photosystème i, ferrédoxine et partenaires solubles - transferts d'électrons en biologie -...
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Photosystème I, ferrédoxine et partenaires solubles
- Transferts d'électrons en biologie- Spectroscopie d'absorption cinétique- Photosystème I, ferrédoxine, partenaires solubles
Ferrédoxine-NADP+ oxydoréductase, nitrite réductase, hydrogénase :- présentation- transferts d’électron, mécanismes
Pierre SétifCEA SaclayDSV/iBiTec-S/SB2SMLaboratoire de Photocatalyse et Biohydrogène
Interaction des orbitales électroniques impliquées dans le transfert est faible :les réactants D et A n'ont pas en commun d'atome ou de groupement chimique
("outer-sphere mechanism")
Réactions chimiques (enzymatiques ou non) :les réactants ont souvent en commun un atome ou un groupement chimique
("inner-sphere mechanism")
D + A D+ + A-
En biologie : Distances centre à centre : 8 - 25 Å Distances bord à bord : 3 - 20 Å ("outer-sphere mechanism")
au sein d'une protéine
Puits de potentiel :densité de probabilité(orbitale moléculaire) :
énergie d'ionisation
dans le vide
D A
Les orbitales électroniques impliquées doivent se recouvrir
distance
transfert d'électron possible
Couplage électronique (faible) TDA
éner
gie
pote
ntie
lle
xnoyaux (d, )
(D + A)
(D+ + A-)
Lorsque l'électron passe du donneur à l'accepteur, les noyaux ne changent pas de position
Approximation de Born-Oppenheimer,principe de Frank-Condon (transitions électroniques) : la transition est verticale
Conservation de l'énergie : la transition est horizontale
x0 (D, A)
x0 (D+, A-)
(D + A)(D+ + A-)
Tunneling de l’électron
(D + A)
(D+ + A-)
énergie de réorganisation
Gactivation
Gactivation =(G ° + )2
4
G°
(G° + )2
4 kBT-
4 kBT
1kTE = TDA
2 exp4 2 h
Constante de vitesse de transfert d'électron kTE (théorie semi-classique de Marcus)
couplage électronique énergie d'activation
terme nucléaire (facteur de Franck-Condon)
FC
Conditions de validité : - faible couplage électronique TDA entre donneur et accepteur (d > 6-7 Å, dbord à bord > 3-4 Å)- transfert d'électron couplé à des vibrations de faible énergie : h < kBT (traitement classique)
G° : différence d'énergie libre entre l’état final (D+ A-) et l’état initial (D A)
: énergie de réorganisation (toujours > 0, typiquement 0.5 à 1.5 eV)T : température; kB : cte de Boltzmann; h : cte de Planck
Marcus & Sutin (1985) Biochim. Biophys. Acta 811, 265-322
région normale région inverse
((di,i)) = Cte G° < 0
(D + A)
(D+ + A-)
Gactiv.G°
(di,i)
Gactiv.= 0
log (kET)
- G°0
TDA = Cte
(G° + )2
4 kBT-
4 kBT
1 expFC =
Gactivation =(G ° + )2
4
par rapport à WT
WT
P865* Bpha P865+ Bpha-
Haffa et al (2002) J. Phys. Chem. 106, 7376
membrane
(bactériophéophytine a)
(quinone)
Centre réactionnel bactérien (Rhodobacter sphaeroides)
0.3 eV
P865* (1er état singulet excité): réducteur très fort
Energie libre
P865* Bpha
P865+ Bpha-
P865 Bpha
1012 s-1 G° (WT) = -0.2 eV
108 s-1 G° (WT) = -1.2 eV h
Mélange à l'équilibre D A D+ A- : modifications de propriétés spectroscopiques liées au transfert d'électron. Ex. : en RMN, système partiellement réduit. En régime de mélange rapide de raies "ox" et "red" (kTE > ox - red), on observe un élargissement éch des nouvelles raies résultantes éch, dû au principe d'incertitude ("lifetime broadening") : E/kTE = héch /kTE h d'où éch kTE
Méthodes de mesure des vitesses de transfert d'électrons
Transfert d'électron déclenché par une photoexcitation laser (spectroscopie d'absorption laser, RPE cinétique, spectroscopies vibrationnelles, ...):- systèmes photobiologiques naturels : centres réactionnels photosynthétiques, photodissociation d’un ligand (hème-CO), photolyase, ...- adjonction ou modification d'un cofacteur "coloré" pour le rendre photochimiquement actif (durée de vie assez longue d'un état excité du cofacteur) :
- complexes de Ruthénium adsorbés ou dans un complexe qui permet la liaison à la protéine.- porphyrines avec Zn ou Mg substitués à Fe.- flavines naturelles, associées à la protéine ou ajoutées dans le milieu.
Mélange rapide ("stopped flow") de D et A (mesure d'absorption) :- Lorsque la diffusion des partenaires est cinétiquement limitante, la vitesse observée correspond à la vitesse de formation du complexe. A concentrations élevées, on peut éventuellement atteindre un plateau qui, en l'absence d'une autre étape limitante, correspond au transfert d'électron.- Limitation cinétique ( > 1-2 ms).
Voltampérommétrie cyclique de protéines adsorbées sur l’électrode ou en solution (transfert direct ou non): mesures de courants catalytiques
Lumière d’analyse
Excitation
t
I
00
I0
0 t
0
ΔA
ΔA = - log (I/I0)
détection/amplification/numérisation
Echantillon
Spectroscopie d’absorption par éclairs
Résolution temporelle quasi illimitée
Identification de la nature chimique des réactionsgrâce aux spectres d’absorption différentiels
Mesures entre 250 et 1500 nm (transitions électroniques)
D'après Biochemistry & Molecular Biology of Plants (Buchanan/Gruissem/Jones)(American Society of Plant Physiologists)
ATP et NADPH : assimilation du CO2 en sucres (cycle de Calvin)
photosystème I
cytochrome c6
(plastocyanine)
ferrédoxine(flavodoxine)
FX
FB
FA
A1 A'1
A0 A'0
P700
FB FA agrégats [4Fe-4S]
FX A1, A1' : phylloquinonesA0, A0' : chlorophylles a
P700 : dimère de chl. a
Transfert d'électron ( ) déclenché par la lumière : absorption par les chlorophylles, formation de l'état excité 1S de P700
h
-
< 500 ns
+-
< 10 ps
, puis séparation primaire de charges
20 ps
P700+
/P700
Em (V) (ref.: H+ / H2 at pH 0)
P700+
/P700*
-1.2
-1.0
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0.0
0.2
0.4
A0, A'0
FX
FA
FB
1-3 ps
15 ns/200 ns
h (700 nm) = 1.77 eV
Fd
P700 : dimère de chlorophylles a A0, A'0 : chlorophylles aA1, A'1 : phylloquinones FX, FA and FB: agrégats 4Fe-4S
A1, A'1
FX
FB
FA
A1 A'1
A0 A'0
P700
Jordan et al. (2001) Nature 411, 909
400 kDa
membrane
Photosystème I de la cyanobactérie Synechococcus elongatus : structure à 2.5 Å
Jordan et al. (2001) Nature 411, 909
Vue perpendiculaire à la membrane: tous cofacteurs
chlorophylles :
transfert d'électron
transfert d'excitation ("antenne")
Centres réactionnels photosynthétiques :
- les premières étapes de transfert productif (séparation initiale, stabilisation) se déroulent à l’optimum: - G° = . Il s’agit d’une exception en biologie
- les recombinaisons de charges (court-circuit) sont plus lentes que l’étape de transfert vers l’accepteur suivant: région inverse de Marcus (pour D+A- = P700+ Chla-)
Dans la plupart des réactions de transfert d’électron biologiques :
G° est de faible valeur absolue, est souvent négatif mais parfois positif : -0.3 eV< G°< 0.3 eV
0.7 à 1 eV : région « normale » de Marcus
PSI + Fd PSI ... Fdkon
koff
PSI- + Fd PSI- ... Fd
k'on
k'off
PSI + Fd- PSI ... Fd-k''on
k''off
h h
ket1
Kd = koff/kon
ket2
ket = ket1 + ket2
t1/2 = ln(2)/ket
PSI = photosystème IFd = ferrédoxine
PSI- = (FA,FB)-
PSI + Fd PSI ... Fdkon
koff
PSI- + Fd PSI- ... Fd
k'on
k'off
PSI + Fd- PSI ... Fd-k''on
k''off
h h
ket1
Kd = koff/kon
ket2
ket = ket1 + ket2
t1/2 = ln(2)/ket
réactions de 1er ordre
éclair laser
Spectroscopie d'absorption cinétique pour étudier la réduction de la ferrédoxine par le photosystème I
Equilibre de liaison à l'obscurité :
PSI + Fd PSI ... Fdkon
koff
PSI- + Fd PSI- ... Fd
k'on
k'off
PSI + Fd- PSI ... Fd-k''on
k''off
h h
ket1
Kd = koff/kon
ket2
ket = ket1 + ket2
t1/2 = ln(2)/ket
PSI = photosystème IFd = ferrédoxine
PSI- = (FA,FB)-
PSI + Fd PSI ... Fdkon
koff
PSI- + Fd PSI- ... Fd
k'on
k'off
PSI + Fd- PSI ... Fd-k''on
k''off
h h
ket1
Kd = koff/kon
ket2
ket = ket1 + ket2
t1/2 = ln(2)/ket
2ème ordre
éclair laser
Spectroscopie d'absorption cinétique pour étudier la réduction de la ferrédoxine par le photosystème I
Equilibre de liaison à l'obscurité :
PSI + Fd PSI ... Fdkon
koff
PSI- + Fd PSI- ... Fd
k'on
k'off
PSI + Fd- PSI ... Fd-k''on
k''off
h h
ket1
Kd = koff/kon
ket2
ket = ket1 + ket2
t1/2 = ln(2)/ket
PSI + Fd PSI ... Fdkon
koff
PSI- + Fd PSI- ... Fd
k'on
k'off
PSI + Fd- PSI ... Fd-k''on
k''off
h h
ket1
Kd = koff/kon
ket2
ket = ket1 + ket2
t1/2 = ln(2)/ket
Equilibre de liaison à l'obscurité :
Spectroscopie d'absorption cinétique pour étudier la réduction de la ferrédoxine par le photosystème I
réactions de 1er ordre
2ème ordre
éclair laser
PSI = photosystème IFd = ferrédoxine
PSI- = (FA,FB)-
Ferrédoxine (Fd) - Fd-
(FA,FB) - (FA,FB)-
(Fd, (FA,FB)-) - (Fd-, (FA,FB))
Synechocystis 6803 :3 phases de 1er ordre à pH 8.0 : < 1 µs, 20 µs et 100 µs à 21°C
0 200 400 600
-1.0
-0.5
0.0
chan
gem
ent d
'abs
orpt
ion
à 58
0 nm
(
104 )
cyanobactérie Synechocystis 6803
time (µs)0 100 200 300
-1.0
-0.5
0.0
algue verte Chlamydomonas reinhardtii
460 480 500 520 540 560 580 600
0
1
2
3
4
5
coef
f. d
'abs
orpt
ion
(mM
-1cm
-1)
longueur d'onde (nm)
Ferrédoxine de cyanobactérie
Fukuyama et al. (1995) J. Biochem (Tokyo) 117, 1017
Ferrédoxine de cyanobactérie
Fukuyama et al. (1995) J. Biochem (Tokyo) 117, 1017
résidus acides aspartique et acide glutamique : COO-
résidus basiques arginine, lysine et histidine: atomes N portant une charge >0
membrane
PsaE PsaC PsaD
membrane
-2 -1 0 1 2
-2
-1
0
1
2
3
D98K
R39K
R39H
E109KD98SS37K
H95E
V48I/K51T/R52Q
K104C & R109C
K104A
K34T/S37KK34T
R39Q
K34D & K34E
R39D & R39E
I11V/T14K/Q15R
E103Q
log(
Kd
mut
ant/K
d W
T)
charge du PSI
diminution d'affinité
augmentation d'affinité
Mutations des 3 sous-unités périphériques PsaC, PsaD et PsaE
PsaE PsaC PsaD
Les 3 sous-unités périphériques PsaC, PsaD et PsaE sont impliquées dans la liaison de la ferrédoxine
membrane
photosystème I
cytochrome c6
(plastocyanine)
ferrédoxine-NADP+-réductase (FNR)
2 e-
ferrédoxine-thiorédoxine-
réductase (FTR)
2 e-
hydrogénase2 e-
nitrite réductasesulfite réductase
6 e-
glutamate synthase(GOGAT)
Ferrédoxine-NADP+-oxydoréductase (FNR)
Nitrite réductase
Modèle d’une hydrogénase d’algue verte
Ferrédoxine-NADP+ oxydoréductase (FNR)
Serre et al. (1996) J. Mol. Biol. 263, 20
2 Fd- + NADP+ + H+ 2 Fd + NADPH
FAD (flavine adénine dinucléotide)
2 Fd- + FAD + H+ 2 Fd + FADH-
FADH- + NADP+ FAD + NADPH
flavine adénine
+
-
600 nm
FNR (ferrédoxine-NADP+-réductase)
580 nm
NiR (nitrite réductase)
: PSI seul
+
-
: PSI + Fd
+
FNR/NiR-: PSI + Fd + FNR/NiR
0 2 4 6 80
1
2
3
abso
rptio
n ch
ange
at 6
30 n
m ( 1
04 )
time (ms)
Réduction à 1 électron de la FNR (sans NADP+)
Observation de la FNR seule à 630 nm
[FNR]
PSI.Fdred PSI + Fdred
koff
Fdred + FNRox Fdox + FNRsq
k1
k-1
kred = k1 [FNRtotale] kox = k-1 [Fdtotale]
Conditions de pseudo-1er ordre : [FNRtotale] >> [PSI] [Fdred] et [FNRox] [FNRtotale][Fdtotale] >> [PSI] [FNRsq] et [Fdox] [Fdtotale]
[ ][FNRsq](t) = kred [PSI-Fd-]t=0
- (kred + kox) t koff e
kred+kox- koff
- koff t- e
(kred+kox- koff)(kred+kox)+ +
1
kred+kox
0 2 4 6 80
1
2
3
abso
rptio
n ch
ange
at 6
30 n
m ( 1
04 )
time (ms)
koff = 800 s-1
k1 = 4.1 108 M-1s-1
k-1 = 1.5 108 M-1s-1
PSI.Fdred PSI + Fdred
koff
Fdred + FNRox Fdox + FNRsq
k1
k-1
Cte d'équilibre rédox : Keq = k1/k-1 = 2.7
E0(Fdox/Fdred) - E0(FNRox/FNRsq) = (RT/F) ln(Keq) = 25 mV
E0(Fdox/Fdred) = -412 mV E0(FNRox/FNRsq) = -387 mV
PSI + Fd PSI ... Fdkon
koff
PSI- + Fd PSI- ... Fd
k'on
k'off
PSI + Fd- PSI ... Fd-k''on
k''off
h h
ket1
Kd = koff/kon
ket2
ket = ket1 + ket2
t1/2 = ln(2)/ket
PSI + Fd PSI ... Fdkon
koff
PSI- + Fd PSI- ... Fd
k'on
k'off
PSI + Fd- PSI ... Fd-k''on
k''off
h h
ket1
Kd = koff/kon
ket2
ket = ket1 + ket2
t1/2 = ln(2)/ket
PSI = photosystème IFd = ferrédoxine
PSI- = (FA,FB)-
FB
FA
k'on = 3.5 108 M-1s-1
Kd = 0.45 µM = koff/kon
k'on < kon ou k"off > koff
k"off = 800 s-1
Kd k'on = 160 s-1
ferrédoxine oxydée
ferrédoxine réduite
surf
ace
de F
d à
l'int
erfa
ce a
vec
les
part
enai
res
Morales et al. (1999) Biochemistry 38, 15764 Refined X-ray structures of the oxidized, at 1.3 Å, and reduced, at 1.17 Å, [2Fe-2S] ferredoxin from the cyanobacterium Anabaena PCC7119 show redox-linked conformational changes
Modèle proposé :
après sa réduction, le changement conformationel de la ferrédoxine favorise sa dissociation du photosystème I: k"off > koff
0 10 20 30
0
2
4
time (ms)
k2/k1 = 1 0.25k2/k-2 20
E0(FNRox/FNRsq) (-387 mV) < E0(FNRsq/FNRred) ( -335 mV)
400 500 600 700 800
-2
0
2
4
wavelength (nm)
wavelength (nm)
abso
rptio
n ch
ange
( 1
04 )
400 500 600 700 800
-2
0
2
4
6
[PSI] = 2.0 µM[Fd] = 4.0 µM[FNR] = 0.8 µM
pas de NADP+
Fdredk1
Fdred
+
Fdox+FNRred
PSI:Fdred
koff
(8)
k-1
k2 k-2
FNRox+
Fdox+FNRsq
étape 7 : transfert d’hydrure :
FADH- + NADP+ FAD + NADPH
2 Fdred 2 Fdox
Swamy et al. (2005) Biochemistry 44, 16054
Nitrite réductase
6 Fd- + NO2
- + 8 H+ 6 Fd + NH4+ + 2 H2O
agrégat 4Fe-4S hème
protéine
e-
NO2-
NH4+
90°Nitrite réductase
hème
agrégat 4Fe-4S
ferrédoxine
nitriteréductase
Nitrite réductase
6 Fd- + NO2- + 8 H+ 6 Fd + NH4
+ + 2 H2O
Swamy et al. (2005) Biochemistry 44, 16054
ferrédoxine [2Fe-2S] : Em = -410 mV
agrégat [4Fe-4S] : Em = -370 mV sirohème : Em = -290 mV
Cycle catalytique de la nitrite réductase
Kuznetsova et al. (2004) Biochemistry 43, 510
CF: piston; C, F: seringues; M: mélangeur; OC: cellule optique; I0: lumière incidenteI: lumière transmise
Kuznetsova et al. (2004) Biochemistry 43, 10765
Mélange rapide (stopped-flow) de 75 µM nitrite réductase et 25 mM NaNO2
cinétique à 563 nm : k = 0.45 s-1
[Fd-] = 3 µM[PSI] = 3 µM[Fd] = 6 µM
0 1 2 3 4 5
chan
gem
ent d
'abs
orpt
ion
à 52
0 nm
temps (s)
pas de NiR [NiR] = 0.1 µM
réoxydation de Fd- par O2
réoxydation de Fd- par NiR (catalyse)
[NaNO2] = 1.5 mMRéoxydation de Fd- nitrite réductase (NiR)
Vitesse initiale : 160 Fd réoxydées par NiR et par s
La fixation de NO2- sur la NiR oxydée est beaucoup trop lente par rapport à cette vitesse.
Cc: cette réaction n'a pas lieu au cours de la catalyse. Différentes possibilités :
- NO2- se fixe beaucoup plus rapidement sur une forme réduite de NiR
- NO2- se fixe lors d'un échange avec la sortie du produit NH4
+, ...
Modèle d’une hydrogénase à fer d’algue verte
D’après la structure de l’hydrogénase à fer de Clostridium pasteurianum. Peters et al. (1998) Science 282, 1853
2 Fd- + 2 H+ H2
2 Fd- + 2 H+ 2 Fd + H+ + H-
H+ + H- H2
centre fer-soufre
cystéine pontante
centre di-fer
centre di-fer
COCN
Cluster H
H2H+
H-
Hydrogénase à fer
0.0 0.5 1.0 1.5
-4
-2
0
2
4
abso
rpti
on c
hang
es (x
104 )
time (s)
+
-
[PSI] = 2 µM
photosystème I
540 nm
La contribution de P700+ (charge positive) est soustraite
0.0 0.5 1.0 1.5
-4
-2
0
2
4
abso
rpti
on c
hang
es (x
104 )
time (s)
+
-+
-
[PSI] = 2 µM[Fd] = 4 µM
photosystème I/ferrédoxine
540 nm
La contribution de P700+ (charge positive) est soustraite
0.0 0.5 1.0 1.5
-4
-2
0
2
4
abso
rpti
on c
hang
es (x
104 )
time (s)
+ +
-?photosystème I/ferrédoxine/hydrogénase
[PSI] = 2 µM[Fd] = 4 µM[HydA1] ≤ 0.16 µM
540 nm
La contribution de P700+ (charge positive) est soustraite
0.0 0.5 1.0 1.5
-4
-2
0
2
4
abso
rpti
on c
hang
es (x
104 )
time (s)
540 nm
-(d[Fdred]/dt)t = 0
[HydA1]Initial rate of reoxidation of Fdred per HydA1 =
[HydA1] = 0.16 µM :
t = 0: 73 Fdred reoxidized per HydA1 per s
[HydA1] = 0.32 µM :
t = 0: 52 Fdred reoxidized per HydA1 per s
-(d[Fdred]/dt)t = 0 = k [Fdred]t=0 = k [PSI] (exponential phase)
- Réduction de la ferrédoxine : cinétiques et site de fixation sur le photosystème I :
Rufat Agalarov, Patrick Barth, Jonathan Hanley Nicolas Fischer/Jean-David RochaixBernard Lagoutte, Hervé Bottin
- Ferrédoxine-NADP+-réductase et nitrite réductaseSonya Kuznetsova, Nicolas Cassan David KnaffBernard Lagoutte Masakasu Hirasawa
- HydrogénaseTatiana Kuznetsova, Kateryna SybirnaHervé Bottin