Prolonger votre offre de soins, jour après jour
Prolonger votre offre de soins, jour après jour
Séparation magnétique des
plasmocytes
dans le cadre des myélomes multiplesElodie DAVIDEquipe Onco-hématologie en cytogénétique
Prolonger votre offre de soins, jour après jour
Sommaire
1. Le Myélome Multiple : Définition
4. Les outils de séparation : Différents appareils
3. La séparation magnétique : Principe
2. La purification des plasmocytes : Pourquoi ?
Prolonger votre offre de soins, jour après jour
1. Le Myélome Multiple Définition :prolifération maligne d’un clone plasmocytaire produisant de manière inadaptée et exagérée une immunoglobuline ou l’un de ses fragments
3 stades (classification de Durie et Salmon) :
Plasmocytes matures
Stade I
Plasmocytes immatures
Cytoplasme important
Stade II
PlasmoblastesFormation d’agrégats
Stade III
Prolonger votre offre de soins, jour après jour
Incidence:-Augmente avec l’âge-Légèrement plus fréquent chez l’homme que chez la femme-Moyenne d’âge de 64 ans
Diagnostic :-Mise en évidence d’une gammapathie monoclonale sérique et/ou urinaire-Mise en évidence d’une prolifération plasmocytaire médullaire
Signes cliniques:-Lésions osseuses-Hypercalcémie-Anémie-Insuffisance rénale…
1. Le Myélome Multiple
Prolonger votre offre de soins, jour après jour
Anomalies cytogénétiques :
- Hyperdiploïdie : 48-74 chromosomes : +3, +9, +15, +19…
- Hypodiploïdie
- t(4;14)
- Délétion totale ou partielle des chromosomes 13 et 17
1. Le Myélome Multiple
Valeur pronostique permettant un traitement adapté
sans anomalies de structure associées
Cytogénétique conventionnelle : vue d’ensemble du caryotype hyperdiploïdie
Diagnostic et suivi :
Cytogénétique moléculaire : plus précis et sensible anomalies fines comme t(4;14), del(13),
del(17)
ET
Prolonger votre offre de soins, jour après jour
2. Pourquoi une purification des plasmocytes?
Tri magnétique des plasmocytes avec étude des chromosomes 4, 14, 13 et 17
Etude du Myélome Multiple = étude des plasmocytes
Plasmocytes dilués dans la masse cellulaire
Prolonger votre offre de soins, jour après jour
3. Séparation magnétique des plasmocytes
Plasmocytes = CD138+
1. Marquage spécifique des plasmocytes : Ac anti-CD138 couplé à une bille magnétique
2. Tri sur colonne magnétique
3. Création d’un champ magnétique
4. Récupération des plasmocytes en cassant le champ magnétique
Principe :
3 appareils (Miltenyi) : - VarioMACS
- AutoMACS- AutoMACS Pro
Prolonger votre offre de soins, jour après jour
3. Séparation magnétique des plasmocytes VarioMACS et AutoMACS
Réalisation d’un ficoll
Récupération des globules blancs au niveau de l’anneau
Filtration de la moelle totale
Lavage
Marquage spécifique des plasmocytes : Ac anti-CD138 couplé à une bille magnétique
Passage de l’échantillon dans une colonne de billes magnétiquesCréation d’un champ magnétiqueRécupération de la fraction négativeCassure du champ magnétiqueRécupération fraction positive
1
3
4
6
7
5
Plasma
Cellules
mononucléesFicoll
Polynucléaires et
globules rouges
2
Lavage
Prolonger votre offre de soins, jour après jour
3. Séparation magnétique des plasmocytes VarioMACS et AutoMACS
Perte cellulaire dans le ficoll :
Utilisation de l’AutoMACS Pro
Colonnes et valves souvent saturées
Technique lourde (temps)
- agrégations protéique et plasmocytaire
- cellules de tailles différentes
I II III
Prolonger votre offre de soins, jour après jour
AutoMACS Pro
3. Séparation magnétique des plasmocytes
Sélection du programme
Tri magnétique sur AutoMacs Pro3 tubes : échantillon, fraction négative et positive
Après cassure du champ magnétique, récupération fraction positive
Après technique, 3 lames étalées :t(4;14),13 et 17
Filtration de la moelle totale
Lavage
Marquage spécifique des plasmocytes : Ac anti-CD138 couplé à une bille magnétique
1
3
4
2 Lavage
5
6
7
8
Prolonger votre offre de soins, jour après jour
AutoMACS Pro
3. Séparation magnétique des plasmocytes
Adaptation du programme de séparation
Travail sur moelle totale : Ac anti-CD138 plus concentrés
rendement augmenté (>86% : panel FISH complet)
automate moins saturé, maintenance adaptée
Tampons plus agressifs et filtres 40 µm
pureté augmentée (<5% d’échec de purification)
Automatisation
Gain de temps
Prolonger votre offre de soins, jour après jour
CONCLUSION
routine dans les bilans de myélome multiple
si nécessaire préférée à la mise en culture
support pour les études pangénomiques
Séparation magnétique :
Prolonger votre offre de soins, jour après jour
Remerciements
L’équipe d’onco-hématologie en cytogénétique, CERBA
L’équipe de FISH, CERBA
Hossain MOSSAFA, cytogénéticien à CERBA
MILTENYI
Prolonger votre offre de soins, jour après jour
Annexe 1 : Classification de Durie et Salmon
http://med2.pagesperso-orange.fr/import/CANCERO/CLASSIFICATION/MYELOME.htm
Prolonger votre offre de soins, jour après jour
4p13 : fluorochrome rouge 14q32 : fluorochrome vert
t(4;14)(p13;q32)
del(17)(p11)
Bandes R
del(13)(q14q21)Bandes G
Annexe 2 : quelques anomalies cytogénétiques
Prolonger votre offre de soins, jour après jour
1er test 2007 : Programme Possel-D avec utilisation uniforme de 50µL d’Ac anti-CD138
PatientBone
Marrow (ml)
Total WBC
% Plasma
cells slide
Theoric Total
plasma cells
MicroBea
ds
Control Purity by flow cytometry
Obtened Total
Labeled P cell
Performance
07D0570753 4.8 mL
3.3*10^6 c/mL
36% 50 µL 94,60% 5.3*10^5
60% 6.5*10^6 8,15%07D0572
733 6.2 mL5.8*10^6 c/mL
8% 50 µL 93,4 5.6*10^5
72.7% 2.6*10^7 2,15%
07D0566314 4.3 mL
4.1*10^6 c/mL
5% 50 µL 68,40%
10.9*10^4
59.3% 1*10^7 1,10%
07D0577164 5.8 mL
5.6*10^6 c/mL
4% 50 µL 72,80% 1.7*10^5
1% 3.2*10^5 53,13%
07D0583892 3 mL
4*10^6 c/mL
22% 50 µL 88,40% 2.5*10^5
15% 1.8*10^6 13,90%
07D0583530 5.3 mL
8.4*10^6 c/mL
0% 50 µL 65,50% 5.2*10^4
5% 2.2*10^6 2,36%
07D0587071 2.7 mL
3*10^6 c/mL
15% 50 µL 88,70% 1.8*10^5
12% 9.7*10^5 19%
07D0606916 6.1 mL
7.7*10^6 c/mL
3% 50 µL 31% 7.4*10^4
1% 4.7*10^5 15,70%
07D0609147 6.8 mL
1.1*10^6 c/mL
60% 50 µL 54,10% 1.5*10^5
5% 3.7*10^5 40,50%
07D0609191 6.3 mL
1.6*10^7 c/mL
8% 50 µL 65,50% 1.8*10^5
1% 10^6 18,00%
% of plasma cells reported by cytologist
% and total plasma cells number determined by flow cytometry labelled by CD138/CD38
Annexe 3 : mise en place d’un nouveau protocole
Mauvais rendement : adaptation
de la quantité d’Ac
: 50µL Ac pour 107 cellules
Prolonger votre offre de soins, jour après jour
Annexe 4 : Comparaison des programmes de séparation
Pas assez de noyaux pour réaliser une FISH
PosselWB+Clean=
Meilleur rendement
Possel-D+Rinse # Possel WB+Clean