NÜKLEIK ASIT HIBRIDIZASYONUNA
DAYALı YÖNTEMLER
HIBRIDIZASYON
Nükleik asit hibridizayon (melezleme) yöntemleri;
tek iplikli nükleik asit moleküllerinin tamamlayıcı
dizileri ile uygun koşullar altında kendiliğinden
eşleşerek çift iplikli hibrid moleküller (melezler)
oluşturma özelliğine dayanır.
Hibridizasyon reaksiyonları tamamlayıcı nükleotid dizileri içeren
tüm tek zincirli nükleik asit molekülleri arasında gerçekleşebilir.
DNA/DNA
RNA/RNA
RNA/DNA
Bu özgün reaksiyonlar, hem RNA hem de DNA molekülleri
üzerindeki belirli nükleotid dizilerini belirlemek amacıyla kullanılır.
Yöntemin uygulanması için, araştırılan nükleik asit dizilerine eşlenik
olan tek iplikli nükleik asit (DNA veya RNA) dizilerine ihtiyaç vardır.
Ayrıca bu dizilerin radyoaktif veya radyoaktif olmayan bir belirleyici
ile işaretlenmesi gerekir.
Ancak bu sayede hibridizasyon reaksiyonu sonucu oluşan çift iplikli
molekül görülebilir hale gelir.
Tanımlanmak istenen nükleik asit bölgesine eşlenik olan ve
belirleyici olarak kullanılan tek iplikli özgün nükleik asit parçalarına
prob adı verilir.
YÖNTEM
Belirli doku veya hücrelerden izole edildikten sonra
jel elektroforezi ile ayrılan ve nitroselüloz veya
naylon membranlara transfer edilen DNA
moleküllerinin (Southern blotting) veya özgün RNA
dizilerinin (Northern blotting) saptanması ve analizi
için uygulandığı gibi, gerek RNA gerekse DNA
dizilerinin belirli hücre veya dokulardaki varlığı ve
dağılımını belirlemede (in situ hibridizasyon) de
kullanılmaktadır.
NÜKLEIK ASIT HIBRIDIZASYONU
REAKSIYONUNUN TEMELLERI
Çift iplikli bir nükleik asitin dayanıklılığı onun erime
(melting temperature = Tm) sıcaklığını hesaplayarak
belirlenir. Bu değer her bir organizma için farklıdır.
Hibrid molekül ne kadar dayanıklı ise, Tm derecesi o kadar
yüksektir, yani ipliklerin ayrılması için gereken enerji o
oranda fazladır.
HIBRID NÜKLEIK ASITLERIN DAYANıKLıLıĞı BIR TAKıM
FAKTÖRLERE BAĞLıDıR
1.Guanin-sitozin oranı (%GC): GC çiftleri, 3 H bağı içerdiğinden, AT çiftlerine
göre daha sağlamdır. Bu nedenle yüksek GC içeriğine sahip olan DNA, AT
bakımından zengin olan DNA’ya nazaran daha dayanıklıdır ve iki ipliği ayırmak
için daha çok enerji gereklidir.
2.Hibrid molekülün boyu: Genellikle uzun bir nükleik asit molekülü, kısa
olana göre daha sağlamdır. Çünkü içerdiği hidrojen bağı sayısı daha fazladır.
Böylece iki ipliği ayırmak için daha çok enerji gerekir.
3.Nükleik asitlerin içinde bulunduğu ortam: Hibridizasyon karışımı ve
hibridizasyon sonrası yıkama solüsyonlarında, tek değerlikli katyonları içeren
iyonik bir tuz tamponu içinde formamid bulunur. Formamid hidrojen bağlarını
bozarak çift iplikli nükleik asitlerin çözülmesini kolaylaştırır. Bunun tersine Na+
gibi tek değerlikli katyonların konsantrasyonunu artırmak hibridleri
sağlamlaştırır. Organik çözücülerin çift iplikli polinükleotitlerin ısıya
dayanıklılığını azaltarak daha düşük sıcaklıklarda hibridizasyona olanak vermesi
bu problemi çözümlemiştir. Formamid bu amaçla kullanılan organik bir
çözücüdür; DNA/DNA ve DNA/RNA çift ipliklerinin ayrılma sıcaklığını azaltır.
Böylece hibridizasyon, %50 formamid varlığında 30-45°C’da gerçekleştirilebilir.
Belirli formamid ve Na+ konsantrasyonlarındaki bu solüsyonların sıcaklığı
hibridizasyonun kesinliğini belirler.
4.Nükleik asit hibridinin çeĢidi: RNA/RNA hibridleri DNA/DNA
hibridlerine göre ısıya daha dayanıklıdır. DNA/RNA hibridleri ise orta
dayanıklılıktadır.
5. YanlıĢ eĢleĢen hibridlerin varlığı: Yanlış eşleşen nükleotitler
(A-T yerine T-T vb.) hibridin dayanıklılığını azaltır. Çünkü bunlar
arasında hidrojen bağları oluşamaz. Yanlış eşleşmenin dayanıklılığı
azaltan etkisi, kısmen prob uzunluğuna bağlıdır. Çift iplikli hibrid ne
kadar uzun ise yanlış eşleşmiş bir çiftin, hibrid dayanıklılığına etkisi
o kadar azdır.
IN SITU HIBRIDIZASYON
In situ hibridizasyon (ISH), nükleik asit dizilerinin (DNA ve RNA)morfolojik olarak korunmuş kromozomlar, hücreler veya doku kesitlerindesaptanarak gösterilmesini sağlayan ve temel olarak çift iplikli nükleikasit oluşumu kinetiğini kullanan güçlü bir tekniktir.
In situ hibridizasyonun diğer hibridizasyon yöntemlerinden (Southernveya Northern Blotting) farkı nükleik asitlerin kendi hücreselortamlarında tanınarak gösterilmesidir. Böylece hedef nükleik asitdizisinin hücredeki yeri belirlenmiş olur.
Nükleik asitlerin bulundukları yerde saptanması:
Kromozomların fiziksel haritalarının yapılmasında,
Kromozom yapı ve hatalarının analizinde,
Kromozomların ve genomun yapı, işlev ve evrimininaraştırılmasında,
Gen anlatımının belirlenmesinde,
Eşey tayininde,
Dokudaki virüs ve bakterilerin tanısında,
Transformasyon dizilerinin ve onkogenlerin yerlerininbelirlenmesinde önemlidir.
In situ hibridizasyonun anlaşılması moleküler biyoloji, genetik,
immünokimya ve histokimya bilgilerini gerektirmektedir. Yöntemin
başlıca aşamaları yandaki gibidir.
Biyolojik materyalin
hazırlanmasıProbun işaretlenmesi
Prob ve materyalin
denatürasyonu
Hibridizasyon
Yıkama
Saptama
Görünür hale getirme
ISH yöntemi ilk kez 1969’da birbirinden bağımsız olarak çalışan iki gruparaştırıcı tarafından (John ve ark., Pardue ve Gall) uygulandı.
İlk uygulamalarda nükleik asitleri işaretlemede radyoizotoplarkullanılmaktaydı; buna göre hibritleşmiş dizileri göstermek içinbaşvurulan tek yöntem otoradyografiydi.
Ayrıca, o sıralarda moleküler klonlama mümkün olmadığından ISH sadecebiyolokimyasal metotlar ile saflaştırılabilen ve izole edilebilen dizilere(fare satellit DNA’sı, viral DNA, ribozomal RNA vb.) uygulanabiliyordu.
Nükleik asitlerin moleküler klonlaması ve radyoaktif işaretlemetekniklerindeki gelişmeler bu tabloyu önemli derecede değiştirdi.
Öte yandan, radyoaktif olmayan işaretleyici ile hazırlanmış nükleik asitproblarının ISH’da kullanılması radyoaktif yöntemin getirdiği zorluklarıortadan kaldırdı.
Radyoaktif olmayan ISH ilk kez 1970’lerin sonunda uygulandı (Rudkin veStollar, 1977; Bauman ve ark., 1980). O günden beri radyoaktif olmayan insitu hibridizasyonun (NISH) biyomedikal araştırmalarda ve kliniktanıdaki uygulamaları büyük bir hız kazanmıştır.
Son yıllarda nükleik asitleri işaretlemek için birçok yöntemgeliştirilmiştir. Günümüzde, biotin, digoksigenin, dinitrofenil veyafluorokromlarla enzimatik olarak işaretleme genellikle tercihedilmektedir. Piyasada çeşitli prob işaretleme kitlerininbulunması, bu işlemleri oldukça kolaylaştırmıştır.
Rekombinant DNA preparasyonları ile birlikte saf prob eldeedilmesi sorunu çözülmüştür. Prob seçimine bağlı olarak, belirligenom ve kromozomlar, tekrarlanan DNA dizileri, tek kopyalıdiziler, mRNA ve viral diziler gibi farklı hedeflersaptanabilmektedir.
Çeşitli sitokimyasal saptama yöntemlerinin geliştirilmesi de ISHtekniğinin başarısını arttırmıştır. Birden fazla prob işaretleme vesaptama yönteminin birlikte kullanılması aynı hücre preparatındaiki veya daha çok nükleik asit dizisinin farklı renklerdegösterilmesini sağlamıştır.
Ayrıca radyoaktif olmayan ISH ile immünositokimyasal yönteminbirlikte kullanılması gen topografisi ile gen aktivitesi arasındakiilişkinin DNA, mRNA ve protein düzeyinde ortaya konulmasınaolanak vermiştir.
In situ Hibridizasyon Problarının Seçimi
ISH’da kullanılacak probların seçilmesinde iki temel nokta vardır:
Prob olarak kullanılacak nükleik asitin tipi ve uygun
işaretleme cinsi
Prob tipleri
Prob olarak hazırlanan nükleik asitler; çift iplikli DNA (dsDNA),
tek iplikli DNA (ssDNA), tek iplikli RNA ve oligonükleotitler olarak
sınıflandırılabilirler (Tablo).
Prob tipi Avantajları Dezavantajları
RNA RNA:RNA melezleri oldukça
dengelidir.
Prob denatürasyonu gerekmez.
Hibridizasyon işlemi sırasında
yeniden eşleşme olmaz.
Prob vektör içermez.
Hibridizasyon sonrası RNaz
uygulaması hibritleşmeyen probları
ortadan kaldırır.
Probun RNaz aktivitesinden
korunması gereklidir. Çok çabuk
parçalanır.
Probun vektör içine altklonlanması
gerekir.
dsDNA Altklonlama gerektirmez.
Fazla sayıda ve uygun işaretleme
yöntemleri uygulanabilir.
Prob denatürasyonu gerekir.
Hibridizasyon sırasında
tamamlayıcı iplikler yeniden
eşleşir.
Hibridler RNA problarından daha
az dengelidir.
Oligonükleotitler Klonlama gerektirmez.
Kendi içinde eşleşmeye uğramaz.
Dokuya penetrasyonu çok iyidir.
Protein dizilerinden yararlanarak
hazırlanabilir.
Sınırlı işaretleme yöntemi
uygulanır.
Dizileme sırasında hatalar
oluşabilir.
Hibridizasyon için oldukça kısa
dizilerdir.
Her prob çalışılacak materyale ve araştırıcının
moleküler biyoloji deneyimine bağlı olarak seçilir.
Kromozomlar üzerinde gerçekleştirilen ISH’da ve
viral DNA tayinlerinde genellikle DNA probları,
mRNA tayinlerinde ise tek iplikli RNA probları
veya oligonükleotitler tercih edilmektedir.
Problar parça-izolasyon, klonlama, in vitro
transkripsiyon veya kimyasal sentez yolu ile elde
edilebilirler.
PROB UZUNLUĞU
Maksimum hibridizasyon oranı uzun problar ile elde edilir.
Ancak ISH’da kısa problar gereklidir. Çünkü, probun hücre veyakromozomlar çevresindeki yoğun matriksten geçerek hedefe ulaşmasıgerekmektedir.
Probların 50-150 bazlık olanları birçok doku için en iyi sinyali verir.
Çok kısa problar ise çok zayıf sinyaller verirler, bazen de istenmeyenişaretlere neden olabilirler. Bununla beraber probun optimum boyuçalışmaya göre değişir.
Örneğin, paraformaldehit ile fikse edilmiş ve parafine gömülmüşembriyo için, ISH çalışmalarında optimum sinyal 1 kb boyutundakiRNA probları ile elde edilir.
Dokunun özelliği, fiksasyon tipi, hibridizasyon öncesi işlemlerininuygulanıp uygulanmamasına göre de prob uzunluğunun seçimi değişir.
Oligonükleotitler tek iplikli oluşları ve çok iyi penetrasyon özelliklerinesahio olmalarından dolayı ISH için oldukça avantajlı problardır. Ancakküçük boyutlu olduklarından, hedef nükleik asidin ancak küçük birbölümü ile eşleşirler.
PROBUN ĠġARETLENMESI
ĠZOTOPIK ĠġARETLEME
ĠZOTOPIK OLMAYAN ĠġARETLEME
Ġzotopik ĠĢaretleme
İşaretleme radyoaktif madde ile yapılır ve işaretin belirlenmesi içinotoradyografi kullanılır.
Reaksiyonun sonucunun hızına, prob stabilitesine ve çalışılankonuya göre farklı tipte izotoplar kullanılır.
H3 işaretli problar; subsellüler uygulamalar için kullanılır, yüksekçözünürlüğe (0,5-1 µm) sahiptir. İşaretli problar birkaç yılsaklanabilir.
S35 ISH’da en yaygın olarak kullanılan radyoaktif işaretlemedir. S35
işaretli problar, özellikle hücresel uygulamalar için uygundur.Otoradyografi işlemi 1 hafta sürebilir. İşaretli prob birkaç ay içindetüketilmelidir. Çözünürlüğü 10-15 µm kadardır.
P32, geniş çaplı alanlar için uygulanır. Çözünürlük 20-30 µm’dir.İşaretli problar bir hafta içinde kullanılmalıdır.
Ġzotopik Olmayan ĠĢaretleme
İşaretleme radyoaktif olmayan maddelerle yapılır ve işaretin
tayini için immünohistokimyasal yöntemler kullanılır.
Son yıllarda izotopik olmayan işaretlemeler daha sıklıkla
kullanılmaktadır.
İzotopik olanlara göre avantajları, işaretli probların 6 ay veya
daha uzun süreli olarak -20°C’da saklanabilmesi,
çözünürlüğün yüksek olması, hızlı sonuç alınması, daha fazla
sayıda işaretleme yöntemi bulunması ve daha güvenilir
olmasıdır.
Dezavantajları ise; duyarlılığın izotopik işaretlemelerden daha
az olması ve istenmeyen bağlantılara daha fazla yol
açabilmesidir.
Prob işaretlemeleri kimyasal veya enzimatik reaksiyonlar ile yapılır.
En yaygın kullanılan işaret maddeleri biotin, digoksigenin gibi
haptenler ve FITC (fluoresein) gibi fluoresan maddelerdir. Ayrıca,
ender olarak peroksidaz, alkalin fosfataz gibi enzim işaretlemelerine
de rastlanır.
Hapten işaretli problar mRNA ISH için güvenilirlik, yüksek stabilite,
hızlı sonuç verme ve tek hücre çözünürlüğü gibi önemli avantajlara
sahiptirler.
En duyarlı yöntem, özgün bir antikora uygun olan bir haptenin, bir
nükleotit türevine bağlanması ile gerçekleştirilir (örneğin,
digoksigenin ddUTP veya dUTP’ye bağlanır). Hibridizasyon ve
yıkamaları takiben doku bir enzime bağlı olan ve hapteni bağlayan bir
protein ile inkübe edilir. Daha sonra sinyal bu enzim için uygun
substratın kullanılması sonucunda, ürünün renklendirilmesi şeklinde
elde edilir. Bu işlem fluoresein işaret maddesinin kullanımı için de
benzer şekildedir. İşaret fluoresan mikroskobunda gözlenir.
IN SITU HIBRIDIZASYONDA KONTROL
ISH deney sonuçlarının doğru olarak yorumlanabilmesi ve güvenilirliğiaçısından çok dikkatli davranılmalı ve işlem sonuçlarından emin olmak içinçeşitli kontroller yapılmalıdır.
Hibridizasyon reaksiyonlarında, problar ile hedef olmayan nükleik asitdizileri arasında, olası homolojilerden dolayı istenmeyen sonuçlar ortayaçıkabilir.
Ayrıca probun G-C bakımından zengin bölgeleri ile hedef olmayan nükleikasitler arasındaki hibridizasyon da yanlış pozitif sonuç verebilir.
Böyle hatalı hibridizasyon reaksiyonlarının önlenmesi için prob dizisininçok dikkatli seçilmesi ve kontrol probların kullanılması gereklidir.
Hibridizasyon öncesi uygulamalarda yer alan RNaz veya DNaz ile sindirmeDNA veya RNA gibi hedef nükleik asitlerin varlığının saptanmasındaönemli bir kontroldür.
Enzim uygulamaları çok dikkatli yapılmalıdır. Nükleaz uygulamasındansonra, hedef nükleik asitin ortadan kaldırılmasını takiben, eğer enzimdokudan tam olarak giderilmemiş ise daha sonraki aşamada probu dasindireceğinden hibridizasyon sinyali çok zayıf olur veya gözlenemez.
İstenmeyen hibridizasyon sinyallerinin bir kısmı da probların spesifikolmayan hücresel bölgelere bağlanması ile ortaya çıkabilir. Bu duruma,proteinler ile prob arasındaki elektriksel çekimlere yol açabilir. Birdiğer prob-protein ilişkisine DNA’ya bağlanan proteinler neden olabilir.Bu gibi özgün olmayan ilişkiler, hücresel nükleik asitlerlehibritlenmeyen negatif kontrol problar kullanılarak ortadankaldırılabilir.
Bunlara ek olarak, histokimyasal veya immünohistokimyasaltekniklerdeki bir hata sürpriz pozitif sonuçlar doğurabilir. Bu da probiçermeyen hibridizasyon tamponu ile inkübe edilen kesitlere işarettayin sistemlerinin uygulanması ile kontrol edilebilir. Ayrıcaimmünolojik tayin sistemlerinde kullanılan enzimlerini dokudaendojen olarak varlıkları dikkate alınmalı; gerekirse bir başka enzimseçilmeli ya da prehibridizasyon aşamasında endojen enzimmaskelenmelidir.
Kontrol probları olarak hedef gene karşı anlamlı (sense) veya anlatımyapmayan bir gene ait karşı anlamlı (antisense) oligonükleotitler,ayrıca rastgele dizili oligonükleotitler ve oligo d(T) veya d(A)kullanılabilir. Oligo d(T) probları, dokudaki mRNA’nın korunmuşluğuve hücresel aktivitesi hakkında önemli bilgi veren poliadenil-RNA’larıtayin etmek için kullanılır. Bu aynı zamanda ISH protokolününoptimizasyonunda kullanılan bir adımdır.
SOUTHERN BLOTTING
İstenilen bir genin veya DNA dizisinin, binlerce baz çiftlik bir DNAmolekülündeki varlığının belirlenmesi, moleküler biyoloji verekombinant DNA teknolojisi çalışmaları için önemli ve vazgeçilmezişlemlerden biridir.
Özellikle gen yapısı, gen ifadesi, genom organizasyonu, haritalamave gen aktarımı çalışmalarında (transformantların istenilen genitaşıyıp taşımadığının, kopya sayısının analizi vb) aranılan DNAdizisinin saptanması Southern blotting tekniği ile mümkünolabilmektedir.
Bu teknik ilk kez adını aldığı Southern tarafından 1975 yılındatanımlanmıştır.
Tekniğin temeli, istenilen DNA parçasının ona tamamlayıcı olanradyoaktif veya radyoaktif olmayan bir takım belirleyicilerleişaretlenmiş olan problar kullanılarak hibridizasyonuna vehibridizasyonun ardından belirleyicinin özelliğine göre radyoaktif,immünolojik, kimyasal ya da fluoresan yöntemlerle görünür halegetirilmesine dayanır.
Probların (tanımlamak istenilen nükleik asidin tamamlayıcısı olan özgün
DNA ya da RNA parçaları) işaretlenmesinde son yıllara kadar belirleyici
olarak P32, S35 ve H3 radyoizotopları yaygın bir şekilde kullanılmış ve
radyoaktivitenin belirlenmesi için otoradyografiden yararlanılmıştır.
Otoradyografinin hızlı sonuç vermesi, güvenilirliği gibi üstün
özelliklerinin yanısıra radyoaktif maddelerle çalışmanın getirdiği
zorluklar ve tehlikeler sistemin en önemli dezavantajını oluşturmaktadır.
Bu durum araştırıcıları daha tehlikesiz yöntemler geliştirmeye
yöneltmiştir. Bu yöntemlerin tümünün ortak özelliği işaretlemenin
radyoaktif olmayan belirleyicilerle yapılmasıdır. Radyoaktif olmayan
işaretleme ve belirleme sistemleri;
Digoksigenin-anti-digoksigenin sistemi,
Yabanturpu (Armoracia lapathifolia, horseradish) peroksidaz
sistemi,
Biotin-streptavidin sistemidir.
Bu üç sistemle de hibritlenen probun belirlenmesi kromogenik
(kolorimetrik) yani renkli bir ürün oluşturan veya ışık oluşumuna neden
olan (kemoluminogenik) substratlar kullanılarak gerçekleştirilir.
PROBUN HAZıRLANMASı VE IġARETLENMESI
Prob hazırlamak, istenilen DNA fragmentinin kalıp olarak
kullanılması ve ona tamamlayıcı DNA zincirinin in vitro sentez
edilmesi demektir.
Probların işaretlenmesi, probun cinsine göre farklı şekillerde yapılır.
DNA probları; ‘random primed’ işaretleme1, ‘nick translation’2 veya
Taq DNA polimeraz3 ile işaretlenir.
1 ‘Random primed’ iĢaretleme: In vitro DNA sentezi sırasında yeni sentez edilen probun
yapısına rastgele biçimde DIG-11-dUTP’ler girer.
2 ‘Nick translation’: DNaz I enzimi ile çift iplikli DNA’nın tek ipliğinde kesikler oluşturma
esasına dayanır. E.coli DNA polimeraz I enziminin 5’-3’ eksonükleaz aktivitesi ile tek iplik
üzerinde kesik noktalar genişletilir ve boşluklar aynı anda enzimin 5’-3’ polimeraz aktivitesi
ile ve DIG işaretli dNTP’lerle doldurulur.
3 Taq DNA polimeraz ile iĢaretleme: PCR ile prob DNA’sı çoğaltılırken Taq DNA
polimeraz enziminin diğer dNTP’lerin yanısıra DIG işaretli dNTP’leri de kullanmasıyla
işaretleme gerçekleştirilir.
RNA probları; T3, T7 ve SP6 RNA polimerazları ile in
vitro transkripsiyon reaksiyonu ile sentezlenirken
ortama katılan DIG-11-dUTP ile işaretlenir.
Oligonükleotit problar; terminal transferaz enzimi ile
ya 3’ uca bir DIG-11-dUTP veya DIG-11-dUTP’den
oluşan bir kuyruk eklenmesi ile ya da digoksigenin-
NHS-esterin 5’ uca eklenmesi ile işaretlenir.
Problar hazırlandıktan sonra hibridizasyon için istenilen
DNA parçası açısından taranacak DNA, eğer plazmid
DNA’sı ya da genomik DNA gibi kompleks özellikte ise
önce bir restriksiyon endonükleaz enzimi ile kesilerek
daha küçük parçalara bölünmelidir.
DNA parçaları, agaroz jel elektroforezi ile birbirinden
ayrıldıktan sonra nitoselüloz membrana aktarılır.
Daha sonra da hazırlanan DIG işaretli probla
hibridizasyona bırakılır.
Probla nitroselüloz membran üzerindeki DNA
parçalarından tamamlayıcısı olan arasında H bağları
oluşumu ile çift zincirli DNA parçası meydana gelir.
Bundan sonraki aşamada prob ile hibritlenmiş DNAparçasının belirlenmesi gerekir.
Bir hapten olduğu daha önce belirtilen digoksigenine karşıözgül digoksigenşn antikoru, alkalin fosfataz enzimi ile bağlıolarak bulunur.
Hibridizasyon işleminin ardından ortama eklenen anti-digoksigenin (digoksigenin antikoru), probların yapısındabulunan dUTP’lere bağlı digoksigenin ile bir antijen-antikorkompleksi oluşturur.
Bu kompleksin oluşumunu takiben ortama katılan ve alkalinfosfataz enziminin substratları olan ‘nitroblue tetrazolium’tuzu (NBT) ve 5-bromo-4-kloro-3-indolil fosfat (X-fosfat)varlığında enzim aktivite gösterir.
Sonuçta mavi renkli bir ürün oluşumu sayesinde istenilenDNA parçası belirlenmiş olur.
ELECTROBLOTTING ILE SOUTHERN AKTARıMı
DNA parçalarının, özellikle de restriksiyon enzim kesimi
uygulaması ile oluşan, boyutları birbirine çok yakın ve çok
sayıda olanların, agaroz jeldeki bantları kısa sürede
difüzyonla kaybolabileceğinden ve/veya agaroz jel kolayca
kırılıp parçalanabileceğinden hibridizasyon amacıyla jeli
kullanmak uygun değildir.
Bu nedenle agaroz jeldeki DNA parçaları electroblotting ile
bir membrana (örneğin nitroselüloz membrana) aktarılır.
Böylece DNA parçaları membran üzerinde tutuklanmış
(immobilize edilmiş) olur.
NORTHERN BLOTTING
İlgilenilen genin transkripsiyon ürünü olan RNA’nın analizininyapılmasında kullanılan başlıca yöntemlerden biri DNA-RNAhibridizasyonudur.
Northern hibridizasyonu olarak adlandırılan bu yöntemde önce totalRNA agaroz jelde yürütülerek RNA moleküllerinin ayrılmasısağlanır.
Daha sonra jelde ayrılmış RNA molekülleri membrana aktarılır veRNA’nın membran üzerine sabit şekilde bağlanması sağlandıktansonra uygun problarla hibridizasyon işlemi gerçekleştirilir.
Membranlar genellikle naylon veya nitroselüloz yapıdadır.
Nötr, negatif veya pozitif yüklü olabilirler.
Northern hibridizasyon için genellikle tercih edilen naylonmembrandır fakat organik çözücüler etkisinde bırakıldığındaküçülebilir veya katlanabilir.
Nitroselüloz membranlar ise fiksasyon işlemindeki fırınlamasırasında yanabilir ve/veya yıkama sırasında kolayca yırtılabilir.