Download - Nukleov é kyseliny
![Page 1: Nukleov é kyseliny](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062301/56815228550346895dc07032/html5/thumbnails/1.jpg)
Význam genetické informace, její replikace
a exprese pro živý organismus
DNA – struktura, vlastnosti a funkce v organismu
RNA – dtto
Virus ( = parazitující soubor genů)
Možné využití syntetických oligonukleotidů
Technické použití nukleových kyselin: aptamerové senzory, DNA nanomateriály
Nukleové kyseliny
![Page 2: Nukleov é kyseliny](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062301/56815228550346895dc07032/html5/thumbnails/2.jpg)
Znaky živého organismu
získávání energie z živin pro své životní potřeby
možnost růstu, diferenciace a reprodukce
aktivní udržování vnitřní uspořádanosti
aktivní reakce na změny vnějších podmínek
Všechny tyto životní projevy se realizují primárně na úrovni buněk
![Page 3: Nukleov é kyseliny](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062301/56815228550346895dc07032/html5/thumbnails/3.jpg)
Jednotná molekulární strategie buněk
Polysacharidy a lipidy … stavební a zásobní
Bílkoviny (proteiny) … univerzální, mohou mít funkci: stavební, zásobní, biochemickou (enzymy), transportní, pohybovou,
kontrolní, signální,..
Specifický vztah mezi strukturou a funkcí:
posloupnost aminokyselin struktura funkce
Kritická podmínka pro zachování životních pochodů buňky: mít možnost podle potřeby vytvořit protein pro zabezpečení dané funkce
To zajišťují Nukleové kyseliny: v DNA je informace uložená, RNA je prostředníkem její realizace (exprese)
![Page 4: Nukleov é kyseliny](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062301/56815228550346895dc07032/html5/thumbnails/4.jpg)
Centrální dogma molekulární biologie
Přenos genetické informace v živých organismech vždyDNA RNA protein
![Page 5: Nukleov é kyseliny](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062301/56815228550346895dc07032/html5/thumbnails/5.jpg)
Chemické složení DNA
Asymetrický řetězec s jasně rozlišeným 5’ a 3’ koncem.
DNA je polymerní řetězec, vzniklý
polymerací nukleotidů.
Nukleotid = báze + deoxyribóza + + fosfátová skupina
![Page 6: Nukleov é kyseliny](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062301/56815228550346895dc07032/html5/thumbnails/6.jpg)
Uspořádání DNA
DNA je v buňkách ve formě dimeru tvořeného antiparalelně uspořádanými řetězci s komplementárním bázovým složením.
![Page 7: Nukleov é kyseliny](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062301/56815228550346895dc07032/html5/thumbnails/7.jpg)
Rozsah buněčné genetické informace
Kompletní genetická informace organismu = genom.
Prokaryota: Genom obsahuje typicky jednotky tisíc genů. Existují však i primitivní bakterie s méně než 100 geny.
________________________________________________Eukaryota: Desetitisíce až statisíce genů v genomu. Primitivní eukaryota nemají o mnoho více genů než nejlépe geneticky vybavená prokaryota (kvasinka Saccharomycescerevisiae má 6 tisíc genů).
![Page 8: Nukleov é kyseliny](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062301/56815228550346895dc07032/html5/thumbnails/8.jpg)
Příklad genu
![Page 9: Nukleov é kyseliny](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062301/56815228550346895dc07032/html5/thumbnails/9.jpg)
Uložení DNA v buňce
Genom prokaryot je uložen v jediné molekule DNA, která je cyklická.__________________________________________________V případě eukaryot je genom představován sadou molekul DNA, které jsou základem jednotlivých chromosomů. Například somatické (nepohlavní) lidské buňky obsahují dvě sady po 23 chromosomech. V každém chromosomu je DNA o délce kolem 10 cm.
Délka a počet DNA molekul v jádře vylučuje jejich volné uložení. Proto dochází k několikastupňové organizaci. Ta je maximální při přípravě pro buněčné dělení, kdy jsou zformovány chromosomy. Při ostatních životních fázích buňky dochází k částečnému rozvolnění:struktura DNA + podpůrné proteiny = chromatin
![Page 10: Nukleov é kyseliny](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062301/56815228550346895dc07032/html5/thumbnails/10.jpg)
Vyšší stupně uspořádání Nukleosomy jsou vázány na další vláknový histon a tvoří „30 nm vlákno“. To je dále zprohýbáno a organizováno.
Díky uspořádání je délka chromosomu 10.000x menší než délka rozvinuté DNA.
Při ostatních životních fázích buňky dochází k rozvolnění. Málo rozvolněný chromatin (heterochromatin) je nedostupný pro expresi genetické informace.
I v nejvíce rozvolněném chromatinu zůstává struktura nukleosomů. Základní pochody na DNA, tj. replikace, transkripce nebo opravy mohou probíhat přes nukleosomy.
![Page 11: Nukleov é kyseliny](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062301/56815228550346895dc07032/html5/thumbnails/11.jpg)
Uspořádání v jádře
V jádře se chromosomy (= molekula DNA + histony) uspořádávají do více a méně rozvinutých oblastí.
![Page 12: Nukleov é kyseliny](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062301/56815228550346895dc07032/html5/thumbnails/12.jpg)
Předávání a rekombinace genetické informace
Genetická informace při diferenciaci buněk nemizí
![Page 13: Nukleov é kyseliny](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062301/56815228550346895dc07032/html5/thumbnails/13.jpg)
Replikace DNA
Přesnost replikace:
prostá syntéza DNA vlákna: pravděpodobnost chyby 1:100000
bezprostřední kontrola a oprava: pravd. chyby 1:100
další kontrola a oprava na novém vláknu: pravd. chyby 1:100
Celková pravděpodobnost chyby při replikaci: 1 : 1 miliarda
![Page 14: Nukleov é kyseliny](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062301/56815228550346895dc07032/html5/thumbnails/14.jpg)
Důležitost předávání genetické informace
Je to především pojistka proti současnému poškození životně důležitých genů u celého společenství jednotlivců
U bakterií je možné předání malého množství DNA přímo mezi jedinci, nebo i z okolí buňky.
Dobře se uplatňují plasmidy, malé kruhové DNA
U eukaryot se děje předávání genetické informace při pohlavním rozmnožování
Somatické buňky jsou diploidní – mají vždy 2 páry chromosomů, jeden od otce a jeden od matky, které se spojily při oplození, kdy se do jednoho jádra dostaly chromosomy z samční i samičí podhlavní buňky.
![Page 15: Nukleov é kyseliny](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062301/56815228550346895dc07032/html5/thumbnails/15.jpg)
Přenos genetické informace podle principu KOMPLEMENTARITY
pouze bázové páry A:T, G:C
Zápis genetické informace
U všech organismů se zápis genetické informace realizuje
v molekule DNA = deoxyribonukleová kyselina
a to pořadím čtyř bází:
Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin
![Page 16: Nukleov é kyseliny](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062301/56815228550346895dc07032/html5/thumbnails/16.jpg)
Co je příčinou principu komplementarity ?
Pouze při zachování principu komplementarity lze při libovolném řazení čtyř bází na jednom řetězci vytvořit pravidelnou strukturu dvojšroubovice
![Page 17: Nukleov é kyseliny](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062301/56815228550346895dc07032/html5/thumbnails/17.jpg)
Stabilita dvojšroubovice DNA
Relativně velká citlivost na vnější podmínky: teplota, tlak, pH, koncentrace kationtů, koncentrace jednotlivých vícemocných iontů
Zvláštní struktury DNA podmíněné speciálním bázovým složením:- alternující G a C ………………………….levotočivá šroubovice- pouze A a G v jednom vlákně … ……….trojšroubovice- pouze G …………………………. ……….kvadruplex- úsek pouze s A a T s alternacemi ………ohyb
Závislost stability na stavbě DNA - délce řetězce - bázovém složení: stabilita roste s podílem G:C párů
![Page 18: Nukleov é kyseliny](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062301/56815228550346895dc07032/html5/thumbnails/18.jpg)
RNA - chemické složení
Chemické složení RNA se od DNA liší pouze ve dvou detailech
Místo báze Thymin je Uracil (Uracil nemá methylovou skupinu)
Místo deoxyribózy je ribóza (má OH skupinu v pozici 2’)
DNA RNA
![Page 19: Nukleov é kyseliny](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062301/56815228550346895dc07032/html5/thumbnails/19.jpg)
Role RNA
RNA molekuly se účastní v procesu exprese genetické informace ve 4 rolíchmRNA (informační) – nese informaci o pořadí aminokyselinrRNA (ribosomální) - stavební jednotky ribosomu (kromě proteinů)tRNA (transferová) – přenašeč aminokyselin při syntéze proteinů na ribosomu krátké RNA – účast při post-transkripčních úpravách
Centrální dogma molekulární biologie:Přenos genetické informace v živých organismech vždy
DNA RNA protein
![Page 20: Nukleov é kyseliny](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062301/56815228550346895dc07032/html5/thumbnails/20.jpg)
Eukaryota Prokaryota
Postup exprese genetické informace
RNA molekuly se účastní v procesu exprese genetické informace ve 4 rolíchmRNA (informační) – nese informaci o pořadí aminokyselinrRNA (ribosomální) - stavební jednotky ribosomu (kromě proteinů)tRNA (transferová) – přenašeč aminokyselin při syntéze proteinů na ribosomu krátké RNA – účast při post-transkripčních úpravách
![Page 21: Nukleov é kyseliny](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062301/56815228550346895dc07032/html5/thumbnails/21.jpg)
Strukturní rysy RNA RNA se zásadně vyskytuje jako jednovláknová, může ale vytvářet lokální interní dvojšroubovice a stabilizovat se ve složité prostorové struktuře. Základními strukturními motivy jsou vlásenka (hairpin, hairpin loop) - obsahuje vlastní smyčku a stonek (stem), výduť (bulge), vnitřní smyčka, křížení (junction)
![Page 22: Nukleov é kyseliny](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062301/56815228550346895dc07032/html5/thumbnails/22.jpg)
Struktura 5´konce viru HIV-1 • TAR – vlásenka, na kterou se vážou proteiny virový Tat a
buněčný CyclinT1• DIS (SL1) – vlásenka, která je zodpovědná za držení obou
homologních vláken viru při sobě
![Page 23: Nukleov é kyseliny](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062301/56815228550346895dc07032/html5/thumbnails/23.jpg)
Viry• Samostatně existující skupiny genů. Mohou se replikovat pouze pokud infikují vhodnou hostitelskou buňku. Nebuněčné částice, nepovažují se za živý organismus.
• Mimo hostitelskou buňku nevykazují životní projevy: nemají látkový ani energetický metabolismus, nerostou, nejsou dráždivé, nemají aktivní pohyb, nerozmnožují se. Žádný z virů neobsahuje geny klíčové pro jeho replikaci, především pro stavbu ribosomu nebo syntézu ATP. • V procesu své reprodukce představují vnitrobuněčné parazity, kteří jsou zpravidla patogenní pro hostitelskou buňku.
• Obsahují 3 až stovky genů a jejich velikosti se pohybují od 15 do cca 400 nm.
![Page 24: Nukleov é kyseliny](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062301/56815228550346895dc07032/html5/thumbnails/24.jpg)
Životní cyklus DNA viru
Lytický cyklus – s využitím buněčného aparátu (permisivita buňky) se replikuje nukleová kyselina i virové proteiny. Kapsidové proteiny se v procesu tzv. maturace samovolně skládají a vytvářejí kapsid, sestavují se nové viriony. Konkrétní mechanismus závisí především na tom, jak je realizován zápis virových genů:
DNA viry - přímá transkripce a translace virové DNA
![Page 25: Nukleov é kyseliny](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062301/56815228550346895dc07032/html5/thumbnails/25.jpg)
Životní cyklus retroviru RNA je virovou reverzní transkriptázou přepsána do DNA a ta je virovou integrázou včleněna do buněčné DNA v jádře
![Page 26: Nukleov é kyseliny](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062301/56815228550346895dc07032/html5/thumbnails/26.jpg)
Použití oligonukleotidu k „uspání“ genu
oligonukleotid = krátký úsek nukleové kyseliny
Motivace:
1. Chemoterapie:
Selektivní likvidace nežádoucích organismů
Potlačení reprodukce virů, především retrovirů
Potlačení růstu vlastních buněk s patogenním chováním
2. Molekulární biologie:
Efektivní zkoumání funkcí řízených jednotlivými geny
![Page 27: Nukleov é kyseliny](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062301/56815228550346895dc07032/html5/thumbnails/27.jpg)
Možné mechanismy
• Antigenní – oligonukleotid se váže na dvojšroubovici DNA a vytváří triplex; blokuje transkripci (vznik mRNA)
• Antisensní – oligonukleotid se váže na mRNA a vytváří duplex; blokuje translaci (syntézu proteinů) nebo dokonce vede ke štěpení mRNA pomocí RNasy H
• Aptamerní – oligonukleotid zabraňuje funkci proteinu zajišťujícímu nezbytný krok v realizaci genetické informace (reverzní transkriptáza, integráza, apod.)
• siRNA – krátká dvojšroubovice RNA obsahující nežádoucí sekvenci
• Ribozymy – speciální RNA sekvence katalyzující štěpení mRNA
![Page 28: Nukleov é kyseliny](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062301/56815228550346895dc07032/html5/thumbnails/28.jpg)
Chemicky modifikovaná analoga nukleových kyselin
Krátké úseky přírozených nukleových kyselin nejsou v buněčném prostředí stabilní – působení štěpících enzymů (nukleázy)
První generace antisense léků: Založené na fosforothioátechAktivují RNázu HDesítky přípravků ve stadiu klinickýchtestů, jeden lék povolen pro lékařské použití Problémem je nespecifická vazba na nukleové kyseliny a proteiny
Druhá a třetí generace antisense léků: Založené na ochranných O-methyl nebo O-methoxy-ethyl skupinách, někdy v kombinaci s fosforothioáty (2.generace) nebo jiné typy modifikací (3.generace)Neaktivují RNázu H, řeší se to tvorbou „chimerických“ oligonukleotidů Více než desítka ve stadiu klinických testů
![Page 29: Nukleov é kyseliny](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062301/56815228550346895dc07032/html5/thumbnails/29.jpg)
Výběr z přehledu testovaných přípravků
![Page 30: Nukleov é kyseliny](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062301/56815228550346895dc07032/html5/thumbnails/30.jpg)
To je motivace pro hledání nových, vhodnějších modifikací
- dostatečná stabilita vůči enzymům v buňce štěpícím nukleové kyseliny
- specifická afinita k cílovému úseku přirozené nukleové kyseliny
s komplementární bázovou sekvencí
- pro antisense aplikaci schopnost aktivovat enzym RNáza H
- úspěšné pronikání do buněk a správná distribuce
ve vnitrobuněčném prostředí
- netoxičnost a to ani metabolických produktů
Žádná z dosud používaných modifikací nemá bohužel optimální vlastnosti, aby se mohl plně využít potenciál antisensní strategie
Požadavky na syntetická analoga nukleových kyselin pro terapeutické použití
![Page 31: Nukleov é kyseliny](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062301/56815228550346895dc07032/html5/thumbnails/31.jpg)
Studium struktury, dynamiky a mezimolekulárních interakcí strukturních motivů přirozených i
modifikovaných nukleových kyselin
Studované problémy
tvorba a rozpad duplexů, triplexů a kvadruplexů
vliv vnějších podmínek : pH, jednotlivé kationty, speciální molekuly
stabilita a dynamika duplexů s neúplnou komplementaritou
struktura, dynamika a interakce s enzymy regulačních úseků DNA
interakce s enzymy (HIV integráza, RNasa H) významné pro terapii
interakce vazebných strukturních motivů s aptamery (TAR smyčka)
pronikání oligonukleotidů do buněk a jejich vnitrobuněčný osud
![Page 32: Nukleov é kyseliny](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062301/56815228550346895dc07032/html5/thumbnails/32.jpg)
Studium struktury, dynamiky a mezimolekulárních interakcí strukturních motivů přirozených i
modifikovaných nukleových kyselin
Používané metody
UV absorpce
Ramanova spektroskopie
senzory na bázi rezonance povrchových plasmonů
mikrokalorimetrie
strukturní a dynamická NMR měření
cikulární dichroismus (v UV absorpci)
gelová elektroforéza
mikrofluorescenční techniky
počítačové modelování
![Page 33: Nukleov é kyseliny](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062301/56815228550346895dc07032/html5/thumbnails/33.jpg)
Testování syntetických oligonukleotidů
0
1
2
3
4
0 10 20 30 40
0
1
2
3
4
0 10 20 30 40 0 10 20 30 40 0 10 20 30 40
O
PO T
HO
OO
OCH3
d[T15
]d[(X)14
T]
dT15
50 nM buffer
buffer
O
PO T
HO
OO
CH3OCH2CH2O
d[(X)14
T]
O
PO
THO
OOH
(S)-
d[T(TX)7] (S)
O TO
PHO
O
O
d[(X)14
T]
Sen
sor
resp
on
se [
nm
]
O
PO T
HO
OO
CH3O
d[(XTTT)3XXT]
O
PO T
HO
OO
OCH3
d[T(XT)7]
Time [min]
O
P
OTHO
O
O
d[(X)14
T]
Testování vazby na přirozený řetězec – SPR biosenzor
![Page 34: Nukleov é kyseliny](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062301/56815228550346895dc07032/html5/thumbnails/34.jpg)
Specificita vazby(výsledky UV absorpce)
![Page 35: Nukleov é kyseliny](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062301/56815228550346895dc07032/html5/thumbnails/35.jpg)
stabilita komplexu s přirozeným vláknem, strukturní podobnost (UV absorpce, počítačové simulace, Ramanův rozptyl)
biochemický test: aktivace RNasy H