PCR en tiempo realComo seleccionar pruebas Moleculares de VPV y ETS
Dr. José de J. Curiel ValdésAnatomopatólogo
ColposcopistaPatólogo Clínico
Evolución en la detección del Cáncer de Cérvix
ThinPrep® SurePath®
1996 19991949
LBC: Citología líquida
2003
Revisión de las pautas de screening
1990s LBC 2000sTest de Papanicolau
VHP– 99,7% Cánceres de Cérvix1
1Walboomers et al., Journal of Pathology 189:12-19,1999 ( Modificado )
PCR
1980
P16 CINTecCervatec p16 ELISA
L1Ag CytoactivONCOTEC mRNA E6/E7Screening 1º basado en
DNA HPV
HC-2 / H VentanaAmplicor* RocheDNA Invader* WD
2008PREVENCION PRIMARIA
ESCENARIO POSTVACUNAL
Prevención SecundariaProg. Base PoblacionalFinlandia 1963-2008
Meisels and Fortin 1976Purola and Savia 1977Coilocito / Efecto citopatico HPV
Dürst et al. 1983
¿Cómo se si lo tengo?¿Cómo se diagnostica?
• 1.- Estudio de “Papanicolaou” citología cervical.
• 2.- Colposcopía
• 3.- Biopsia “Estándar de
• 4.- Pruebas moleculares
FORMA TRADICIONAL
FORMA MODERNAMAS SEGURA
“BASE LIQUIDA”
¿Cómo se si lo tengo?¿Cómo se diagnostica?
• 1.- Estudio de “Papanicolaou” citología cervical.
• 2.- Colposcopía
• 3.- Biopsia “Estándar de Oro” (?)
• 4.- Pruebas moleculares NORMAL
VIRUS
Citología
• Es el método de detección recomendado• Se considera en NIC 1 poco sensible y específica.• Solo es positiva por definición si existe una fase
productiva.• NIC 2 y 3 es mas sensible y específica.• En base líquida sube la sensibilidad y especificidad.• Es estándar para medir esta sensibilidad y
especificidad ha sido la biopsia.
Colposcopía• Indicada cuando existe una citología anormal
• Usada de rutina y en personas de 20 a 30 años es causa de sobre diagnóstico
• Imágenes en mosaico de diversos tipos, relieves, patrón de vasos etc.
• Algunos muy característicos.
• Siempre requiere de biopsia que lo corrobore.
ALGUNAS IMÁGENES COLPOSCÓPICAS Y SU CORRELACIÓN HISTOLÓGICA
FinoMetaplasia Madura
Metaplasia InmaduraRara vez NIC
DensoNIC Alto Grado
Liso
FinoMetaplasia Maduracon paraqueratosis
GruesoNIC Alto Grado
a Carcinoma Invasor
Mosaico
FinoNIC I
GruesoNIC II y III
Punteado
Metaplasia queratinizante
Siempre ver quehay por debajo
Leucoplasia
Aceto Blanco
¿Cómo se si lo tengo?¿Cómo se diagnostica?
• 1.- Estudio de “
• 2.- Colposcopía
• 3.- Biopsia “Estándar de Oro” (?)
• 4.- Pruebas mol
NORMAL
VIRUS
Espectros molecular y visiblepara diagnóstico de VPH
UNIVERSO POSIBLE A ESTUDIAR
80-90% < 25 años~20 % > 30 años
40-50% < 25 años~20 % 30 años
<10 % > 30 años
A quienes seleccionar
UNIVERSO CON ENFERMEDAD GRAVENUESTRO OBJETIVO A ENCONTRAR
P16
PCR Y CH II
A quienes seleccionar
J.J.C.V.
PORTADOR
Debemos situar de manera segura a nuestra paciente en este esquema
antes de cualquier tratamiento
METAPLASIAS
HS
META
• DETECTAR LAS INFECCIONES PERSISTENTES PREDOMINATEMENTE POR VIRUS DE ALTO RIESGO
• DEFINICIÓN DE ALTO RIESGO– POR BIOLOGÍA MOLECULAR Y DATOS EPIDEMIOLÓGICOS.– CASOS CON Dx HISTOLÓGICO DE CÁNCER Y NIC
METODOS MOLECULARES
• PCR• CH2• OTROS
• Inmunohistoquímica: P16• L 1 DE Cápsula• otros
DEFINICION DE RIESGO
• Bajo: Pocas posibilidades, pero existentes de producir cáncer
• Alto: Mayores posibilidades de producir cáncer
• No es una definición absoluta.
INFECCION POR VPHDOS MODALIDADES
TRES ETAPAS
• PRODUCTIVA: L1 Y L2• TRANSFORMANTE: E6 (P53) Y E7 (gRb)
(ONCOGÉNICA)
• AMBAS EN TRES ETAPAS CLÍNICAS– PORTADOR SANO– INFECCIÓN SUBCLÍNICA– INFECCIÓN CLÍNICA
Donde está el Patólogo Clínico en el diagnóstico del VPH
Detección
Como riesgo
Enfermedad
Diagnóstico yCapacidad de progresión
Estudio citológico
Sensibilidad medianaEspecificidad alta
Colposcopía
Sensibilidad altaEspecificidad baja
Biopsia
Sensibilidad alta Especificidad mediana a alta
Clínico GinecólogoColposcopista
Colposcopía y Toma de muestras
AnatomopatólogoCitopatólogo
Interpretación y diagnóstico
Patólogo Clínico
¿ ?
Para que se usan las pruebas
DETECCION: Presencia de VPH como método primario de tamizaje antes de citología
CONFIRMACION DE DX
SEGUIMIENTO DESPUÉS DE TRATAMIENTO
CURIOSIDAD (POSITIVO EN LA PAREJA) USO EN HOMBRES (?) EN TEJIDOS FRESCO Y PARAFINA
Involucrados: Biólogos molecularesAnatomopatólogos Patólogos Clínicos, Químicos
Detección
• Estudio epidemiológico
• Factor de riesgo
• Seleccionar a quien realizar estudio citológico
• Preferentemente en mujeres de mas de 30 años
EVOLUCIÓN DE VIRUS PRESENTE A VIRUS TRANSFORMANTE
¿Quién fue primero mujer u hombre?
• La enfermedad es tan antigua como la humanidad
• PERO… se detectó apenas desde 1980 como infección
• En 1983 se le ligó como productor de Cáncer C.U.
• De ahí nació su importancia
HPV Prevalence and Cervical Cancer Incidence by Age
15-19
20-24
25-29
30-34
35-39
40-44
45-49
50-54
55-59
60-65
Age (Years)
HPV
Pre
vale
nce
(%) HPV (HC2)
Cancer
1. Sellors JW, et al. CMAJ, 2000;163:503. Ries, et al. 2000 SEER Cancer Stats NCI, 1973-1997. Sellors JW, et al. CMAJ, 2002;167:871.
0
5
10
15
20
25
30
0
5
10
15
20
25
30
Canc
er in
cide
nce
per 1
00,0
00
VIRUS FASE PRODUCTIVA (vegetativa o episomal)
• El virus es diagnosticable morfológicamente cuando tiene una fase proliferativa es decir un gran número de copias.
• Es cuando cambia la morfología celular , el núcleo crece y se lobula y es visible = Coilocitosis
• Existen estadios intermedios en donde hay virus con menos copias con cambios morfológicos inciertos ¡Coilocitosis Abortiva!.
Infección productiva HPV
¿Cómo se transforma una infección HPV en un carcinoma? Integración del ADN viral en el ADN
huésped
Adaptado de 1. Phelps y Alexander. Ann Intern Med. 1995;123:368–382. 2. Syrjänen y Syrjänen. Papillomavirus infections in human pathology. Wiley & Sons, Chichester; 2000. págs.11–46.
LCRE7
E6
E1L1
L2
E2
E4E5
Punto de rotura e integración
+
–
LCR E7E6 E1L1L2E2 E4 E5
ADN del VPH integradoAND huéspedADN huésped
E2
ADN episomal del VPH
La integración aumenta el riesgo de cáncer - I
PA
p53E6
Después de laintegración
Episomal
Asociación de E6 con p53 y PA
Efecto
• Expresión del gen E6 controlada por E2
• La expresión de E6 deja de estar controlada
• Bloqueo de la actividad de p53
• Resistencia a la apoptosis
• Aumento de la inestabilidad cromosómica
Syrjänen y Syrjänen. Papillomavirus infections in human pathology. Wiley & Sons, Chichester; 2000. págs.11–46.
Forma del VPH en la célula
E2F
pRBE7
Después de laintegración
Episomal
Libre
Forma del VPH en la célula Efecto
• Expresión del gen E7 controlada por E2
• La expresión de E7 deja de estar controlada
• Generación de múltiples cromosomas
• Inmortalización celular
• Oncogénesis
+
Syrjänen y Syrjänen. Papillomavirus infections in human pathology. Wiley & Sons, Chichester; 2000. págs.11–46.
La integración aumenta el riesgo de cáncer - II
PCR de punto final
• Replicación, y electroforesis con comparación de un “codigo de barras” contra controles ya establecidos.
• No es absoluta la comparación, similitud de un % decreciente– 95 % virus de alto riesgo– 89 % virus de bajo riesgo– 70 Virus de alto riesgo.
PCR de punto final
• El patrón y traducción para catalogar los virus en alto y bajo riesgo fue por aislamiento de VPH en casos de carcinoma y displasias y así saber si fueron o no oncogénicos.
• De nuevo el estándar fue la biopsia.• Es decir PCR es una evidencia indirecta de
la capacidad oncogénica y por lo tanto no es absoluta por si sola.
PCR de punto finalIndicaciones de uso
• Como un método de Dx epidemiológico.• Detecta desde portadores y enfermedad
transitoria hasta enfermos • No distingue fase productiva o
transformante• Selecciona a quienes vigilar de los 30 años
en adelante.
Método de captura de híbridos (HC2)
• DESNATURALIZACIÓN
• HIBRIDACIÓN CON SONDAS ARN DE ALTO Y BAJO RIESGO
• CAPTURA DEL HÍBRIDO ADN/ARN MEDIANTE ANTICUERPOS ANTI-ADN/ARN
• FIJACIÓN AL HÍBRIDO DE ANTICUERPOS ANTI-ADN/ARN MARCADOS CON FOSFATASA ALCALINA
• DETECCIÓN DE LA ENZIMA FIJADA MEDIANTE SUSTRATO QUIMIOLUMINISCENTE
• Hibridación ADN/ARN.• Cóctel de sondas:
- Alto riesgo: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68.
- Bajo riesgo: 6, 11, 42, 43 y 44.• Sensibilidad adecuada a procesos de
tamizaje de VPH (1 pg/mL).• Aprobado por la FDA.• Posibilidad de semicuantificar.• Estandarizada y automatizable.
(Poljak et al. J Clin Virol 2002; 25: S89-97.)
Detección del VPH mediante amplificación de la señal. Tecnología de captura de híbridos (HC2)
• LIMITACIONES:• Prueba dependiente del estado de conservación del DNA viral• La semicuantificación de la Carga Viral• No distingue los diferentes tipos virales• No detecta infecciones múltiples• Se dan reacciones cruzadas entre las sondas de alto riesgo y ciertos tipos
virales de bajo riesgo. La mayoría de las muestras discordantes HCII+ están relacionadas con un valor bajo de RLU y reactividad cruzada con genotipos de bajo riesgo
Detección del VPH mediante amplificación de la señal. Tecnología de captura de híbridos (HC2)
CAPTURA DE HIBRIDOS TRADUCCION CLINICA
• Al ser menos sensible a través de estudio se ha comprobado que detecta a los mas capaces de inducir neoplasia.
• Factor pronóstico de progresión.
• Aprobado por FDA.
CAPTURA DE HIBRIDOS TRADUCCION CLINICA
• Una prueba negativa de CH2 no significa que no se tenga virus
• El método ha sido estandarizado de manera que las unidades relativas de luz detectadas se compararon con la evolución a Ca Cu
• Se requiere un número relativamente elevado de copias para que sea oncogénico
• Por ello es que se requiere realizar la prueba cada 3 años
CAPTURA DE HIBRIDOS TRADUCCION CLINICA
• Toda mujer debería después de los 30 años realizarse cuando menos una vez la prueba
• Una mujer de mas de 60 años sin vida sexual y con CH2 podría hacerse su estudio dos veces mas cada 3 años y suspender estudios.
• Si hay Actividad sexual debe continuar con Citología cada 2 o 3 años de acuerdo al grado de riesgo
PRC en tiempo real
• El mismo método para subir la temperatura y desdoblar la cadena de DNA
• Ciclos con temperatura controlada con sustratos que emiten luz
• Medida a diferentes temperatura y diferentes colores para los tipos específicos de virus
• El proceso dura unas horas y se realiza en una termociclador programado que lee “EN TIEMPO INMEDIATO (REAL)” la progresión de la replicación viral.
PRC en tiempo realVentajas sobre PCR de punto final
• Detección segura del tipo viral: la lectura de la electroforesis es dependiente de la calidad de la electroforesis, en PCR TR esta dada por la temperatura de unión y el color en cada ciclo
• Detección de enfermedades mixtas (varios tipos virales) La PCR de punto final el tipo que predomina inhibe a los otros y no se detectan.
• Tiempo de proceso: el mismo día (se requieren cuando menos 16 muestras por corrida) PCR tradicional mínimo 10 días
• Costo: es semejante
CH2 y PCR tiempo real FUTURO
• Método de tamizaje• Es mas senisble que el estudio citológico (pero
es mas caro)• Si se realiza de manera simultánea obliga a
revisar la citología de manera mas minuciosa, evita falsos negativos sobre todo el LAG
• Detecta mas mujeres en riesgo sin enfermedad (CCV detecta solo las que tienen enfermedad)
En ASC US o H en México
• Es preferible hacer colposcopía y tomar biopsia.
• La psoitividad de PCR, CH2 no indica necesariamente enfermedad, puede ser metaplasia atípica o inmadura.
• En EU la colposcopía y la biopsia son mucho mas caras que una prueba de PCR o CH2.
• Si sale positiva en EU ya se manda a Colposcopía y biopsia.
CH2: 3.28
CH2 7.19
Recomendaciones de la sociedad Española de ETS
Metodologías
• Cultivo celular• Cultivos con inmunoquímica• Frotis con anticuerpos monoclonales• PCR
• Cultivos: Falso positivos y negativos, depende del estado de conservación de la muestra y el tiempo de la toma a el inicio del proceso en el laboratorio.
• Publicación del Hospital Universitario de Monterrey NL
• Las muestras con sangrado fueron positivas en el 50 %, cuando el población fue solo el 29%,
• La mustra se toma de endocérvix y sangra fácilmente.
Uso en ETS
• La metodología tradicional de Chlamydia y las variedades de Mycoplasma- Ureaplasma (4 variedades) es muy errática, hay falsos negativos y positivos
• Depende de la toma y conservación de la muestra.
• Es método de crecimiento del germen. Es intracelular, por lo mismo está generalmente en el endocérvix
PCR en TR
• La muestra es fijada en el mismo medio de CBL
• La replicación de DNA es 100% específica de cada organismo
• Es mas sensible que los métodos microbiológicos convencionales.
• No da sensibilidad a antibióticos
Conclusión
• PCR RT es una metodología que se está usando en forma alterna y asm segura que CH2 y PCR de punto final
• 1.- Detecta infecciones múltiples• 2.- El tipo viral detectados en el mas real• 3.- Mismo costo• 4.- Menos tiempo de proceso• 5.- En ETS es mas segura y con un costo similar a
los dos cultivos.