (replicação) e RNA (transcrição). Este por sua vez é o “molde” para formação das proteínas (tradução).
• Hoje se sabe que, em alguns vírus, o RNA pode replicar-se e, em outros, o RNA pode produzir DNA (transcrição reversa) utilizando o maquinário genético da célula-hospedeira.
• Porém, não é possível se sintetizar ácidos nucléicos a partir de proteínas.
• Os novos conhecimentos permitiram que se ampliasse o dogma central sem contudo perder a unidirecionalidade, ou seja, de ácido nucléico à proteína.
• Projeto Proteômico.
Diferenças entre RNA e DNA
O RNA é uma molécula intermediária na síntese de proteínas, ela faz a intermediação entre o DNA e as proteínas.
Ele é formado por uma cadeia de ribonucleotídeos, que, por sua vez, são formados por um grupo fosfato, um açucar (ribose), e uma base nitrogenada (veja abaixo).
As principais diferenças entre o RNA e o DNA são sutis, mas fazem com que o último seja mais estável do que o primeiro. O RNA é formado por uma fita simples, o açúcar de seu esqueleto é a ribose e uma de suas bases pirimídicas (de anel simples) é diferente da do DNA (uracila ao invés de timina), além disso o açucar do RNA é a ribose invés da desoxirribose do DNA.
DNA
RNA
Os processos de síntese de proteínas na célula são controlados pelo metabolismo de controle.As duas
principais personagens do metabolismo de controle são as moléculas de DNA e RNA. O DNA (ácido
desoxirribonucléico) é o patrimônio genético, que contém as instruções para a síntese de todas as
proteínas que a célula é capaz de realizar. O RNA atua como mensageiro (RNA mensageiro) entre o
DNA e o ribossomo, local de síntese de proteínas.
DNA (ácido desoxirribonucléico) RNA (ácido ribonucléico)
Se localiza somente no núcleo Se localiza no núcleo e no citoplasma
Apresenta forma de dupla hélice com duas fitas
Apresenta apenas uma fita
É formado com a pentose (açúcar) desoxirribose
É formado com a pentose ribose
Bases nitrogenadas participantes: A, T, C, G
Bases nitrogenadas participantes: A, U, C, G
DNA e RNA
Código Genético
Codon que dá origem à síntese dequalquer proteína
Código Genético – correspondência entre cada tripleto (codon) de RNA e cada um dos 20 aminoácidos habituais das proteínas (desde 1964)No código genético há 64 trincas possíveis, apenas 61 delas correspondem a aminoácidos. As tres trincas restantes são usadas como pontuação; elas dizem à célula o ponto em que termina a codificação de cada proteína.
Genoma Conjunto de moléculas de DNA
Disciplina de Biologia Molecular(60 h)
Prof. Leonardo Crema
Ementa
• EMENTA:
1) Mecanismos moleculares da replicação doDNA, transcrição e tradução gênica.Características do código genético. Tipos demutações. Polimorfismos. Organização dogenoma. Técnicas de biologia molecular.Bioinformática. Genética forense. Clonagem.Transgenia. Tipos de células tronco. PráticaProfissional Integrada.
Bibliografia Básica
• ALBERTS, B.; et al. Biologia molecular da célula. 5 ed. Porto Alegre: Artmed. 2010.
• GRIFFITHS, A. J. F.; et al. Introdução à genética. 7 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. 2002.
• SNUSTAD, P. & SIMMONS, M. J. Fundamentos de Genética. 2 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2001.
Bibliografia Básica
• ALBERTS, B.; ANDRADE, A. E. Fundamentos da biologia celular. 3 ed. Porto Alegre: Artmed, 2011.
• COOPER, G. M.; HAUSMAN, R. E. A célula: uma abordagem molecular. 3 ed. Porto Alegre: Artmed. 2009.
• JUNQUEIRA, L. C.; CARNEIRO, J. Biologia celular e molecular.8 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. 332 p. 2011.
• RAVEN, P. H.; EVERT, R. F. Biologia Vegetal. 7 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2001.
• SADAVA, D.; HELLER, C.; ORIANS, G.H.; PURVES, W.K.; HILLIS, D.M. Vida: A Ciência da Biologia - Célula e Hereditariedade. V. 1, 8 ed. Porto Alegre: Artmed. 2009.