TAYANE GUEDES GONÇALVES
USO DE CONSÓRCIO MICROBIANO AUTÓCTONE DE ÁREAS IMPACTADAS,
COMO ALTERNATIVA PARA REDUÇÃO DE MANGANÊS EM SOLO
CONTAMINADO
CANOAS, 2016
TAYANE GUEDES GONÇALVES
USO DE CONSÓRCIO MICROBIANO AUTÓCTONE DE ÁREAS IMPACTADAS,
COMO ALTERNATIVA PARA REDUÇÃO DE MANGANÊS EM SOLO
CONTAMINADO
Trabalho de conclusão apresentado ao Curso de Química do Centro Universitário La Salle – Unilasalle, como exigência parcial para a obtenção do grau de Bacharela em Química.
Orientador: Prof. Dr. Delmar Bizani
CANOAS, 2016
TAYANE GUEDES GONÇALVES
USO DE CONSÓRCIO MICROBIANO AUTÓCTONE DE ÁREAS
IMPACTADAS, COMO ALTERNATIVA PARA REDUÇÃO DE
MANGANÊS EM SOLO CONTAMINADO.
Trabalho de conclusão aprovado como requisito parcial para a obtenção do grau de Bacharela em Química pelo Centro Universitário La Salle – Unilasalle.
Aprovado pelo avaliador em 06 de julho de 2016.
AVALIADOR:
________________________________ Prof. Dr Delmar Bizani
Unilasalle
Aos meus familiares que, com muito carinho е apoio, não mediram esforços
para que eu chegasse até esta etapa de minha vida.
AGRADECIMENTOS
A Deus por ter me dado força e sabedoria durante essa jornada.
Aos meus pais pelo amor, incentivo e dedicação, pois sem eles nada disto
seria possível.
Ao meu namorado, pela paciência e cooperação, estando sempre presente
em minha vida.
A todos os professores que a mim repassaram seus conhecimentos. Em
especial ao meu orientador Delmar, pelo auxílio e incentivo na elaboração deste
trabalho.
E as colegas que correm atrás deste mesmo sonho em busca de um único
objetivo e que hoje certamente são minhas grandes amigas.
RESUMO
O manganês e seus compostos, apesar de serem essenciais aos seres vivos em
baixas concentrações, são muito tóxicos em concentrações elevadas. Eles existem
na atmosfera na forma de partículas, resultantes da erosão do solo, emissões
industriais e vulcânico, assim como da queima de gasolina contendo TMM
(tricarbonil metilciclopentadienil manganês), sendo um líquido volátil de coloração
alaranjada, insolúvel em água e usado como aditivo. No solo, este material
particulado contendo Mn pode ser emitido para o ar, e o estado de oxidação do
metal pode ser alterado por atividade microbiológica. Sendo um nutriente essencial
em pequenas quantidades para muitos organismos vivos, incluindo o ser humano, é
válido lembrar que o perigo está no excesso desse metal pesado, bem como a sua
deficiência pode causar uma série de problemas orgânicos. O estudo tem como
proposta avaliar a redução das concentrações de Mn em amostras de solo através
de bioprocessos, utilizando um consórcio bacteriano autóctone proveniente de áreas
impactadas e possíveis interferências na capacidade fisiológica dos microrganismos
em remediar o Mn. Após a contaminação, o solo foi submetido a análises físicas e
químicas para a caracterização e determinação do ponto de partida. Foram
realizadas análises microbiológicas para o monitoramento do crescimento
microbiano, no qual o Manganês foi monitorado quantitativamente, e a partir dessas
análises realizadas foi possível observar que os microrganismos têm crescimento
ideal a uma faixa de pH neutra e a uma temperatura de 32°C, sendo assim, os
microrganismos estão ativos para desempenharem a sua tarefa de biodegradação.
Portanto a partir desses resultados obtidos, pode-se concluir que dentro das
linhagens bacterianas testadas é possível reduzir a concentração do metal Mn em
solos contaminados.
Palavras-chave: Biorremediação. Consórcio. Manganês.
ABSTRACT
The manganese and its compounds, although they are essential to living organisms
at low concentrations, are highly toxic at high concentrations. They exist in the
atmosphere in the form of particles resulting from soil erosion, industrial and volcanic
emissions, and combustion of fuel containing MMT (tricarbonyl
methylcyclopentadienyl manganese), and a volatile liquid orange color, insoluble in
water and used as additive. In soil, the particulate material containing Mn can be
emitted into the air, and metal oxidation state can be changed by microbiological
activity. Being an essential nutrient in small amounts for many living organisms,
including humans, it is worth remembering that the danger is in excess of this heavy
metal, and its deficiency can cause a number of physical problems. The study aims
to evaluate the reduction of Mn concentrations in soil samples through bioprocesses,
using autochthonous bacterial consortium from impacted areas and possible
interference on the physiological ability of microorganisms to remedy the Mn. After
contamination, the soil was subjected to physical and chemical analysis for the
characterization and determination of the starting point. Microbiological analyzes
were performed for the monitoring of microbial growth, in which the manganese was
monitored quantitatively and from these analyzes it was observed that the
microorganisms have optimum growth at a neutral pH range and a 32° C, and thus,
the microorganisms are enabled to perform its task biodegradation. So from these
results, it can be concluded that within the tested bacterial strains is possible to
reduce the concentration of Mn metal contaminated soil.
Keywords: Bioremediation. Consortium. Manganese.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Principais formas, transformações e fluxos dos metais no sistema
solo-planta.......................................................................................... 17
Figura 2 - Esquema simplificado da interação célula-metal que contribui para
acumulação e detoxificação dos metais para os
microrganismos................................................................................. 18
Figura 3 - Procedimento para determinação de CO2........................................................... 22
Figura 4 - Curva de crescimento do consórcio para o pH 4,0........................... 27
Figura 5 - Curva de crescimento do consórcio para o pH 7,0........................... 28
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Determinação de CO2..................................................................... 22
Tabela 2 - Planejamento fatorial...................................................................... 23
Tabela 3 - Primeira Determinação de CO2...................................................... 24
Tabela 4 - Segunda Determinação de CO2..................................................... 25
Tabela 5 - Soma das determinações de CO2.................................................. 26
Tabela 6 - Resultados finais da liberação de CO2........................................... 26
Tabela 7 - Avaliação da curva de crescimento referente ao pH 4,0................ 27
Tabela 8 - Avaliação da curva de crescimento referente ao pH 7,0................ 27
LISTA DE ABREVIATURAS
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
Mn Manganês
IDR
SOD
Ingestão Diária Recomendada
Superóxido Dismutase
BHI Brain Heart Infusion (meio de cultura)
mL Mililitros
g Gramas
mg Miligramas
µg Micrograma
min Minutos
M Molaridade
nm Nanômetros
atm
L
Atmosfera
Litros
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................... 11
2 OBJETIVOS ........................................................................................... 13
2.1 Objetivo geral ....................................................................................... 13
2.2 Objetivo específico .............................................................................. 13
3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ............................................................. 14
3.1 Manganês .............................................................................................. 14
3.1.1 Propriedades físicas .............................................................................. 14
3.1.2 Propriedades químicas .......................................................................... 14
3.1.3 Meio ambiente e organismo .................................................................. 14
3.1.4 Toxicidade .............................................................................................. 15
3.2 Microbiologia ........................................................................................ 16
3.2.1 Microbiologia do solo ............................................................................. 16
3.3 Biorremediação ..................................................................................... 18
3.3.1 Fatores físicos e químicos .................................................................... 19
3.3.2 Fatores biológicos .................................................................................. 19
4 METODOLOGIA ..................................................................................... 21
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES ........................................................... 24
6 CONCLUSÃO ......................................................................................... 29
REFERÊNCIAS ...................................................................................... 30
11
1 INTRODUÇÃO
A água e o solo são recursos indispensáveis à sobrevivência humana e de
função vital no ciclo produtivo, sua contaminação pode ser causada por diversas
substâncias, tais como compostos orgânicos e metais, deste último grupo podemos
destacar o manganês que apesar de ser um metal de grande importância à vida, em
altas concentrações pode ser prejudicial à saúde humana.
Na cadeia produtiva, o processo industrial, além dos produtos de interesse
econômico que são gerados, ocorre também à geração de subprodutos que muitas
vezes não possuem valor econômico, estes últimos são denominados resíduos. Tais
resíduos devido ao fato de não possuírem aplicação seja dentro da própria indústria,
nem de outras indústrias e muitas vezes devido ao alto custo para sua
transformação em algum produto com utilidade e que possa ser comercializado ou
reutilizado, muitas vezes o descarte desse material é feito de forma inadequada
acarretando a poluição de solos e águas. Podemos também mencionar que devido a
imposições dos órgãos de controle ambiental, em alguns estados da Federação,
toda indústria tem de realizar seu descarte a montante do seu ponto de coleta de
água, assim caso haja o despejo de efluente contaminado a indústria não somente
estaria causando impactos aos rios e a todos que o utilizam, mas também
prejudicando o seu próprio processo, uma vez que para grande maioria dos
processos se faz necessária à utilização de água com qualidade elevada.
O manganês é essencial aos seres vivos em baixas concentrações, mas em
concentrações elevadas é muito tóxico. Ele existe na atmosfera na forma de
partículas, resultantes da erosão do solo, emissões industriais e vulcânico, assim
como da queima de gasolina contendo TMM (tricarbonil metilciclopentadienil
manganês), sendo um líquido volátil de coloração alaranjada, insolúvel em água e
usado como aditivo. Essas partículas apresentam meia-vida em torno de 7 a 10 dias.
No solo, este material particulado contendo Mn pode ser emitido para o ar, e o
estado de oxidação do metal pode ser alterado por atividade microbiológica. Sendo
um nutriente essencial em pequenas quantidades para muitos organismos vivos,
incluindo o ser humano, principalmente em processos reprodutivos, manutenção da
estrutura óssea e funcionamento do sistema nervoso. É válido lembrar que o perigo
está no excesso desse metal pesado, bem como a sua deficiência pode causar uma
série de problemas orgânicos, entre eles, perda de peso, além de afetar a função
12
pancreática e o metabolismo de carboidratos, prejuízo do crescimento,
anormalidades no esqueleto, diminuição na função reprodutora de fêmeas e
degeneração testicular em machos. Nas plantas exerce efeitos negativos sobre o
crescimento e afetam os processos bioquímicos, ou seja, causa grave riscos
ambientais, devido às capacidades de migração, bioacumulação e biomagnificação.
A utilização de processos de biorremediação é feito com o objetivo de se
preservar os recursos financeiros, diminuição do período de descontaminação, bem
como dos gastos expressivos para minimizar os impactos no meio ambiente, se
comparados a outras tecnologias de remediação.
13
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
O estudo tem como proposta avaliar a redução das concentrações de Mn em
amostras de solo através de bioprocessos, utilizando um consórcio bacteriano
autóctone proveniente de áreas impactadas e possíveis interferências na capacidade
fisiológica dos microrganismos em remediar o Mn.
2.2. Objetivos específicos
a) Avaliar a interação do possível consórcio de microrganismos com potencial
biorredutor;
b) determinar o potencial biorredutor do consórcio microbiano em amostras
matrizes de solos contaminados com Mn, através de avaliação dos
parâmetros: curva de crescimento e potencial de biorredução;
c) avaliar os interferentes no processo de biorremediação através da
modificação dos parâmetros: temperatura e pH.
14
3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
3.1 Manganês
O manganês é um metal de transição pertencente ao grupo 7 da Tabela
Periódica e consiste de uma única espécie atômica, 55Mn. Ele decompõe-se
lentamente a água à temperatura ambiente e mais rapidamente quando quente. É
facilmente dissolvido em soluções diluídas de ácidos (inclusive não oxidantes),
formando íons Mn2+.
3.1.1 Propriedades físicas
O manganês é um dos elementos mais abundantes na crosta terrestre e
encontra-se largamente distribuído em solos, sedimentos, rochas, água e materiais
biológicos. Em sua forma natural ele é composto por um isótopo estável, o 55Mn.
O manganês é um metal cinza escuro, duro e quebradiço. Quimicamente ele é bastante reativo. Na forma de pó, o metal é lentamente oxidado pelo oxigênio atmosférico, chegando mesmo a ser pirofórico. Na forma maciça, o manganês somente reage com O2 quando aquecido. (ROCHA; AFONSO, 2012, p.103).
3.1.2 Propriedades químicas
O estado de oxidação do manganês é notável por ser um elemento que
apresenta 11 estados de oxidação (alguns bastante incomuns), de -3 até +7. Sendo
o mais estável deles é o +2, correspondendo ao íon Mn2+.
O manganês possui configuração 1s2 2s
2 2p
6 3s
2 3p
6 4s
2 3d
5, e a remoção
dos elétrons do orbital 4s produz um íon com configuração final d5 (orbital
preenchido pela metade) de grande estabilidade. O íon Mn2+
é estável no estado sólido e em soluções ácidas. (ROCHA; AFONSO, 2012, p.104).
3.1.3 Meio ambiente e organismo
O manganês é um mineral essencial em todos os organismos vivos. Ele
participa das enzimas fosfotransferases (que atuam no crescimento das plantas) e
no processo de fotossíntese (etapa de foto-oxidação da água, com liberação de O2
15
pelos cloroplastos). O elemento é o 3o metal de transição mais importante em nossa
dieta (após ferro e zinco). Segundo a ANVISA recomenda-se uma ingestão diária
(IDR) de 5 mg. As principais fontes são cereais integrais, legumes, verduras e frutas.
Em média, segundo estudos realizados um organismo adulto pode conter no
máximo 20 mg de Manganês concentrado nos rins, pâncreas, fígado e, mais
importante nos ossos. Bem como em altas concentrações ele é prejudicial e em sua
deficiência ele causa sintomas como: perda de peso, fadiga, redução da fertilidade,
dermatite, perturbação no metabolismo de ossos e cartilagens, alteração da síntese
de insulina, redução da taxa de colesterol no sangue, intensificação de reações
alérgicas e inflamatórias e malformações fetais. (ROCHA; AFONSO, 2012, p. 104).
No organismo humano, o manganês está presente em pequenas doses e um
dos componentes da enzima (SOD: superóxido dismutase) é um poderoso
antioxidante que ajuda a combater radicais livres. O Manganês é um poderoso
antioxidante que procura os radicais livres no corpo e consegue neutralizar estas
partículas prejudiciais e prevenir qualquer perigo potencial que elas possam causar.
Cabe citar que o manganês utilizável biologicamente é o Mn2+, e o elemento nos
demais números de oxidação é tóxico. Contudo, o excesso de Mn2+ causa desordens
neurológicas e motoras, como o Parkinson, e problemas respiratórios.
3.1.4 Toxicidade
Agourakis et al. (2006) definem que a contaminação começa pela disposição
inadequada, nos lixões, ou seja, em aterros não controlados para onde é destinada
a maior parte dos resíduos sólidos domiciliares do Brasil. Através do vazamento
gradativo dos metais tóxicos, atingi diretamente o solo. No entanto, os metais
tendem com o tempo a migrar para os demais compartimentos do ecossistema, até
atingirem diretamente o ser humano. Sabe-se que são os metais tóxicos aqueles
que representam maior risco ambiental, devido às capacidades de migração,
bioacumulação e biomagnificação.
Nos seres vivos o manganês pode causar dermatite, diminuição do colesterol
sérico, diminuição dos fatores coagulantes dependentes da vitamina K, aumento dos
níveis sanguíneos de cálcio e fósforo, infertilidade, diminuição do metabolismo da
glucose, diminuição do metabolismo proteico, diminuição do crescimento e distúrbios
ao nível do esqueleto, disfunção pancreática, aumento da pressão sanguínea,
16
redução da função imune, depressão da atividade das glândulas mamárias e
anormalidades nas mitocôndrias. (DAMIÃO & RAMOS, 2004/2005).
3.2 Microbiologia
É a ciência que estuda os microrganismos e suas atividades. Preocupa-se com
a forma, estrutura, reprodução, fisiologia, metabolismo e a identificação dos seres
microscópicos. Inclui o estudo de sua distribuição natural, suas relações recíprocas
e com outros seres vivos, seus efeitos benéficos e prejudiciais sobre os homens;
suas alterações físicas e químicas que provocam em seu meio ambiente. Está
associada ao estudo das células vivas e ao seu funcionamento:
Há duas áreas principais de estudos no campo da microbiologia: microbiologia básica, que estuda a natureza fundamental e as propriedades dos microrganismos, e microbiologia aplicada, em que a informação aprendida na microbiologia básica é empregada para controlar e usar os microrganismos de maneira benéfica. (PELCZAR JR; CHAN; KRIEG, 1997).
Segundo Pelczar et al. (1997) a microbiologia básica abrange as descobertas
cientificas que conduzem ao conhecimento fundamental sobre as células e a
população microbiana. As aplicações da microbiologia são ilimitadas e variadas em
suas áreas. Os principais campos de aplicação da microbiologia incluem aqueles
que focalizam a medicina, alimentos e laticínios, agricultura, indústria ou ambiente.
3.2.1 Microbiologia do solo
A microbiologia do solo é a ciência que estuda e trata os microrganismos que
vivem neste ambiente, ou seja, que habitam e participam da dinâmica desses
processos importantes no solo como as atividades metabólicas, fluxo de energia,
ciclagem e transporte de nutrientes e etc. Os principais micro-organismos do solo
são representados pelas bactérias, fungos, protozoários, vírus, entre outros.
O mais importante processo químico a influenciar o componente e a biodisponibilidade de metais em solos será associado à adsorção de metais na fase sólida e na fase líquida. Esses processos controlam a concentração de íons metálicos e seus complexos na solução do solo e exercem grande influência no seu acúmulo em plantas. (ROCHA; ROSA; CARDOSO, 2009).
17
Conforme Siqueira e Moreira (2006) os metais são encontrados em diversas
formas no solo, como: solúveis em água, retidos nos sítios de troca, insolúveis
precipitados pelos óxidos de Fe e Mn, como minerais primários, nos compostos
orgânicos e inorgânicos adicionados pelos resíduos, dentre outras maneiras.
Mostrado na figura 1, esses elementos, quando presentes em resíduos
orgânicos vegetais, animais e outros, como lodo de esgoto, são liberados mediante
biodegradação, produzindo quelatos orgânicos e metais livres, os quais vão para a
biomassa, entram nas diversas formas do estoque de metais do solo ou são
absorvidos pelas plantas ou, ainda, lixiviados. Essas transformações e outras
maneiras de interação microrganismos-metais envolvem adsorção e dessorção,
oxidação autotrófica e enzimática, absorção e bioacumulação na biomassa (figura
2) e transformações indiretas resultantes da atividade dos heterotróficos. (SIQUERIA
e MOREIRA, 2006, p. 389).
Figura 1 - Principais formas, transformações e fluxos dos metais no sistema solo-
planta. (Modificado de Stevenson, 1986.)
Fonte: SIQUEIRA; MOREIRA (2006, p.?)
18
Figura 2 - Esquema simplificado da interação célula-metal que contribui para
acumulação e detoxificação dos metais para os microrganismos. (Modificado de
Gomes et al., 1998.)
Fonte: SIQUEIRA; MOREIRA (2006, p.).
Segundo Tortora et al. (2005), populações de bactérias do solo são geralmente
estimadas utilizando-se contagem em placas em meio nutriente, e os números
atuais são provavelmente subestimados por esse método. Nenhum meio nutriente
ou condição de crescimento pode encontrar todos os nutrientes e outras exigências
necessárias para todos os microrganismos do solo.
3.3 Biorremediação
Gaylarde et al. (2005) afirmam que a biorremediação é um processo no qual,
organismos vivos, normalmente plantas ou microrganismos, são utilizados
tecnologicamente para remover ou reduzir (remediar) poluentes do meio ambiente.
Tem sido intensamente pesquisado este processo biotecnológico de remediação e
recomendado por científicos como uma alternativa viável para o tratamento de
ambientes contaminados, como águas superficiais, subterrâneas e solo, além de
resíduos e efluentes industriais em aterros ou áreas de contenção.
19
Embora outras tecnologias que usam processos físicos e/ou químicos sejam
também indicadas para descontaminar ambientes poluídos, o processo biológico de
biorremediação é uma alternativa tecnologicamente mais adequada e eficaz para o
tratamento de ambientes contaminados com moléculas orgânicas de difícil
degradação e metais tóxicos.
3.3.1 Fatores físicos e químicos
Gaylarde et al. (2005) explicam que os principais parâmetros físicos que
influenciam na degradabilidade são: natureza física da matriz onde o composto é
encontrado (solo, água, sedimento), temperatura e luz. Como por exemplo,
ambientes complexos, como solo e sedimentos, têm a propriedade de, através da
atração de cargas opostas, adsorver moléculas, diminuindo, desta maneira, a
biodisponibilidade do poluente. Em regiões temperadas do globo, a atividade
metabólica de microrganismos pode ser reproduzida em função das baixas
temperaturas médias anuais, reduzindo, consequentemente, a taxa de degradação
de poluentes nestas áreas.
Portanto, diversos fatores químicos podem influenciar, acelerando ou
reduzindo, a taxa de degradação de um poluente. Entre estes fatores incluem-se a
composição química da matriz ambiental, a qual define a capacidade nutritiva, o pH,
umidade, teor de oxigênio dissolvido, o potencial redox do meio e a composição e a
estrutura química do poluente. Metais pesados, quando presentes, podem interagir
com enzimas produzidas pelos microrganismos, inibindo a sua atividade e, por
conseguinte, a capacidade degradativa deste. Por outro lado, concentrações
adequadas de metais que têm ação de cofatores enzimáticos podem melhorar a
capacidade degradativa do meio. (GAYLARDE; BELLINASO; MANFIO, 2005)
3.3.2 Fatores biológicos
A biodegradação de um composto químico no meio ambiente depende,
sobretudo, da presença de uma população de microrganismos capaz de metabolizar
a molécula original e seus produtos de degradação. Obviamente, as características
físico-químicas e nutricionais do meio externo e do compartimento intracelular
microbiano estão estritamente relacionadas. Mesmo que um sistema microbiano
20
porte todos os requisitos bioquímicos e genéticos necessários para a degradação de
um xenobiótico, se as características físico-químicas e componentes nutricionais do
meio não condizem com as necessidades metabólicas do microrganismo, a
biodegradação não ocorrerá. (GAYLARDE; BELLINASO; MANFIO, 2005).
21
4 METODOLOGIA
O processo metodológico foi dividido em cinco etapas para melhor
compreensão e demanda das atividades laboratoriais.
1) Seleções de microrganismos para o consórcio
Foi realizada uma seleção de linhagens bacterianas disponíveis na coleção de
microrganismos do Laboratório de Microbiologia e Bioquímica de Microrganismos do
UNILASALLE/RS. Foram utilizadas cinco linhagens nos consórcios testados, sendo
escolhidas pelo histórico de remediar localidades contaminadas por manganês.
2) Método de seleção do consórcio microbiano com maior taxa de remediação
Todos os consórcios bacterianos foram testados frente às soluções contendo
concentração definida de manganês (300 mg.L-1) em meio de cultura líquido (BHI),
por um intervalo de 72 horas à 32ºC, temperatura em estufa bacteriológica.
3) Utilização do consórcio bacteriano na biorremediação de manganês em solo
Por testes prévios, indicados no melhor momento, foram selecionados 5
linhagens bacterianas com capacidade de remediar o manganês. Em 3 tubos foram
adicionados 10 mL de meio de cultura BHI e 1 mL de cada bactéria por tubo (50µL)
e colocado em estufa a 31°C por 3 dias. Transcorrido este período, ocorreu a
sulfatação nas bactérias formando 3 consórcios. Após foram utilizados copos de
béquer com aproximadamente 50 g de solo, juntamente com o consórcio microbiano
e solução de 300 mg.L-1 de Mn, foram incubados em jarras microaerofilia, por um
período de 15 dias à temperatura ambiente (o experimento foi conduzido em
triplicata).
4) Determinação de CO2
Outro fator que foi determinado é a respiração microbiana, ou seja, o quanto de
CO2 era produzido pelos microrganismos durante o processo. Esse parâmetro foi
determinado através da técnica de respirometria (utilização de solução 0,5 mol L-1 de
NaOH), por titrimetria de neutralização.
As massas utilizadas estão descritas na tabela 1 abaixo:
22
Tabela 1: Determinação de CO2
Béquer Massa de solo Componentes
1 50,0338g Com manganês
2 50,0644g Com bactéria
3 50,0173g Consórcio 1
4 50,0531g Consórcio 3
5 50,0171g Branco
6 50,0508g Consórcio 2
Fonte: Autoria própria, 2016.
O solo foi autoclavado a 121°C, a 1,5 atm por 10 min., para garantir
esterilidade e pureza. Após, foram inseridos no solo 5 mL de consórcio e 5 mL de
manganês, procedendo-se assim à vedação das jarras microaerofilia e
acondicionando em local escuro, a temperatura ambiente, por 32 dias. Juntamente
com as amostras foram colocados um béquer em cada jarra microaerofilia contendo
30 mL de NaOH para determinação de CO2 liberado, conforme figura 3. Passados
os primeiros 18 dias, ocorreu a titulação das amostras e na sequência nova
incubação. Após o período de incubação foi feita novamente outra titulação.
Figura 3 - Procedimentos para determinação de CO2.
Fonte: Autoria própria, 2016.
23
5) Determinar o potencial biorredutor do consórcio microbiano, através de
avaliação dos parâmetros: curva de crescimento, temperatura e pH
Para determinação do potencial biorredutor foi utilizado à técnica de
planejamento fatorial do tipo 2k, onde, dois níveis com duas variáveis gerando 22
formam 4 parâmetros a serem analisados. Portanto as variáveis e níveis utilizados
para realizar os testes do consórcio foram:
a) Temperatura de incubação: 32°C e 37°C
b) pH: 4,0 e 7,0
Para realização do planejamento completo, é necessário fazer todas as
combinações possíveis dos níveis de fatores, conforme tabela 2:
Tabela 2: Planejamento fatorial
pH Temperatura
4 32°C
4 37°C
7 32°C
7 37°C
Fonte: Autoria própria, 2016.
Para realização desses fatores foram preparados 200mL de peptona 0,5% +
Mn (300mg/L) distribuídos em 4 vias de erlenmeyer a um pH 4,0 e incubados a
temperatura de 32°C e 37°C, sendo adicionado em 3 vias 5 mL de consórcio
microbiano. O mesmo procedimento foi realizado para o pH 7,0. Para realização da
amostra “branco” foi preparado 100 mL de peptona 0,5% sem Mn e incubados a
32°C e 37°C em estufas bacteriológicas.
24
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES
Segundo Amadori (2009), um dos métodos mais identificados para quantificar a
atividade microbiológica do solo é através da respiração dos microrganismos. Sendo
ela um processo respiratório dos microrganismos aeróbicos é determinada através
de titulação, capturando pelo NaOH o CO2 que está sendo liberado, representando a
respiração proveniente da atividade das bactérias.
No entanto, a respiração avaliada pela determinação de CO2 que foi liberado,
ocorreu após o período de incubação de 18 dias, foram abertos as jarras e o NaOH
presente em cada amostra foi titulado com ácido clorídrico (HCl) 0,5M, com 1mL de
BaCl2 e 3 gotas de fenolftaleína. Os valores obtidos estão expressos na tabela 3:
Tabela 3 - Primeira determinação de CO2
Béquer Componente Valor gasto na titulação (mL)
1 Com manganês 50,0
2 Com bactéria 36,3
3 Consórcio 1 36,1
4 Consórcio 3 42,0
5 Branco 50,0
6 Consórcio 2 40,5
Fonte: Autoria própria, 2016.
Após essa análise, foram incubadas novamente as amostras com um béquer
de NaOH para cada amostra e transcorrido mais 14 dias, as jarras foram abertas e o
NaOH presente foi titulado para a segunda determinação de CO2. Os valores obtidos
estão na tabela 4.
25
Tabela 4: Segunda determinação de CO2
Béquer Componente Valor gasto na titulação (mL)
1 Com manganês 33,7
2 Com bactéria 29,4
3 Consórcio 1 29,6
4 Consórcio 3 28,9
5 Branco 33,9
6 Consórcio 2 28,3
Fonte: Autoria própria, 2016.
A partir desses valores o cálculo da respiração microbiana foi feito utilizando-
se o método da titulação com captura de CO2 por NaOH, a equação empregada no
cálculo para a quantificação está demonstrada abaixo (Equação 1):
Equação 1. CO2 = ((Vb-Va) x 1,1 x 1000)
PSS
Sendo:
Vb = volume de HCl (mL), gasto na titulação do NaOH do controle;
Va = volume de HCl (mL), gasto na titulação de NaOH da mostra;
1,1 = fator de conversão (1 mL de NaOH 0,5 M = 1 mg de CO2);
PPS = peso do solo seco.
(Dado: CO2(controle) = 75,2 mL)
Portanto para realização do cálculo, foi necessário fazer a soma das duas
titulações realizadas, as quais seguem na tabela 5:
26
Tabela 5: Soma das determinações de CO2
Béquer Componentes Valores gastos na
titulação (mL)
Soma do valor
total (mL)
1 Com manganês 50,0 + 29,6 83,7
2 Com bactéria 36,6 + 29,4 65,7
3 Consórcio 1 36,1 + 29,6 65,7
4 Consórcio 3 42,0 + 28,9 70,9
5 Branco 50,0 + 33,9 83,9
6 Consórcio 2 40,5 + 28,3 68,8
Fonte: Autoria própria, 2016.
Seguindo a metodologia citada por Amadori et al. (2009), a metodologia padrão
de respiração microbiana, obteve os resultados expressos na tabela 6 a seguir:
Tabela 6: Resultados finais da liberação de CO2
Béquer Componentes CO2 liberado
1 Com manganês 0,209
2 Com bactéria 0,141
3 Consórcio 1 0,095
4 Consórcio 3 - 0,191
5 Branco 0,209
6 Consórcio 2 - 0,187
Fonte: Autoria própria, 2016.
Os resultados mostram que os solos que possuíam consórcio obtiveram uma
média mais baixa de respiração microbiana quando comparado com as outras
amostras de solos.
27
Na determinação do potencial biorredutor do consórcio microbiano, o
crescimento celular das bactérias foi acompanhado por medidas de absorbância de
600 nm em espectrofotômetro por um período de 5 dias. Os resultados obtidos estão
expressos na tabela 7 e 8, sendo demostrados os gráficos nas figuras 4 e 5:
Tabela 7 - Avaliação da curva de crescimento referente ao pH 4,0.
Tempo (dia) Comprimento de Onda (nm)
32°C 37°C
T0 0,427 0,496
T1 0,474 0,510
T2 0,699 0,550
T3 0,49 0,554
T4 0,446 0,524 Fonte: Autoria própria, 2016.
Figura 4: Curva de crescimento do consórcio para o pH 4,0.
Fonte: Autoria própria, 2016.
Tabela 8: Avaliação da curva de crescimento referente ao pH 7,0.
Fonte: Autoria própria, 2016.
Tempo (dia) Comprimento de Onda (nm)
32°C 37°C
T0 0,543 0,545
T1 0,787 0,553
T2 1,035 0,809
T3 0,721 0,706
T4 0,770 0,647
28
Figura 5 - Curva de Crescimento do Consórcio para o pH 7,0
Fonte: Autoria própria, 2016.
A partir dos parâmetros ideais encontrados, o melhor planejamento fatorial
observado foi pH 7,0 a 32°C, onde demostrou um melhor desenvolvimento
microbiano.
Portanto o resultado está de acordo com a literatura, onde segundo Tortora et
al. (2012) afirma que para um crescimento ideal de bactérias o pH deve ser neutro,
em uma faixa estreita de pH 6,5 – 7,5. Já em um pH abaixo de 4 é muito difícil o
crescimento de bactérias, portanto o procedimento experimental explica o melhor
resultado do planejamento fatorial. A temperatura de 32°C é onde ocorre o melhor
desenvolvimento dessas bactérias, ou seja, é aquela que permite um
desenvolvimento mais rápido, que irá variar para cada espécie de microrganismo.
Ela permite que o microrganismo expresse o seu potencial máximo metabólico.
No entanto, a partir desses experimentos é possível afirmar que a
biorremediação é uma alternativa ecologicamente adequada e eficaz para o
tratamento do meio ambiente contaminado com moléculas de difícil degradação,
assim como o Mn que em altas concentrações é prejudicial à saúde humana, animal
e vegetal.
Conforme Gaylarde (2005), as moléculas de difícil degradação são
denominadas “recalcitrantes” (não biodegradáveis), portanto o processo biológico de
descontaminação, enquadrados na categoria de biorremediação, deve ser por
microrganismos autóctones, ou seja, do próprio ambiente para degradar estes
metais, resultando em produtos de degradação com estrutura menos recalcitrante
em relação à molécula original.
29
6 CONCLUSÃO
Conforme estudos, a biorremediação, assim como as demais técnicas químicas
de degradação, tem como objetivo principal a mineralização completa dos
contaminantes, ou seja, transformá-los em produtos com pouca ou nenhuma
toxicidade (inócuos), como CO2 e água. Em suma, os microrganismos metabolizam
as substâncias orgânicas, das quais se obtêm nutrientes e energia. Sendo que, para
que isso ocorra, os microrganismos devem estar ativos para desempenharem a sua
tarefa de biodegradação. (EPA apud ANDRADE et al., 2010).
No consórcio testado os microrganismos mostraram capacidade de biorreduzir,
pois a curva de crescimento teve comportamento de acordo com o estudo de Tortora
et al. (2012) que afirma que os microrganismos requerem um pH na faixa neutra pra
atingir um crescimento microbiano ideal. Assim nos mostra que o estudo realizado
produz efeitos positivos para uma tentativa de biorremediação de Mn.
Portanto a partir dos resultados obtidos, pode-se concluir que dentro das
linhagens bacterianas testadas é possível fazer a redução da concentração do metal
Mn em solos contaminados.
Porém, os interferentes como a temperatura e o pH, são fatores que modificam
o processo de biorremediação, pois influenciam no crescimento dos microrganismos,
portanto se a temperatura for alta e o pH ácido, não haverá crescimento adequado
para uma possível biorremediação. Esse processo de crescimento é dependente de
reações químicas que são alteradas pela temperatura e pH, portanto ela pode afetar
a taxa de crescimento, assim como o tipo de reprodução.
Sendo assim, essa análise de Biorremediação pode ser uma tecnologia capaz
de resolver determinados problemas ambientais, a qual visa detoxificar o solo ou
outros ambientes contaminados através do uso de microrganismos nativos ou
adaptados, degradando substâncias ou compostos perigosos aos seres humanos e
transformá-los em substâncias com pouca ou nenhuma toxicidade. Embora ainda
precise de mais estudos sobre este assunto, esta se apresenta como técnica
promissora para minimizar alguns agravos do meio ambiente.
30
REFERÊNCIAS
AGOURAKIS, Demetrios Chiuratto; DE CAMARGO, Iara Maria Carneiro; COTRIM, Marycel Barboza; FLUES, Marlene. Comportamento de Zinco e Manganês de pilhas alcalinas em coluna de solo. Quim. Nova, v. 29, n. 5, p. 960-964, Junho 2006. AMADORI, Caroline; FUMAGALLI, Luis Gustavo; DE MELLO, Nilvania Aparecida. Análise de métodos quantitativos de atividade microbiana em diferentes sistemas de manejo. Synergismuss cyentifica UTFPR. Pato Branco-PR, 2009. ANDRADE, Juliano de Almeida; JARDIM Fabio Augusto & Isabel Cristina Sales Fontes. Biorremediação de solos contaminados por petróleo e seus derivados. Eclética Química, v. 35, n. 3, p. 17-43, 2010. DAMIÃO, A.; RAMOS, A. Manganês. Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto, Portugal. Disponível em: <http://www.ff.up.pt/toxicologia/monografias/ano0405/manganes/manganes.htm>. Acesso em junho de 2016. GAYLARDE, Christine Claire; BELLINASO, Maria de Lourdes; MANFIO, Gilson Paulo. Biorremediação. Biotecnologia Ciência e Desenvolvimento, n. 34, p. 36-43, Jan/Jun 2005. JUNIOR, Michael J. Pelczar; CHAN, E.C.S.; KRIEG, Noel R. Microbiologia: conceitos e aplicações. São Paulo: Pearson Makron Books, 1997. ROCHA, Julio Cesar; ROSA, André Henrique; CARDOSO, Arnaldo Alves. Introdução à química ambiental. São Paulo: Bookman, 2009. ROCHA, Renan Azevedo da; AFONSO, Júlio Carlos. Manganês. Química Nova, v. 34, n. 2, p. 103-105, Maio 2012. SIQUEIRA, José Oswaldo; MOREIRA, Fátima M. S. Microbiologia e bioquímica do solo. Minas Gerais: UFLA, 2006. TORTORA, Gerard J.; FUNKE, Berdell R.; CASE, Christine L. Microbiologia. 6. ed. São Paulo: Artmed, 2005. TORTORA, Gerard J.; FUNKE, Berdell R.; CASE, Christine L. Microbiologia. 10. ed. São Paulo: Artmed, 2012.