LEVERALebensmittelversorgung und Analytik
BMBF‐Programm „Forschung für die zivile Sicherheit“Themenfeld „Sicherung der Lebenmittel und „ g
Lebensmittelwarenketten“
Forschungsverbund LEVERAJustus‐Liebig‐Universität, Fachbereich VeterinärmedizinInstitut für Tierärztliche NahrungsmittelkundeProfessur für MilchwissenschaftenProfessur für Milchwissenschaften
Ludwig‐Maximilians‐Universität, Tiermedizinische FakultätVeterinärwissenschaftliches DepartmentpLehrstuhl für Hygiene und Technologie der Milch
Technische Universität MünchenDepartment ChemieLehrstuhl für Analytische Chemie
hR‐Biopharm AGDarmstadt
Milchprüfring Bayern e.V. Milchindustrieverband e.V.
LEVERAZi l St t iZiele – Strategie
Schnelle und einfache Multianalytik vonKrankheitserregern und Toxinen in Lebensmitteln
auf der Basis immunchemischer und molek larbiologischer Detektion
Arbeitsprogramm
molekularbiologischer Detektion
• Immunreagenzien für Mikroorganismen/Toxine
• Instrumenteller Multianalyt-Chip (MCR3)y p ( )
• Non-instrumenteller (Multi-)-Schnelltest (Dipstick, lateral-flow)
• Lateral-flow PCR (Dipstick, lateral-flow)
• Immunchemische Isolierung/Aufkonzentrierung (MAS)
• Validierung/Referenzanalysen/Anwendungsstudien
Microarray‐Chiptechnologie (MCR3) Monolithische IAC‐Reinigung
Antikörperp
On‐site Schnelltest‐Diagnostik Dipstick‐PCR
Lebensmittelversorgung und Analytik
LEVERA – Teilvorhaben 1P l kl l A ikö d E bli IPolyklonale Antikörper und Etablierung von Immuntests
Professur für MilchwissenschaftenFachbereich VeterinärmedizinJustus Liebig UniversitätJustus‐Liebig‐UniversitätLudwigstrasse 21, 35390 Gießen
Identifizierung und Charakterisierung Enterobacteriaceae‐Isolate unterschiedlicher Herkunft
Gattungen Anzahl der Isolate Herkunft
Klebsiella 78 Milch, Käse, Säuglingsnahrung, Salat
Escherichia 205 Milch Käse Säuglingsnahrung Salat FleischEscherichia 205 Milch, Käse, Säuglingsnahrung, Salat , Fleisch
Yersinia 4 Klinische Isolate
Cronobacter 270 Säuglingsnahrung, Nudeln, Salat, Produktionsumfeld
Citrobacter 29 Milch, Käse, Säuglingsnahrung, Salat , Fleisch
Proteus 10 Käse, Hackfleisch
Salmonella 25 Fleisch, Milch
Serratia 16 Käse, Säuglingsnahrung
P 33 Kä Sä li hPantoea 33 Käse, Säuglingsnahrung
Enterobacter 75 Säuglingsnahrung, Käse, Produktionsumfeld
Identifizierung und Charakterisierung von Cronobacter spp IsolatenIdentifizierung und Charakterisierung von Cronobacter spp.‐Isolaten unterschiedlicher Herkunft
Verwendete Isolate und Referenzstämme
• 259 Cronobacter‐Isolate unterschiedlicher Herkunft• Säuglingsnahrung (aus Deutschland und Indonesien)• Sonstige Milchtrockenerzeugnisse
Verwendete Isolate und Referenzstämme
• Sonstige Milchtrockenerzeugnisse• Trockenteigwaren• Müsli• Fertigsalateg• Wasser• Produktionsumfeld (Säuglingsnahrung)
• 10 Referenzstämme• 10 Referenzstämme C. sakazakii ATCC 29544, DSM 4485; C. malonaticus DSM 18702; C. turicensis DSM 18703; C. muytjensii DSM 21870; C. dublinensis subsp. dublinensis DSM 18705; C. dublinensis subsp. lausannensis DSM 18706; C. dublinensis subsp. lactaridi DSM 18707 C di ti LMG 26250 C i li NCTC 952918707; C. condimenti LMG 26250; C. universalis NCTC 9529
• 5 Klinische Isolate(Laboratorium für Mikrobiologie, BCCM/LMG, Universität Gent, Belgien) Cronos=Kronos=Saturn
devouring his sonFrancisco de Goya,c. 1819‐1823Museo del Prado, Madrid
Identifizierung und Charakterisierung von Cronobacter spp Isolaten
Identifizierung und Speziesdifferenzierung der Isolate
Identifizierung und Charakterisierung von Cronobacter spp.‐Isolaten unterschiedlicher Herkunft
Alle Isolate (n=259) als Cronobacter spp. identifiziert
Spezies Anzahl der Isolate Biotyp Anzahl der IsolateSpezies Anzahl der Isolate Biotyp Anzahl der Isolate
C. sakazakii 213 128
1039628
8a13*
2525
C. malonaticus 36 59
2610
Typisches Wachstum
C. turicensis 9 16 9
C. muytjensii 1 15 1
von Cronobacter spp. auf CASO‐Agar, Druggan‐Forsythe‐Iversen (DFI)‐Agar,
Enterobacter sakazakii‐Isolation‐Agar (ESIA)
Identifizierung und Charakterisierung von Cronobacter spp IsolatenIdentifizierung und Charakterisierung von Cronobacter spp.‐Isolaten unterschiedlicher Herkunft
C. muytjensiiC t i iC. turicensisC. malonaticusC. sakazakii
Identifizierung und Charakterisierung von Cronobacter spp IsolatenIdentifizierung und Charakterisierung von Cronobacter spp.‐Isolaten unterschiedlicher Herkunft
Serotypisierung mittels Multiplex PolymerasekettenreaktionSerotypisierung mittels Multiplex PolymerasekettenreaktionAmplifizierung der O‐Antigen‐Gene O1 bis O7
Serotyp Anzahl Isoliert ausypder Isolate
O1 15 Säuglingsnahrung,Reduktionskost
O3O7
O1Reduktionskost
O2 19 Säuglingsnahrung, Umweltproben, Milchpulver
O1
O2
O‐Antigen‐Gene der C. sakazakii‐IsolateO3 7 Säuglingsnahrung
O4 10 Säuglingsnahrung
O5 ‐
O6 ‐
O7 7 SäuglingsnahrungO7 7 Säuglingsnahrung,Salat
Präparation der Immunogene
Keimzahlbestimmung20 ml LB‐Bouillon
Präparation der ImmunogeneYersinia spp., Cronobacter spp., Campylobacter spp., Enterobacteriaceae (Klebsiella spp.)
Referenzstamm / Isolat
Keimzahlbestimmung auf CASO‐Agar im Doppelansatzbei 37°C für 24h
20 ml LB Bouillon bei 37°C für 24h
1 ml1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
10‐1 10‐2 10‐3 10‐4 10‐5 10‐6 10‐7
je 9 ml Ringerlösung
Waschen mit 5 ml sterilem PBS‐Puffer (Zentrifugieren bei 4000 × g, 4°C, für 10 min)
Inaktivierunginkubator
Inaktivierte Bakteriensuspension (1 ml Immunogen, ca. 108‐109 KbE)
KontrollausstrichKontrollausstrich auf CASO Agar (100 µl)bei 37°C für 24 h
Immunisierung
C b tCronobacter spp.
Optimierung und Standardisierung der Testdauer
1.2
• Beschichtung: Anti‐
Optimierung und Standardisierung der Testdauer
1Test 1 (180 Minuten)
Test 2 (80 Minuten)
Beschichtung: AntiCronobacter pAk 1:6000
• Antigen: Immunogene• Markierte Anti‐
0.6
0.8xt
inkt
ion
Cronobacter‐pAk 1:3000• Streptavidin‐Peroxidase
1:50.000
0.4
Ex
0
0.2kein wesentlicher Unterschied zwischen inaktivierten und lebenden
1.00E+04 1.00E+05 1.00E+06 1.00E+07 1.00E+08 1.00E+09Keimzahl [KbE/ml]
Keimen in Bezug auf Reaktivität des Testsystems
C b tCronobacter spp.
Screening Reaktivität mit verschiedenen C. sakazakii‐Serotypen von ‐Isolaten
1.4
g yp
1
1.2
0.6
0.8
Extin
ktio
n
0.2
0.4
0O1 O2 O3 O4 O7
Serotyp
Enterobacteriaceae (Klebsiella spp )Enterobacteriaceae (Klebsiella spp.)
Verwendete Stämme
Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae DSM 30104 Typstamm, Serotyp O9
Kl b i ll i b DSM 16358 T S O3Klebsiella pneumoniae subsp. ozaenae DSM 16358 Typstamm, Serotyp O3
Klebsiella oxytoca DSM 5175 Typstamm, Serotyp O3
E t b t i (Kl b i ll )Enterobacteriaceae (Klebsiella spp.)
Titerkontrolle
35
Indirekte ELISA‐ Testanordnung
25
30Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae DSM 30104
Klebsiella pneumoniae subsp. ozaenae DSM 16358
20
000)
Klebsiella oxytoca DSM 5175
10
15
Titer (x10
5
0Woche 0 Woche 4 Woche 8 Woche 12 Woche 17
Immunisierungsdauer
E t b t i (Kl b i ll )Enterobacteriaceae (Klebsiella spp.)
Screening
Stamm‐ bzw. Isolatbezeichnung positiv negativ
Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae 26 0
g
p p p
Klebsiella pneumoniae subsp. ozaenae 4 0
Klebsiella oxytoca 20 0Escherichia coli DSM 5802 Yersinia enterocolitica DSM 4780 0 8Escherichia coli DSM 5802, Yersinia enterocolitica DSM 4780, Cronobacter sakazakii DSM 4485, Salmonella typhimurium ATCC 19585, Citrobacter freundii DSM 30039, Proteus mirabilis DSM 788, Shigella sonnei
0 8
Isolierung und Charakterisierung von Staphylococcus aureus Enterotoxin H
Phänotypische und Molekularbiologische Identifizierung und Charakterisierung der
Isolierung und Charakterisierung von Staphylococcus aureus‐Enterotoxin H
S. aureus‐Isolate
Herkunft Anzahl Proben Anzahl Isolate
Käseproben 21 72
Viertelgemelksproben 31 Betriebe, 137 Tiere 168
Mastitisuntersuchung 6 6Mastitisuntersuchung 6 6
Schafmilch 1 1
Teigwaren 3 3
Klinische Isolate 8 8
Referenz‐ und Kontrollstämme
19Kontrollstämme
Sonstige Isolate aus Lebensmitteln
4 4
Gesamt 281
Untersuchung der Isolate auf Enterotoxinbildungsvermögen
Isolierung und Charakterisierung von Staphylococcus aureus Enterotoxin H
Untersuchung auf Enterotoxinbildungsvermögen mittels
Isolierung und Charakterisierung von Staphylococcus aureus‐Enterotoxin H
Untersuchung auf Enterotoxinbildungsvermögen mittels Polymerasekettenreaktion sea bis seu
16 S. aureus‐Isolate positiv für das seh‐Gen (375 bp)1 2 3 4 5 6 7 8 9 101 2 3 4 5 6 7 8 9 10
375 bp
Herstellung von pAk zum Nachweis pathogener Keime
Antikörper gegen
Yersinia spp.
Campylobacter sppCampylobacter spp.
S. aureus
B. cereus
C. perfringens
Teilvorhaben 2
Hybridomaentwicklung und Anwendung monoklonaler Antikörper (mAk)
Lehrstuhl für Hygiene und Technologie der Milch, Tierärztliche FakultätLudwig-Maximilians-Universität München
Arbeitsschwerpunkte
Herstellung von monoklonalen Antikörpernzum Nachweiszum Nachweis
von
Bakteriellen Proteinen Bakterien Sporenp
Bacillus cereus: Enterotoxine
• Enterotoxine: Dreikomponentenproteine: Nhe, Hbl
• Ziel: Herstellung von Antikörpern zum Nachweis der Hbl-
Hbl‐BPDB‐ID: 2NRJ
Bildung
• Stand: Nachweis der Toxin-komponenten Hbl-L1 und Hbl-B mittels Immunoblot
Immunoblot
Bacillus cereus: Cereulid
• Emetisches Toxin
• Ziel: Herstellung von Antikörpern zum Nachweis in• Ziel: Herstellung von Antikörpern zum Nachweis in Lebensmitteln
• S Ü f S• Stand: Überprüfung verschiedener B. cereus Stämme mit
Zellkulturtest und Produktion von Cereulid zur
AntikörperherstellungAntikörperherstellung
Cereulid
Staphylokokkenenterotoxine (SE)
• Ziel: Herstellung von Antikörpern gegen SEH zum Nachweis in Lebensmitteln
SEHPDB ID: 1ENF
• Stand: SEH wurde rekombinant exprimiert und gereinigt
Aminosäurensequenz-Vergleich der von Holden et al 2004 publizierten SEH-Sequenz (Zeile 1) mitAminosäurensequenz Vergleich der von Holden et al., 2004 publizierten SEH Sequenz (Zeile 1) mit den generierten E. coli Klonen A2 (DSM 25693) und E1 (DSM 19045) (entsprechend Zeilen 2.-5.).
Clostridium perfringens
•• Ziel: Herstellung von Antikörpern gegen Clostridium perfringens-Sporen zum Nachweis in Lebensmitteln
• Stand: Die Bedingungen zur Sporenbildung wurden optimiert, Sporen konnten in ausreichender Menge und Reinheit gewonnen werdenausreichender Menge und Reinheit gewonnen werden
a b cc dd
Mikroskopische Bilder der Sporenanreicherung verschieder C. perfringens Stämme nach der N d Z t if ti DSM 11786 b 1C 7B d 8C (A l ti ti i htb )Nycodenz-Zentrifugation. a: DSM 11786, b: 1C, c: 7B, d: 8C (Agglutination sichtbar)
MHI 995 + 2F8
Yersinia enterocolitica
• Ziel: Herstellung von Antikörpern gegen Yersinien zum Nachweis in Lebensmitteln
MHI DSM Keim andere Bezeichnung Serovar Biovar Herkunft Isoliert aus
Ziel: Herstellung von Antikörpern gegen Yersinien zum Nachweis in Lebensmitteln• Stand: Auswahl verschiedener Yersinen-Spezies zur Antikörperherstellung
MHI Nr. Keim andere Bezeichnung Serovar Biovar Herkunft Isoliert aus
21113 11502 Yersinia enterocoliticasubsp. enterocolitica O:3 4 Deutschland
21120 9676 Yersinia enterocoliticasubsp enterocolitica
CIP 81.41; WDCM 00039 O:3 4 Schweden Mesenterial-
lymphknotensubsp. enterocolitica 00039 lymphknoten
21116 27689 Yersinia enterocoliticasubsp. enterocolitica
ATCC 23715; NCTC 10598; WDCM 00160 O:8 1 humane
Blutprobe
21118 4780 Yersinia enterocoliticasubsp enterocolitica
ATCC 9610; WDCM 00038 O:8 1
rotz-ähnliche Infektion des subsp. enterocolitica 00038 Gesichtes
21112 11067 Yersinia enterocoliticasubsp. enterocolitica
ATCC 55075; DSM 11067 O:9 Canada
21114 11503 Yersinia enterocolitica O 9 3 D t hl d21114 11503 subsp. enterocolitica O:9 3 Deutschland
21117 28012 Yersinia enterocoliticasubsp. enterocolitica O:9 2 Belgien Mensch (?)
21119 9499 Yersinia enterocoliticasubsp enterocolitica
CIP 81.42; NCTC 11174 O:9 2 Belgien humane
Stuhlprobesubsp. enterocolitica 11174 g Stuhlprobe
21115 11504 Yersinia enterocoliticasubsp. enterocolitica O:5,27 2
21121 13030 Yersinia enterocoliticasubsp. palearctica O:3,4 Deutschland humane
Stuhlprobe
MHI 995 + 2F8
Cronobacter spp.• Ziel: Herstellung von Antikörpern gegen Cronobacter spp. zum Nachweis g p g g pp
in Lebensmitteln• Stand: Eine breite Palette an monoklonalen Antikörpern unterschiedlicher
Reaktivität wurde generiert Cronobacter sakazakii: Immunogen C.s. prot I C.s. prot II C.s. prot. III C.s. prot II*
E‐Nr MHI Serotyp mAk1A11;1C3; 1C4 mAk 1A4 mAk 2D10 mAk 2D12 mAk 2F2 mAk 2F8 mAk 3C11 mAk 4F9 mAk 2C8 mAk 2G11
975 O1 ++ neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. + + 21000 O1 ´++ neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. + + 21001 O1 Imm1 ´++ neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. + + 21008 O1 ´++ neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. + +21008 O1 ++ neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. + + 21011 O1 ´++ neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. + + 21012 O1 ´++ neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. + +
821 21038 O1 ++ neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. + + 655 21028 O1 ´++ neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. + + 789 21030 O1 ´++ neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. + + 823 21039 O1 ´++ neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. + + 824 21040 O1 Imm1 neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. + + 601 21090 O1 + neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. + + 785 21029 O2 Imm 2 neg. + + + + + + + + +
977 O2 Imm2 neg. + + + + + neg. neg. + + 767 21098 O2 neg. + + + + + neg. neg. + +
995 O2 neg. + + + + + neg. neg. + + 604 21027 O2 neg. + + + + + neg. neg. + + 796 21032 O2 neg. + + + + + + + + + 901 21041 O2 neg. + + + + + + + + + 886 21035 O2 neg. + + + + + neg. neg. + + 786 21037 O2 neg. + + + + + neg. neg. + +
MHI 21042/Es 5 O2 neg. + + + + + neg. neg. + +
982 O3 neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. + + 990 O3 neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. + +
535 21036 O3 neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. + + 21002 O6 neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. + + 992 O6 neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. + + 986 O6 neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. + +
MHI 995 + 2F8
987 O6 neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. + + 981 O7 neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. + +
Technische Universität MünchenDepartment ChemieLehrstuhl für Analytische Chemie
Teilvorhaben 3: Schnellkonzentrierung und Multiplex‐Mikroarray‐Analyse von Mikroorganismen und ToxinenAnalyse von Mikroorganismen und Toxinen
li hi fil iUse efficient and fast concentration methods
d h i f f id i • Monolithic Immunofiltration• Immunomagnetic Filtration
to reduce the time factor for rapid separation and filtration enrichment of bacteria and
microbial toxins
Rapid multiplex analysis method for pathogenic microorganisms and
their toxins in food• MCR3 System
28
Epoxy based monolithic columnsEpoxy based monolithic columnsAdvantages:• Immunofiltration of large volumes in short timeg• Analyte enrichment depends on the selective affinity ligands• Enhanced mass transport• Low pressure drop• Shape and size is easily adjusted
Coating with DIAPEG
Hydrolyzed monoliths with GOTPS coating
56°C, overnight
Activation with DSC
RT, 4h
Immobilization of antibody Antibody, ‐NH2
RT, overnight
29Ott, S. PhD thesis titled ‘Combination of monolithic immune filtration and antibody microarrays for rapid quantification of microorganisms in milk’, Technische Universitaet Munchen, 2012.
Immunomagnetic filtrationImmunomagnetic filtration
Magnetic nanoparticles coated with silica
labeled target cells
Permanent0
20
u/g sa
mpl
e)
Ms
Magnetic immunofiltrationPermanent magnet
10 nm-40 0 40
-20
M (e
m
H (kOe)
Enriched target cells
Non‐labeled cells
H (kOe)
MCR3 analysis
30
Cronobacter turicensisCronobacter turicensisMCR3Initial procedure
Steps Volume Flow rate
Sample injection 600 µLStop‐flow with 0.5 µl/s and 30 s of interaction
time; 12 loopsWashing step 2000 µL 100 µl/s
Biotin labeled detection antibody 600 µLStop‐flow with 2 µl/s and 5 s of interaction
time; 12 loopsWashing step 2000 µL 20 µL/sWashing step 2000 µL 20 µL/s
HRP‐labeled streptavidin 600 µL 20 µL/s, continuous flow
Washing step 2000 µL 100 µl/s
Chemiluminescence substrateChemiluminescence substrateLuminol and peroxide
200 µL each 20 µL/s
Picture with CCD‐camera ‐ 60s
hi i h hi b ff1500 µL 500 µl/s
Washing step with washing bufferµ µ /
3 x 1000µL 68 µL/sAssay duration 36 min
31
Cronobacter turicensisCronobacter turicensisMCR3
10000100008000
(+)
4000
6000
8000
ensi
ty (a
. u.)
4000
6000
8000
ensi
ty (a
. u.)
4000
6000
ensi
ty (a
. u.)
(+)
108
5 300
2000
Inte
Antibody flow (L/s)0.1 0.5 5
0
2000
Inte
Sample flow (L/s)5 30 60
0
2000
Inte
Sample interaction time (s)
(‐)
Antibody Interaction time (s)Antibody flow (L/s)Sample flow (L/s) Sample interaction time (s) Antibody Interaction time (s)
10000
C 8 06 ll/4000
6000
8000
sity
(a. u
.)
IC50= 8.4 106 cell/mLLOD= 4.2 105 cell/mL
m=50
2000
4000
Inte
ns
32
10-3 103 104 105 106 107 108 109
Cell concentration (g/mL)(cell/mL)
LEVERA
Teilvorhaben 4: Erforschung und Bereitstellung von Methoden zurProbenvorbereitung und zum immunologischen/molekularbiologischen Pathogennachweis
Arbeitsschwerpunkte
Multiplex‐PCRder relevanten
Keime
Molekularbiologie
MöglichkeitPoint‐of‐Care
EinsatzMolekularbiologie
Point-of-Care PCR Nachweis: Campylobacter
Palm PCR Portable Cycler Nachweis:Lateral‐Flow Streifen
Point-of-Care PCR Nachweis: Multiplex-Nachweis
CampylobacterS. aureusListeria monocytogenes
Außerdem bereits Singleplex von
Yersinia Clostridium
Point-of-Care PCR Nachweis: Sondenhybridisierung
Staphylococcus aureusNachweis
Yersinia enterocoliticaNachweis
S. aureus Yersinia
Arbeitsschwerpunkte
Universeller Lateral‐Flow Streifen
Proben‐aufarbeitung
A iköAntikörperKeim‐/Toxin‐Microarray
Arbeitsschwerpunkte
Antikörper
Kontrolle lateral flowKontrolle
Parameter 1Parameter 2Parameter 3Parameter 4
Erweiterung des Analytspektrums ‐ Etablierung von UniversalteststreifenErweiterung des Analytspektrums Etablierung von Universalteststreifen
Probenaufarbeitung: Anreicherung von Zielanalyten
Beads Säulen
Probenaufarbeitung: Anreicherung von Zielanalyten
Nächste Schritte/Technologieplattformen:
Antikörper kovalent an Sepharose koppeln (NHS, BrCn)
Ferromagnetische Beads
Immunaffinitätssäulen (Sepharose)
Monolithische SäulenMonolithische Säulen
Keim-/Toxin-Microarray
S d i h F t
Keime/Toxine
Sandwich‐Format
LEVERAd b hOutput – Anwendungsbereiche
L b itt l i h h it• Lebensmittelsicherheit• Urproduktion
• Lebensmittelindustrie
L b itt lüb h• Lebensmittelüberwachung
• Importkontrolle
• Klinische Diagnostik
• Abwehr biologischer Gefahren
LEVERALEVERA2013 ‐20162013 ‐2016
Fö d BMBFFörderung: BMBFProjektträger: VDIProjektträger: VDI