Universidade Federal de Goiás
Faculdade de Farmácia
WEULLER FILHO DE MORAES
ESTUDO FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES ANALGÉSICA E ANTIINFLAMATÓRIA DO EXTRATO ETANÓLICO, FRAÇÕES E SUBSTÂNCIA ISOLADA DA CASCA DO CAULE DE Pterodon
emarginatus VOG. (SUCUPIRA)
Goiânia
2007
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WEULLER FILHO DE MORAES
ESTUDO FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES ANALGÉSICA E ANTIINFLAMATÓRIA DO
EXTRATO ETANÓLICO, FRAÇÕES E SUBSTÂNCIA ISOLADA DA CASCA DO CAULE DE Pterodon
emarginatus VOG. (SUCUPIRA)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Farmacêuticas da
Faculdade de Farmácia da Universidade
Federal de Goiás, como requisito parcial para a
obtenção do Título de Mestre em Ciências
Farmacêuticas.
Área de concentração: Fármacos e
Medicamentos
Orientador: Prof. Dr. José Realino de Paula
Co-Orientador: Prof. Dr. Elson Alves Costa
Goiânia 2007
Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)
(GPT/BC/UFG)
Moraes, Weuller Filho. M827e Estudo fitoquímico e avaliação das atividades analgésica e antiinflamatória do extrato etanólico, frações e substância isolada da casca do caule de Pterodon emarginatus VOG. (Sucupira) / Weuller Filho de Moraes. � 2007. 102 f. : il., figs., tabs., qds. Orientador: Prof. Dr. José Realino de Paula, Co-Orien- tador: Prof. Dr. Elson Alves Costa.
Dissertação (Mestrado) � Universidade Federal de Goiás. Faculdade de Farmácia, 2007.
Bibliografia: f. 86-93. Inclui listas de figuras e quadros, tabelas, abreviatu- ras e siglas. Inclui apêndices.
1. Plantas medicinais 2. Pterodon emarginatus 3. Fito-
química - Sucupira 4. Lupeol 5. Betulina I. Paula, José
Realino de II. Costa, Elson Alves III. Universidade Federal
de Goiás. Faculdade de Farmácia IV. Titulo. CDU: 615.322:582.999
WEULLER FILHO DE MORAES
ESTUDO FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES
ANALGÉSICA E ANTIINFLAMATÓRIA DO EXTRATO
ETANÓLICO, FRAÇÕES E SUBSTÂNCIA ISOLADA DA
CASCA DO CAULE DE Pterodon emarginatus VOG.
(SUCUPIRA)
Dissertação defendida no Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas, Área de Concentração: Fármacos e Medicamentos, da Faculdade de
Farmácia da Universidade Federal de Goiás, como requisito parcial para a obtenção
do título de Mestre, aprovada em 27 de agosto de 2007 pela Banca Examinadora
constituída pelos seguintes professores:
___________________________________________________
Prof. Dr. José Realino de Paula � UFG
Presidente da Banca
___________________________________________________
Profª. Dra. Laila Salmen Espíndola - UnB
___________________________________________________ Profª. Dra. Maria Tereza Freitas Bara - UFG
Aos meus pais, José e Adélia por todo
amor, carinho, amizade, confiança, apoio,
paciência e incentivo
.
AGRADECIMENTOS
• A Deus, pela vida, sabedoria e força que recebi ao longo de mais uma etapa.
• Ao meu orientador, Prof. Dr. José Realino de Paula, e ao meu co-orientador,
Prof. Dr. Elson Alves Costa, por todo o ensinamento, pela confiança, pela
paciência, disposição e amizade que tiveram comigo durante esse período.
• Ao aluno de iniciação científica Marcus Vinícius Silva Mariano, por ter me
ajudado sempre que precisei principalmente na parte experimental, pela sua
amizade, pelas dicas, meu muito obrigado.
• A todos os professores do Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas e da Faculdade de Farmácia-UFG, que colaboraram de forma
direta ou indiretamente para o êxito desse trabalho.
• A todos os colegas do Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas da Faculdade de Farmácia-UFG e de outros Programas de
Pós-Graduação, pela amizade, pelas sugestões e apoio durante todo esse
período.
• Aos alunos de Iniciação Científica e aos técnicos do Laboratório de
Farmacognosia da Faculdade de Farmácia-UFG e do Laboratório de
Farmacologia de Produtos Naturais por todo o suporte necessário para
desenvolver a parte experimental.
• A Profª. Dra. Inês Sabioni Resck do Departamento de Química da
Universidade de Brasília (UnB), pelos espectros de Ressonância Magnética
Nuclear de 1H e de 13C das substâncias isoladas.
• Ao Prof. Dr. Edemilson Cardoso da Conceição, Profª. MSc. Leonice
Tresvenzol e a Profª. Dra. Maria Teresa Freitas Bara por todas as sugestões,
dicas, amizade e companheirismo que foram muito úteis para o
aperfeiçoamento e concretização desse trabalho.
• Aos animais de laboratório utilizados para a realização do procedimento
experimental necessário para complementar esse trabalho, que sem eles não
seria possível.
• Ao CNPq pela bolsa concedida, à CAPES, FUNAPE/UFG por todo o fomento
e incentivo repassado para a realização desse trabalho.
• A todos os meus amigos, colegas e principalmente à minha Família que
contribuíram direta ou indiretamente para a concretização desse trabalho.
• Em especial, quero agradecer muito a Profª. MSc. Danielle Diniz que me
despertou para esse mundo científico tão fascinante, me apoiou e sempre
que precisei me ajudou com suas dicas que foram imprescindíveis para a
qualidade e a realização desse trabalho. Gostaria de agradecer também a
Profª. Dra. Eliana Martins Lima pelo apoio incondicional que foi dado, pela
confiança e por acreditar nos meus objetivos.
�A vitória sempre foi de quem nunca duvidou dela�.
Raul Follerean
RESUMO
Pterodon emarginatus Vogel, conhecida popularmente como Sucupira Branca, é uma espécie arbórea nativa dos Cerrados Brasileiros, sendo encontrada em Minas Gerais, São Paulo, Goiás e Mato Grosso do Sul. Possui interesse como planta medicinal e fonte de madeira. Vários estudos com o óleo e extratos dos seus frutos demonstraram atividades cercaricida, antimicrobiana e antiinflamatória. Na região Centro-Oeste, a população utiliza o chá das cascas do caule contra inflamações e infecções ginecológicas. Entretanto a maioria dos estudos foram realizados com extratos dos frutos. O objetivo deste trabalho foi realizar o estudo fitoquímico com o intuito de isolar compostos, e avaliar as atividades analgésica e antiinflamatória do extrato etanólico, das frações e dos compostos isolados da casca de Pterodon emarginatus Vogel, procurando comprovar cientificamente, o uso medicinal desta planta. O material Botânico foi coletado no município de Bela Vista-GO (847 m de Altitude, 17º 02� 1,1� S / 48º 49� 0,3� W), e uma exscicata foi depositada no Herbário da Universidade Federal de Goiás sob o número UFG � 27155. As cascas foram dessecadas em estufa com circulação forçada de ar a 40°C, em seguida moídas em moinho de facas. O extrato etanólico de sucupira (EES) foi obtido por maceração a frio em etanol, por 72h, do material botânico pulverizado, e concentrado sob pressão reduzida em rotavapor obtendo um rendimento de 30,14% (p/p). O EES foi fracionado por partição com Hexano, Diclorometano e Acetato de Etila. Através de Cromatografia em Camada Delgada e Cromatografia em Coluna das frações, conseguiu-se isolar duas substâncias: O Lupeol da fração hexânica e a Betulina da fração diclorometano. Ambas as substâncias são triterpenos pertencentes à classe dos Lupanos. As doses utilizadas nos testes farmacológicos foram definidas através do teste geral de atividade cujas doses escolhidas foram (100, 300 e 1000 mg/kg). O modelo de atividade analgésica escolhido foi o da contorção abdominal induzida por ácido acético (1,2% v/v i.p.) onde camundongos tratados previamente com extrato etanólico de sucupira (1000 mg/kg, v.o e s.c.) reduziram o número de contorções acumuladas, após 30 minutos da aplicação do ácido, do valor controle 76,3 ± 7,82 para 48,5 ± 3,5 e 26,6 ± 4,4 respectivamente. A migração celular na peritonite induzida por carragenina (1%, 0,25 mL) foi um dos modelos utlizados para avaliar a atividade antiinflamatória. O número de leucócitos migrados para cavidade intraperitoneal em camundongos previamente tratado com EES (s.c.) nas doses de 100, 300 e 1000 mg/kg foi reduzido de 11,8 ± 1,2 x 106
(controle), para 7,08 ± 1,5 x 106, 6,32 ± 0,61 x 106 e 5,02 ± 0,37 x 106, respectivamente. A redução do número de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético pode ser devido a uma ação analgésica e ou antiinflamatória. A atividade antiinflamatória foi também demonstrada na redução da migração leucocitária. Tais resultados podem justificar o uso popular da planta como antiinflamatório.
ABSTRACT
Pterodon emarginatus Vogel, known popularly as sucupira branca, is a native specie widely distributed over Brazilian Savannah, being found in Minas Gerais, São Paulo, Goiás and Mato Grosso do Sul states. It possess interest as medicinal plant and wood source. Some studies with the extract and oil from its fruits had demonstrated cercaricida, antimicrobiana and anti-inflammatory activities. In the center-west Brazil, the population uses the tea of the stem bark for inflammations and gynecological infections. However the majority of the studies had been carried throught with extracts from the fruits. The objective of this work was the phytochemical study with intention to isolate compounds to evaluate the analgesic and anti-inflammatory activities of the crude ethanolic extract, fractions and isolate compounds of the stem bark of Pterodon emarginatus Vogel, being looked for to prove cientificaly, the medicinal use of this plant. The botanical material was collected in Bela Vista, (847 m, 17° 02� 1.1�S / 48° 49� 0.3� W), Goiás, Brazil (September 2003). A voucher specimen (UFG � 27155) was deposited at the Herbarium of the Universidade Federal de Goiás (UFG), Goiás, Brazil. The ethanolic extract (EES) was obtained from the powdered botanical material by maceration in cold ethanol (95% P.A.) with occasional agitation, for 72 h, followed by filtration, before being concentrated and dried under reduced pressure in a rotary evaporator (yield = 30.14%). The EES was submitted by partitions with hexane, dicloromethane and ethyl acetate. The hexane, dichloromethane and ethyl acetate fractions had been gotten. Through thin layer chromatography and column chromatography of the fractions was isolated two compounds from the fractions: The lupeol from the hexane fraction and the betuline from the dichloromethane fraction. Both compounds are lupanes triterpenes. The doses used in the pharmacological tests, had been defined through the general test of pharmacological activity whose chosen doses were: 100, 300 and 1000 mg/Kg. The chosen model to evaluate the analgesic activity was acetic acid-induced abdominal writhing. Groups of mice were previously trated with the EES (1000 mg/Kg, p.o. and s.c). They had reduced the number of abdominal writhing, after 30 minutes of the application the acetic acid (1.2%, v/v i.p.); in relation to the control value 76.3 ± 7.82 for 48.5 ± 3.5 and 26.6 ± 4.4 respectively. The cellular migration in the carrageenan-induced peritonitis was chosen model to evaluate the anti-inflammatory activity. The number of leukocytes migrated for intraperitoneal socket in mice previously treated with EES (s.c.) in the doses 0.1, 0.3 and 1.0 g/kg was reduced in relation to control value 11.8 ± 1.2 x 106 for 7.08 ± 1.5 x 106, 6.32 ± 0.61 x 106 and 5.02 ± 0.37 x 106 respectively. The reduction of the number of acetic acid-induced abdominal writhing suggests analgesic or anti-inflammatory action. The anti-inflammatory activity also was demonstrated in the reduction of the leukocytes migration. Such results can justify the popular use of this plant as anti-inflammatory.
LISTA DE FIGURAS E QUADROS
Figura 1: Árvore de Pterodon emarginatus Vogel (Sucupira) no município de Bela Vista � GO. J. R. Paula, setembro de 2006...............................................................23 Figura 2: Esquema resumido dos principais eicosanóides........................................27 Figura 3: Fluxograma do Fracionamento do EES por partição Líquido/Líquido...........................................................................................................37 Figura 4: Fracionamento da Fração Hexânica por cromatografia de adsorção em coluna de sílica gel.....................................................................................................38
Figura 5: Fracionamento da Fração Diclorometano por cromatografia de adsorção em coluna de sílica gel...............................................................................................39
Quadro 1: Esquema do isolamento do lupeol da fração hexânica da casca do caule
de P.emarginatus......................................................................................................47
Quadro 2: Esquema do isolamento da betulina da fração diclorometano da casca do
caule de P.emarginatus. ...........................................................................................47
Figura 6: Substâncias isoladas do extrato etanólico da casca do caule de Sucupira.....................................................................................................................48 Figura 7: Espectro de Infravermelho do Lupeol (LP-10)............................................49 Quadro 3: Dados de RMN 1H de LP-10 e a comparação com os dados da literatura.....................................................................................................................50 Figura 8: Espectro de RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) de LP-10................................51 Quadro 4: Dados de RMN 13C de LP-10 e a comparação com os dados da literatura..................................................................................................................... 52 Figura 9: Espectro de RMN de 13C (75 MHz, CDCl3) de LP-10................................53 Figura 10: Espectro de Infravermelho da Betulina (BT � 4).......................................56
Quadro 5: Dados de RMN 1H de BT- 4 e a comparação com os dados da literatura......................................................................................................................57 Figura 11: Espectro de RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) de BT- 4...............................58 Quadro 6: Dados de RMN de 13C de BT- 4 e a comparação com os dados da literatura ....................................................................................................................59 Figura 12: Espectro de RMN de 13C (75 MHz, CDCl3) de BT- 4................................60
Figura 13: Contorções abdominais induzidas pelo ácido acético (1,2 % v/v em salina, i.p.) durante 30 minutos em camundongos previamente tratados (45 min) pela via p.o. e s.c. com veículo (grupo controle; V), com o extrato etanólico das cascas da P. emarginatus (EES; 1000 mg/Kg) ou com indometacina (INDO; 10 mg/Kg). As colunas e barras verticais representam as médias ± EPM de 12 animais por grupo experimental...............................................................................................................63 Figura 14: Contorções abdominais induzidas pelo ácido acético (1,2 % v/v em salina, i.p.) durante 30 minutos em camundongos previamente tratados (45 min) pela via s.c. com veículo (V), com as frações hexânica (FH, 100 mg/kg), diclorometano (FD, 114 mg/kg) e acetato de etila (FAcOEt), 50 mg/kg) ou com indometacina (Indo 10 mg/kg). As colunas e barras verticais representam as médias ± EPM de 12 animais por grupo experimental...............................................................................................64 Figura 15: Contorções abdominais induzidas pelo ácido acético (1,2 % v/v em salina, i.p.) durante 30 minutos em camundongos previamente tratados (45 min) pela via s.c. com veículo (V), com o Lupeol (Lupeol; 70 mg/kg) ou com indometacina (INDO; 10 mg/kg). As colunas e barras verticais representam as médias ± EPM de 10 animais por grupo experimental.................................................................................65 Figura 16: Latência ao estímulo térmico nociceptivo medido no teste do �tail flick� em camundongos antes e após tratamento com o veículo, com EES (100, 300 ou1000 mg/kg) ou morfina (10 mg/kg). Nas ordenadas estão representados os tempos dos camundongos ao estímulo térmico nociceptivo expressos em porcentagem relativa ao tempo zero. Os símbolos e barras verticais representam as médias ± EPM de 6 animais por grupo experimental.................................................................................66 Figura 17: Reatividade à aplicação intraplantar de formalina (20 µL, 3%) na pata posterior direita de camundongos, durante a primeira fase (0 � 5 min) do teste da formalina, previamente tratados (60 min) pela via s.c. com veículo (grupo controle, V; n = 9), com o EES (1000 mg/kg, n = 8), com morfina (Morf; 10 mg/kg, n = 7) ou com indometacina (Indo; 10 mg/kg, n = 6). As colunas e barras verticais representam as médias ± EPM............................................................................................................68 Figura 18: Reatividade à aplicação intraplantar de formalina (20 µL, 3%) na pata posterior direita de camundongos, durante a segunda fase (15 � 30 min) do teste da formalina, previamente tratados (60 min) pela via s.c. com veículo (grupo controle, V; n = 7), com o EES (1000 mg/kg, n = 7), com morfina (Morf; 10 mg/kg, n = 7) ou com indometacina (Indo; 10 mg/kg, n = 6). As colunas e barras verticais representam as médias ± EPM............................................................................................................69 Figura 19: Edema de orelha, em mg, induzido por óleo de cróton (2,5% v/v em acetona) nos grupos previamente tratados pela via s.c. com veículo (V; n = 9), com extrato etanólico de P. emarginatus (EES 100, 300 ou 1000 mg/kg, n = 6, 8 e 6 respectivamente) ou com dexametasona (Dexa; 2 mg/kg, n = 6). As colunas e barras verticais representam a média ± EPM........................................................................71
Figura 20: Edema de orelha, em mg, induzido por óleo de cróton (2,5% v/v em acetona) nos grupos previamente tratados pela via s.c. com veículo (V; n = 10), com Lupeol (Lupeol 35, 70 ou 140 mg/kg, n = 8) ou com dexametasona (Dexa; 2 mg/kg, n = 6). As colunas e barras verticais representam a média ± EPM............................................................................................................................72 Figura 21: Migração de leucócitos totais no modelo de peritonite induzida por carragenina (1% m/v) injetada na cavidade intraperitoneal de camundongos previamente tratados pela via s.c. com veículo (V; n = 9), com extrato etanólico de P. emarginatus (EES 100, 300 ou 1000 mg/kg, n = 6, 7 e 7 respectivamente) ou dexametasona (Dexa; 2 mg/kg, n = 6). As colunas e barras verticais representam a média ± EPM..............................................................................................................73 .
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 � Contorções abdominais induzidas pelo ácido acético (1,2 % v/v em salina, i.p.) durante 30 minutos em camundongos previamente tratados (45 min) pela via p.o. com veículo (grupo controle; V), pela via p.o. e s.c. com o extrato etanólico das cascas de P. emarginatus (EES; 1000 mg/kg) (I), pela via s.c. com as frações hexânica (FH, 100 mg/kg), diclorometano (FD, 114 mg/kg) e acetato de etila (FAcOEt, 50 mg/kg) (II), pela via s.c. com o Lupeol (70 mg/kg) (III) ou com indometacina (Indo;10mg/kg)....................................................................................95 Tabela 2 � Latência ao estímulo térmico nociceptivo medido no teste do �tail flick� em camundongos antes e após tratamento por via s.c. com o veículo (V) (I), com EES 100 (II), 300 (III) ou 1000 (IV) mg/kg, ou morfina (V) (10 mg/kg)........................................................................................................................97 Tabela 3 - Reatividade à aplicação intraplantar de formalina (20 µL, 3%) na pata posterior direita de camundongos, durante a primeira fase (0 � 5 min) (I) e segunda fase (15 � 30 min) (II) do teste da formalina, previamente tratados (60 min) pela via s.c. com veículo, com o EES (1000 mg/kg), com morfina (10 mg/kg) ou com indometacina (10 mg/kg)..........................................................................................100 Tabela 4 � Edema de orelha, em mg, induzido por óleo de cróton (2,5% v/v em acetona) nos grupos previamente tratados pela via s.c. com veículo (V), com extrato etanólico de P. emarginatus (EES 100, 300 ou 1000 mg/kg) (I), pela via s.c. com o Lupeol (Lupeol 35, 70 ou 140 mg/kg) (II) ou dexametasona (Dexa; 2 mg/kg)......................................................................................................................101 Tabela 5 � Migração de leucócitos totais (x 106) no modelo de peritonite induzida por carragenina (1% m/v) injetada na cavidade intraperitoneal de camundongos previamente tratados pela via s.c. com veículo (V), com extrato etanólico de P. emarginatus (EES 100, 300 ou 1000 mg/kg) ou dexametasona (Dexa; 2 mg/kg)......................................................................................................................102
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
5-HT 5-hidroxitriptamina
5-HPTE 5-hidroperoxiácido
5-LOX 5-Lipoxigenase
AA Ácido araquidônico
AcOEt Acetato de Etila
AINE(S) Antiinflamatório(s) não-esteroidal(is)
ANOVA Análise de variância
BT-4 Betulina
CC Cromatografia em Coluna
CCD Cromatografia em Camada Delgada
COX Cicloxigenase
COX-1 Cicloxigenase-1
COX-2 Cicloxigenase-2
COX-3 Cicloxigenase-3
d Dubleto
dd Duplo Dubleto
dl Dubleto Largo
DEXA Dexametasona
EES Extrato etanólico da casca do caule de Pterodon emarginatus
EPM Erro padrão da média
FAcOEt Fração acetato de etila
FD Fração diclorometano
FH Fração hexânica
g Grama(s)
Hz Hertz
i.p. Via intraperitoneal
ILs Interleucinas
IL-1 Interleucina 1
IL-2 Interleucina 2
INDO Indometacina
J Constante de acoplamento, em Hertz
Kg Kilograma(s)
LP-10 Lupeol
LT Leucotrieno
LTA4 Leucotrieno A4
LTB4 Leucotrieno B4
LTC4 Leucotrieno C4
LTD4 Leucotrieno D4
LTE4 Leucotrieno E4
m Multipleto
m/v Massa/volume
mg Miligrama(s)
min Minuto(s)
mL Mililitro(s)
mm Milímetro(s)
MHz Megahertz
MOR Morfina
Nº Número
NO Óxido nítrico (nitric oxide)
P.A. Padrão analítico
p.o. Via oral
PBS Solução salina tamponada (Phosphate Buffered Saline)
PG Prostaglandina
PGD2 Prostaglandina D2
PGE2 Prostaglandina E2
PGF2α Prostaglandina F2α
PGG2 Prostaglandina G2
PGI2 Prostaglandina I2
ppm Partes por milhão
RMN 1H Ressonância Magnética Nuclear de Próton
RMN 13C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono 13
s Singleto
s.c. Via subcutânea
SNC Sistema nervoso central
TNF-α Fator de necrose tumoral α
UFG Universidade Federal de Goiás
v/v Volume/volume
δ Deslocamento químico (em ppm) µg Micrograma(s) µL Microlitro(s)
SUMÁRIO
RESUMO.....................................................................................................................7
ABSTRACT .................................................................................................................8
LISTA DE FIGURAS E QUADROS .............................................................................9
LISTA DE TABELAS .................................................................................................12
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS.....................................................................13
1. INTRODUÇÃO ......................................................................................................19
1.1. Os produtos naturais e o estudo fitoquímico .....................................................19
1.2. Pterodon emarginatus Vogel (Sucupira).............................................................21
1.3. Dor��������...............���������..........................................24
1.4.Inflamação.................�����������.������������.......26 2. OBJETIVOS..................................................................................................... ......31 2.1. Objetivo Geral......................................................................................................31 2.2. Objetivos Específicos..........................................................................................31 3. MATERIAIS ...........................................................................................................33
3.1. Material Botânico.........����������������������.........33 3.2. Extrato, frações e medicamentos .......................................................................33
3.3. Reagentes utilizados ..........................................................................................33
3.4. ANIMAIS.............................................................................................................34
4. MÉTODOS ............................................................................................................36
4.1. MÉTODOS FITOQUÍMICOS..............................................................................36
4.1.1. Preparo do extrato etanólico de Pterodon emarginatus ..................................36
4.1.2. Preparo das Frações e Isolamento de alguns constituintes químicos. ............36
4.1.2.1. Fracionamento da Fração Hexânica (FH).....................................................38 4.1.2.2. Fracionamento da Fração Diclorometano (FD).............................................39 4.1.2.3. Elucidação estrutural das substâncias isoladas............................................40
4.2. MÉTODOS FARMACOLÓGICOS ......................................................................40
4.2.1. Teste Geral de Atividades Farmacológicas .....................................................40
4.2.2. Avaliação da Atividade Antinociceptiva������������.�............41
4.2.2.1. Contorções abdominais induzidas por ácido acético.......................................41
4.2.2.2. Teste do �tail flick��������������������.�.............�41 4.2.2.3. Dor induzida pela Formalina .....................�����������............42 4.2.3. Avaliação da Atividade Antiinflamatória............ �������������43 4.2.3.1. Edema de orelha induzido por óleo de cróton..................................................43
4.2.3.2. Peritonite induzida por carragenina...................................................................43
5. ANÁLISE ESTATÍSTICA .......................................................................................44
6. RESULTADOS ......................................................................................................46
6.1. RESULTADOS FITOQUÍMICOS........................................................................46
6.1.1.Extração ...........................................................................................................46
6.1.2. Fracionamento, Isolamento e caracterização dos constituintes químicos.......46 6.1.2.1. Determinação estrutural dos compostos isolados.........................................48 6.1.2.2. Substância LP-10..........................................................................................48 6.1.2.2.1 Dados Espectroscópicos da Substância isolada Lupeol (LP-10)................54 6.1.2.3. Substância BT-4............................................................................................55 6.1.2.3.1 Dados Espectroscópicos da Substância isolada Betulina (BT-4)...............61 7 RESULTADOS FARMACOLÓGICOS....................................................................62
7.1.Teste geral de Atividades Farmacológicas...........................................................62
7.2. Atividade Antinociceptiva.....................................................................................62 7.2.1. Contorções abdominais induzidas por ácido acético..........................................62
7.2.2. Teste do �tail flick� ..................................................................................................66
7.2.3. Dor induzida pela Formalina ............................................................................67 7.3. Atividade Antiinflamatória���������....................................................70 7.3.1. Edema de orelha induzido por óleo de cróton.....................................................70
7.3.2. Peritonite induzida por carragenina ......................................................................70
8. DISCUSSÃO .........................................................................................................75
9. CONCLUSÕES .....................................................................................................84
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................86
APÊNDICE ............................................................................................................95
Introdução
19
1. INTRODUÇÃO
1.1. Os Produtos naturais e o estudo fitoquímico
Os vegetais fazem parte da vida do homem desde a antiguidade, sendo
usados como fonte de alimentos, habitação, meio restaurador da saúde, na
produção de meios de transporte, dentre outras. Até o século XIX, os recursos
terapêuticos eram constituídos predominantemente por plantas e extratos vegetais
(Simões et al., 2004).
O papel das plantas na medicina é de fundamental importância para toda a
população. Elas fornecem algumas substâncias extremamente úteis, entre essas
substâncias podemos citar, por exemplo os alcalóides da papoula produtora do ópio,
a digoxina da Dedaleira (Digitalis sp) dentre outras. Das plantas também são
retirados compostos que podem apresentar pouca ou nenhuma atividade e ao serem
modificados tornam-se mais eficazes ou menos tóxicos, podendo ainda servir como
protótipos ou modelos para medicamentos sintéticos que tenham atividades
fisiológicas semelhantes às originais (Robbers et al., 1997).
Entretanto, inúmeras plantas que são usadas em preparações fitoterápicas
carecem de um maior controle de qualidade, uma vez que a literatura científica
indica que várias destas podem apresentar composição química variável ou
substâncias tóxicas (Noldin et al., 2003).
A identificação de metabólitos vegetais de interesse terapêutico continua
sendo uma área de grande importância para a saúde humana. Várias moléculas já
foram isoladas e identificadas e algumas dessas apresentaram diferentes atividades
biológicas (Simões et al., 2004).
Atualmente, o principal interesse das pesquisas com produtos naturais, não é
produzir medicamentos melhores do que os que já existem no mercado e sim
fornecer novas alternativas, ampliando a quantidade de substâncias químicas
disponibilizadas. Através do estudo fitoquímico em que é feito o isolamento,
20
purificação e identificação estrutural das substâncias químicas, a quantidade de
informações disponíveis na literatura aumenta, podendo ser utilizadas nesse caso,
para fornecer novos modelos de fármacos para a química farmacêutica, ou após
estudos biológicos, como fonte alternativa em relação às substâncias já existentes
no mercado (Simões et al., 2004).
O Brasil possui a maior diversidade genética vegetal do mundo. Um total
estimado entre 350.000 a 550.00 espécies existem no país, das quais 55.000 são
catalogadas, e apenas 8% dessas espécies vegetais foram estudadas em busca de
compostos bioativos (Simões et al., 2004). Atualmente cerca de 25% dos
medicamentos prescritos no mundo são obtidas direta ou indiretamente de plantas.
Além disso, cerca de 49% dos fármacos desenvolvidas entre 1981 a 2002 foram
obtidas a partir de produtos naturais, ou análogos semi-sintéticos ou ainda
compostos sintéticos baseados em produtos naturais (Koehn e Carter, 2005).
Um estudo fitoquímico abrange várias etapas. A etapa inicial consiste na
definição do material vegetal a ser estudado, qual órgão desse vegetal será utilizado
e a coleta do material. É uma etapa que se deve tomar muito cuidado, evitando
coletar partes do vegetal afetadas com doenças, materiais estranhos e parasitas,
além de anotar a época do ano e o horário de coleta desse material tendo em vista
que a produção de alguns metabólitos podem aumentar ou diminuir dependendo da
época do ano (Simões et al., 2004).
Na etapa de preparo do material vegetal, deve-se atentar as condições ideais
para preservar os metabólitos existentes. Na extração do material vegetal, o
solvente a ser utilizado, também deverá ser escolhido baseado no que irá ser
extraído. Existem várias reações químicas que caracterizam determinados grupos de
metabólitos, essas reações são importantes, pois direcionam o estudo que está
sendo realizado. A etapa de fracionamento, isolamento e purificação de substâncias
é uma etapa fundamental, tendo em vista a diversidade de substâncias químicas
que podem ser encontrados em uma planta. A utilização de diferentes métodos em
conjunto, possibilita uma otimização dessa etapa e da etapa de elucidação estrutural
da substância isolada, assim como da avaliação da existência ou não de atividade
biológica (Simões et al., 2004).
21
Estudos fitoquímicos feitos com diferentes espécies do gênero Pterodon
levaram ao isolamento de vários metabólitos secundários onde alguns deles
demonstraram atividade biológica. Na casca do caule foram identificados alcalóides
(Sabino et al., 1999; Coelho, et al., 2005), na madeira do caule, isoflavonas (Sabino
et al., 1999; Coelho et al., 2005) e triterpenos (Coelho et al., 2005), no óleo dos
frutos, isoflavonas (Coelho et al., 2005) e diterpenos (Sabino et al., 1999; Coelho et
al., 2005). Além disso, vários furanos diterpenos foram encontrados no óleo dos
frutos das espécies P. apparicoi e P. polygalaeflorus (Fascio et al., 1976), assim
como em P. pubescens (Dos Santos, 1972; Fascio et al., 1976), P. polygalaeflorus
(Duarte et al., 1992; Campos et al., 1994; Demuner e Barbosa, 1996; Arriaga et al.,
2000; Belinelo et al., 2002), e P. emarginatus (Mahajan et al. 1972).
Outros tipos de metabólitos secundários também foram isolados. No óleo dos
frutos de P. polygalaeflorus, isolou-se flavonóides (Arriaga et al., 2000; Silva et al.,
2004), já no alburno e no cerne, isoflavonas, os triterpenos lupeol, betulina e o ácido
4-metoxibenzóico (Marques et al., 1998). Isoflavonas foram isoladas da madeira do
caule de P. apparicioi (Galina e Gottlieb, 1974; Almeida e Gottlieb, 1975) e P.
pubescens (Braz Filho et al., 1971).
1.2. Pterodon emarginatus Vogel (Sucupira)
A Pterodon emarginatus Vogel, conhecida popularmente como Sucupira,
Sucupira-Branca, Sucupira do Cerrado, Sucupira-Lisa, Faveira, Fava de Sucupira,
Fava de Santo Inácio e Bilro (Figura 1), pertence à Família Leguminosae-
Papilionoideae. Esta família compreende cerca de 650 gêneros e 18.000 espécies.
O gênero Pterodon inclui 5 espécies nativas do Brasil: Pterodon abruptus Benth,
Pterodon apparicioi Pedersoli, Pterodon emarginatus Vog, Pterodon pubescens
Benth e Pterodon polygalaeflorus Benth (Carvalho et al., 1999). No Brasil, essa
espécie encontra-se distribuída nos estados da Região Centro-Oeste, além de Minas
Gerais, São Paulo, Maranhão, Piauí e Tocantins. É uma árvore de grande porte,
podendo chegar até 15 metros de altura, a casca é de cor cinza-clara, levemente
áspera, soltando placas. As folhas são alternas, compostas pinadas, imparipinadas e
22
pecioladas. Inflorescência em panícula terminal e nas axilas das folhas superiores,
com cerca de 80 a 200 flores (Almeida et al., 1998).
As flores com aproximadamente 1 cm de comprimento, pediceladas, cálice
petalóide, róseo, com 3 dentes diminutos e 2 maiores, oblongos, ciliados,
semelhante a um vexilo, corola papilionácea, rósea ou lilás, ovário súpero,
unilocular, longo-estipitado, com um só óvulo parietal inserido no meio do lóculo.
Frutos são legumes deiscente com cerca de 5 cm de comprimento, castanho-escuro,
oval a orbicular, plano-compresso, semente única, central, dotada de invólucro
aliforme de endocarpo. Existe uma controvérsia sobre a possível existência de uma
ou duas espécies de sucupira-branca, quando unidas, o nome dado para a espécie
é P. emarginatus. Mas estudos recentes de taxonomia molecular usando RAPD dá
base para manter a divisão tradicional em duas espécies: P. polygalaeflorus Benth
que possui flores de coloração roxa e folhas glabras e P. pubescens Vogel que
possui flores de coloração rosa (Almeida et al., 1998).
No Brasil, extrato alcoólico das sementes de Pterodon emarginatus Vogel são
utilizadas popularmente como antiinflamatório e analgésico (Silva et al., 2004). O
extrato do fruto de P. emarginatus Vogel, exerceu atividade antiinflamatória que foi
mostrada através dos seguintes testes: peritonite induzida por carragenina e edema
de pata induzida por dextrana, histamina, carragenina e nistatina (Carvalho et al.,
1999).
Pterodon polygalaeflorus Benth é usada na medicina popular contra
bronquites, amigdalites e como tônico (Pimenta et al., 2006). O extrato alcoólico da
semente dessa espécie é usado como anti-reumático, antiinflamatório e em
preparações analgésicas (Belinelo et al., 2002). As sementes são também usadas
na forma de infusão alcoólica para o tratamento de infecções; as cascas, que
produzem um óleo volátil e aromático semelhante ao encontrado nos alvéolos das
sementes, são bastante eficientes no tratamento do reumatismo; as túberas
radiculares denominadas de �batata de sucupira� são usadas no tratamento de
diabetes. O óleo dos frutos foi capaz de inibir a penetração na pele humana da
cercária da esquistossomose (Demuner et al., 1996; Lorenzi e Matos, 2002).
23
Figura 1: Árvore de Pterodon emarginatus Vogel (Sucupira) no município de Bela Vista
- GO. J. R. Paula, setembro de 2006.
24
1.3. Dor
A palavra dor em latim, poena, significa penalidade e reflete portanto, os efeitos
deletérios que pode infligir o corpo. É uma reação do corpo a estímulos nocivos e,
portanto constitui um sistema de alerta precoce e protetor. A natureza da dor é
extremamente subjetiva, sendo formada tanto por componentes sensitivos, quanto
por componentes psicológicos. Como milhões de pessoas sofrem algum tipo de dor,
a cada ano, resultando num gasto de bilhões de dólares para vários tipos de
tratamentos, a dor e suas causas subjacentes é um problema sério de saúde pública
(Craig e Stitzel, 2005).
A dor pode ser classificada como neurogênica, nociceptiva, neuropática ou
psicogênica, quando associada à lesão do tecido neuronal na periferia ou em nível
central, estimulação excessiva dos nociceptores, disfunção/dano de um ou mais
nervo, e a fatores psicológicos, respectivamente (Millan, 1999).
Em termos de duração, a dor pode ser classificada em: dor aguda e dor
crônica. A dor aguda, cuja duração não se estende além do estímulo doloroso
desencadeador, tem três origens geralmente detectadas: superficial, causada por
feridas, agentes químicos irritantes e queimaduras; a de origem somática profunda,
como por exemplo, um infarto, ou a injeção de substâncias irritantes no organismo e,
por último a dor de origem visceral que está relacionada à inflamação. Por outro
lado, a dor crônica se estende além do estímulo doloroso desencadeador que na
maioria das vezes é de origem desconhecida, esse tipo de dor está relacionado a
doenças como câncer e artrite (Craig e Stitzel, 2005).
A nocicepção é a tradução, condução e o processamento central dos sinais
recebidos geralmente por estimulação dos nociceptores. É um processo que quando
ocorre, resulta na percepção consciente da dor. Os estímulos gerados são captados
pelos nociceptores, conduzidos por fibras aferentes, interneurônios e medula
espinhal, chegando ao hipotálamo, córtex cerebral e sistema límbico, onde a dor é
reconhecida, em termos de localização, natureza e intensidade (Rosa e Massone,
2005).
25
Os nociceptores são terminações periféricas de neurônios sensitivos primários
cujos corpos celulares estão localizados nos gânglios da raiz dorsal ou nos gânglios
trigêmeos. Eles são responsáveis pela percepção do estímulo nocivo e estão
amplamente distribuídos no nosso organismo. São distribuídos em três classes
principais: mecanorreceptores, termorreceptores e receptores polimodais (ativados
por estímulos mecânicos, químicos ou térmicos de alta intensidade). Quando
estimulados devidamente, os nociceptores são ativados, gerando potenciais de ação
que se propagam através das fibras nervosas aferentes. A sensibilização dos
nociceptores causa uma redução do seu limiar de ativação e, em alguns casos,
atividade espontânea.
As fibras nervosas são classificadas, de acordo com seu diâmetro, estrutura e
velocidade de condução. A do tipo Aα, possui maior diâmetro, maior velocidade de
condução e fortemente mielinizadas; do tipo Aβ, também com grande diâmetro,
velocidade de condução rápida e também mielinizadas; as fibras do tipo Aδ, com
diâmetro intermediário, velocidade de condução moderada e fracamente
mielinizadas; e as do tipo C com menor diâmetro, velocidade de condução lenta e
não mielinizadas. O potencial de ação é conduzido por estas fibras nervosas até
atingir os tratos espinotalâmicos, espinorreticular e espinomesencefálico,
transmitindo para estas regiões a informação nociceptiva. Após o processamento
central da dor, estes estímulos são retransmitidos para fibras descendentes de
origem cortical ou medular (Grubb, 1998; Carr e Goudas, 1999; Millan, 1999;
Almeida et al., 2004; Djouhri e Lawson, 2004).
A maioria dos estados de dor crônica está associada com aberrações da via
fisiológica normal, dando surgimento ao que chamamos de hiperalgesia que faz com
que ocorra um aumento da resposta geralmente de um estímulo doloroso. A alodinia
é um outro exemplo desse tipo de alteração sensorial (Craig e Stitzel, 2005).
Alguns tipos de receptores opióides µ (mu), κ (kappa) ou δ (delta), encontram-
se distribuídos por todo o cérebro e medula espinhal. Esses receptores são
membros da grande família de receptores acoplados a proteína G, e são
responsáveis por modular a resposta analgésica através de mecanismos centrais.
Subtipos de receptores também são encontrados no sistema nervoso central. O
próprio organismo produz peptídios opióides chamado de endomorfinas, esses
26
peptídios são responsáveis na modulação das funções críticas do organismo, como
exemplo a homeostasia (Craig e Stitzel, 2005).
A ação analgésica dos opióides ocorre como conseqüência de sua interação
com receptores específicos µ, δ, e κ, localizados em diversos pontos do sistema
aferente e eferente, que participam da transmissão da sensibilidade dolorosa e
modulam a informação nociceptiva (Resende et al., 2006).
Para os análogos quaternários dos alcalóides da morfina, como a N-
metilmorfina, propõe-se que estes agentes, por apresentarem uma mínima
capacidade de transpor a barreira hematoencefálica, exercem o efeito analgésico
através da atuação em receptores opióides presentes nas terminações nervosas
periféricas (Ferreira e Nakamura, 1979 a,b,c; Ferreira et al., 1981; Smith et al., 1982;
Stein, 1993; Antonijevic et al., 1995). Diferentemente dos agonistas opióides que
exercem efeitos analgésicos através de ação no sistema nervoso central, como
ocorre com a morfina (Herz e Teschemacher, 1971; Millan, 1986).
Em um processo de hiperalgesia inflamatória, alguns dos mediadores
inflamatórios liberados (prostaglandinas e as prostaciclinas), embora não sejam
algógenas, aumentam diretamente a atividade dos nociceptores; por reduzirem o
limiar de excitabilidade das terminações nociceptivas, por potenciarem a ação
nociceptiva da bradicinina e da histamina e por estimularem a liberação de
substância P em neurônios sensitivos (Birell et al., 1991; Dray, 1995; Carr e Goudas,
1999).
1.4. Inflamação
A inflamação caracteriza-se por uma seqüência de diversos processos,
começando pelo desencadeamento do evento provocado por uma substância
estranha ou uma lesão física, recrutamento e quimiotaxia de células inflamatórias e
ativação dessas células liberando mediadores da inflamação capazes de lesar ou
destruir a substância invasora.
Os sinais clássicos da inflamação são: rubor, edema, calor, dor e perda da
função (Craig e Stitzel, 2005). O processo inflamatório pode ser desencadeado por
inúmeros estímulos, tais como agentes infecciosos, interação antígeno-anticorpo,
27
traumas químicos, mecânicos ou térmicos, isquemia, dentre outros. Esses estímulos
vão induzir a liberação de mediadores químicos presentes no plasma e nas células
do tecido lesado (Scognamillo-Szabó et al., 2005).
Assim como a dor, a inflamação pode ser classificada em aguda e crônica. A
inflamação aguda corresponde a uma resposta imediata a uma determinada lesão,
com alterações no calibre vascular aumentando o fluxo sanguíneo, modificações
estruturais na parede vascular, extravasamento de leucócitos e proteínas do plasma
para o interstício e consequentemente o surgimento de edema, e por último, a
migração e agregação de leucócitos para o local de lesão responsáveis por
combater os agentes ofensivos. A exposição prolongada a agentes tóxicos, à
infecção persistente e os desvios do sistema autoimune, são fatores que levam à
inflamação crônica e que podem durar semanas, meses ou anos (Di Vaio e Freitas,
2001).
Numerosos mediadores inflamatórios são ativados durante um processo
inflamatório. Dentre esses, podemos destacar os eicosanóides que são derivados do
ácido araquidônico (AA) presente nos fosfolipídios da membrana. A clivagem do
ácido araquidônico pela enzima fosfolipase A2, ativa uma das duas vias enzimáticas
existentes, a da cicloxigenase (COX) também conhecida como prostaglandina
sintetase ou prostaglandina endoperóxido sintetase levando a produção de
prostaglandinas e tromboxanos ou da lipoxigenase levando a produção de
leucotrienos (Figura 2).
Figura 2: Esquema resumido dos principais eicosanóides.
Fosfolipídios da Membrana
Fosfolipase A2
Ácido Araquidônico
Cicloxigenase
Tromboxano Prostaglandinas
Lipoxigenase
Leucotrienos
28
Existem duas isoformas da enzima COX, a COX-1 que é uma isoforma
constitutiva, ou seja, presente nas células em condições fisiológicas, principalmente
nos vasos sanguíneos, plaquetas, estômago e rins, responsável pela produção basal
de prostaglandinas, prostaciclinas, etc; e a COX-2 que é induzível pelas citocinas
(IL-1, IL-2 e TNF-α) interleucina-1, interleucina-2 e fator de necrose tumoral α e
outros estímulos inflamatórios. As prostaglandinas exercem uma série de funções
fisiológicas no organismo como, proteção da mucosa gástrica, metabolismo ósseo,
hipotensão, ovulação. Essas prostaglandinas (PGF2α, PGI2, PGE2, PGD2) agem no
organismo causando vasodilatação, bronconstrição e vasoconstrição. Pela via da
lipoxigenase, os leucotrienos produzidos LTA4, LTB4, LTC4, LTD4 e LTE4, 5-HPTE
(5- hidroperoxiácido) também exercem várias funções como quimiotaxia e ativação
de leucócitos cujo responsável por isso é o LTB4 (Craig e Stitzel, 2005).
A expressão de uma terceira via enzimática da COX, denominada (COX-3) foi
demonstrada em estudos in vitro com linhagens de macrófagos. Nesse caso essa
via não levaria a produção de prostaglandinas, mas sim de um membro da família
das ciclopentanonas (PGJ2) que também exerceria atividade antiinflamatória. A
COX-3, possivelmente uma variação da COX-1, (oriunda de um mesmo gene dessa
isoforma), encontra-se distribuída principalmente no córtex cerebral, medula
espinhal e coração. Supõe-se que a inibição da COX-3 representaria o mecanismo
de ação pelos quais os antiinflamatórios não esteroidais (AINES), exerceriam sua
atividade analgésica e antipirética (Carvalho et al., 2004).
Em 1893, começou a ser produzido pela Bayer (Indústria Farmacêutica), o
ácido acetilsalicílico patenteado como a Aspirina®. A partir desse período, os
agentes antiinflamatórios não esteroidais passaram a ser os medicamentos mais
largamente prescritos e usados em todo o mundo (Fiorucci et al., 2001). John Vane
em 1971, propôs que o mecanismo de ação desses agentes é de suprimir o
processo inflamatório através da inibição da cicloxigenase (COX), impedindo assim
a síntese de prostaglandinas (Carvalho et al., 2004). O uso do AINES deve ser
limitado, pelo fato de apresentar efeitos colaterais, particularmente no trato
gastrintestinal (TGI) e nos rins (Fosslien, 1998).
29
Outra classe de substâncias muito usadas no tratamento de um processo
inflamatório são os corticosteróides, cujo mecanismo de ação consiste na inibição da
via da cicloxigenase e a via da lipoxigenase (Meireles-Teixeira et al., 2003).
Entretanto, esses agentes devem ser utilizados com cautela por também
apresentarem efeitos adversos, por exemplo, alteração no metabolismo ósseo e
toxicidade ocular (Rizzo e Solé, 2006).
Células fagocíticas (neutrófilos e macrófagos), geram potentes oxidantes
como o peróxido de hidrogênio (H2O2), óxido nítrico (NO), ácido hipocloroso (HOCl),
dentre outros, que são bons agentes bactericidas, mas que induzem lesão tecidual.
Algumas das funções fisiológicas do NO, inclui vasodilatação e citotoxicidade em
macrófagos (Schuman e Madison, 1994).
Outro mediador inflamatório que merece destaque são as citocinas das quais
as mais importantes são o fator de necrose tumoral-α (TNF-α) e a interleucina 1 (IL-
1). São produzidos primeiramente por células da linhagem dos monócitos-
macrófagos, atuando em conjunto, esses mediadores estimulam respostas
inflamatórias, como dor, febre e recrutamento de linfócitos induzindo também a
produção de outros mediadores da inflamação e na inflamação crônica, contribuindo
com a lesão tecidual (Craig e Stitzel, 2005).
As aminas vasoativas (histamina e serotonina) também exercem papel
fundamental na inflamação, elas são capazes de causar dilatação de vênulas pós-
capilares e, conseqüentemente, aumentar o fluxo sangüíneo e a permeabilidade
vascular (Barnes et al., 1988).
30
Objetivos
31
2. OBJETIVOS 2.1. Objetivo Geral:
Realizar o estudo químico �biomonitorado� do extrato etananólico da casca do
caule de Pterodon emarginatus sobre modelos experimentais de inflamação e dor.
2.2. Objetivos Específicos:
• Realizar o estudo fitoquímico do extrato etanólico bruto da casca do caule de
P. emarginatus Vogel visando o isolamento e identificação de substâncias
responsáveis pela atividade farmacológica do extrato.
• Avaliar as atividades analgésica e antiinflamatória do extrato etanólico bruto,
frações e substâncias isoladas da casca do caule de Pterodon emarginatus
Vogel.
32
Materiais
33
3. MATERIAIS
3.1. Material Botânico
A casca do caule de Pterodon emarginatus Vogel foi coletada no município de
Bela Vista - Goiás, Brasil, (847 m de Altitude, 17º02�1,1� S / 48º49�0,3� W) em
setembro de 2003. O material botânico foi identificado pelo Professor Dr. José
Realino de Paula. Uma excicata foi depositada no Herbário da Universidade Federal
de Goiás (UFG) sob número UFG-27155. A casca do caule foi dessecada a 40ºC em
uma estufa com circulação forçada de ar por 48 horas, em seguida foram trituradas
em moinho de facas.
3.2. Extrato, Frações e Medicamentos.
Nos modelos farmacológicos utilizados para avaliar a atividade analgésica e
antiinflamatória do extrato e das frações hexânica, diclorometano e acetato de etila,
foram preparadas soluções, imediatamente antes da realização dos experimentos.
As suspensões do extrato nas doses pré-estabelecidas foram feitas utilizando água
destilada. Para as frações e para o lupeol, foram utilizados para preparar as
soluções nas doses estabelecidas, água destilada e tween-80 3%. Foram usados
como controle positivo os medicamentos indometacina (Prodome � Brasil), morfina
(Cristália � Brasil), dexametasona (Hipolabor � Brasil) e heparina (Prodome � Brasil).
Todos os medicamentos foram solubilizados em água destilada, exceto a
indometacina, que foi solubilizada em solução aquosa de NaHCO3 5% (p/v).
3.3. Reagentes utilizados
• Acetato de Etila (Synth � Brasil)
• Acetona (Synth � Brasil)
• Ácido acético glacial (Synth � Brasil)
34
• Bicarbonato de sódio (Synth � Brasil)
• Carragenina (Sigma � USA)
• Diclorometano (Synth � Brasil)
• Etanol 95% P.A (p/v) (Synth � Brasil)
• Formaldeído (Synth � Brasil)
• Metanol (Synth � Brasil)
• Hexano (Synth � Brasil)
• Óleo de cróton (Sigma � USA)
• Sílica Gel 60 (Merck � USA)
• Solução de Türk (Sigma � USA)
• Tween 80 (Synth � Brasil)
3.4. Animais
Os animais utilizados nos modelos farmacológicos escolhidos foram
camundongos albinos (Mus musculus) tipo Swiss, machos, pesando entre 25 e 40 g
obtidos no Biotério Central da Universidade Federal de Goiás (UFG). Os tratamentos
dos animais com o veículo (grupo controle), extrato, frações ou diferentes
substâncias foram realizados em concentrações adequadas para a administração de
um volume constante de 10 mL/kg, volume esse padronizado no Laboratório de
Farmacologia de Produtos Naturais/UFG, onde foram feitos os experimentos. As
administrações foram feitas a 45 ou 60 minutos, dependendo do modelo escolhido,
pela via (s.c.) ou (p.o.) antes de iniciar os testes de atividade farmacológica.
Os animais foram mantidos em condições controladas de temperatura (24°C ±
1,5ºC) e iluminação (ciclo claro / escuro de 12 h), com água e ração ad libitum,
permanecendo no laboratório por um período de adaptação de pelo menos 24 horas
antes dos experimentos que geralmente começavam no período matutino.
35
Métodos
36
4. MÉTODOS 4.1. MÉTODOS FITOQUÍMICOS 4.1.1. Preparo do extrato etanólico de Pterodon emarginatus.
A casca do caule de P. emarginatus, após ter sido dessecada em estufa com
circulação forçada de ar, foi triturada em moinho de facas. O pó obtido foi macerado
em álcool etílico 95% P.A. (p/v) na proporção 1:5 (m/v), sob agitação por 5 horas,
seguida por filtração. A extração foi repetida por mais duas vezes para garantir o
esgotamento das substâncias extraíveis pelo álcool etílico e, em seguida, os filtrados
foram agrupados. O filtrado foi evaporado em rotaevaporador a 40ºC sob pressão
reduzida a fim de concentrá-lo, obtendo assim o extrato etanólico bruto da casca do
caule de Pterodon emarginatus, que denominamos de extrato etanólico de sucupira
(EES).
4.1.2. Preparo das Frações e Isolamento de alguns constituintes químicos.
O EES obtido foi fracionado utilizando para isso, partições líquido/líquido com
solventes de polaridades crescentes (hexano, diclorometano e acetato de etila).
Pesou-se 50,0 g do extrato etanólico bruto e adicionou-se 200 mL de metanol/água
na proporção 7:3. Feito isso, a amostra foi transferida para um funil de separação.
Adicionou-se 100 mL de hexano, agitando-o em seguida. O funil permaneceu em
repouso até ocorrer a separação entre as fases, onde a fase hexânica foi
armazenada em um recipiente limpo e seco. Realizou-se mais duas extrações
subseqüentes com 100 mL de hexano. Repetiu-se o mesmo procedimento para
diclorometano e acetato de etila. No final, após a evaporação do metanol da fração
metanol/água, a fração aquosa resultante foi armazenada em freezer (-10ºC) para
ser liofilizada posteriormente (Figura 3).
37
Hexano (3x100 mL)
Diclorometano (3x100mL)
Acetato de Etila (3X100mL)
Figura 3 - Fluxograma do fracionamento do EES por partição líquido/líquido.
Extrato Etanólico Bruto da casca do caule de Pterodon emarginatus ( 50 g )+
200 mL de Metanol:Água ( 7:3 )
Fração Hexânica
Fração Acetato de Etila
Fração Diclorometano
Fração Aquosa
38
4.1.2.1. Fracionamento da Fração Hexânica (FH)
Da (FH) após ter evaporado todo o solvente, foram pesados 2,5g, em
seguida, essa foi submetida à cromatografia de adsorção em coluna de sílica gel,
empacotada com uma mistura de hexano/acetato de etila (95:5) e eluída com essa
mistura de solventes em polaridade crescente até 50% AcOEt (Figura 4). Foram
coletadas 62 frações de 20 mL cada, reunidas em 15 novas frações de acordo com
os índices de retenção (Rf) observados nas placas de CCD, cuja fase móvel
utilizada foi hexano: acetato de etila (90:10 e 85:15), após serem reveladas com Iodo
(I2).
Fração Hexânica (2,5 g)
Hex/AcOEt(95:5)
FH (1-2 0)
FH(21- 2 5)
Hex/AcOEt(93:7)
Hex/ AcOEt(90:10)
FH(26-30 )
Hex/AcOEt(85:15)
FH(36- 4 0)
Hex/AcOEt(80:20)
FH(41-45 )
FH(46-50 )
Hex/AcOEt(75:25)
Hex/AcOEt(70:30)
FH(51-55)
FH(56-62 )
Hex/AcOEt(60:40)
Hex/AcOEt(50:50)
FH(31-35 )
Figura 4 - Fracionamento da Fração Hexânica por cromatografia de adsorção em coluna de sílica gel.
39
4.1.2.2. Fracionamento da Fração Diclorometano (FD)
Da (FD) após ter evaporado todo o solvente, foram pesados 2,86g, sendo
submetida em seguida à cromatografia de adsorção em coluna de sílica gel,
empacotada com uma mistura de hexano/acetato de etila (80:20) e eluída com essa
mistura de solventes em polaridade crescente até 50% AcOEt (Figura 5). Foram
coletadas 62 frações de 20 mL cada, reunidas em 16 novas frações de acordo com
os índices de retenção (Rf) observados nas placas de CCD, cuja fase móvel
utilizada foi hexano: acetato de etila (90:10 e 85:15), após serem reveladas com
Iodo (I2).
Fração Diclorometano (2,86g)
FD1-20
FD21-30
FD31-35 FD
46-50FD
36-40FD
41-45FD
51-62Hex/AcOEt80:20
Hex/AcOEt75:25
Hex/AcOEt70:30
Hex/AcOEt65:35
Hex/AcOEt60:40
Hex/AcOEt55:45
Hex/AcOEt50:50
Figura 5 - Fracionamento da Fração Diclorometano por cromatografia de adsorção em coluna de sílica gel.
40
4.1.2.3. Elucidação estrutural das substâncias isoladas
Uma vez purificada por cromatografia em coluna (CC) e cromatografia em
camada delgada (CCD), as substâncias isoladas, foram caracterizadas por
Espectrometria de Infravermelho (EI) e Ressonância Magnética Nuclear de
hidrogênio (RMN 1H) e de carbono (RMN 13C).
As pastilhas de KBr a serem utilizadas no (EI), foram preparadas com KBr
(Vetec), previamente dessecada em estufa a 120°C. Em seguida foram colocados
100 mg de KBr no pastilhador, seguido de compressão em prensa hidráulica Perkin
Elmer ® modelo 4037 com pressão de 10a toneladas por 2 minutos, para a obtenção
de pastilhas finas e transparentes. As análises foram realizadas em um aparelho de
Infravermelho BX/RX Perkin Elmer ® (modelo 60508). O equipamento foi mantido
em sala com temperatura e umidade controladas. A faixa espectral utilizada
compreendia números de onda entre 4000 e 450cm-1 , sendo utilizada resolução de
4cm-1.
As análises de RMN foram realizadas à temperatura ambiente em um
espectrômetro Mercury plus da VARIAN (7,05 T), utizando uma sonda de 5mm e
pulsos de 45º para o hidrogênio e carbono. Os deslocamentos químicos no RMN de 1H (300 MHz) foram referenciados aos padrões internos TMS (tetrametilsilano; 0,0
ppm) para o solvente CDCl3. Nos espectros de RMN de 13C (75,46 MHz), foram
referenciados ao CDCl3 (77,0 ppm).
4.2. MÉTODOS FARMACOLÓGICOS 4.2.1. Teste Geral de Atividades Farmacológicas
Grupos de animais foram tratados pela via oral através de gavagem, pela via
subcutânea e intraperitoneal através de injeção, com extrato etanólico de sucupira
nas doses (100 a 2000 mg/kg). O grupo controle recebeu veículo (água) em volume
proporcional às doses do extrato utilizadas. Os animais após o tratamento, foram
41
observados em deambulação livre, sobre uma superfície plana durante 3 minutos,
nos tempos 5, 10, 20, 30 e 60 minutos, 4, 8, 24 e 48 horas, e após 4 e 7 dias do
tratamento. Os efeitos observados nos animais foram anotados em uma ficha
padrão de triagem farmacológica, adaptada daquela descrita por Malone (1977).
4.2.2. Avaliação da Atividade Antinociceptiva 4.2.2.1. Contorções abdominais induzidas por ácido acético
De acordo com a metodologia descrita por Koster (1959), foram utilizados
grupos experimentais de camundongos que foram tratados com veículo (n = 10;
s.c.), EES (n = 10; 1000 mg/kg s.c. e p.o.), FH (n = 12; 100 mg/kg s.c.), FD (n = 12;
114 mg/kg s.c.), FAcOEt (n = 12; 50 mg/kg s.c.), Lupeol (n= 10; 70 mg/kg s.c.) ou
indometacina (n = 8, 12 ou 10; 10 mg/kg s.c.). Todos os grupos receberam ácido
acético 1,2% (v/v i.p.) 45 minutos após os tratamentos. O número de contorções
abdominais, que é a contração da parede abdominal seguida pela extensão de ao
menos uma das patas posteriores (Tornos et al., 1999), foram contadas
acumulativamente em 30 minutos de avaliação. Os resultados foram expressos
como as médias ± erro padrão da média (EPM) dos números de contorções
abdominais acumuladas em 30 minutos de avaliação experimental.
4.2.2.2. Teste do �tail flick�
Para este teste foi empregada a metodologia descrita por Janssen et al
(1963), adaptada por Grotto e Sulman, (1967). Este ensaio permite o estudo de
substâncias com atividade opióide central, mediante a avaliação do tempo, em
segundos, que o animal leva para retirar a cauda do local de incidência de um
estímulo térmico doloroso. Este estímulo nociceptivo foi produzido por imersão do
terço distal da cauda dos camundongos em banho-maria a 55,5 ± 0,5 ºC.
42
Grupos experimentais de 6 animais foram previamente selecionados quanto à
sua reatividade ao estímulo nociceptivo, não sendo utilizados animais cujo tempo de
resposta foi superior a 7 segundos. A reatividade foi medida a cada 30 minutos,
iniciando-se uma hora antes e prolongando-se por 2 horas depois da administração
s.c. do veículo ou do EES (100, 300 ou 1000 mg/kg). A morfina (10 mg/kg),
administrada via s.c., foi utilizada como controle positivo do ensaio. O tempo máximo
que se deixaram as caudas dos animais em contato com a água do banho-maria foi
de 20 segundos para se evitar lesões.
4.2.2.3. Dor induzida pela Formalina
Esse método permite distinguir a dor de origem neurogênica que ocorre entre
(0 � 5 minutos) através da estimulação direta dos nociceptores, e a dor de origem
inflamatória, que ocorre entre (15 � 30 minutos) onde ocorre a liberação de
mediadores inflamatórios (Hunskaar et al., 1985, 1986 e 1987).
Foram utilizados grupos experimentais de até 10 camundongos tratados pela
via s.c. com veículo, EES (1000 mg/kg), morfina (10 mg/Kg) ou indometacina (10
mg/kg). 60 minutos após os tratamentos via s.c., foram injetados na região
intraplantar da pata posterior direita dos animais 20 µL de formalina 3% v/v
(formaldeído 1,2% v/v). Feito isso, os animais foram observados individualmente
durante 30 min em caixas de acrílico com fundo especular para auxiliar a
visualização. Após a aplicação da formalina, foi medida a reatividade do animal
considerada como o tempo, em segundos, que o animal permanece lambendo a
pata injetada. O efeito antinociceptivo foi avaliado nas duas fases da dor: no período
de 0 - 5 minutos (dor neurogênica) e de 15 a 30 minutos (dor de origem
inflamatória). Os resultados foram expressos como as médias ± EPM dos tempos de
reatividade nas duas fases, comparando ao grupo controle experimental.
43
4.2.3. Avaliação da Atividade Antiinflamatória
4.2.3.1. Edema de orelha induzido por óleo de cróton
Grupos de camundongos foram tratados pela via s.c. com o veículo (n = 10),
EES (100, 300 ou 1000 mg/kg) n = 6, 8 e 6 respectivamente, Lupeol (35, 70 e 140
mg/kg) n = 8 ou dexametasona (2 mg/kg) n = 6. Após 60 minutos dos tratamentos,
em cada animal foi administrado topicamente 20 µL de solução recém preparada de
óleo de cróton 2,5% v/v em acetona, na superfície interna da orelha direita e o
mesmo volume de acetona na orelha esquerda dos camundongos. Após 4 horas, os
animais foram sacrificados por deslocamento cervical. Segmentos idênticos (discos
de 6 mm de diâmetro) de ambas as orelhas foram tomados e pesados em balança
analítica. A formação e intensidade do edema foi avaliado através das diferenças de
peso de tais segmentos (Zanini et al, 1992). Os resultados foram comparados com o
grupo controle experimental.
4.2.3.2. Peritonite induzida por carragenina
Este ensaio avalia a evolução da migração leucocitária para a cavidade
peritoneal, segundo protocolo originalmente descrito por Ferrándiz e Alcaraz (1991).
Grupos experimentais de até 9 camundongos foram tratados previamente pela via
s.c. com veículo (grupo controle), com EES (100, 300 ou 1000 mg/kg) ou com
dexametasona (2 mg/kg). Decorridos 60 minutos após os tratamentos, foram
injetados nos animais, pela via intraperitoneal, 0,25 mL de carragenina (1% m/v em
solução salina). Após 4 horas, os animais foram sacrificados por deslocamento
cervical e injetou-se na cavidade peritoneal 2 mL de PBS heparinizado (10 UI/mL de
heparina). Após 60 compressões leves no abdômen, o fluído peritoneal foi coletado,
a amostra diluída (1:20 em Solução de Tϋrk) e a contagem do número de leucócitos
totais migrados realizada na câmera de Newbauer. Os resultados foram expressos
como médias ± EPM dos números de leucócitos totais por mL.
44
5. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados foram expressos como média ± erro padrão das médias (EPM).
As diferenças estatísticas entre os grupos experimentais foram detectadas pela
análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de Tukey. Considerou-se como
valores significantes aqueles cujo p < 0,001, p < 0,01 e p < 0,05. Para a análise dos
dados foi utilizado o software GraphPad Prism 3.0.
45
Resultados
46
6. RESULTADOS
6.1. RESULTADOS FITOQUÍMICOS 6.1.1. Extração
Pesou-se 900 gramas da casca do caule seca de Pterodon emarginatus Vog,
dessecada e pulverizada, extraiu-se por maceração em etanol 95% P.A (p/v) com
agitação ocasional, obtendo 271,32g de extrato etanólico bruto de sucupira (EES)
com um rendimento de 30,14% (p/v).
6.1.2. Fracionamento, Isolamento e Caracterização dos Constituintes Químicos
Após a ressuspensão de 50,0 gramas do extrato etanólico da casca do caule
de P. emarginatus em metanol:água (7:3) e o fracionamento com hexano (FH),
diclorometano (FD) e acetato de etila (FAcOEt), foram obtidos 2,5g de Fração
Hexânica (5,0%), 2,86g de Fração Diclorometano (5,72%) e 1,25g de Fração Acetato
de Etila (2,5%).
Parte dessas frações FH, FD e FAcOEt foram submetidas ao fracionamento
por cromatografia em coluna de adsorção em sílica na proporção 1:40 (um mg de
fração para cada quarenta mg de sílica gel), com gradiente Hexano/Acetato de Etila.
Após as frações serem coletadas em alíquotas de 20 mL, elas foram analisadas
através de CCD, usando como fase móvel Hexano/Acetato de Etila na proporção
(90:10 e 85:15), e depois de terem sido reveladas com Iodo (I2), foram reunidas,
baseado no fator de retenção (Rf) de cada mancha obtida, em quinze, dezesseis e
dez frações respectivamente. Novamente fez-se cromatografia em camada delgada
das frações reunidas anteriormente e após a revelação das placas de cromatografia,
observou-se a formação de apenas uma mancha na Fração Hexânica FH-1.10
(Quadro 1), uma mesma mancha na Fração Diclorometano FD-1.4 e FD-1.5 na
Fração Diclorometano (Quadro 2), e nenhuma mancha única na Fração Acetato de
Etila. Foi feita análise espectroscópica através do Infravermelho utilizando pastilhas
de KBr e Ressonância Magnética Nuclear de 1H e 13C utilizando como solvente
clorofórmio deuterado, nas três frações onde apareceram as manchas únicas e, após
47
a interpretação dos espectros, identificou-se na fração hexânica, o Lupeol (LP-10)
cujo rendimento foi de 28,8% e nas duas frações diclorometano, a Betulina (BT- 4) que teve o rendimento total de 2,79% (Figura 6).
Frações Reunidas
Nomenclatura Massa(g) Substância Isolada
2-5 6-8 9-12 13-15 16-17 18 19-23 24-25 26 27-32 33-34 35-38 39-44 45-50 51-62
FH-1.1 FH-1.2 FH-1.3 FH-1.4 FH-1.5 FH-1.6 FH-1.7 FH-1.8 FH-1.9 FH-1.10 FH-1.11 FH-1.12 FH-1.13 FH-1.14 FH-1.15
0,06 0,04 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,02 0,04 0,72 0,18 0,18 0,06 0,04 0,22
LP-10
Quadro � 1: Esquema do isolamento do lupeol da fração hexânica da casca do caule de
P.emarginatus.
Frações Reunidas
Nomenclatura Massa (g) Substância Isolada
1 2 3 4-10 11 12-20 21-40 41 42-45 46-49 50 51-55 56 57-58 59-61
62
FD-1.1 FD-1.2 FD-1.3 FD-1.4 FD-1.5 FD-1.6 FD-1.7 FD-1.8 FD-1.9 FD-1.10 FD-1.11 FD-1.12 FD-1.13 FD-1.14 FD-1.15 FD-1.16
0,04 0,01 0,02 0,07 0,01 0,07 0,04 0,04 0,05 0,01 0,01 0,02 0,01 0,01 0,01 0,09
BT- 4 BT- 4
Quadro � 2: Esquema do isolamento da betulina da fração diclorometano da casca do
caule de P.emarginatus.
48
6.1.2.1. Determinação estrutural dos compostos isolados
Figura 6 - Substâncias isoladas do extrato etanólico da casca do caule de Sucupira.
6.1.2.2. Substância LP-10
A substância LP-10 (720 mg) foi isolada da fração hexânica FH-1.10, através
de coluna cromatográfica de adsorção em sílica, obtendo após a evaporação do
solvente, um sólido branco solúvel em diclorometano.
No espectro de Infravermelho observou-se a presença de uma banda larga
em 3.414 cm-1 atribuído à deformação axial de O-H, uma banda em 2.944 cm-1
atribuído à deformação axial de CH de alifático e uma banda em 1.637 cm-1 atribuído
a deformação axial de grupos metileno (Figura 7).
CH2OH
HO
Betulina
1
3 5 7
9
11 13
15
17
18
1920 21
22
2324
25 26
27
28
29
30
HO
Lupeol
1
3 5 7
9
11 13
15
17
18
1920 21
22
2324
25 26
27
28
29
30
49
Fi
gura
7 �
Esp
ectro
de
Infra
verm
elho
do
Lupe
ol (L
P-10
).
Ban
da c
arac
terís
tica
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H
Def
orm
ação
axi
al
de C
H a
lifát
ico
Def
orm
ação
axi
al
de g
rupo
s m
etile
no
50
No espectro de RMN 1H (Figura 8), observam-se os sinais de hidrogênios
vinílicos em δ 4,57(m) e δ 4,68 (dl; J=2,4Hz) referentes aos hidrogênios H-29 da
ligação dupla terminal. O duplo dubleto em δ 3,18 (J=5,1 e 10,5Hz) relativo ao
hidrogênio carbinólico H-3α, estes acoplamentos indicaram a presença da hidroxila
em C-3 com β-configuração, e os sinais em δ 0,76 a δ 1,68 são referentes às
metilas. Os dados de RMN 1H de LP-10 (Quadro 3) foram comparados com os
dados da literatura para o Lupeol (Silva, 2004).
Hidrogênio LP-10 a
δ 1H, multi. (nº H, J) Lupeol b
δ 1H, multi. (nº H, J). (Silva, 2004)
H-3 H-19 H-21 H-23 H-24 H-25 H-26 H-27 H-28 H-29
H-30
3,18, dd (1H, 5,1 e 10,5) 2,38, m (1H) 1,36, m (1H), 1,92, m (1H) 0,97,s (3H) 0,76, s (3H) 0,83, s (3H) 1,03, s (3H) 0,94, s (3H) 0,79, s (3H) 4,68, dl (1H, 2,4); 4,57, m (1H) 1,68, m (3H)
3,18, dd (1H, 5,4 e 10,8) 2,37, m (1H) 1,35, m (1H), 1,91 m (1H) 0,97,s (3H) 0,76, s (3H) 0,83, s (3H) 1,03, s (3H) 0,94, s (3H) 0,79, s (3H) 4,69, d (1H, 2,4); 4,50, m (1H) 1,68, s (3H)
a- RMN 1H (CDCl3, 300MHz); b- RMN 1H (CDCl3, 400MHz); As constantes de acoplamento J entre parênteses estão em Hertz.
Quadro 3 - Dados de RMN 1H de LP-10 e a comparação com os dados da literatura
(Silva, 2004).
51
9.0
8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
-0.5
-1.0
23.7
51.
000.
500.
500.
50
CD
Cl3
TMS
4.694.68
4.574.57 4.55
3.213.20
3.183.16
2.422.41
2.392.37
2.352.331.951.91
1.701.681.68
1.65 1.591.51
1.381.36 1.26
1.25 1.201.03
0.970.94 0.91
0.760.700.690.66
Figu
ra 8
� E
spec
tro d
e R
MN
1 H (3
00 M
Hz,
CD
Cl 3)
de
LP-1
0.
HO
Lupe
ol
1
35
7
9
1113
15
17181920
21
22
2324
2526
27
28
29
30
Hid
rogê
nio
viní
lico
(H-2
9)
Hid
rogê
nio
carb
inól
ico
(H-3
)
52
No espectro de RMN 13C (Figura 9) observa-se os sinais em δ 109,3 (C-29) e
δ 150,9 (C-20), referentes à dupla terminal. O sinal em δ 78,9 corresponde ao próton
carbinólico C-3. Os dados de RMN 13C de LP-10 foram comparados com os dados
da literatura para o Lupeol (Mahato e Kundu, 1994), conforme Quadro 4.
Nº Carbono Lupeol δ 13Cb
(Mahato e Kundu, 1994)
LP-10 δ 13Ca
1 2 3 4 5 6 7 8 9
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
38,7 27,4 78,9 38,8 55,3 18,3 34,2 40,8 50,4 37,1 20,9 25,1 38,0 42,8 27,4 35,5 43,0 48,2 47,9
150,9 29,8 40,0 28,0 15,4 16,1 15,9 14,5 18,0
109,3 19,3
38,652 27,388 78,946 38,805 55,228 18,268 34,218 40,766 50,366 37,110 20,871 25,060 37,980 42,773 27,388 35,531 42,949 48,229 47,932
150,918 29,784 39,957 27,953 15,346 16,086 15,933 14,506 17,963
109,311 19,268
a- RMN 13C (CDCl3, 75MHz); b- RMN 13C (CDCl3, 14,5MHz)
Quadro 4 - Dados de RMN 13C de LP-10 e a comparação com os dados da literatura
(Mahato e Kundu, 1994).
53
230
220
210
200
190
180
170
160
150
140
130
120
110
100
9080
7060
5040
3020
100
-10
-20
-30
150.91
109.30
78.9477.42
77.0076.57
55.22
50.3648.23
42.9542.7740.76
37.9835.53
34.22 29.7827.95
27.34
20.8718.2717.96
16.0914.51
Figu
ra 9
� E
spec
tro R
MN
13C
(75
MH
z, C
DC
l 3) d
e LP
-10.
HO
Lupe
ol
1
35
7
9
1113
15
17181920
21
22
2324
2526
27
28
29
30
C-2
0
C-2
9
54
Após análise dos dados espectrais e da comparação com os dados de
literatura do Infravermelho, da Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio e de
Carbono 13, conclui-se que a substância LP-10 trata-se de um triterpeno da série
dos lupanos, o Lupeol (lup-20(29)-en-3β-ol).
6.1.2.2.1. Dados Espectroscópicos da Substância Isolada Lupeol (LP-10):
Lupeol: (lup-20(29)-en-3β-ol)
Fórmula Molecular: C30H50O
IV √ máx cm -1 (KBr), (Figura 7): 3414, 2944, 1637, 1458, 1380, 1043.
RMN 1H (CDCl3, 300 MHz), δ1H, mult. (H, J em Hz, nº H), (Figura 8).
4,68, dl (H-29; 2,4; 1H); 4,57, m (H-29; 1H); 3,18, dd (H-3; 5,1 e 10,5; 1H); 2,38, m
(H-19; 1H), 1,92, m (H-21; 1H); 1,68, m (H-30; 3H); 1,36, m (H-21; 1H); 1,03, s (H-26;
3H); 0,97, s (H-23; 3H); 0,94, s (H-27; 3H); 0,83, s (H-25; 3H); 0,79, s (H-28; 3H);
0,76, s, (H-24; 3H).
RMN 13C (CDCl3, 75,5 MHz), δ13C (C), (Figura 9).
38,6 (C-1); 27,3 (C-2); 78,9 (C-3); 38,8 (C-4); 55,2 (C-5); 18,2 (C-6); 34,2 (C-7); 40,7
(C-8); 50,3 (C-9); 37,1 (C-10); 20,8 (C-11); 25,0 (C-12); 37,9 (C-13); 42,7 (C-14); 27,3
(C-15); 35,5 (C-16); 42,9 (C-17); 48,2 (C-18); 47,9 (C-19); 150,9 (C-20); 29,7 (C-21);
39,9 (C-22); 27,9 (C-23); 15,3 (C-24); 16,0 (C-25); 15,9 (C-26); 14,5 (C-27); 17,9 (C-
28); 109,3 (C-29); 19,2 (C-30).
55
6.1.2.3. Substância BT- 4
A substância BT- 4 (80 miligramas), foi isolada da fração diclorometano (FD-
1.4, FD-1.5) através de coluna cromatográfica de adsorção em sílica, obtendo após a
evaporação do solvente, um sólido branco solúvel em diclorometano.
No espectro de Infravermelho observou-se a presença de uma banda forte em
3.435 cm-1, indicando a presença de grupo hidroxila. A banda na região de 2942 a
2869 cm-1 apresentou deformação axial de ligação C-H, em 1459 cm-1 uma banda
de deformação angular de grupo metileno, em 1376 cm-1 uma banda de deformação
angular de grupo metila (Figura 10).
56
Fi
gura
10
� Es
pect
ro d
e In
frave
rmel
ho d
a Be
tulin
a (B
T �
4).
Ban
da c
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tica
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orm
ação
axi
al
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HD
efor
maç
ão a
ngul
ar
do g
rupo
met
ilenoD
efor
maç
ão a
ngul
ar d
o gr
upo
met
ila
57
O espectro de RMN 1H (Figura 11) de BT-4 apresentou em δ 4,58 e δ 4,68,
sinais de hidrogênios vinílicos referentes aos hidrogênios H-29 da ligação dupla
terminal. O sinal na região de δ 3,17 é relativo ao hidrogênio carbinólico H-3, cujos
acoplamentos indicaram a presença de β-configuração, e os dos metilas ocorrem
entre δ 0,96 a δ 1,68. Os dois dubletos de dubletos em δ 3,78 e δ 3,33 em relação
aos de LP - 10 evidenciam a presença de um metileno carbinólico em BT-4 no lugar
do metila-28 de LP-10. Os dados de RMN 1H de BT-4 foram comparados com os
dados da literatura para a betulina (Silva, 2004) (Quadro 5).
Hidrogênio BT-4 a
δ 1H, multi. (nº H, J) Betulina b
δ 1H, multi. (nº H, J) (Silva, 2004)
H-3 H-19 H-21 H-23 H-24 H-25 H-26 H-27 H-28
H-29
H-30
3,17, dd (1H; 5,1 e 10,8) 2,37, m (1H) 1,95, m (2H) 0,96,s (3H) 0,75, s (3H) 0,82, s (3H) 1,02, s (3H) 0,97, s (3H) 3,78, dd (1H; 3,9 e 10,2); 3,33, dd (1H; 3,0 e 10,8) . 4,68, m (1H); 4,58, m (1H) 1,68, m (3H)
3,18 2,38 1,40;1,95 0,96 0,76 0,82 1,02 0,98 3,77; 3,31 4,68; 4,58 1,68
a-RMN 1H (CDCl3, 300MHz); b- RMN 1H (CDCl3, 400MHz); As constantes de acoplamento J entre parêntese estão em Hertz.
Quadro 5 - Dados de RMN 1H de BT - 4 e a comparação com os dados da literatura
(Silva, 2004).
58
9.0
8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
-0.5
-1.0
28.1
91.
551.
000.
570.
530.
50
CD
Cl3
TMS
4.694.684.584.58
3.823.813.78
3.353.21
3.183.16
2.412.38
2.34
1.971.951.90
1.891.89
1.851.68
1.611.57 1.43
1.391.38
1.251.22 1.14
1.020.98 0.97 0.90
0.820.76
0.68
Figu
ra 1
1 �
Espe
ctro
de
RM
N 1 H
(300
MH
z, C
DC
l 3) d
e B
T �
4.
CH
2OH
HO
Bet
ulin
a
1
35
7
9
1113
15
17181920
21
22
2324
2526
27
28
29
30
Hid
rogê
nio
viní
lico
H-2
9M
etile
no c
arbi
nólic
oH
-28
59
No espectro de RMN 13C (Figura 12) observam-se os sinais em δ 109,6
referente ao metileno C-29 da dupla terminal, em δ 150,4 referente ao C-20, em δ
78,9 ao metino carbinólico C-3, em δ 60,4 ao metileno carbinólico C-28 e na região
entre δ 14,7 a 27,9 as metilas. Os dados de RMN 13C foram comparados com os
dados da literatura para a betulina, segundo (Mahato e Kundu, 1994) (Quadro 6).
Nº Carbono BT- 4 a δ 13C Betulina b δ 13C (Mahato e Kundu, 1994)
1 2 3 4 5 6 7 8 9
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
38,828 26,999 78,954 38,828 55,228 18,261 34,172 40,865 50,336 37,248 20,779 25,144 37,248 42,674 26,999 29,120 47,749 48,703 47,749 150,45 29,685 33,936 27,953 15,346 16,086 16,086 14,727 60,493 109,66 19,138
38,8 27,2 78,9 38,9 55,3 18,3 34,3 40,9 50,4 37,2 20,9 25,3 37,3 42,7 27,0 29,2 47,8 48,8 47,8
150,6 29,8 34,0 28,0 15,4 16,1 16,0 14,8 60,2
109,6 19,1
a- RMN de 13C (CDCl3, 75MHz); b- RMN de 13C (CDCl3, 100,6MHz)
Quadro 6 - Dados de RMN 13C de BT- 4 e a comparação com os dados da literatura
(Mahato e Kundu, 1994).
60
Fi
gura
12
� Es
pect
ro d
e R
MN
13C
(75
MH
z, C
DC
l3) d
e B
T- 4
.
CH
2OH
HO
Bet
ulin
a
1
35
7
9
1113
15
17181920
21
22
2324
2526
27
28
29
30
61
Após análise dos dados espectrais e comparação com os dados de literatura
do Infravermelho, da Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio e de Carbono
13, conclui-se que a substância BT- 4 trata-se de um triterpeno da série dos lupanos,
a Betulina (3β,28-Diidróxilup-20(29)-ene).
6.1.2.3.1. � Dados Espectroscópicos da Substância Isolada Betulina (BT- 4):
Betulina: (3β,28-Diidróxilup-20(29)-ene).
Fórmula Molecular: C30H50O2
IV √ máx cm -1 (KBr), (Figura 10): 3435, 2942, 2869, 1637, 1459, 1376, 1027.
RMN 1H (CDCl3, 300 MHz), δ1 H, mult. (H, J em Hz, nº H), (Figura 11)
4,68 m (H-29; 1H); 4,58 m (H-29; 1H); 3,78 dd (H-28; 10,2 e 3,9; 1H); 3,33 d (H-28;
10,8 e 3,0; 1H); 3,17 dd (H-3; 10,8 e 5,1; 1H); 2,37 m (H-19; 1H); 1,95 m (H-21; 2H);
1,68 m (H-30; 3H); 1,02 s (H-26; 3H); 0,97 s (H-27; 3H); 0,96 s (H-23; 3H); 0,82 s (H-
25; 3H); 0,75 s (H-24; 3H).
RMN 13C (CDCl3, 75,5 MHz), δ13C (C), (Figura 12) 38,8 (C-1); 26,9 (C-2); 78,9 (C-3); 38,8 (C-4); 55,2 (C-5); 18,2 (C-6); 34,1 (C-7); 40,8 (C-8);
50,3 (C-9); 37,2 (C-10); 20,7 (C-11); 25,1 (C-12); 37,2 (C-13); 42,6 (C-14); 26,9 (C-15); 29,1
(C-16); 47,7 (C-17); 48,7 (C-18); 47,7 (C-19); 150,4 (C-20); 29,6 (C-21); 33,9 (C-22); 27,9
(C-23); 15,3 (C-24); 16,0 (C-25); 16,0 (C-26); 14,7 (C-27); 60,4 (C-28); 109,6 (C-29); 19,1
(C-30).
62
7. RESULTADOS DOS ENSAIOS FARMACOLÓGICOS
7.1. Teste Geral de Atividades Farmacológicas
Durante todo o período de observação, baseado nos dados contidos na ficha
padrão de triagem farmacológica, adaptada daquela descrita por Malone (1977),
nenhuma alteração comportamental que caracterizasse algum efeito do extrato nos
animais foi demonstrado. Ocorreu óbito em dois animais somente na dose de 100
mg/kg pela via intraperitoneal, até 4 horas após a administração do EES. As doses
do extrato etanólico de sucupira escolhidas para a realização dos demais testes
farmacológicos foram (100, 300 e 1000 mg/kg). A administração do extrato durante a
realização do teste de contorção abdominal induzida por ácido acético foi feita
utilizando duas vias, a via oral e via subcutânea, tendo em vista que essas não
provocaram morte nos animais durante o teste geral de atividade. No entanto, a via
subcutânea apresentou melhores resultados do que a via oral, e por isso foi à
escolhida para ser utilizada nos demais testes farmacológicos.
7.2. Atividade Antinociceptiva 7.2.1. Contorções abdominais induzidas por ácido acético
Comparado com o grupo controle, o EES foi capaz de reduzir o número de
contorções abdominais induzidas pelo ácido acético. O grupo controle que foi
previamente tratado com veículo (água destilada), 45 minutos antes da injeção de
ácido acético (1,2 % i.p.) apresentou 76,3 ± 7,8 contorções em 30 min. Já o grupo
que foi tratado previamente com EES (1000 mg/kg s.c. ou p.o.) o número de
contorções abdominais diminuiu (26,6 ± 4,4), (48,5 ± 3,5), respectivamente. A
indometacina (10 mg/kg s.c.) também diminuiu o número de contorções (44,1 ± 7,1)
(Figura 13). Grupo de animais que foram tratados previamente pela via s.c. com as
frações FH (100 mg/kg), FD (114 mg/kg) ou FAcOEt (50 mg/kg), o número de
contorções reduziu significativamente naqueles tratados com as Frações FH (27,9 ±
4,5), FD (29,0 ± 6,0) em relação ao grupo controle (62,3 ± 9,0), enquanto que a
63
FAcOEt não reduziu o número de contorções de forma significativa (51,6 ± 7,1). O
controle positivo Indometacina, diminuiu o número de contorções (41,3 ± 6,1) (Figura 14). O pré-tratamento com Lupeol (70 mg/kg) reduziu as contorções em (40,1 ± 4,7)
em relação ao grupo controle (74,2 ± 7,3) e no grupo tratado com indometacina o
número de contorções foi de (40,0 ± 5,6) (Figura 15).
Figura 13 - Contorções abdominais induzidas pelo ácido acético (1,2 % v/v em
salina, i.p.) durante 30 minutos em camundongos previamente tratados (45 min) pela
via s.c. com veículo (V; grupo controle; n = 10), pela via s.c. e p.o. com o extrato
etanólico da casca do caule de P. emarginatus (EES; 1000 mg/kg, n = 10) ou com
indometacina (Indo; 10 mg/kg, n = 8) s.c.. As colunas e barras verticais representam
as médias ± EPM de cada grupo experimental.
** Estatisticamente diferente do grupo controle (p < 0,01) � ANOVA, teste de Tukey
*** Estatisticamente diferente do grupo controle (p < 0,001) � ANOVA, teste de Tukey
0
3 0
6 0
9 0
**
***
**
V In d o 1 0 0 0 m g /k g E E S
s .c . p .o .
Núm
ero
de C
onto
rçõe
s
64
0
15
30
45
60
75
* *
V FH100
FD114
FAcOEt50
Indo
Núm
ero
de C
onto
rçõe
s
Figura 14 - Contorções abdominais induzidas pelo ácido acético (1,2 % v/v em
salina, i.p.) durante 30 minutos em camundongos previamente tratados (45 min) pela
via s.c. com veículo (V), com as frações hexânica (FH, 100 mg/kg), diclorometano
(FD, 114 mg/kg) e acetato de etila (FAcOEt, 50 mg/kg) ou com indometacina (INDO;
10 mg/kg). As colunas e barras verticais representam as médias ± EPM de 12
animais por grupo experimental.
* Estatisticamente diferente do grupo controle (p < 0,05) � ANOVA, teste de Tukey.
65
01 02 03 04 05 06 07 08 09 0
V L u p eo l In d o7 0
* *
Núm
ero
de C
onto
rçõe
s
Figura 15 - Contorções abdominais induzidas pelo ácido acético (1,2 % v/v em
salina, i.p.) durante 30 minutos em camundongos previamente tratados (45 min) pela
via s.c. com veículo (V), com o Lupeol (Lupeol; 70 mg/kg) ou com indometacina
(Indo; 10 mg/kg). As colunas e barras verticais representam as médias ± EPM de 10
animais por grupo experimental.
* Estatisticamente diferente do grupo controle (p < 0,05) � ANOVA, teste de Tukey.
66
7.2.2. Teste do �tail flick�
O tratamento prévio com o EES (100, 300 ou 1000 mg/kg) não alteraram o
tempo para reação ao estímulo térmico, 2 horas após a administração. O tratamento
com morfina (10 mg/kg) usada como controle positivo, ampliou o tempo de latência
ao estímulo térmico, 30 minutos após a sua administração e continuou causando
antinocicepção até o tempo de 90 minutos (Figura 16).
-60 -30 0 30 60 90 120
0100200300400500600700
Veículo 10 mL/kgEES 100 mg/kgEES 300 mg/KgEES 1000 mg/KgMorfina 10 mg/Kg
Tempo do tratamento (min)
Tem
po p
ara
reaç
ão(%
do
tem
po z
ero)
**
*
Figura 16 - Latência ao estímulo térmico nociceptivo medido no teste do tail flick em
camundongos antes e após tratamento com o veículo, com EES (100, 300 ou1000
mg/kg) ou morfina (10 mg/kg). Nas ordenadas estão representados os tempos dos
camundongos ao estímulo térmico nociceptivo expressos em porcentagem relativa
ao tempo zero. Os símbolos representam as médias ± EPM dos tempos para reação,
expressos em porcentagem relativa ao tempo zero imediatamente após a
administração em 6 animais por grupo experimental.
* Estatisticamente diferente do grupo controle (p < 0,05) � ANOVA, teste de Tukey.
67
7.2.3. Dor induzida pela Formalina
A aplicação intraplantar de formalina 3% na pata posterior direita de
camundongos produziu intensa nocicepção em duas fases distintas: a primeira de 0
a 5 minutos (dor neurogênica) (Figura 17) e a segunda de 15 a 30 minutos (dor
inflamatória) (Figura 18). Nos animais previamente tratados (60 min) pela via s.c.
com veículo, a reatividade na primeira fase de nocicepção foi de 65,7 ± 6,3 s (n = 9)
e na segunda fase foi de 134,1 ± 19,8 s (n = 7). O pré-tratamento com EES (1000
mg/kg, s.c.) foi capaz de reduzir só a segunda fase de nocicepção, na primeira fase o
valor obtido foi de (44,3 ± 6,1 s, n = 8) e na segunda fase, a redução foi de (76,1 ±
13,7 s, n = 7). O grupo tratado com morfina (10 mg/kg s.c.) teve ambas as fases
reduzidas, sendo que a primeira fase foi reduzida em (22,7 ± 11,6 s, n = 7) e a
segunda fase em (30,0 ± 15,8 s, n = 7). No grupo tratado com indometacina (10
mg/kg, s.c.) a primeira fase não foi reduzida (65,8 ± 6,5 s, n = 6), porém a segunda
fase foi reduzida (44,3 ± 10,1 s, n = 6).
68
1ª Fase (0 � 5 minutos)
0
20
40
60
80
**
V EES 1000 Morf Indo
Tem
po d
e re
ação
(s)
Figura 17 - Reatividade à aplicação intraplantar de formalina (20 µL, 3%) na pata
posterior direita de camundongos, durante a primeira fase (0 � 5 min) do teste da
formalina, previamente tratados (60 min) pela via s.c. com veículo (grupo controle, V;
n = 9), com o EES (1000 mg/kg, n = 8), com morfina (Morf; 10 mg/kg, n = 7) ou com
indometacina (Indo; 10 mg/kg, n = 6). As colunas e barras verticais representam as
médias ± EPM.
** Estatisticamente diferente do grupo controle (p < 0,01) � ANOVA, teste de Tukey.
69
2ª Fase (15 � 30 minutos)
0
40
80
120
160
200
*** **
V EES 1000 Morf Indo
*
Tem
po d
e re
ação
(s)
Figura 18 - Reatividade à aplicação intraplantar de formalina (20 µL, 3%) na pata
posterior direita de camundongos, durante a segunda fase (15 � 30 min) do teste da
formalina, previamente tratados (60 min) pela via s.c. com veículo (grupo controle, V;
n = 7), com o EES (1000 mg/kg, n = 7), com morfina (Morf; 10 mg/kg, n = 7) ou com
indometacina (Indo; 10 mg/kg, n = 6). As colunas e barras verticais representam as
médias ± EPM.
***Estatisticamente diferente do grupo controle (p < 0,001) � ANOVA, teste de Tukey.
**Estatisticamente diferente do grupo controle (p < 0,01) � ANOVA, teste de Tukey.
*Estatisticamente diferente do grupo controle (p < 0,05) � ANOVA, teste de Tukey.
70
7.3. Atividade Antiinflamatória
7.3.1. Edema de orelha induzido por óleo de cróton
O EES e o Lupeol reduziram o edema de orelha induzido pelo óleo de cróton.
No grupo controle, previamente tratado (60 min antes) com o veículo (s.c.), a
administração de óleo de cróton (2,5% v/v em solução de acetona) na orelha direita e
o mesmo volume de acetona na orelha esquerda dos camundongos, gerou um
edema de 18,7 ± 1,1 mg (n = 9) em 4 horas. Nos animais que foram previamente
tratados com EES (100, 300 ou 1000 mg/kg; s.c.) reduziu o edema em (13,1 ± 1,0
mg, n = 6), (10,7 ± 1,4 mg, n = 8) e (8,0 ± 1,9 mg, n = 6), respectivamente. O pré-
tratamento com dexametasona (2 mg/kg s.c.) reduziu o edema em (3,6 ± 0,7mg, n =
6) (Figura 19). Animais tratados previamente com Lupeol (35, 70 ou 140 mg/kg; s.c.)
cujos os resultados foram expressos como porcentagem relativa ao grupo controle, o
edema foi reduzido (110,25 ± 7,9, n = 8), (101,37 ± 6,0 mg, n = 8) e (70,93 ± 7,9 mg,
n = 8), respectivamente em relação ao grupo controle (173,29 ± 11,4). O pré-
tratamento com dexametasona (2 mg/kg; s.c.) reduziu o edema em (46,67 ± 3,9, n =
6) (Figura 20).
7.3.2. Peritonite induzida por carragenina
O EES reduziu significativamente o número de leucócitos migrados para o
peritônio no modelo de peritonite induzida por carragenina (Figura 21). O grupo
controle tratado com o veículo (s.c.), 4 horas após a administração de carragenina
1% (m/v i.p.) induziu a migração de 11,8 ± 1,0 x 106 leucócitos / mL (n = 9) para a
cavidade peritoneal. O pré-tratamento com EES (100, 300 ou 1000 mg/kg s.c.)
reduziu a migração celular em (7,1 ± 1,1 , n = 6), (6,3 ± 5,7, n = 7) e (5,0 ± 3,5, n = 7)
x 106 leucócitos / mL. O pré-tratamento com dexametasona (2 mg/kg, n = 6, s.c.)
reduziu a migração celular em (4,3 ± 7,6 x 106 leucócitos / mL).
71
Figura 19 - Edema de orelha, em mg, induzido por óleo de cróton (2,5% v/v em
acetona) nos grupos previamente tratados pela via s.c. com veículo (V; n = 9), com
extrato etanólico da casca do caule de P. emarginatus (EES 100, 300 ou 1000
mg/kg, n = 6, 8 e 6, respectivamente) ou com dexametasona (Dexa; 2 mg/kg, n = 6).
As barras verticais representam a média ± EPM.
* Estatisticamente diferente do grupo controle (p < 0,05) � ANOVA, teste de Tukey.
*** Estatisticamente diferente do grupo controle (p < 0,001) � ANOVA, teste de
Tukey.
0
5
10
15
20
*
***
V Dexa 100 300 1000E ES
*** ***
∆ P
eso
entr
e as
ore
lhas
(mg)
72
0255075
100125150175200
V 35 70 140 Dexa
Lupeol
* **
*∆ d
e Pe
so e
ntre
as
orel
has(
%)
Figura 20 - Edema de orelha, em mg, induzido por óleo de cróton (2,5% v/v em
acetona) nos grupos previamente tratados pela via s.c. com veículo (V; n = 10), com
Lupeol (Lupeol 35, 70 ou 140 mg/kg, n = 8) ou com dexametasona (Dexa; 2 mg/kg, n
= 6). As barras verticais representam a média ± EPM dos pesos das orelhas,
expressos em percentagem relativa ao controle. Os resultados foram expressos
como média ± EPM em porcentagem relativa ao grupo controle.
* Estatisticamente diferente do grupo controle (p < 0,05) � ANOVA, teste de Tukey.
Os grupos tratados com as diferentes doses de Lupeol são significativamente
diferentes entre si (p < 0,05) � ANOVA, teste de Tukey.
73
0
5
10
15
*
V Dexa 100 300 1000
EES
Leuc
ócito
mig
rado
s/m
L
(X 1
06 )
***** ***
Figura 21 - Migração de leucócitos totais no modelo de peritonite induzida por
carragenina (1% m/v), para a cavidade intraperitoneal de camundongos previamente
tratados pela via s.c. com veículo (V; n = 9), com extrato etanólico da casca do caule
de P. emarginatus (EES 100, 300 ou 1000 mg/kg, n = 6, 7 e 7, respectivamente) ou
dexametasona (Dexa; 2 mg/kg, n = 6). As barras verticais representam a média ±
EPM.
* Estatisticamente diferente do grupo controle (p < 0,05) � ANOVA, teste de Tukey.
** Estatisticamente diferente do grupo controle (p < 0,01) � ANOVA, teste de Tukey.
*** Estatisticamente diferente do grupo controle (p < 0,001) � ANOVA, teste de
Tukey.
74
Discussão
75
8. DISCUSSÃO
Atualmente várias doenças permanecem com sua origem desconhecida,
sendo que algumas dessas doenças apresentam caráter inflamatório e doloroso que
persistem ao longo dos tempos. AINES, glicocorticóides, opióides e seus derivados
são exemplos de medicamentos bastante utilizados na terapêutica para aliviar os
sintomas que essas doenças causam (Gupta e Dubois, 2001).
Algumas evidências demonstram que um grande número de medicamentos
utilizados na terapêutica é derivado direta ou indiretamente de produtos naturais,
especialmente de plantas, sendo uma fonte inesgotável de possibilidades para a
descoberta de novos fármacos (Koehn e Carter, 2005). O uso de plantas medicinais
pela população não é suficiente para validá-las eticamente como medicamentos
eficazes e seguros. Nesse sentido, as plantas medicinais para serem usadas
oficialmente como medicamentos, devem ser fundamentadas em evidências
experimentais comprobatórias de que o risco a que se expõem aqueles que a
utilizam é suplantado pelos benefícios que possam obter (Simões et al., 2004).
No estudo fitoquímico realizado com a casca do caule de P. emarginatus, das
frações hexânica e diclorometano foram extraídos dois triterpenos da classe dos
lupanos, o lupeol e a betulina respectivamente. Alguns dos triterpernos dessa classe
exercem atividade antiinflamatória através da inibição da produção de óxido nítrico e
da prostaglandina E2 (Reyes et al., 2006). Tendo em vista o rendimento obtido da
substância Lupeol, foram feitos testes farmacológicos para avaliar a atividade
antiinflamatória e analgésica desse composto.
Em estudos feitos anteriormente com o lupeol, ele apresentou atividade
antiinflamatória e analgésica (Geetha e Varalakshmi, 2001; Agarwal e Rangari,
2003). Foi capaz de inibir a proliferação de células através da indução da apoptose,
exercendo dessa maneira ação antitumoral (Aratanechemuge et al., 2004). O lupeol
também apresentou atividade antimalárica, hepatoprotetora e antifúngica (Sunitha et
al., 2001; Fotie et al., 2006; Lall et al., 2006; Preetha et al., 2006). Nos estudos feito
com a betulina, foi mostrado que ela exerce atividade antitumoral, antiviral,
76
antimalárica, antifúngica e antiinflamatória, nesse caso, através da inibição da
enzima fosfolipase A2, (Sun et al., 1998; Pavlova et al., 2003; Lall et al., 2006; Sami
et al., 2006).
O diterpeno 14,15 diidroxigeranilgeraniol isolado do óleo essencial do fruto de
Pterodon pubescens Benth, além de exercer atividade antiinflamatória, é um dos
responsáveis pela ação profilática do óleo de P. pubescens sobre Schistossoma
mansoni em camundongos (Pimenta et al., 2006). Já o furano diterpeno 6α,7β-
diidroxivouacapan-17 β-oic, isolado do óleo do fruto de P. polygalaeflorus Benth
demonstrou ter atividade antiinflamatória no teste de edema de pata induzido por
carragenina (Carvalho et al., 1999).
No teste geral de atividades farmacológicas, os tratamentos com EES não
demonstraram nenhuma alteração comportamental, ocorrendo óbito somente pela
via intraperitoneal. Na via de administração e nas doses definidas através do teste
geral de atividades, o EES demonstrou ter efeito antiinflamatório e antinociceptivo
analisados através de alguns modelos de inflamação e de nocicepção em
camundongos. O lupeol, uma das substâncias isoladas do EES, também demonstrou
exercer efeito antiinflamatório e antinociceptivo nos modelos farmacológicos de
inflamação e de nocicepção utilizados para avaliar tais atividades.
Para verificar se o EES, as frações e o composto isolado Lupeol exercem
atividade analgésica e/ou antiinflamatória, utilizamos como modelo farmacológico, o
modelo da contorção abdominal induzida pelo ácido acético de acordo com a
metodologia empregada por Koster (1959). Onde o número de contrações da parede
abdominal, seguidas de torção do tronco e extensão de um dos membros posteriores
após a injeção intraperitoneal de ácidos fracos ou outros agentes inflamatórios, são
contadas durante 30 minutos (Tornos et al., 1999).
Esse modelo é considerado adequado para avaliar compostos que tem
atividade antinociceptiva. O próprio ácido acético causa dor, e ao mesmo tempo ele
estimula a liberação de mediadores endógenos envolvidos na modulação da
nocicepção, por exemplo, a PGE2, uma das prostaglandinas associadas a processos
77
fisiológicos de dor e inflamação (Shu et al., 2006). O modelo das contorções
abdominais em camundongos mostra-se sensível aos fármacos com atividades
analgésicas semelhantes à aspirina ®, aos antagonistas de receptores colinérgicos e
aos analgésicos opióides de ação central e periférica (Matos et al., 2004). Apesar
desse modelo ser sensível, a resposta antinociceptiva é pouco específica tendo em
vista que vários compostos essencialmente não analgésicos como os anti-
histamínicos, estimulantes do sistema nervoso central, antagonistas
serotoninérgicos, neurolépticos, dentre outros, também são capazes de inibir as
contorções (Rates e Barros, 1994). Faz-se necessário a realização de ensaios
complementares para a interpretação dos resultados desse teste.
Os resultados do presente estudo demonstram que, no modelo de contorções
abdominais induzidas pelo ácido acético, o EES pelas vias s.c. e p.o. na maior dose
(1000 mg/kg), as Frações Hexânica (100 mg/kg) e Diclorometano (114 mg/kg), e o
composto isolado Lupeol na dose (70 mg/kg) ambos pela via s.c., apresentaram
atividade antinociceptiva, pois foram capazes de diminuir o número de contorções
abdominais acumuladas durante 30 minutos após a injeção intraperitoneal de ácido
acético 1,2% (v/v). Como era de se esperar, a indometacina, um antiinflamatório não
esteroidal, inibidor da COX-1 e da COX-2 (Craig e Stitzel, 2005), usada como
controle positivo no teste, também foi capaz de diminuir o número de contorções
abdominais.
A analgesia moderada produzida pelo ácido acetilsalicílico e pela
indometacina é explicada pela inibição da atividade da COX e redução da síntese de
PG (Vane, 1971). Entretanto, nos testes padrões em animais nos quais se induz uma
reação inflamatória, tem sido difícil a separação entre a influência da atividade
antiinflamatória desses compostos e entre um efeito analgésico singular (Hunskaar
et al., 1986).
A fim de diferenciar entre uma ação opióide central ou periférica, foi realizado
o teste do �tail flick�. Esse modelo de imersão de cauda mede o tempo de reação do
animal a um estímulo térmico, é sensível a compostos opióides tipo morfina (Janssen
et al., 1963), cujo efeito analgésico é devido à ação no sistema nervoso central
(Millan, 1986).
78
O EES administrado nos animais pela via subcutânea, nas doses (100, 300 ou
1000 mg/kg) não foi capaz de alterar o tempo de latência ao estímulo térmico
doloroso durante os 120 minutos de realização do teste, enquanto a morfina, que foi
o controle positivo do teste, aumentou o tempo de latência de modo significativo, até
90 minutos após o tratamento. Sugere-se então que o EES não atua através de
mecanismos de antinocicepção dependente de atividade analgésica central, o que
nos leva a crer que as substâncias presentes no EES exercem atividade
antinociceptiva através de mecanismos periféricos atuando como agonistas opióides
periféricos ou por induzirem a liberação de peptídeos opióides endógenos
perifericamente.
Tradicionalmente, os agonistas opióides exercem efeitos analgésicos através
de ação no sistema nervoso central, como ocorre com o fentanil ou a morfina (Herz e
Teschemacher, 1971; Milan, 1986). A utilização de análogos quaternários de
agonistas ou antagonistas opióides, por exemplo, os alcalóides N-metilmorfina e N-
metilnalorfina que possuem a mínima capacidade de atravessarem a barreira
hematoencefálica, parecem exercer o efeito analgésico através da atuação em
receptores opióides presentes nas terminações nociceptivas periféricas (Ferreira e
Nakamura, 1979 a,b,c; Ferreira et al., 1981; Smith et al., 1982).
A utilização de modelos de inflamação ocorre na quase totalidade dos estudos
que caracterizam a atividade antinociceptiva opióide periférica (Stein, 1993). Durante
o processo inflamatório o número de receptores opióides está aumentado (supra-
regulação) nos terminais aferentes periféricos (Hassan et al., 1993; Schäfer et al.,
1995). Esses receptores são ativados por peptídeos opióides endógenos produzidos
por células do sistema imunológico que migram para o tecido inflamado (Stein et al.,
1989; Przewlocki et al., 1992).
Os agentes opióides produzem analgesia através da ativação de receptores
opióides conhecidos como µ, δ ou κ. Os receptores opióides µ são responsáveis por
uma analgesia predominantemente supraespinhal e espinhal, e juntamente com
receptores δ e κ influenciam periféricamente os terminais nociceptivos das fibras
aferentes primárias C e A-δ. Desta forma há uma menor participação dos receptores
79
δ e κ no controle da dor a nível espinhal (Stein et al., 1989; Dickenson, 1991; Levine
et al., 1993; Kanjhan, 1995; Grubb, 1998; Law e Loh, 1999).
Outro teste realizado foi o teste da formalina em camundongos, esse teste foi
feito com o objetivo de melhor caracterizar a atividade antinociceptiva do EES. É um
modelo químico de nocicepção que fornece uma resposta mais específica
comparativamente ao modelo do ácido acético (Shibata et al., 1989; Tjǿlsen et al.,
1992). Esse ensaio consiste na injeção intraplantar de formalina 3% (v/v) na pata
posterior direita. A nocicepção causada pela formalina é caracterizada por vigorosas
lambidas, mordidas e batidas na pata injetada com o agente irritante. A aplicação
desse agente na pata posterior torna a resposta nociceptiva mais específica, tendo
em vista que o animal, durante o �grooming�, utiliza mais freqüentemente as patas
anteriores (Tjǿlsen et al., 1992).
Em roedores, o teste da formalina caracteriza-se por apresentar duas fases
distintas de nocicepção (Hunskaar et al., 1985; Dickenson e Sullivan, 1987; Cowan et
al., 1989). A primeira fase ocorre nos 5 primeiros minutos após a aplicação de
formalina (dor neurogênica) possivelmente ocasionada pela estimulação química
direta dos nociceptores (Dubuisson e Dennis, 1977; Hunskaar et al., 1985). Já a
segunda fase que ocorre entre 15 e 30 minutos (dor inflamatória) após a aplicação
da formalina e está relacionada com a liberação de vários mediadores pró-
inflamatórios como histamina, serotonina, prostaglandinas, dentre outros (Hunskaar
e Hole, 1987).
O pré-tratamento pela via subcutânea com EES na dose de 1000 mg/kg, que
produziu o efeito no modelo de contorções abdominais, foi capaz de inibir a segunda
fase do teste da formalina, à semelhança do efeito obtido com a indometacina
utilizada como padrão. A morfina, um agonista opióide de ação central e periférica,
inibiu ambas as fases da formalina.
A segunda fase da formalina pode ser inibida também por agentes
antiinflamatórios. Assim, a investigação dessa atividade também foi realizada através
de um modelo que mede a atividade antiedematogênica e um outro que quantifica a
inibição da migração de leucócitos para o foco inflamatório.
80
A atividade antiedemetogênica do EES e do Lupeol foi avaliada utilizando
para isso o teste de edema de orelha induzida por óleo de cróton. O óleo de cróton é
um agente irritante que provoca a migração de leucócitos causando edemas
intervasculares (Swingle et al., 1981). Esse teste apresenta sensibilidade aos
antiinflamatórios esteroidais e aos não esteroidais (Schiantarelli et al, 1982). Neste
ensaio, a formação de edema é induzida através da aplicação tópica do óleo de
cróton em solução com acetona, na orelha direita do camundongo.
A formação do edema em tecidos injuriados resulta no sinergismo entre vários
mediadores inflamatórios, além do aumento da permeabilidade vascular mediados
pelo aumento do fluxo sanguíneo. O desenvolvimento do edema é dividido em duas
fases: fase precoce observada em torno de uma hora, onde ocorre a liberação de
bradicinina, histamina e serotonina; e a fase tardia onde ocorre a liberação de
prostaglandinas (Miceli et al, 2005).
Portanto, deve-se considerar, ao interpretar os resultados deste ensaio,
fatores que influenciam a formação do edema, tais como a perfusão vascular do
tecido, pressão sanguínea sistêmica e nível de glicocorticóides, pois a intensidade do
edema é o parâmetro observado nesse teste quanto à ação antiinflamatória
analisada (Rates e Barros, 1994; Souccar e Lapa, 1997).
Em animais previamente tratados pela via subcutânea com EES (100, 300 ou
1000 mg/kg) e lupeol (35, 70 ou 140 mg/kg) e com a dexametasona que foi o
controle positivo do teste de edema de orelha induzida por óleo de cróton, foram
capazes de reduzir a formação do edema de maneira significativa. O lupeol foi
escolhido para ser avaliado quanto à atividade antiinflamatória visto que ele foi capaz
de inibir o número de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético.
Entretanto, de acordo com os resultados obtidos, não foi possível distinguir em qual
das 3 fases de um processo inflamatório (aguda, tardia ou crônica) que o EES e o
lupeol atuaram.
Assim, não se sabe ao certo de que maneira ocorreu a ação
antiedematogência provocada pelo EES e pelo lupeol, o qual pode ter várias
explicações, como por exemplo, uma ação inespecífica gerando vasoconstrição,
81
mecanismos de inibição da migração celular, ou se foi por uma ação direta sobre a
cascata do AA, seja inibindo a COX e acil-hidrolases, dentre outras possibilidades
que existem (Faiçal e Uehara, 1998).
Relata-se que o lupeol exerce supressão de PGE2 e que a sua atividade
antiinflamatória é exercida possivelmente por prevenir a produção de mediadores
pró-inflamatórios (Agarwal e Rangari, 2003). O efeito antiinflamatório tópico do lupeol
detectado no teste de edema de orelha induzido pelo óleo de cróton, pode ser devido
ao efeito de proliferação de queratinócitos, especialmente pela hemisuccinilação
(Agarwal e Rangari, 2003).
Outro modelo utilizado foi o teste da peritonite induzida por carragenina, que
teve como objetivo avaliar a participação de mecanismos antiinflamatórios na
atividade antinociceptiva do EES. A carragenina, administrada intraperitonealmente
provoca uma reação inflamatória aguda, onde vários mediadores pró-inflamatórios
são liberados, principalmente a histamina, a serotonina, as cininas, as
prostaglandinas e os tromboxanos (Di Rosa et al., 1971; Damas et al., 1990). Esse
teste consiste na contagem do número de leucócitos migrados para a cavidade
intraperitoneal sob a ação de agentes quimiotáticos principalmente interleucinas e
leucotrienos, sendo sensível a ação de agentes antiinflamatórios esteroidais (Vinegar
et al., 1973; Higgs et al., 1980; Mikami e Miyasaka, 1983; Brooks e Day, 1991).
Nos animais previamente tratados com EES nas doses definidas
anteriormente, o número de leucócitos migrados para cavidade intraperitoneal
diminuiu significativamente, comparados com os animais tratados com veículo
(água). O que reforça a ação antiinflamatória desse extrato, vista anteriormente no
modelo que avaliou a atividade antiedematogênica. A dexametasona (glicocorticóide)
usada como controle positivo nesse teste, exerceu ação antiinflamatória de forma
eficiente, o que pode ser comprovado pela redução do número de leucócitos
migrados nos animais tratados com esse controle.
82
Esse resultado, somado ao resultado positivo no teste de edema de orelha
induzido por óleo de cróton sugere que o EES possui uma ação antiinflamatória,
assim como o Lupeol, de acordo com o modelo antiedematogênico. A ação
antiinflamatória vista através da redução da migração de leucócitos para o sítio
inflamatório, mostra a possível interferência do EES nos mecanismos quimiotáticos.
83
Conclusões
84
9. CONCLUSÕES
• Lupeol e Betulina foram os componentes isolados das frações hexânica e
diclorometano, respectivamente.
• Baseado nos testes realizados, EES possui atividade antiinflamatória e
antinociceptiva.
• EES não exerce ação antinociceptiva através de mecanismo centrais, devido
ao teste de flexão de cauda não ter demonstrado resultado significativo.
• As Frações Hexânica e Diclorometano também demonstraram ter atividade
antinociceptiva e antiinflamatória nos testes realizados.
• O lupeol exerceu atividade antiinflamatória, e, portanto, parece ser um dos
compostos responsáveis por tal atividade, tanto do EES quanto da fração
hexânica.
• Esse estudo respalda o uso popular da casca de Pterodon emarginatus Vog
como antiinflamatório.
85
Referências
86
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94
Apêndice
95
APÊNDICE A � Tabelas de Dados Tabela 1 � Contorções abdominais induzidas pelo ácido acético (1,2 % v/v em salina,
i.p.) durante 30 minutos em camundongos previamente tratados (45 min) pela via
p.o. com veículo, pela via p.o. e s.c. com o extrato etanólico das cascas de P.
emarginatus (EES; 1000 mg/kg) (I), pela via s.c. com as frações hexânica (FH, 100
mg/kg), diclorometano (FD, 114 mg/kg) e acetato de etila (FAcOEt, 50 mg/kg) (II), pela via s.c. com o Lupeol (70 mg/kg) (III) ou com indometacina (10 mg/kg).
I (EES)
Tratamento
Veículo
EES
Indometacina
Dose - Via
10mL/kg - s.c.
1000 mg/Kg - p.o.
1000 mg/Kg - s.c.
10 mg/Kg - s.c.
Número de contorções (Média ± EPM)
76,3 ± 7,8
48,5 ± 3,5 ** 26,6 ± 4,4 ***
44,1 ± 7,1 **
II (Frações) Tratamento
Veículo
FH FD FAcOEt
Indometacina
Dose - Via
10mL/kg - s.c.
100 mg/kg - s.c. 114 mg/kg - s.c. 50 mg/kg - s.c. 10 mg/kg � s.c.
Número de contorções (Média ± EPM)
62,3 ± 9,0
27,9 ± 4,5 * 29,0 ± 6,0 * 51,6 ± 7,1
41,3 ± 6,1
96
III (Lupeol) Tratamento
Veículo
Lupeol
Indometacina
Dose - Via
10mL/kg - s.c.
70 mg/kg - s.c.
10 mg/kg - s.c.
Número de contorções (Média ± EPM)
74,2 ± 7,3
40,1 ± 4,7 * 40,0 ± 5,6 *
* Estatisticamente diferente do grupo controle (p < 0,05) � ANOVA, teste de Tukey.
** Estatisticamente diferente do grupo controle (p < 0,01) � ANOVA, teste de Tukey.
*** Estatisticamente diferente do grupo controle (p < 0,001) � ANOVA, teste de
Tukey.
97
Tabela 2 � Latência ao estímulo térmico nociceptivo medido no teste do �tail flick� em
camundongos antes e após tratamento por via s.c. com o veículo (I), com EES 100
(II), 300 (III) ou 1000 (IV) mg/kg, ou morfina (V) (10 mg/kg).
I (Veículo)
Imersão das caudas (min)
-60 -30
0 30
60
90
120
Tempo (%) (Média ± EPM)
169,33 ± 36,95 99,00 ± 16,41
100 ± 0,00
142,00 ± 23,98
160,00 ± 26,50
172,16 ± 17,29
132,16 ± 16,34
II (EES 100 mg/kg)
Imersão das caudas
(min)
-60 -30 0
30
60
90
120
Tempo (%)
(Média ± EPM)
104,00 ± 15,59 94,33 ± 21,66
100 ± 0,00
225,16 ± 21,57
215,50 ± 38,03
132,50 ± 24,65
188,83 ± 24,28
98
III (EES 300 mg/kg)
Imersão das caudas (min)
-60 -30 0
30
60
90
120
Tempo (%) (Média ± EPM)
121,00 ± 31,27 111,33 ± 22,88
100 ± 0,00
208,83 ± 38,62
199,83 ± 27,99
206,66 ± 20,65
295,50 ± 74,47
IV (EES 1000 mg/kg)
Imersão das caudas (min)
-60 -30
0 30
60
90
120
Tempo (%) (Média ± EPM)
130,50 ± 19,92 142,00 ± 27,45
100 ± 0,00
232,83 ± 48,31
238,83 ± 42,52
194,16 ± 30,23
290,50 ± 51,01
99
V (Morfina 10 mg/kg)
Imersão das caudas (min)
-60 -30
0 30
60
90
120
Tempo (%) (Média ± EPM)
73,33 ± 16,85 67,50 ± 7,85
100 ± 0,00
334,00 ± 67,54 * 464,16 ± 139,45 * 383,33 ± 106,73 *
295,33 ± 64,364
* Estatisticamente diferente do grupo controle (p < 0,05) � ANOVA, teste de Tukey.
Os grupos tratados com as diferentes doses de EES são significativamente
diferentes entre si (p < 0,05) � ANOVA, teste de Tukey.
100
Tabela 3 � Reatividade à aplicação intraplantar de formalina (20 µL, 3%) na pata
posterior direita de camundongos, durante a primeira fase (0 � 5 min) (I) e segunda
fase (15 � 30 min) (II) do teste da formalina, previamente tratados (60 min) pela via
s.c. com veículo, com o EES (1000 mg/kg), com morfina (10 mg/kg) ou com
indometacina (10 mg/kg).
I (Primeira Fase) Tratamento
Veículo
EES Morfina Indometacina
Dose - Via
10mL/kg - s.c.
1000 mg/kg - s.c. 10 mg/kg - s.c. 10 mg/kg � s.c.
Tempo de Latência (Média ± EPM)
65,7 ± 6,3
44,3 ± 6,1 22,7 ± 11,6 **
65,8 ± 6,5
II (Segunda Fase) Tratamento
Veículo EES
Morfina Indometacina
Dose - Via
10mL/kg - s.c. 1000 mg/kg - s.c.
10 mg/kg - s.c. 10 mg/kg � s.c.
Tempo de Latência (Média ± EPM)
134,1 ± 19,8 76,1 ± 13,7 *
30,0 ± 15,8 *** 44,3 ± 10,1 **
* Estatisticamente diferente do grupo controle (p < 0,05) � ANOVA, teste de Tukey.
** Estatisticamente diferente do grupo controle (p < 0,01) � ANOVA, teste de Tukey.
*** Estatisticamente diferente do grupo controle (p < 0,001) � ANOVA, teste de
Tukey.
101
Tabela 4 � Edema de orelha, em mg, induzido por óleo de cróton (2,5% v/v em
acetona) nos grupos previamente tratados pela via s.c. com veículo (V), com extrato
etanólico de P. emarginatus (EES 100, 300 ou 1000 mg/kg) (I), pela via s.c. com o
Lupeol (Lupeol 35, 70 ou 140 mg/kg) (II) ou dexametasona (Dexa; 2 mg/kg).
(I) EES
Tratamento
Veículo EES
Dexametasona
Dose - Via
10mL/kg - s.c. 100 mg/kg - s.c. 300 mg/kg - s.c.
1000 mg/kg - s.c. 2 mg/kg � s.c.
Diferença de peso entre as orelhas
(Média ± EPM)
18,7 ± 1,1 13,1 ± 1,0 * 10,7 ± 1,4 *** 8,0 ± 1,9 ***
3,6 ± 0,7 ***
II) Lupeol
Tratamento
Veículo Lupeol
Dexametasona
Dose - Via
10mL/kg - s.c. 35 mg/kg - s.c.
70 mg/kg - s.c.
140 mg/kg - s.c. 2 mg/kg - s.c.
Diferença de peso entre
as orelhas em % (Média ± EPM)
173,29 ± 11,4 110,25 ± 7,9 *
101,37 ± 6,0 * 70,93 ± 7,9 *
46,67 ± 3,9 *
* Estatisticamente diferente do grupo controle (p < 0,05) � ANOVA, teste de Tukey.
*** Estatisticamente diferente do grupo controle (p < 0,001) � ANOVA, teste de
Tukey.
102
Tabela 5 � Migração de leucócitos totais (x 106) no modelo de peritonite induzida por
carragenina (1% m/v) injetada na cavidade intraperitoneal de camundongos
previamente tratados pela via s.c. com veículo (V), com extrato etanólico de P.
emarginatus (EES 100, 300 ou 1000 mg/kg) ou dexametasona (Dexa; 2 mg/kg).
Tratamento
Veículo EES
Dexametasona
Dose - Via
10mL/kg - s.c. 100 mg/kg - s.c.
300 mg/kg - s.c.
1000 mg/kg - s.c. 2 mg/kg � s.c.
Número de Leucócitos Migrados (106) (Média ± EPM)
11,8 ± 1,2 7,1 ± 1,5 * 6,3 ± 0,61 ** 5,0 ± 0,37 ***
4,3 ± 0,88 ***
* Estatisticamente diferente do grupo controle (p < 0,05) � ANOVA, teste de Tukey.
** Estatisticamente diferente do grupo controle (p < 0,01) � ANOVA, teste de Tukey.
*** Estatisticamente diferente do grupo controle (p < 0,001) � ANOVA, teste de
Tukey.
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