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Photosystème I, ferrédoxine et partenaires solubles
- Transferts d'électrons en biologie- Spectroscopie d'absorption cinétique- Photosystème I, ferrédoxine, partenaires solubles
Ferrédoxine-NADP+ oxydoréductase, nitrite réductase, hydrogénase :- présentation- transferts d’électron, mécanismes
Pierre SétifCEA SaclayDSV/iBiTec-S/SB2SMLaboratoire de Photocatalyse et Biohydrogène
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Interaction des orbitales électroniques impliquées dans le transfert est faible :les réactants D et A n'ont pas en commun d'atome ou de groupement chimique
("outer-sphere mechanism")
Réactions chimiques (enzymatiques ou non) :les réactants ont souvent en commun un atome ou un groupement chimique
("inner-sphere mechanism")
D + A D+ + A-
En biologie : Distances centre à centre : 8 - 25 Å Distances bord à bord : 3 - 20 Å ("outer-sphere mechanism")
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au sein d'une protéine
Puits de potentiel :densité de probabilité(orbitale moléculaire) :
énergie d'ionisation
dans le vide
D A
Les orbitales électroniques impliquées doivent se recouvrir
distance
transfert d'électron possible
Couplage électronique (faible) TDA
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éner
gie
pote
ntie
lle
xnoyaux (d, )
(D + A)
(D+ + A-)
Lorsque l'électron passe du donneur à l'accepteur, les noyaux ne changent pas de position
Approximation de Born-Oppenheimer,principe de Frank-Condon (transitions électroniques) : la transition est verticale
Conservation de l'énergie : la transition est horizontale
x0 (D, A)
x0 (D+, A-)
(D + A)(D+ + A-)
Tunneling de l’électron
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(D + A)
(D+ + A-)
énergie de réorganisation
Gactivation
Gactivation =(G ° + )2
4
G°
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(G° + )2
4 kBT-
4 kBT
1kTE = TDA
2 exp4 2 h
Constante de vitesse de transfert d'électron kTE (théorie semi-classique de Marcus)
couplage électronique énergie d'activation
terme nucléaire (facteur de Franck-Condon)
FC
Conditions de validité : - faible couplage électronique TDA entre donneur et accepteur (d > 6-7 Å, dbord à bord > 3-4 Å)- transfert d'électron couplé à des vibrations de faible énergie : h < kBT (traitement classique)
G° : différence d'énergie libre entre l’état final (D+ A-) et l’état initial (D A)
: énergie de réorganisation (toujours > 0, typiquement 0.5 à 1.5 eV)T : température; kB : cte de Boltzmann; h : cte de Planck
Marcus & Sutin (1985) Biochim. Biophys. Acta 811, 265-322
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région normale région inverse
((di,i)) = Cte G° < 0
(D + A)
(D+ + A-)
Gactiv.G°
(di,i)
Gactiv.= 0
log (kET)
- G°0
TDA = Cte
(G° + )2
4 kBT-
4 kBT
1 expFC =
Gactivation =(G ° + )2
4
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par rapport à WT
WT
P865* Bpha P865+ Bpha-
Haffa et al (2002) J. Phys. Chem. 106, 7376
membrane
(bactériophéophytine a)
(quinone)
Centre réactionnel bactérien (Rhodobacter sphaeroides)
0.3 eV
P865* (1er état singulet excité): réducteur très fort
Energie libre
P865* Bpha
P865+ Bpha-
P865 Bpha
1012 s-1 G° (WT) = -0.2 eV
108 s-1 G° (WT) = -1.2 eV h
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Mélange à l'équilibre D A D+ A- : modifications de propriétés spectroscopiques liées au transfert d'électron. Ex. : en RMN, système partiellement réduit. En régime de mélange rapide de raies "ox" et "red" (kTE > ox - red), on observe un élargissement éch des nouvelles raies résultantes éch, dû au principe d'incertitude ("lifetime broadening") : E/kTE = héch /kTE h d'où éch kTE
Méthodes de mesure des vitesses de transfert d'électrons
Transfert d'électron déclenché par une photoexcitation laser (spectroscopie d'absorption laser, RPE cinétique, spectroscopies vibrationnelles, ...):- systèmes photobiologiques naturels : centres réactionnels photosynthétiques, photodissociation d’un ligand (hème-CO), photolyase, ...- adjonction ou modification d'un cofacteur "coloré" pour le rendre photochimiquement actif (durée de vie assez longue d'un état excité du cofacteur) :
- complexes de Ruthénium adsorbés ou dans un complexe qui permet la liaison à la protéine.- porphyrines avec Zn ou Mg substitués à Fe.- flavines naturelles, associées à la protéine ou ajoutées dans le milieu.
Mélange rapide ("stopped flow") de D et A (mesure d'absorption) :- Lorsque la diffusion des partenaires est cinétiquement limitante, la vitesse observée correspond à la vitesse de formation du complexe. A concentrations élevées, on peut éventuellement atteindre un plateau qui, en l'absence d'une autre étape limitante, correspond au transfert d'électron.- Limitation cinétique ( > 1-2 ms).
Voltampérommétrie cyclique de protéines adsorbées sur l’électrode ou en solution (transfert direct ou non): mesures de courants catalytiques
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Lumière d’analyse
Excitation
t
I
00
I0
0 t
0
ΔA
ΔA = - log (I/I0)
détection/amplification/numérisation
Echantillon
Spectroscopie d’absorption par éclairs
Résolution temporelle quasi illimitée
Identification de la nature chimique des réactionsgrâce aux spectres d’absorption différentiels
Mesures entre 250 et 1500 nm (transitions électroniques)
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D'après Biochemistry & Molecular Biology of Plants (Buchanan/Gruissem/Jones)(American Society of Plant Physiologists)
ATP et NADPH : assimilation du CO2 en sucres (cycle de Calvin)
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photosystème I
cytochrome c6
(plastocyanine)
ferrédoxine(flavodoxine)
FX
FB
FA
A1 A'1
A0 A'0
P700
FB FA agrégats [4Fe-4S]
FX A1, A1' : phylloquinonesA0, A0' : chlorophylles a
P700 : dimère de chl. a
Transfert d'électron ( ) déclenché par la lumière : absorption par les chlorophylles, formation de l'état excité 1S de P700
h
-
< 500 ns
+-
< 10 ps
, puis séparation primaire de charges
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20 ps
P700+
/P700
Em (V) (ref.: H+ / H2 at pH 0)
P700+
/P700*
-1.2
-1.0
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0.0
0.2
0.4
A0, A'0
FX
FA
FB
1-3 ps
15 ns/200 ns
h (700 nm) = 1.77 eV
Fd
P700 : dimère de chlorophylles a A0, A'0 : chlorophylles aA1, A'1 : phylloquinones FX, FA and FB: agrégats 4Fe-4S
A1, A'1
FX
FB
FA
A1 A'1
A0 A'0
P700
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Jordan et al. (2001) Nature 411, 909
400 kDa
membrane
Photosystème I de la cyanobactérie Synechococcus elongatus : structure à 2.5 Å
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Jordan et al. (2001) Nature 411, 909
Vue perpendiculaire à la membrane: tous cofacteurs
chlorophylles :
transfert d'électron
transfert d'excitation ("antenne")
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Centres réactionnels photosynthétiques :
- les premières étapes de transfert productif (séparation initiale, stabilisation) se déroulent à l’optimum: - G° = . Il s’agit d’une exception en biologie
- les recombinaisons de charges (court-circuit) sont plus lentes que l’étape de transfert vers l’accepteur suivant: région inverse de Marcus (pour D+A- = P700+ Chla-)
Dans la plupart des réactions de transfert d’électron biologiques :
G° est de faible valeur absolue, est souvent négatif mais parfois positif : -0.3 eV< G°< 0.3 eV
0.7 à 1 eV : région « normale » de Marcus
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PSI + Fd PSI ... Fdkon
koff
PSI- + Fd PSI- ... Fd
k'on
k'off
PSI + Fd- PSI ... Fd-k''on
k''off
h h
ket1
Kd = koff/kon
ket2
ket = ket1 + ket2
t1/2 = ln(2)/ket
PSI = photosystème IFd = ferrédoxine
PSI- = (FA,FB)-
PSI + Fd PSI ... Fdkon
koff
PSI- + Fd PSI- ... Fd
k'on
k'off
PSI + Fd- PSI ... Fd-k''on
k''off
h h
ket1
Kd = koff/kon
ket2
ket = ket1 + ket2
t1/2 = ln(2)/ket
réactions de 1er ordre
éclair laser
Spectroscopie d'absorption cinétique pour étudier la réduction de la ferrédoxine par le photosystème I
Equilibre de liaison à l'obscurité :
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PSI + Fd PSI ... Fdkon
koff
PSI- + Fd PSI- ... Fd
k'on
k'off
PSI + Fd- PSI ... Fd-k''on
k''off
h h
ket1
Kd = koff/kon
ket2
ket = ket1 + ket2
t1/2 = ln(2)/ket
PSI = photosystème IFd = ferrédoxine
PSI- = (FA,FB)-
PSI + Fd PSI ... Fdkon
koff
PSI- + Fd PSI- ... Fd
k'on
k'off
PSI + Fd- PSI ... Fd-k''on
k''off
h h
ket1
Kd = koff/kon
ket2
ket = ket1 + ket2
t1/2 = ln(2)/ket
2ème ordre
éclair laser
Spectroscopie d'absorption cinétique pour étudier la réduction de la ferrédoxine par le photosystème I
Equilibre de liaison à l'obscurité :
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PSI + Fd PSI ... Fdkon
koff
PSI- + Fd PSI- ... Fd
k'on
k'off
PSI + Fd- PSI ... Fd-k''on
k''off
h h
ket1
Kd = koff/kon
ket2
ket = ket1 + ket2
t1/2 = ln(2)/ket
PSI + Fd PSI ... Fdkon
koff
PSI- + Fd PSI- ... Fd
k'on
k'off
PSI + Fd- PSI ... Fd-k''on
k''off
h h
ket1
Kd = koff/kon
ket2
ket = ket1 + ket2
t1/2 = ln(2)/ket
Equilibre de liaison à l'obscurité :
Spectroscopie d'absorption cinétique pour étudier la réduction de la ferrédoxine par le photosystème I
réactions de 1er ordre
2ème ordre
éclair laser
PSI = photosystème IFd = ferrédoxine
PSI- = (FA,FB)-
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Ferrédoxine (Fd) - Fd-
(FA,FB) - (FA,FB)-
(Fd, (FA,FB)-) - (Fd-, (FA,FB))
Synechocystis 6803 :3 phases de 1er ordre à pH 8.0 : < 1 µs, 20 µs et 100 µs à 21°C
0 200 400 600
-1.0
-0.5
0.0
chan
gem
ent d
'abs
orpt
ion
à 58
0 nm
(
104 )
cyanobactérie Synechocystis 6803
time (µs)0 100 200 300
-1.0
-0.5
0.0
algue verte Chlamydomonas reinhardtii
460 480 500 520 540 560 580 600
0
1
2
3
4
5
coef
f. d
'abs
orpt
ion
(mM
-1cm
-1)
longueur d'onde (nm)
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Ferrédoxine de cyanobactérie
Fukuyama et al. (1995) J. Biochem (Tokyo) 117, 1017
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Ferrédoxine de cyanobactérie
Fukuyama et al. (1995) J. Biochem (Tokyo) 117, 1017
résidus acides aspartique et acide glutamique : COO-
résidus basiques arginine, lysine et histidine: atomes N portant une charge >0
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membrane
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PsaE PsaC PsaD
membrane
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-2 -1 0 1 2
-2
-1
0
1
2
3
D98K
R39K
R39H
E109KD98SS37K
H95E
V48I/K51T/R52Q
K104C & R109C
K104A
K34T/S37KK34T
R39Q
K34D & K34E
R39D & R39E
I11V/T14K/Q15R
E103Q
log(
Kd
mut
ant/K
d W
T)
charge du PSI
diminution d'affinité
augmentation d'affinité
Mutations des 3 sous-unités périphériques PsaC, PsaD et PsaE
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PsaE PsaC PsaD
Les 3 sous-unités périphériques PsaC, PsaD et PsaE sont impliquées dans la liaison de la ferrédoxine
membrane
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photosystème I
cytochrome c6
(plastocyanine)
ferrédoxine-NADP+-réductase (FNR)
2 e-
ferrédoxine-thiorédoxine-
réductase (FTR)
2 e-
hydrogénase2 e-
nitrite réductasesulfite réductase
6 e-
glutamate synthase(GOGAT)
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Ferrédoxine-NADP+-oxydoréductase (FNR)
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Nitrite réductase
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Modèle d’une hydrogénase d’algue verte
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Ferrédoxine-NADP+ oxydoréductase (FNR)
Serre et al. (1996) J. Mol. Biol. 263, 20
2 Fd- + NADP+ + H+ 2 Fd + NADPH
FAD (flavine adénine dinucléotide)
2 Fd- + FAD + H+ 2 Fd + FADH-
FADH- + NADP+ FAD + NADPH
flavine adénine
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+
-
600 nm
FNR (ferrédoxine-NADP+-réductase)
580 nm
NiR (nitrite réductase)
: PSI seul
+
-
: PSI + Fd
+
FNR/NiR-: PSI + Fd + FNR/NiR
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0 2 4 6 80
1
2
3
abso
rptio
n ch
ange
at 6
30 n
m ( 1
04 )
time (ms)
Réduction à 1 électron de la FNR (sans NADP+)
Observation de la FNR seule à 630 nm
[FNR]
PSI.Fdred PSI + Fdred
koff
Fdred + FNRox Fdox + FNRsq
k1
k-1
kred = k1 [FNRtotale] kox = k-1 [Fdtotale]
Conditions de pseudo-1er ordre : [FNRtotale] >> [PSI] [Fdred] et [FNRox] [FNRtotale][Fdtotale] >> [PSI] [FNRsq] et [Fdox] [Fdtotale]
[ ][FNRsq](t) = kred [PSI-Fd-]t=0
- (kred + kox) t koff e
kred+kox- koff
- koff t- e
(kred+kox- koff)(kred+kox)+ +
1
kred+kox
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0 2 4 6 80
1
2
3
abso
rptio
n ch
ange
at 6
30 n
m ( 1
04 )
time (ms)
koff = 800 s-1
k1 = 4.1 108 M-1s-1
k-1 = 1.5 108 M-1s-1
PSI.Fdred PSI + Fdred
koff
Fdred + FNRox Fdox + FNRsq
k1
k-1
Cte d'équilibre rédox : Keq = k1/k-1 = 2.7
E0(Fdox/Fdred) - E0(FNRox/FNRsq) = (RT/F) ln(Keq) = 25 mV
E0(Fdox/Fdred) = -412 mV E0(FNRox/FNRsq) = -387 mV
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PSI + Fd PSI ... Fdkon
koff
PSI- + Fd PSI- ... Fd
k'on
k'off
PSI + Fd- PSI ... Fd-k''on
k''off
h h
ket1
Kd = koff/kon
ket2
ket = ket1 + ket2
t1/2 = ln(2)/ket
PSI + Fd PSI ... Fdkon
koff
PSI- + Fd PSI- ... Fd
k'on
k'off
PSI + Fd- PSI ... Fd-k''on
k''off
h h
ket1
Kd = koff/kon
ket2
ket = ket1 + ket2
t1/2 = ln(2)/ket
PSI = photosystème IFd = ferrédoxine
PSI- = (FA,FB)-
FB
FA
k'on = 3.5 108 M-1s-1
Kd = 0.45 µM = koff/kon
k'on < kon ou k"off > koff
k"off = 800 s-1
Kd k'on = 160 s-1
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ferrédoxine oxydée
ferrédoxine réduite
surf
ace
de F
d à
l'int
erfa
ce a
vec
les
part
enai
res
Morales et al. (1999) Biochemistry 38, 15764 Refined X-ray structures of the oxidized, at 1.3 Å, and reduced, at 1.17 Å, [2Fe-2S] ferredoxin from the cyanobacterium Anabaena PCC7119 show redox-linked conformational changes
Modèle proposé :
après sa réduction, le changement conformationel de la ferrédoxine favorise sa dissociation du photosystème I: k"off > koff
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0 10 20 30
0
2
4
time (ms)
k2/k1 = 1 0.25k2/k-2 20
E0(FNRox/FNRsq) (-387 mV) < E0(FNRsq/FNRred) ( -335 mV)
400 500 600 700 800
-2
0
2
4
wavelength (nm)
wavelength (nm)
abso
rptio
n ch
ange
( 1
04 )
400 500 600 700 800
-2
0
2
4
6
[PSI] = 2.0 µM[Fd] = 4.0 µM[FNR] = 0.8 µM
pas de NADP+
Fdredk1
Fdred
+
Fdox+FNRred
PSI:Fdred
koff
(8)
k-1
k2 k-2
FNRox+
Fdox+FNRsq
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étape 7 : transfert d’hydrure :
FADH- + NADP+ FAD + NADPH
2 Fdred 2 Fdox
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Swamy et al. (2005) Biochemistry 44, 16054
Nitrite réductase
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6 Fd- + NO2
- + 8 H+ 6 Fd + NH4+ + 2 H2O
agrégat 4Fe-4S hème
protéine
e-
NO2-
NH4+
90°Nitrite réductase
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hème
agrégat 4Fe-4S
ferrédoxine
nitriteréductase
Nitrite réductase
6 Fd- + NO2- + 8 H+ 6 Fd + NH4
+ + 2 H2O
Swamy et al. (2005) Biochemistry 44, 16054
ferrédoxine [2Fe-2S] : Em = -410 mV
agrégat [4Fe-4S] : Em = -370 mV sirohème : Em = -290 mV
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Cycle catalytique de la nitrite réductase
Kuznetsova et al. (2004) Biochemistry 43, 510
![Page 46: Photosystème I, ferrédoxine et partenaires solubles - Transferts d'électrons en biologie - Spectroscopie d'absorption cinétique - Photosystème I, ferrédoxine,](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062417/551d9d8e497959293b8c38eb/html5/thumbnails/46.jpg)
CF: piston; C, F: seringues; M: mélangeur; OC: cellule optique; I0: lumière incidenteI: lumière transmise
Kuznetsova et al. (2004) Biochemistry 43, 10765
Mélange rapide (stopped-flow) de 75 µM nitrite réductase et 25 mM NaNO2
cinétique à 563 nm : k = 0.45 s-1
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[Fd-] = 3 µM[PSI] = 3 µM[Fd] = 6 µM
0 1 2 3 4 5
chan
gem
ent d
'abs
orpt
ion
à 52
0 nm
temps (s)
pas de NiR [NiR] = 0.1 µM
réoxydation de Fd- par O2
réoxydation de Fd- par NiR (catalyse)
[NaNO2] = 1.5 mMRéoxydation de Fd- nitrite réductase (NiR)
Vitesse initiale : 160 Fd réoxydées par NiR et par s
La fixation de NO2- sur la NiR oxydée est beaucoup trop lente par rapport à cette vitesse.
Cc: cette réaction n'a pas lieu au cours de la catalyse. Différentes possibilités :
- NO2- se fixe beaucoup plus rapidement sur une forme réduite de NiR
- NO2- se fixe lors d'un échange avec la sortie du produit NH4
+, ...
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Modèle d’une hydrogénase à fer d’algue verte
D’après la structure de l’hydrogénase à fer de Clostridium pasteurianum. Peters et al. (1998) Science 282, 1853
2 Fd- + 2 H+ H2
2 Fd- + 2 H+ 2 Fd + H+ + H-
H+ + H- H2
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centre fer-soufre
cystéine pontante
centre di-fer
centre di-fer
COCN
Cluster H
H2H+
H-
Hydrogénase à fer
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0.0 0.5 1.0 1.5
-4
-2
0
2
4
abso
rpti
on c
hang
es (x
104 )
time (s)
+
-
[PSI] = 2 µM
photosystème I
540 nm
La contribution de P700+ (charge positive) est soustraite
![Page 51: Photosystème I, ferrédoxine et partenaires solubles - Transferts d'électrons en biologie - Spectroscopie d'absorption cinétique - Photosystème I, ferrédoxine,](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062417/551d9d8e497959293b8c38eb/html5/thumbnails/51.jpg)
0.0 0.5 1.0 1.5
-4
-2
0
2
4
abso
rpti
on c
hang
es (x
104 )
time (s)
+
-+
-
[PSI] = 2 µM[Fd] = 4 µM
photosystème I/ferrédoxine
540 nm
La contribution de P700+ (charge positive) est soustraite
![Page 52: Photosystème I, ferrédoxine et partenaires solubles - Transferts d'électrons en biologie - Spectroscopie d'absorption cinétique - Photosystème I, ferrédoxine,](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062417/551d9d8e497959293b8c38eb/html5/thumbnails/52.jpg)
0.0 0.5 1.0 1.5
-4
-2
0
2
4
abso
rpti
on c
hang
es (x
104 )
time (s)
+ +
-?photosystème I/ferrédoxine/hydrogénase
[PSI] = 2 µM[Fd] = 4 µM[HydA1] ≤ 0.16 µM
540 nm
La contribution de P700+ (charge positive) est soustraite
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0.0 0.5 1.0 1.5
-4
-2
0
2
4
abso
rpti
on c
hang
es (x
104 )
time (s)
540 nm
-(d[Fdred]/dt)t = 0
[HydA1]Initial rate of reoxidation of Fdred per HydA1 =
[HydA1] = 0.16 µM :
t = 0: 73 Fdred reoxidized per HydA1 per s
[HydA1] = 0.32 µM :
t = 0: 52 Fdred reoxidized per HydA1 per s
-(d[Fdred]/dt)t = 0 = k [Fdred]t=0 = k [PSI] (exponential phase)
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- Réduction de la ferrédoxine : cinétiques et site de fixation sur le photosystème I :
Rufat Agalarov, Patrick Barth, Jonathan Hanley Nicolas Fischer/Jean-David RochaixBernard Lagoutte, Hervé Bottin
- Ferrédoxine-NADP+-réductase et nitrite réductaseSonya Kuznetsova, Nicolas Cassan David KnaffBernard Lagoutte Masakasu Hirasawa
- HydrogénaseTatiana Kuznetsova, Kateryna SybirnaHervé Bottin