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TAYANE GUEDES GONÇALVES

USO DE CONSÓRCIO MICROBIANO AUTÓCTONE DE ÁREAS IMPACTADAS,

COMO ALTERNATIVA PARA REDUÇÃO DE MANGANÊS EM SOLO

CONTAMINADO

CANOAS, 2016


USO DE CONSÓRCIO MICROBIANO AUTÓCTONE DE ÁREAS IMPACTADAS,

COMO ALTERNATIVA PARA REDUÇÃO DE MANGANÊS EM SOLO

CONTAMINADO

Trabalho de conclusão apresentado ao Curso de Química do Centro Universitário La Salle – Unilasalle, como exigência parcial para a obtenção do grau de Bacharela em Química.

Orientador: Prof. Dr. Delmar Bizani

CANOAS, 2016


USO DE CONSÓRCIO MICROBIANO AUTÓCTONE DE ÁREAS

IMPACTADAS, COMO ALTERNATIVA PARA REDUÇÃO DE

MANGANÊS EM SOLO CONTAMINADO.

Trabalho de conclusão aprovado como requisito parcial para a obtenção do grau de Bacharela em Química pelo Centro Universitário La Salle – Unilasalle.

Aprovado pelo avaliador em 06 de julho de 2016.

AVALIADOR:

________________________________ Prof. Dr Delmar Bizani

Unilasalle

Aos meus familiares que, com muito carinho е apoio, não mediram esforços

para que eu chegasse até esta etapa de minha vida.

AGRADECIMENTOS

A Deus por ter me dado força e sabedoria durante essa jornada.

Aos meus pais pelo amor, incentivo e dedicação, pois sem eles nada disto

seria possível.

Ao meu namorado, pela paciência e cooperação, estando sempre presente

em minha vida.

A todos os professores que a mim repassaram seus conhecimentos. Em

especial ao meu orientador Delmar, pelo auxílio e incentivo na elaboração deste

trabalho.

E as colegas que correm atrás deste mesmo sonho em busca de um único

objetivo e que hoje certamente são minhas grandes amigas.

RESUMO

O manganês e seus compostos, apesar de serem essenciais aos seres vivos em

baixas concentrações, são muito tóxicos em concentrações elevadas. Eles existem

na atmosfera na forma de partículas, resultantes da erosão do solo, emissões

industriais e vulcânico, assim como da queima de gasolina contendo TMM

(tricarbonil metilciclopentadienil manganês), sendo um líquido volátil de coloração

alaranjada, insolúvel em água e usado como aditivo. No solo, este material

particulado contendo Mn pode ser emitido para o ar, e o estado de oxidação do

metal pode ser alterado por atividade microbiológica. Sendo um nutriente essencial

em pequenas quantidades para muitos organismos vivos, incluindo o ser humano, é

válido lembrar que o perigo está no excesso desse metal pesado, bem como a sua

deficiência pode causar uma série de problemas orgânicos. O estudo tem como

proposta avaliar a redução das concentrações de Mn em amostras de solo através

de bioprocessos, utilizando um consórcio bacteriano autóctone proveniente de áreas

impactadas e possíveis interferências na capacidade fisiológica dos microrganismos

em remediar o Mn. Após a contaminação, o solo foi submetido a análises físicas e

químicas para a caracterização e determinação do ponto de partida. Foram

realizadas análises microbiológicas para o monitoramento do crescimento

microbiano, no qual o Manganês foi monitorado quantitativamente, e a partir dessas

análises realizadas foi possível observar que os microrganismos têm crescimento

ideal a uma faixa de pH neutra e a uma temperatura de 32°C, sendo assim, os

microrganismos estão ativos para desempenharem a sua tarefa de biodegradação.

Portanto a partir desses resultados obtidos, pode-se concluir que dentro das

linhagens bacterianas testadas é possível reduzir a concentração do metal Mn em

solos contaminados.

Palavras-chave: Biorremediação. Consórcio. Manganês.

ABSTRACT

The manganese and its compounds, although they are essential to living organisms

at low concentrations, are highly toxic at high concentrations. They exist in the

atmosphere in the form of particles resulting from soil erosion, industrial and volcanic

emissions, and combustion of fuel containing MMT (tricarbonyl

methylcyclopentadienyl manganese), and a volatile liquid orange color, insoluble in

water and used as additive. In soil, the particulate material containing Mn can be

emitted into the air, and metal oxidation state can be changed by microbiological

activity. Being an essential nutrient in small amounts for many living organisms,

including humans, it is worth remembering that the danger is in excess of this heavy

metal, and its deficiency can cause a number of physical problems. The study aims

to evaluate the reduction of Mn concentrations in soil samples through bioprocesses,

using autochthonous bacterial consortium from impacted areas and possible

interference on the physiological ability of microorganisms to remedy the Mn. After

contamination, the soil was subjected to physical and chemical analysis for the

characterization and determination of the starting point. Microbiological analyzes

were performed for the monitoring of microbial growth, in which the manganese was

monitored quantitatively and from these analyzes it was observed that the

microorganisms have optimum growth at a neutral pH range and a 32° C, and thus,

the microorganisms are enabled to perform its task biodegradation. So from these

results, it can be concluded that within the tested bacterial strains is possible to

reduce the concentration of Mn metal contaminated soil.

Keywords: Bioremediation. Consortium. Manganese.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Principais formas, transformações e fluxos dos metais no sistema

solo-planta.......................................................................................... 17

Figura 2 - Esquema simplificado da interação célula-metal que contribui para

acumulação e detoxificação dos metais para os

microrganismos................................................................................. 18

Figura 3 - Procedimento para determinação de CO2........................................................... 22

Figura 4 - Curva de crescimento do consórcio para o pH 4,0........................... 27

Figura 5 - Curva de crescimento do consórcio para o pH 7,0........................... 28

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Determinação de CO2..................................................................... 22

Tabela 2 - Planejamento fatorial...................................................................... 23

Tabela 3 - Primeira Determinação de CO2...................................................... 24

Tabela 4 - Segunda Determinação de CO2..................................................... 25

Tabela 5 - Soma das determinações de CO2.................................................. 26

Tabela 6 - Resultados finais da liberação de CO2........................................... 26

Tabela 7 - Avaliação da curva de crescimento referente ao pH 4,0................ 27

Tabela 8 - Avaliação da curva de crescimento referente ao pH 7,0................ 27

LISTA DE ABREVIATURAS

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

Mn Manganês

IDR

SOD

Ingestão Diária Recomendada

Superóxido Dismutase

BHI Brain Heart Infusion (meio de cultura)

mL Mililitros

g Gramas

mg Miligramas

µg Micrograma

min Minutos

M Molaridade

nm Nanômetros

atm

L

Atmosfera

Litros

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ....................................................................................... 11

2 OBJETIVOS ........................................................................................... 13

2.1 Objetivo geral ....................................................................................... 13

2.2 Objetivo específico .............................................................................. 13

3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ............................................................. 14

3.1 Manganês .............................................................................................. 14

3.1.1 Propriedades físicas .............................................................................. 14

3.1.2 Propriedades químicas .......................................................................... 14

3.1.3 Meio ambiente e organismo .................................................................. 14

3.1.4 Toxicidade .............................................................................................. 15

3.2 Microbiologia ........................................................................................ 16

3.2.1 Microbiologia do solo ............................................................................. 16

3.3 Biorremediação ..................................................................................... 18

3.3.1 Fatores físicos e químicos .................................................................... 19

3.3.2 Fatores biológicos .................................................................................. 19

4 METODOLOGIA ..................................................................................... 21

5 RESULTADOS E DISCUSSÕES ........................................................... 24

6 CONCLUSÃO ......................................................................................... 29

REFERÊNCIAS ...................................................................................... 30

11

1 INTRODUÇÃO

A água e o solo são recursos indispensáveis à sobrevivência humana e de

função vital no ciclo produtivo, sua contaminação pode ser causada por diversas

substâncias, tais como compostos orgânicos e metais, deste último grupo podemos

destacar o manganês que apesar de ser um metal de grande importância à vida, em

altas concentrações pode ser prejudicial à saúde humana.

Na cadeia produtiva, o processo industrial, além dos produtos de interesse

econômico que são gerados, ocorre também à geração de subprodutos que muitas

vezes não possuem valor econômico, estes últimos são denominados resíduos. Tais

resíduos devido ao fato de não possuírem aplicação seja dentro da própria indústria,

nem de outras indústrias e muitas vezes devido ao alto custo para sua

transformação em algum produto com utilidade e que possa ser comercializado ou

reutilizado, muitas vezes o descarte desse material é feito de forma inadequada

acarretando a poluição de solos e águas. Podemos também mencionar que devido a

imposições dos órgãos de controle ambiental, em alguns estados da Federação,

toda indústria tem de realizar seu descarte a montante do seu ponto de coleta de

água, assim caso haja o despejo de efluente contaminado a indústria não somente

estaria causando impactos aos rios e a todos que o utilizam, mas também

prejudicando o seu próprio processo, uma vez que para grande maioria dos

processos se faz necessária à utilização de água com qualidade elevada.

O manganês é essencial aos seres vivos em baixas concentrações, mas em

concentrações elevadas é muito tóxico. Ele existe na atmosfera na forma de

partículas, resultantes da erosão do solo, emissões industriais e vulcânico, assim

como da queima de gasolina contendo TMM (tricarbonil metilciclopentadienil

manganês), sendo um líquido volátil de coloração alaranjada, insolúvel em água e

usado como aditivo. Essas partículas apresentam meia-vida em torno de 7 a 10 dias.

No solo, este material particulado contendo Mn pode ser emitido para o ar, e o

estado de oxidação do metal pode ser alterado por atividade microbiológica. Sendo

um nutriente essencial em pequenas quantidades para muitos organismos vivos,

incluindo o ser humano, principalmente em processos reprodutivos, manutenção da

estrutura óssea e funcionamento do sistema nervoso. É válido lembrar que o perigo

está no excesso desse metal pesado, bem como a sua deficiência pode causar uma

série de problemas orgânicos, entre eles, perda de peso, além de afetar a função

12

pancreática e o metabolismo de carboidratos, prejuízo do crescimento,

anormalidades no esqueleto, diminuição na função reprodutora de fêmeas e

degeneração testicular em machos. Nas plantas exerce efeitos negativos sobre o

crescimento e afetam os processos bioquímicos, ou seja, causa grave riscos

ambientais, devido às capacidades de migração, bioacumulação e biomagnificação.

A utilização de processos de biorremediação é feito com o objetivo de se

preservar os recursos financeiros, diminuição do período de descontaminação, bem

como dos gastos expressivos para minimizar os impactos no meio ambiente, se

comparados a outras tecnologias de remediação.

13

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

O estudo tem como proposta avaliar a redução das concentrações de Mn em

amostras de solo através de bioprocessos, utilizando um consórcio bacteriano

autóctone proveniente de áreas impactadas e possíveis interferências na capacidade

fisiológica dos microrganismos em remediar o Mn.

2.2. Objetivos específicos

a) Avaliar a interação do possível consórcio de microrganismos com potencial

biorredutor;

b) determinar o potencial biorredutor do consórcio microbiano em amostras

matrizes de solos contaminados com Mn, através de avaliação dos

parâmetros: curva de crescimento e potencial de biorredução;

c) avaliar os interferentes no processo de biorremediação através da

modificação dos parâmetros: temperatura e pH.

14

3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

3.1 Manganês

O manganês é um metal de transição pertencente ao grupo 7 da Tabela

Periódica e consiste de uma única espécie atômica, 55Mn. Ele decompõe-se

lentamente a água à temperatura ambiente e mais rapidamente quando quente. É

facilmente dissolvido em soluções diluídas de ácidos (inclusive não oxidantes),

formando íons Mn2+.

3.1.1 Propriedades físicas

O manganês é um dos elementos mais abundantes na crosta terrestre e

encontra-se largamente distribuído em solos, sedimentos, rochas, água e materiais

biológicos. Em sua forma natural ele é composto por um isótopo estável, o 55Mn.

O manganês é um metal cinza escuro, duro e quebradiço. Quimicamente ele é bastante reativo. Na forma de pó, o metal é lentamente oxidado pelo oxigênio atmosférico, chegando mesmo a ser pirofórico. Na forma maciça, o manganês somente reage com O2 quando aquecido. (ROCHA; AFONSO, 2012, p.103).

3.1.2 Propriedades químicas

O estado de oxidação do manganês é notável por ser um elemento que

apresenta 11 estados de oxidação (alguns bastante incomuns), de -3 até +7. Sendo

o mais estável deles é o +2, correspondendo ao íon Mn2+.

O manganês possui configuração 1s2 2s

2 2p

6 3s

2 3p

6 4s

2 3d

5, e a remoção

dos elétrons do orbital 4s produz um íon com configuração final d5 (orbital

preenchido pela metade) de grande estabilidade. O íon Mn2+

é estável no estado sólido e em soluções ácidas. (ROCHA; AFONSO, 2012, p.104).

3.1.3 Meio ambiente e organismo

O manganês é um mineral essencial em todos os organismos vivos. Ele

participa das enzimas fosfotransferases (que atuam no crescimento das plantas) e

no processo de fotossíntese (etapa de foto-oxidação da água, com liberação de O2

15

pelos cloroplastos). O elemento é o 3o metal de transição mais importante em nossa

dieta (após ferro e zinco). Segundo a ANVISA recomenda-se uma ingestão diária

(IDR) de 5 mg. As principais fontes são cereais integrais, legumes, verduras e frutas.

Em média, segundo estudos realizados um organismo adulto pode conter no

máximo 20 mg de Manganês concentrado nos rins, pâncreas, fígado e, mais

importante nos ossos. Bem como em altas concentrações ele é prejudicial e em sua

deficiência ele causa sintomas como: perda de peso, fadiga, redução da fertilidade,

dermatite, perturbação no metabolismo de ossos e cartilagens, alteração da síntese

de insulina, redução da taxa de colesterol no sangue, intensificação de reações

alérgicas e inflamatórias e malformações fetais. (ROCHA; AFONSO, 2012, p. 104).

No organismo humano, o manganês está presente em pequenas doses e um

dos componentes da enzima (SOD: superóxido dismutase) é um poderoso

antioxidante que ajuda a combater radicais livres. O Manganês é um poderoso

antioxidante que procura os radicais livres no corpo e consegue neutralizar estas

partículas prejudiciais e prevenir qualquer perigo potencial que elas possam causar.

Cabe citar que o manganês utilizável biologicamente é o Mn2+, e o elemento nos

demais números de oxidação é tóxico. Contudo, o excesso de Mn2+ causa desordens

neurológicas e motoras, como o Parkinson, e problemas respiratórios.

3.1.4 Toxicidade

Agourakis et al. (2006) definem que a contaminação começa pela disposição

inadequada, nos lixões, ou seja, em aterros não controlados para onde é destinada

a maior parte dos resíduos sólidos domiciliares do Brasil. Através do vazamento

gradativo dos metais tóxicos, atingi diretamente o solo. No entanto, os metais

tendem com o tempo a migrar para os demais compartimentos do ecossistema, até

atingirem diretamente o ser humano. Sabe-se que são os metais tóxicos aqueles

que representam maior risco ambiental, devido às capacidades de migração,

bioacumulação e biomagnificação.

Nos seres vivos o manganês pode causar dermatite, diminuição do colesterol

sérico, diminuição dos fatores coagulantes dependentes da vitamina K, aumento dos

níveis sanguíneos de cálcio e fósforo, infertilidade, diminuição do metabolismo da

glucose, diminuição do metabolismo proteico, diminuição do crescimento e distúrbios

ao nível do esqueleto, disfunção pancreática, aumento da pressão sanguínea,

http://www.saudedica.com.br/manganes/

http://www.saudedica.com.br/manganes/

16

redução da função imune, depressão da atividade das glândulas mamárias e

anormalidades nas mitocôndrias. (DAMIÃO & RAMOS, 2004/2005).

3.2 Microbiologia

É a ciência que estuda os microrganismos e suas atividades. Preocupa-se com

a forma, estrutura, reprodução, fisiologia, metabolismo e a identificação dos seres

microscópicos. Inclui o estudo de sua distribuição natural, suas relações recíprocas

e com outros seres vivos, seus efeitos benéficos e prejudiciais sobre os homens;

suas alterações físicas e químicas que provocam em seu meio ambiente. Está

associada ao estudo das células vivas e ao seu funcionamento:

Há duas áreas principais de estudos no campo da microbiologia: microbiologia básica, que estuda a natureza fundamental e as propriedades dos microrganismos, e microbiologia aplicada, em que a informação aprendida na microbiologia básica é empregada para controlar e usar os microrganismos de maneira benéfica. (PELCZAR JR; CHAN; KRIEG, 1997).

Segundo Pelczar et al. (1997) a microbiologia básica abrange as descobertas

cientificas que conduzem ao conhecimento fundamental sobre as células e a

população microbiana. As aplicações da microbiologia são ilimitadas e variadas em

suas áreas. Os principais campos de aplicação da microbiologia incluem aqueles

que focalizam a medicina, alimentos e laticínios, agricultura, indústria ou ambiente.

3.2.1 Microbiologia do solo

A microbiologia do solo é a ciência que estuda e trata os microrganismos que

vivem neste ambiente, ou seja, que habitam e participam da dinâmica desses

processos importantes no solo como as atividades metabólicas, fluxo de energia,

ciclagem e transporte de nutrientes e etc. Os principais micro-organismos do solo

são representados pelas bactérias, fungos, protozoários, vírus, entre outros.

O mais importante processo químico a influenciar o componente e a biodisponibilidade de metais em solos será associado à adsorção de metais na fase sólida e na fase líquida. Esses processos controlam a concentração de íons metálicos e seus complexos na solução do solo e exercem grande influência no seu acúmulo em plantas. (ROCHA; ROSA; CARDOSO, 2009).

17

Conforme Siqueira e Moreira (2006) os metais são encontrados em diversas

formas no solo, como: solúveis em água, retidos nos sítios de troca, insolúveis

precipitados pelos óxidos de Fe e Mn, como minerais primários, nos compostos

orgânicos e inorgânicos adicionados pelos resíduos, dentre outras maneiras.

Mostrado na figura 1, esses elementos, quando presentes em resíduos

orgânicos vegetais, animais e outros, como lodo de esgoto, são liberados mediante

biodegradação, produzindo quelatos orgânicos e metais livres, os quais vão para a

biomassa, entram nas diversas formas do estoque de metais do solo ou são

absorvidos pelas plantas ou, ainda, lixiviados. Essas transformações e outras

maneiras de interação microrganismos-metais envolvem adsorção e dessorção,

oxidação autotrófica e enzimática, absorção e bioacumulação na biomassa (figura

2) e transformações indiretas resultantes da atividade dos heterotróficos. (SIQUERIA

e MOREIRA, 2006, p. 389).

Figura 1 - Principais formas, transformações e fluxos dos metais no sistema solo-

planta. (Modificado de Stevenson, 1986.)

Fonte: SIQUEIRA; MOREIRA (2006, p.?)

18

Figura 2 - Esquema simplificado da interação célula-metal que contribui para

acumulação e detoxificação dos metais para os microrganismos. (Modificado de

Gomes et al., 1998.)

Fonte: SIQUEIRA; MOREIRA (2006, p.).

Segundo Tortora et al. (2005), populações de bactérias do solo são geralmente

estimadas utilizando-se contagem em placas em meio nutriente, e os números

atuais são provavelmente subestimados por esse método. Nenhum meio nutriente

ou condição de crescimento pode encontrar todos os nutrientes e outras exigências

necessárias para todos os microrganismos do solo.

3.3 Biorremediação

Gaylarde et al. (2005) afirmam que a biorremediação é um processo no qual,

organismos vivos, normalmente plantas ou microrganismos, são utilizados

tecnologicamente para remover ou reduzir (remediar) poluentes do meio ambiente.

Tem sido intensamente pesquisado este processo biotecnológico de remediação e

recomendado por científicos como uma alternativa viável para o tratamento de

ambientes contaminados, como águas superficiais, subterrâneas e solo, além de

resíduos e efluentes industriais em aterros ou áreas de contenção.

19

Embora outras tecnologias que usam processos físicos e/ou químicos sejam

também indicadas para descontaminar ambientes poluídos, o processo biológico de

biorremediação é uma alternativa tecnologicamente mais adequada e eficaz para o

tratamento de ambientes contaminados com moléculas orgânicas de difícil

degradação e metais tóxicos.

3.3.1 Fatores físicos e químicos

Gaylarde et al. (2005) explicam que os principais parâmetros físicos que

influenciam na degradabilidade são: natureza física da matriz onde o composto é

encontrado (solo, água, sedimento), temperatura e luz. Como por exemplo,

ambientes complexos, como solo e sedimentos, têm a propriedade de, através da

atração de cargas opostas, adsorver moléculas, diminuindo, desta maneira, a

biodisponibilidade do poluente. Em regiões temperadas do globo, a atividade

metabólica de microrganismos pode ser reproduzida em função das baixas

temperaturas médias anuais, reduzindo, consequentemente, a taxa de degradação

de poluentes nestas áreas.

Portanto, diversos fatores químicos podem influenciar, acelerando ou

reduzindo, a taxa de degradação de um poluente. Entre estes fatores incluem-se a

composição química da matriz ambiental, a qual define a capacidade nutritiva, o pH,

umidade, teor de oxigênio dissolvido, o potencial redox do meio e a composição e a

estrutura química do poluente. Metais pesados, quando presentes, podem interagir

com enzimas produzidas pelos microrganismos, inibindo a sua atividade e, por

conseguinte, a capacidade degradativa deste. Por outro lado, concentrações

adequadas de metais que têm ação de cofatores enzimáticos podem melhorar a

capacidade degradativa do meio. (GAYLARDE; BELLINASO; MANFIO, 2005)

3.3.2 Fatores biológicos

A biodegradação de um composto químico no meio ambiente depende,

sobretudo, da presença de uma população de microrganismos capaz de metabolizar

a molécula original e seus produtos de degradação. Obviamente, as características

físico-químicas e nutricionais do meio externo e do compartimento intracelular

microbiano estão estritamente relacionadas. Mesmo que um sistema microbiano

20

porte todos os requisitos bioquímicos e genéticos necessários para a degradação de

um xenobiótico, se as características físico-químicas e componentes nutricionais do

meio não condizem com as necessidades metabólicas do microrganismo, a

biodegradação não ocorrerá. (GAYLARDE; BELLINASO; MANFIO, 2005).

21

4 METODOLOGIA

O processo metodológico foi dividido em cinco etapas para melhor

compreensão e demanda das atividades laboratoriais.

1) Seleções de microrganismos para o consórcio

Foi realizada uma seleção de linhagens bacterianas disponíveis na coleção de

microrganismos do Laboratório de Microbiologia e Bioquímica de Microrganismos do

UNILASALLE/RS. Foram utilizadas cinco linhagens nos consórcios testados, sendo

escolhidas pelo histórico de remediar localidades contaminadas por manganês.

2) Método de seleção do consórcio microbiano com maior taxa de remediação

Todos os consórcios bacterianos foram testados frente às soluções contendo

concentração definida de manganês (300 mg.L-1) em meio de cultura líquido (BHI),

por um intervalo de 72 horas à 32ºC, temperatura em estufa bacteriológica.

3) Utilização do consórcio bacteriano na biorremediação de manganês em solo

Por testes prévios, indicados no melhor momento, foram selecionados 5

linhagens bacterianas com capacidade de remediar o manganês. Em 3 tubos foram

adicionados 10 mL de meio de cultura BHI e 1 mL de cada bactéria por tubo (50µL)

e colocado em estufa a 31°C por 3 dias. Transcorrido este período, ocorreu a

sulfatação nas bactérias formando 3 consórcios. Após foram utilizados copos de

béquer com aproximadamente 50 g de solo, juntamente com o consórcio microbiano

e solução de 300 mg.L-1 de Mn, foram incubados em jarras microaerofilia, por um

período de 15 dias à temperatura ambiente (o experimento foi conduzido em

triplicata).

4) Determinação de CO2

Outro fator que foi determinado é a respiração microbiana, ou seja, o quanto de

CO2 era produzido pelos microrganismos durante o processo. Esse parâmetro foi

determinado através da técnica de respirometria (utilização de solução 0,5 mol L-1 de

NaOH), por titrimetria de neutralização.

As massas utilizadas estão descritas na tabela 1 abaixo:

22

Tabela 1: Determinação de CO2

Béquer Massa de solo Componentes

1 50,0338g Com manganês

2 50,0644g Com bactéria

3 50,0173g Consórcio 1


5 50,0171g Branco


Fonte: Autoria própria, 2016.

O solo foi autoclavado a 121°C, a 1,5 atm por 10 min., para garantir

esterilidade e pureza. Após, foram inseridos no solo 5 mL de consórcio e 5 mL de

manganês, procedendo-se assim à vedação das jarras microaerofilia e

acondicionando em local escuro, a temperatura ambiente, por 32 dias. Juntamente

com as amostras foram colocados um béquer em cada jarra microaerofilia contendo

30 mL de NaOH para determinação de CO2 liberado, conforme figura 3. Passados

os primeiros 18 dias, ocorreu a titulação das amostras e na sequência nova

incubação. Após o período de incubação foi feita novamente outra titulação.

Figura 3 - Procedimentos para determinação de CO2.


23

5) Determinar o potencial biorredutor do consórcio microbiano, através de

avaliação dos parâmetros: curva de crescimento, temperatura e pH

Para determinação do potencial biorredutor foi utilizado à técnica de

planejamento fatorial do tipo 2k, onde, dois níveis com duas variáveis gerando 22

formam 4 parâmetros a serem analisados. Portanto as variáveis e níveis utilizados

para realizar os testes do consórcio foram:

a) Temperatura de incubação: 32°C e 37°C

b) pH: 4,0 e 7,0

Para realização do planejamento completo, é necessário fazer todas as

combinações possíveis dos níveis de fatores, conforme tabela 2:

Tabela 2: Planejamento fatorial

pH Temperatura

4 32°C

4 37°C

7 32°C

7 37°C


Para realização desses fatores foram preparados 200mL de peptona 0,5% +

Mn (300mg/L) distribuídos em 4 vias de erlenmeyer a um pH 4,0 e incubados a

temperatura de 32°C e 37°C, sendo adicionado em 3 vias 5 mL de consórcio

microbiano. O mesmo procedimento foi realizado para o pH 7,0. Para realização da

amostra “branco” foi preparado 100 mL de peptona 0,5% sem Mn e incubados a

32°C e 37°C em estufas bacteriológicas.

24

5 RESULTADOS E DISCUSSÕES

Segundo Amadori (2009), um dos métodos mais identificados para quantificar a

atividade microbiológica do solo é através da respiração dos microrganismos. Sendo

ela um processo respiratório dos microrganismos aeróbicos é determinada através

de titulação, capturando pelo NaOH o CO2 que está sendo liberado, representando a

respiração proveniente da atividade das bactérias.

No entanto, a respiração avaliada pela determinação de CO2 que foi liberado,

ocorreu após o período de incubação de 18 dias, foram abertos as jarras e o NaOH

presente em cada amostra foi titulado com ácido clorídrico (HCl) 0,5M, com 1mL de

BaCl2 e 3 gotas de fenolftaleína. Os valores obtidos estão expressos na tabela 3:

Tabela 3 - Primeira determinação de CO2

Béquer Componente Valor gasto na titulação (mL)

1 Com manganês 50,0

2 Com bactéria 36,3

3 Consórcio 1 36,1

4 Consórcio 3 42,0

5 Branco 50,0

6 Consórcio 2 40,5


Após essa análise, foram incubadas novamente as amostras com um béquer

de NaOH para cada amostra e transcorrido mais 14 dias, as jarras foram abertas e o

NaOH presente foi titulado para a segunda determinação de CO2. Os valores obtidos

estão na tabela 4.

25

Tabela 4: Segunda determinação de CO2

Béquer Componente Valor gasto na titulação (mL)



3 Consórcio 1 29,6

4 Consórcio 3 28,9

5 Branco 33,9

6 Consórcio 2 28,3


A partir desses valores o cálculo da respiração microbiana foi feito utilizando-

se o método da titulação com captura de CO2 por NaOH, a equação empregada no

cálculo para a quantificação está demonstrada abaixo (Equação 1):

Equação 1. CO2 = ((Vb-Va) x 1,1 x 1000)

PSS

Sendo:

Vb = volume de HCl (mL), gasto na titulação do NaOH do controle;

Va = volume de HCl (mL), gasto na titulação de NaOH da mostra;

1,1 = fator de conversão (1 mL de NaOH 0,5 M = 1 mg de CO2);

PPS = peso do solo seco.

(Dado: CO2(controle) = 75,2 mL)

Portanto para realização do cálculo, foi necessário fazer a soma das duas

titulações realizadas, as quais seguem na tabela 5:

26

Tabela 5: Soma das determinações de CO2

Béquer Componentes Valores gastos na

titulação (mL)

Soma do valor

total (mL)

1 Com manganês 50,0 + 29,6 83,7

2 Com bactéria 36,6 + 29,4 65,7

3 Consórcio 1 36,1 + 29,6 65,7

4 Consórcio 3 42,0 + 28,9 70,9

5 Branco 50,0 + 33,9 83,9

6 Consórcio 2 40,5 + 28,3 68,8


Seguindo a metodologia citada por Amadori et al. (2009), a metodologia padrão

de respiração microbiana, obteve os resultados expressos na tabela 6 a seguir:

Tabela 6: Resultados finais da liberação de CO2

Béquer Componentes CO2 liberado



3 Consórcio 1 0,095

4 Consórcio 3 - 0,191

5 Branco 0,209

6 Consórcio 2 - 0,187


Os resultados mostram que os solos que possuíam consórcio obtiveram uma

média mais baixa de respiração microbiana quando comparado com as outras

amostras de solos.

27

Na determinação do potencial biorredutor do consórcio microbiano, o

crescimento celular das bactérias foi acompanhado por medidas de absorbância de

600 nm em espectrofotômetro por um período de 5 dias. Os resultados obtidos estão

expressos na tabela 7 e 8, sendo demostrados os gráficos nas figuras 4 e 5:

Tabela 7 - Avaliação da curva de crescimento referente ao pH 4,0.

Tempo (dia) Comprimento de Onda (nm)

32°C 37°C

T0 0,427 0,496

T1 0,474 0,510

T2 0,699 0,550

T3 0,49 0,554

T4 0,446 0,524 Fonte: Autoria própria, 2016.

Figura 4: Curva de crescimento do consórcio para o pH 4,0.


Tabela 8: Avaliação da curva de crescimento referente ao pH 7,0.


Tempo (dia) Comprimento de Onda (nm)

32°C 37°C

T0 0,543 0,545

T1 0,787 0,553

T2 1,035 0,809

T3 0,721 0,706

T4 0,770 0,647

28

Figura 5 - Curva de Crescimento do Consórcio para o pH 7,0


A partir dos parâmetros ideais encontrados, o melhor planejamento fatorial

observado foi pH 7,0 a 32°C, onde demostrou um melhor desenvolvimento

microbiano.

Portanto o resultado está de acordo com a literatura, onde segundo Tortora et

al. (2012) afirma que para um crescimento ideal de bactérias o pH deve ser neutro,

em uma faixa estreita de pH 6,5 – 7,5. Já em um pH abaixo de 4 é muito difícil o

crescimento de bactérias, portanto o procedimento experimental explica o melhor

resultado do planejamento fatorial. A temperatura de 32°C é onde ocorre o melhor

desenvolvimento dessas bactérias, ou seja, é aquela que permite um

desenvolvimento mais rápido, que irá variar para cada espécie de microrganismo.

Ela permite que o microrganismo expresse o seu potencial máximo metabólico.

No entanto, a partir desses experimentos é possível afirmar que a

biorremediação é uma alternativa ecologicamente adequada e eficaz para o

tratamento do meio ambiente contaminado com moléculas de difícil degradação,

assim como o Mn que em altas concentrações é prejudicial à saúde humana, animal

e vegetal.

Conforme Gaylarde (2005), as moléculas de difícil degradação são

denominadas “recalcitrantes” (não biodegradáveis), portanto o processo biológico de

descontaminação, enquadrados na categoria de biorremediação, deve ser por

microrganismos autóctones, ou seja, do próprio ambiente para degradar estes

metais, resultando em produtos de degradação com estrutura menos recalcitrante

em relação à molécula original.

29

6 CONCLUSÃO

Conforme estudos, a biorremediação, assim como as demais técnicas químicas

de degradação, tem como objetivo principal a mineralização completa dos

contaminantes, ou seja, transformá-los em produtos com pouca ou nenhuma

toxicidade (inócuos), como CO2 e água. Em suma, os microrganismos metabolizam

as substâncias orgânicas, das quais se obtêm nutrientes e energia. Sendo que, para

que isso ocorra, os microrganismos devem estar ativos para desempenharem a sua

tarefa de biodegradação. (EPA apud ANDRADE et al., 2010).

No consórcio testado os microrganismos mostraram capacidade de biorreduzir,

pois a curva de crescimento teve comportamento de acordo com o estudo de Tortora

et al. (2012) que afirma que os microrganismos requerem um pH na faixa neutra pra

atingir um crescimento microbiano ideal. Assim nos mostra que o estudo realizado

produz efeitos positivos para uma tentativa de biorremediação de Mn.

Portanto a partir dos resultados obtidos, pode-se concluir que dentro das

linhagens bacterianas testadas é possível fazer a redução da concentração do metal

Mn em solos contaminados.

Porém, os interferentes como a temperatura e o pH, são fatores que modificam

o processo de biorremediação, pois influenciam no crescimento dos microrganismos,

portanto se a temperatura for alta e o pH ácido, não haverá crescimento adequado

para uma possível biorremediação. Esse processo de crescimento é dependente de

reações químicas que são alteradas pela temperatura e pH, portanto ela pode afetar

a taxa de crescimento, assim como o tipo de reprodução.

Sendo assim, essa análise de Biorremediação pode ser uma tecnologia capaz

de resolver determinados problemas ambientais, a qual visa detoxificar o solo ou

outros ambientes contaminados através do uso de microrganismos nativos ou

adaptados, degradando substâncias ou compostos perigosos aos seres humanos e

transformá-los em substâncias com pouca ou nenhuma toxicidade. Embora ainda

precise de mais estudos sobre este assunto, esta se apresenta como técnica

promissora para minimizar alguns agravos do meio ambiente.

30

REFERÊNCIAS

AGOURAKIS, Demetrios Chiuratto; DE CAMARGO, Iara Maria Carneiro; COTRIM, Marycel Barboza; FLUES, Marlene. Comportamento de Zinco e Manganês de pilhas alcalinas em coluna de solo. Quim. Nova, v. 29, n. 5, p. 960-964, Junho 2006. AMADORI, Caroline; FUMAGALLI, Luis Gustavo; DE MELLO, Nilvania Aparecida. Análise de métodos quantitativos de atividade microbiana em diferentes sistemas de manejo. Synergismuss cyentifica UTFPR. Pato Branco-PR, 2009. ANDRADE, Juliano de Almeida; JARDIM Fabio Augusto & Isabel Cristina Sales Fontes. Biorremediação de solos contaminados por petróleo e seus derivados. Eclética Química, v. 35, n. 3, p. 17-43, 2010. DAMIÃO, A.; RAMOS, A. Manganês. Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto, Portugal. Disponível em: <http://www.ff.up.pt/toxicologia/monografias/ano0405/manganes/manganes.htm>. Acesso em junho de 2016. GAYLARDE, Christine Claire; BELLINASO, Maria de Lourdes; MANFIO, Gilson Paulo. Biorremediação. Biotecnologia Ciência e Desenvolvimento, n. 34, p. 36-43, Jan/Jun 2005. JUNIOR, Michael J. Pelczar; CHAN, E.C.S.; KRIEG, Noel R. Microbiologia: conceitos e aplicações. São Paulo: Pearson Makron Books, 1997. ROCHA, Julio Cesar; ROSA, André Henrique; CARDOSO, Arnaldo Alves. Introdução à química ambiental. São Paulo: Bookman, 2009. ROCHA, Renan Azevedo da; AFONSO, Júlio Carlos. Manganês. Química Nova, v. 34, n. 2, p. 103-105, Maio 2012. SIQUEIRA, José Oswaldo; MOREIRA, Fátima M. S. Microbiologia e bioquímica do solo. Minas Gerais: UFLA, 2006. TORTORA, Gerard J.; FUNKE, Berdell R.; CASE, Christine L. Microbiologia. 6. ed. São Paulo: Artmed, 2005. TORTORA, Gerard J.; FUNKE, Berdell R.; CASE, Christine L. Microbiologia. 10. ed. São Paulo: Artmed, 2012.

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