KARMEN ĈERKIĆ
ZAŠČITNA VLOGA PEGILACIJE PRI STABILNOSTI
ZELO HIDROFOBNEGA PROTEINA V TEKOČI
FARMACEVTSKI OBLIKI
PROTECTIVE ROLE OF PEGYLATION ON
STABILITY OF VERY HYDROPHOBIC PROTEIN IN
LIQUID PHARMACEUTICAL FORMULATION
MAGISTRSKA NALOGA
Ljubljana, 2012
I
Magistrsko delo sem opravljala v podjetju Lek, ĉlan skupine Sandoz (Biofarmacevtika, Nove
generacije proteinov, meritve DLS na oddelku Razvoj izolacij). Ugotavljanje biološke
aktivnosti sem izvedla na Kemijskem inštitutu v Laboratoriju za biosintezo in
biotransformacijo v Ljubljani.
Zahvala
Za neprecenljivo strokovno pomoč pri izdelavi magistrske naloge se zahvaljujem dr. Simoni
Jevševar in dr. Katarini Fidler.
Zahvaljujem se tudi mentorju prof. dr. Urošu Urlebu za srkrben pregled magistrske naloge in
koristne napotke. Hvala tudi predsedniku komisije prof. dr. Stanku Srčiču in članu komisije
doc. dr. Damjanu Janešu za pregled dela.
Za pomoč pri izvedbi BA testov se zahvaljujem Maji Marušič in za pomoč pri izvedbi DLS
meritev hvala Dejanu Arzenšku.
Zahvaljujem se tudi vsem sodelavcem, ki so me spodbujali med nastankom magistrske naloge.
Hvala tudi vsem sorodnikom in prijateljem, ki ste verjemi vame.
Izjava:
Izjavljam, da sem magistrsko delo samostojno izdelala pod mentorstvom prof. dr. Uroša
Urleba, mag.farm.
Karmen Ĉerkić
Predsednik komisije: prof. dr. Stanko Srĉiĉ, mag. farm.
Ĉlan komisije: doc. dr. Damjan Janeš, mag. farm.
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga KAZALO VSEBINE
II
KAZALO VSEBINE
1. UVOD ................................................................................................................................ 1
1.1 BIOLOŠKA ZDRAVILA ............................................................................................ 1
1.1.1 Podobna biološka zdravila ................................................................................... 1
1.1.2 Druga generacija bioloških zdravil....................................................................... 3
1.2 PEGILACIJA ............................................................................................................... 3
1.2.1 Reagenti PEG ....................................................................................................... 5
1.2.1.1 Prva in druga generacija reagentov PEG ...................................................... 5
1.2.2 Kemija PEGilacije ................................................................................................ 6
1.3 HIDROFOBNI PROTEINI: izziv za stabilno konĉno farmacevtsko obliko ............... 7
1.3.1 Primeri hidrofobnih proteinov .............................................................................. 9
1.4 STABILNOST PROTEINOV ................................................................................... 11
1.4.1 Kemijska stabilnost proteinov ............................................................................ 11
1.4.2 Fizikalna stabilnost proteinov ............................................................................ 12
1.4.3 Stabilizacija proteinov ........................................................................................ 13
1.5 KARAKTERIZACIJA AGREGATOV .................................................................... 14
1.5.1 Gelska filtracija .................................................................................................. 14
1.5.2 Pretoĉni sistem za loĉevanje makromolekul po velikosti (FFF) ........................ 15
1.5.3 Analizno ultracentrifugiranje ............................................................................. 15
1.5.4 MALS, tehnika statiĉnega sipanja svetlobe ....................................................... 16
1.5.4.1 Izraĉun molekulske mase ............................................................................ 17
1.5.5 DLS, tehnika dinamiĉnega sipanja svetlobe ...................................................... 19
2. NAMEN DELA ................................................................................................................ 22
3. MATERIALI IN METODE ............................................................................................. 23
3.1 MATERIALI ............................................................................................................. 23
3.1.1 Kemikalije .......................................................................................................... 23
3.1.2 Voda ................................................................................................................... 24
3.1.3 Raztopine in pufri ............................................................................................... 24
3.1.4 Vzorci (izvor, sestava, kakovost) ....................................................................... 25
3.1.5 Standardi ............................................................................................................. 25
3.1.6 Kromatografske kolone za analizno kromatografijo .......................................... 25
3.2 METODE ................................................................................................................... 26
3.2.1 Oprema ............................................................................................................... 26
3.2.2 Priprava konĉnih vzorcev za stabilnost: zamenjava pufra, koncentriranje in
sterilna filtracija ................................................................................................................ 27
3.2.2.1 Merjenje koncentracij z UV spektrofotometrom ........................................ 27
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga KAZALO VSEBINE
III
3.2.3 Stabilnost: naĉrt in koliĉine vzorcev .................................................................. 28
3.2.4 Analizna kromatografija ..................................................................................... 29
3.2.4.1 Kromatografija na reverzni fazi (RPC) ....................................................... 29
3.2.4.2 Kationsko-izmenjevalna kromatografija (CEC) ......................................... 30
3.2.4.3 Gelska kromatografija (SEC) ...................................................................... 31
3.2.4.4 SEC-MALS ................................................................................................. 31
3.2.5 DLS, tehnika dinamiĉnega sipanja svetlobe ...................................................... 32
3.2.6 Ugotavljanje biološke aktivnosti in vitro ........................................................... 32
4. REZULTATI IN RAZPRAVA ........................................................................................ 34
4.1 Analizna kromatografija ............................................................................................ 34
4.1.1 Ĉistost RPC ........................................................................................................ 34
4.1.2 Ĉistost CEC ........................................................................................................ 37
4.1.3 Ĉistost SEC ........................................................................................................ 40
4.1.4 Ugotavljanje molekulske mase s SEC-MALS ................................................... 43
4.1.4.1 Ugotavljanje molekulske mase izhodnih vzorcev ....................................... 44
4.1.4.2 Ugotavljanje molekulske mase stabilitetnih vzorcev .................................. 46
4.2 DLS ............................................................................................................................ 49
4.3 Biološka aktivnost in vitro ......................................................................................... 53
5. ZAKLJUĈEK ................................................................................................................... 55
6. LITERATURA ................................................................................................................. 58
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga POVZETEK
IV
POVZETEK
Razvoj tekoĉe farmacevtske oblike za zelo hidrofobne proteine je zahteven proces, saj so
zaradi slabe topnosti nagnjeni k agregaciji. Agregati so pogosto imunogeni in njihova
dovoljena vsebnost v biofarmacevtskih izdelkih je strogo omejena. Dodajanje ekscipientov
(na primer sladkorjev) je najpogostejši naĉin stabilizacije proteinov v tekoĉi farmacevtski
obliki. Drug uspešen pristop bi lahko bila PEGilacija. V prvi vrsti je PEGilacija proteinov
namenjena podaljšanju razpolovnega ĉasa v telesu, kar privede do izboljšanih
farmakokinetiĉnih in farmakodinamiĉnih lastnosti molekule. Vendar konjugacija proteina z
verigo polietilenglikola (PEG) prinaša tudi druge prednosti, kot je izboljšana topnost v vodi
oziroma izbrani formulaciji. To je še posebej pomembno pri zelo hidrofobnih proteinih.
V magistrski nalogi smo izvedli študijo stresne stabilnosti in na modelnem zelo hidrofobnem
proteinu preuĉili zašĉitno vlogo PEGilacije na nastanek agregatov. Dodatno smo preuĉili tudi
uĉinek ekscipienta, sladkorja trehaloze. Naša izhodišĉna hipoteza je bila, da bo PEGilacija
izboljšala stabilnost modelnega proteina. Modelni protein (Protein_t), v optimirani tekoĉi
farmacevtski obliki z dodatkom trehaloze smo primerjali s PEGiliranim proteinom
(PEGprotein) v dveh razliĉnih tekoĉih farmacevtskih oblikah in sicer z dodatkom trehaloze
(PEGprotein_t) in brez (PEGprotein_a). Stabilitetna študija je vkljuĉevala temperaturno
stabilnost (-60 °C, 4 °C, 25 °C in 40 °C), cikle zamrzovanja / odmrzovanja in striţne sile
(stresanje). Stabilnost vzorcev je bila ocenjena s standardnimi tehnikami HPLC RPC in CEC.
Agregacija je bila ovrednotena s tehniko dinamiĉnega sipanja svetlobe (DLS) in tehniko
HPLC SEC, sklopljeno z merjenjem statiĉnega sipanja svetlobe (SEC-MALS). Ocenili smo
tudi vpliv stresnih pogojev na biološko aktivnost in vitro.
Razlike v stabilnosti smo zaznali pri pogojih pospešene stabilnosti, pri 25 °C in 40 °C. Glede
na analize RPC in CEC, je bil nastanek razgradnih produktov v obeh PEGiliranih razliĉicah
poĉasnejši in analiza SEC je nakazala poĉasnejšo agregacijo PEGiliranih molekul.
Kombinacija PEGilacije in dodatka trehaloze je prinesla dodaten stabilizirajoĉi uĉinek. Z DLS
smo v vzorcih Protein_t v povpreĉju zaznali veĉje število populacij razliĉnih velikosti kot v
vzorcih PEGprotein, kar ravno tako kaţe na veĉjo stabilnost vzorcev PEGprotein. Raziskava
je potrdila našo izhodišĉno hipotezo, PEGilacija ima zašĉitno vlogo v stabilnosti zelo
hidrofobnega proteina v tekoĉi farmacevtski obliki. Vsi vzorci, tako Protein_t kot tudi
PEGprotein, so po izpostavitvi temperaturnemu stresu ohranili biološko aktivnost in vitro.
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga ABSTRACT
V
ABSTRACT
Very hydrophobic proteins are especially demanding regarding the development of liquid
pharmaceutical formulations, mainly due to their low solubility which makes them prone to
aggregation. Aggregates may elicit immune response in patients and their acceptable content
in the final drug product is strictly limited. The most common method for protein stabilization
in liquid formulations is addition of excipients (e.g. sugars). Another successful approach
could be PEGylation. Protein PEGylation is primarily being introduced in cases where
improved pharmacokinetic and pharmacodynamic properties arising from the prolonged
elimination half-life are envisaged. But protein conjugation to the polyethylene glycol (PEG)
chain also brings other benefits, such as increased solubility, which is particularly important
when dealing with very hydrophobic proteins.
In the MSc thesis we have performed a stress stability study of a highly hydrophobic model
protein and tested a protective role of PEGylation on aggregation. Additionally, the effect of
sugar excipient (trehalose) was tested. Our initial hypothesis was that PEGylation will
improve stability of the model protein. The model protein (Protein_t) in an optimised liquid
pharmaceutical formulation containing trehalose was compared to the PEGylated protein
(PEGprotein) in two different liquid pharmaceutical formulations, with (PEGprotein_t) and
without (PEGprotein_a) trehalose. The stability studies included temperature stability (-60
°C, 4 °C, 25 °C and 40 °C), freeze/thaw cycles and sheer forces (shaking). Stability of the
tested samples was evaluated with standard HPLC techniques RPC and CEC. Aggregation
was evaluated using dynamic light scattering (DLS) and HPLC technique SEC coupled to
static light scattering (SEC-MALS). The influence of stress conditions to the in vitro
biological activity was also evaluated.
Differences in stability were observed at accelerated stability conditions, 25 °C and 40 °C.
According to RPC and CEC the formation of degradation products was slower for both
PEGprotein variants and SEC indicates slower formation of aggregates in PEGylated
molecules. A combination of PEGylation and the addition of trehalose proved to ensure an
even greater stabilizing effect. DLS in average detected a larger number of different size
populations in the Protein_t samples than in the PEGprotein samples, which also indicates a
higher stability of PEGprotein samples. The research confirmed our initial hypothesis,
PEGylation plays a protective role in the stability of the very hydrophobic protein in the liquid
pharmaceutical formulation. Both Protein_t and PEGprotein samples retained their in vitro
biological activities after exposure to temperature stress.
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga OKRAJŠAVE IN SIMBOLI
VI
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI
ACN acetonitril
Asn asparagin
BA biološka aktivnost
BSA goveji serumski albumin
(angl. Bovine Serum Albumin)
c koncentracija (mol/l)
CE-HPLC (CEC) kationsko-izmenjevalna kromatografija
Da dalton: enota za molekulsko maso, ki ustreza 1/12 mase ĉistega izotopa
12C
DLS dinamiĉno sipanje svetlobe
(angl. Dynamic Light-Scattering)
DNA deoksiribonukleinska kislina
EMA Evropska agencija za zdravila
(angl. European Medicines Agency)
FDA Ameriška agencija za hrano in zdravila
(angl. Food and Drug Administration)
FFF pretoĉni sistem za loĉevanje makromolekul po velikosti
(angl. Field Flow Fractionation)
FFFF pretoĉni sistem za loĉevanje makromolekul po velikosti z uporabo
preĉnega pretoka FFFF ali F4
(angl. Flow Field-Flow Fractionation)
G-CSF granulocitne kolonije stimulirajoĉi faktor
(angl. Granulocyte Colony Stimulating Factor)
HIFBS toplotno inaktiviran fetalni goveji serum
(angl. Heat Inactivated Fetal Bovine Serum)
HPLC tekoĉinska kromatografija visoke loĉljivosti
(angl. High Performance Liquid Chromatography)
HSA humani serumski albumin
(angl. Human Serum Albumin)
IFN interferon
IL interlevkin
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga OKRAJŠAVE IN SIMBOLI
VII
INN mednarodno nelastniško ime
(angl. International Nonproprietary Name)
MALS sipanje svetlobe pri veĉih kotih
(angl. Multi-Angle Light Scatter)
MW molekulska masa v Da
(angl. Molecular Weight)
PAS površinsko aktivna snov
PD polidisperznost
PEG polietilenglikol
pNPP 4-nitrofenil fosfat dinatrijev heksahidrat
(angl. 4-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahidrate)
pH negativni logaritem koncentracije vodikovih ionov
RI lomni koliĉnik
(angl. Refractive Index).
RNA ribonukleinska kislina
RP-HPLC (RPC) kromatografija na reverzni fazi
rpm število obratov na minuto
(angl. revolutions per minute)
RT sobna temperatura
(angl. Room Temeprature)
SE-HPLC (SEC) gelska kromatografija
t ĉas (s, min, h)
T temperatura (°C, K)
TNF-α dejavnik tumorske nekroze alfa
(angl. Tumor Necrosis Factor)
Thr treonin
VEGF ţilni rastni dejavnik
(angl. Vascular Endothelial Growth Factor)
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga UVOD
1
1. UVOD
1.1 BIOLOŠKA ZDRAVILA
Farmacevtska biotehnologija je v zadnjem desetletju podroĉje farmacevtske industrije, ki se
najhitreje razvija. Z odobritvijo prvega biološkega zdravila inzulina leta 1982 in z nadaljnim
razvojem bioloških zdravil so se odprle nove poti zdravljenja in prepreĉevanja bolezni, za
katere prej niso poznali primerne terapije (1, 2).
Biološka zdravila se od klasiĉnih zdravil razlikujejo predvsem zaradi visoke molekulske
mase, kompleksne tridimenzionalne zgradbe in pridobivanja s pomoĉjo ţivih organizmov.
Zanimiv je podatek, da se trţni deleţ bioloških zdravil poveĉuje kar dvakrat hitreje kot pri
klasiĉnih zdravilih (1).
Biološka zdravila razdelimo v pet skupin glede na sestavo, izvor in naĉin pridobivanja in sicer
na biološka zdravila pridobljena z izolacijo (naravni in ĉloveški hormoni, uĉinkovine iz
rastlin, kri in krvni proizvodi ter klasiĉna cepiva), biološka zdravila pridobljena s sintezo
(sintezni peptidi), genska zdravila (terapevtski geni vneseni z virusnim ali nevirusnim
transportnim sistemom, uĉinkovine RNAi, ribocimi, protismiselne (angl. antisense) molekule
RNA), monoklonska protitelesa in rekombinantna biološka zdravila, ki so najveĉja skupina
bioloških zdravil (1, 2).
1.1.1 Podobna biološka zdravila
Pri klasiĉnih zdravilih je pojem generiĉno zdravilo jasen: to je zdravilo, ki vsebuje enako
uĉinkovino v enaki farmacevtski obliki in se tudi po jakosti, kakovosti, varnosti in
uĉinkovitosti ne razlikuje od originalnega zdravila, kar proizvajalec generiĉnega zdravila
dokaţe z bioekvivalenĉnimi raziskavami. Pri bioloških zdravilih pa lahko reĉemo, da ni
generikov, zato so agencije EMA in FDA uvedle izraz podobna biološka zdravila (angl.
Biosimilars). Skoraj nemogoĉe je namreĉ izdelati popolnoma enako biološko zdravilo, saj ţe
minimalne spremembe v procesu izdelave lahko vodijo do velikih razlik v zgradbi
uĉinkovine. Razlogi zato so kompleksnost biološke molekule (velikost, struktura, stabilnost,
nastanek sprememb v zgradbi med procesom kot so npr. glikozilacija, oksidacija,
deamidacija, proces denaturacije in agregacije kot posledica reakcije s pomoţnimi snovmi),
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga UVOD
2
uporaba ţivih organizmov za proizvodnjo uĉinkovine (ti so lahko zelo obĉutljivi na majhne
spremembe v procesu) in zapleten proces proizvodnje zdravila (priprava genskega konstrukta,
vstavljanje konstrukta v celice, rast celic v velikih reaktorjih, izolacija in ĉišĉenje produkta,
konĉna formulacija produkta in na koncu izbira primerne ovojnine za skladišĉenje in
aplikacijo zdravila). Vse te korake mora ponoviti tudi izdelovalec podobnega biološkega
zdravila, pri ĉem je najbolj zahteven korak priprava enake celiĉne banke, s pomoĉjo katere
pridobi enak produkt (1, 2).
Podobna biološka zdravila pa morajo ne glede na kompleksnost izdelave imeti primerljivo
kakovost, uĉinkovitost in varnost, kar proizvajalci podobnega biološkega zdravila dokaţejo z
lastnimi predkliniĉnimi in kliniĉnimi študijami, ki pa so obiĉajno manj obseţne kot študije
originatorskega biološkega zdravila (v skladu z Direktivo 2004/27/ES) (1, 4, 5).
Preboj na trg je za podobna biološka zdravila mnogo teţji kot za navadna generiĉna zdravila,
predvsem zaradi višjih stroškov kliniĉnih raziskav, zato je malo farmacevtskih podjetij
sposobnih proizvesti tako zdravilo (1). Trenutno se na trgu nahaja nekaj podobnih bioloških
zdravil, kar je prikazano v preglednici I.
Preglednica I: Odobrena podobna biološka zdravila v Evropi, status september 2011 (6)
INN ime Podobno biološko
zdravilo
Proizvajalec Referenčni
produkt
Datum
oddobritve
Somatropin Omnitrope® Sandoz Genotropin April, 2006
Somatropin Valtropin® Biopartners Humatrope April, 2006
Epoetin alfa Binocrit® Sandoz Erypo/Eprex Avgust, 2007
Epoetin alfa Epoetin alfa Hexal® Hexal Erypo/Eprex Avgust, 2007
Epoetin alfa Abseamed® Medice Erypo/Eprex Avgust, 2007
Epoetin zeta Silapo® Stada Erypo/Eprex December, 2007
Epoetin zeta Retacrit® Hospira Erypo/Eprex December, 2007
Filgrastim Ratiograstim® Ratiopharm Neupogen September, 2008
Filgrastim Tevagrastim® Teva Neupogen September, 2008
Filgrastim Biograstim® CT
Arzneimittel
Neupogen September, 2008
Filgrastim Filgrastim ratiopharm® Ratiopharm Neupogen September, 2008
Filgrastim Zarzio® Sandoz Neupogen Februar, 2009
Filgrastim Filgrastim Hexal® Hexal Neupogen Februar, 2009
Filgrastim Nivestim® Hospira Neupogen Junij, 2010
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga UVOD
3
1.1.2 Druga generacija bioloških zdravil
V zadnjih letih razvoj bioloških zdravil teţi predvsem k izboljšanju lastnosti proteinov prve
generacije za dosego ţelenih farmakokinetiĉnih in farmakodinamiĉnih lastnosti. Podjetja se
odloĉajo za razvoj druge generacije bioloških zdravil zaradi medicinskih potreb, izboljšano
delovanje zdravila jim olajša prodor na trg, izognejo se tudi ĉakanju na iztek patentov (2).
Pri prvi generaciji bioloških zdravil gre predvsem za monoklonska protitelesa in biološka
zdravila, ki posnemajo ĉloveku lastne proteine (9, 10). Biološka zdravila druge generacije
imajo lahko spremenjeno farmacevtsko obliko, naĉin aplikacije ali profil uĉinkovitosti (1). Ta
zdravila so razvili z namenom izboljšati farmakokinetiĉne, farmakodinamske in imunološke
lastnosti, kot so podaljšanje razpolovnega ĉasa, manj pogost vnos zdravila (velja predvsem za
PEGilirane produkte), zmanjšana imunogenost, izboljšana topnost in stabilnost, zmanjšana
toksiĉnost in bolj prijazen naĉin vnosa zdravila (npr. inhalacijski inzulin) (1, 9).
Danes obstaja ţe kar nekaj naĉinov priprave bioloških zdravil druge generacije, kot so
spremembe aminokislinskega zaporedja (npr. druge generacije inzulinov), spremembe
glikokomponent (pri glikoziliranih proteinih, kot je epoetin), fuzije z drugimi proteini (npr.
Etanercept, Alefacept), novi dostavni sistemi (nanodelci, liposomi) ali pa postprodukcijske
spremembe, kot so konjugacije z naravnimi ali sintetiĉnimi polimeri (PEGilacija,
HESilacija®, polisialilacija) (npr. PEGiliran filgrastim) (9, 10).
1.2 PEGILACIJA
Z izrazom PEGilacija oznaĉujemo vezavo ene ali veĉ verig polietilenglikola razliĉnih
velikosti na proteine, peptide, oligonukleotide ali majhne organske molekule. Tehnologija je
ţe dobro uveljavljena in se zelo hitro razvija. Na trgu je ţe prisotnih nekaj PEGiliranih
zdravilnih uĉinkovin, kar dokazuje uĉinkovitost in varnost tako pripravljenih zdravil. Prvo
tako zdravilo je FDA oddobrila leta 1990, gre za PEGilirano obliko adenozin deaminaze
(Adagen®, Enzon Pharmaceuticals, ZDA), ki se uporablja pri zdravljenju hude kombinirane
imunske bolezni (angl. SCID, severe combined immunodeficiency). V preglednici II je
pregled PEGiliranih zdravil, ki se nahajajo na trgu (10).
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga UVOD
4
Preglednica II: Pregled PEGiliranih produktov na trgu (10, 11)
Učinkovina Lastniško
ime
Podjetje Indikacija Leto
registracije
Adenozin deamidaza Adagen®, Enzon
Pharmaceuticals
huda kombinirana
imunska bolezen
1990
Asparaginaza Oncaspar® Enzon
Pharmaceuticals
akutna limfoblastna
levkemija
1994
Interferon α-2b PegIntron® Schering-Plough hepatitis C 2000
Interferon α-2a Pegasys® Hoffman-
LaRoche
hepatitis C 2002
GCSF Neulasta® Amgen nevtropenija 2002
Rastni hormon Somavert® Pfizer akromegalija 2002
VEGF
Oligonukleotid
Macugen® Pfizer oĉesno ţilne bolezni 2004
Eritropoetin Mircera® Hoffman-
LaRoche
anemija zaradi kroniĉne
odpovedi ledvic
2007
Fragment anti-TNF-
α monoklonskega
protitelesa
Cimzia® UCB Pharma Crohnova bolezen,
revmatoidni artritis
2008
2009
Sesalska uratna
oksidaza
Krystexxa®
Savient
Pharmaceuticals
kroniĉni protin (putika) 2010
Razlogi za PEGilacijo proteinov so zašĉita imunogenih delov molekule, prepreĉevanje
razgradnje s proteolitiĉnimi encimi, zmanjšana ledviĉna filtracija, podaljšan biološki
razpolovni ĉas, zmanjšana toksiĉnost, veĉja stabilnost zdravila, spremenjen farmakokinetiĉni
in farmakodinamiĉni profil. Glavna pomankljivost PEGilacije je zmanjšana biološka aktivnost
zdravila in vitro, kar pa kompenziramo z izboljšanimi farmakokinetiĉnimi lastnostmi in vivo.
Vse te spremembe lahko reguliramo tudi z izbiro:
velikosti in strukture PEG-a,
števila verig PEG, ki jih pripnemo na protein,
mesta pripetja PEG-a na protein,
vrste reakcije PEGilacije (12).
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga UVOD
5
1.2.1 Reagenti PEG
Polietilenglikol je dobro uveljavljen in preuĉen polimer za kovaletno pripetje na protein. PEG
je nevtralen, kemiĉno inerten, netoksiĉen, neimunogen hidrofilen polimer. Komercialno
dostopni so linerani reagenti PEG z molekulsko maso do 40 kDa, medtem ko so razvejani
PEG-i dostopni do 80 kDa. Taki reagenti PEG imajo še ustrezno kvaliteto za uporabo pri
izdelavi bioloških zdravil. PEG je topen v vodi in v nekaterih organskih topilih (12).
Na trgu so komercialno dostopni reagenti PEG razliĉnih dolţin in oblik (linearen, razvejan).
Aktivirani so z razliĉnimi fukcionalnimi skupinami, kar jim omogoĉa pripenjanje na protein.
Komercialna podjetja, ki proizvajajo reagente PEG, so NOF Corporation (Japonska), SunBio
(Juţna Koreja), Dr. Reddy’s (Velika Britanija), JenKem (Kitajska), Creative PEGWorks
(USA) in drugi (10).
Reagenti PEG niso biorazgradljivi, kar je njihova najveĉja pomankljivost. V ĉlankih poroĉajo,
da se reagenti PEG razgradijo z alkoholno ali aldehidno dehidrogenazo in/ali se encimsko
oksidirajo s citokromom P450 v omejenih koliĉinah. PEG-i, manjši od 20 kDa, se iz telesa
izloĉijo z ledviĉno filtracijo, molekule z veĉjo molekulsko maso pa se iz telesa izloĉajo po
drugih poteh (skozi jetra, prek imunskega sistema, izloĉanje s pomoĉjo proteoliznih encimov)
(10, 12).
1.2.1.1 Prva in druga generacija reagentov PEG
Zaradi pomankljivosti prve generacije reagentov PEG so razvili reagente PEG druge
generacije z izboljšanimi lastnostmi. Najbolj znaĉilne pomankljivosti reagentov PEG prve
generacije so kratke ( 12 kDa) in linerane verige, velika polidisperznost, prisotnost
deaktiviranega reagenta PEG, difukcionalnost reagenta (na obeh koncih verige se nahaja
funkcionalna skupina), tvorba nestabilnih konjugatov in neselektivnost mesta konjugacije
(12).
Z drugo generacijo reagentov PEG so rešili teţavo difukcionalnosti PEG-a z uporabo metoksi
PEG-a, ki ima eno hidroksilno skupino zašĉiteno (metilirano), zato tam ne poteĉe aktivacija
verige PEG. Selektivnost reakcije je izboljšana tudi z uporabo daljših in razvejanih reagentov
PEG, ter z uporabo novih kemizmov in naĉinov pripetja verige PEG na protein, ki zvišujejo
selektivnost mesta konjugacije. Selektivnost konjugacije lahko še izboljšamo s spremembo
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga UVOD
6
reakcijskih pogojev, kot so pH, molarno razmerje med proteinom in reagentom PEG,
koncentracija reaktantov, temperatura ter ĉas reakcije (12).
1.2.2 Kemija PEGilacije
Verige PEG morajo imeti za pripetje na protein aktivirano funkcionalno skupino na koncu
verige (ali na obeh koncih verige v primeru difunkcionalnih PEG-ov). Vrsta funkcionalne
skupine, ki jo izberemo, je odvisna od reaktivne skupine na proteinu.
Reaktivne skupine aminokislin, znaĉilne za proteine, so -NH2, -NH-, -COOH, -OH, -SH, kot
tudi disulfidnih vezi (-S-S-) (12).
Za izbiro primernega mehanizma reakcije moramo natanĉno preuĉiti protein, upoštevati
moramo stabilnost proteina pri reakcijskih pogojih. Izbrati moramo primerno mesto za
konjugacijo, ki bo v najveĉji meri ohranila biološko funkcijo proteina.
V grobem poznamo dva mehanizma reakcij: nespecifiĉne (nakljuĉne) in mestno-specifiĉne
PEGilacije. Pri nespecifiĉni PEGilaciji za mesto pripetja na proteinu pogosto uporabljamo
amino skupino in ε-amino skupine na stranskih verigah lizinskih ostankov. Lizini so v
proteinih zelo pogosti in se obiĉajno nahajajo na površini, zato so lahko dostopni za reakcijo z
reagentom PEG. Take reakcije poteĉejo hitro in kot rezultat dobimo kompleksno mešanico
konjugatov, ki se med seboj razlikujejo po številu in mestu pripetja verige PEG. Prva
PEGilirana produkta na trgu PEGilirana oblika adenozin deaminaze (Adagen®) in PEGilirana
asparaginaza (Oncaspar®) sta pripravljena z nespecifiĉno PEGilacijo. Tudi PEGiliran
interferon α-2b, interferon α-2a, rastni hormon in eritropoetin (PegIntron®, Pegasys®,
Somavert® in Mircera®) so kompleksne mešanice PEGiliranih proteinov (10, 11).
Vodilo za uvedbo nove mestno-specifiĉne PEGilacije so bolj definirani produkti. Kot mestno-
specifiĉna PEGilacija se velikokrat omenja PEGilacija na N-koncu z reduktivnim alkiliranjem
z aldehidnim reagentom PEG in uporabo reducenta. Tak primer je je mono-PEGiliran G-CSF
z 20 kDa linearnim aldehidnim reagentom PEG na N-koncu (Neulasta®
). Naslednji, ravno
tako znan princip, je PEGilacija na tiolni skupini na cisteinu (ta je lahko naravno prisoten ali
uveden z metodami genskega inţenirstva). V ta namen uporabljamo maleimidne, piridil
disulfidne, vinilsufonske in druge reagente PEG. Poleg PEGiliranega G-CSF (Neulaste®) sta
produkta mestno specifiĉne PEGilacije še PEGiliran eritropoetin (Cimzia®) in PEGiliran
fragment anti-TNF-α monoklonskega protitelesa (Macugen®) (10, 11).
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga UVOD
7
1.3 HIDROFOBNI PROTEINI: izziv za stabilno končno farmacevtsko obliko
Mnogo proteinov, ki jih uporabljamo kot biološka zdravila (npr. interferoni, interlevkini in
rastni faktorji), so hidrofobni. Njihova hidrofobnost se še dodatno poveĉa, ko jih proizvajamo
v E. coli, saj ta gostiteljski organizem ne omogoĉa glikozilacije. Veĉina proteinov v naravni
obliki premore doloĉeno stopnjo glikozilacije, ta je pri veĉini omenjenih bioloških zdravil
pomembna za topnost in stabilnost, ne pa za biološko aktivnost.
Dobro znana primera hidrofobnih terapevtskih proteinov sta rekombinantni humani G-CSF ter
humani interferon beta-1b (IFN-ß-1b). G-CSF ima v svoji naravni obliki eno glikozilacijsko
mesto na Thr133, to je pomembno predvsem za topnost proteina, ne vpliva pa na njegovo
aktivnost. IFN-ß-1b je glikoziliran na mestu Asn80 na koncu heliksa C. Odsotnost
glikozilacije pri rekombinantnem humanem IFN-ß-1b, proizvedenem v E. coli, moĉno poveĉa
njegovo hidrofobnost (13).
Priprava stabilne formulacije je eden od kritiĉnih korakov v razvoju biološkega zdravila, saj
so proteini kompleksne molekule, zelo podvrţene razliĉnim procesom, ki vodijo v
nestabilnost zdravila. Teţava hidrofobnih proteinov je tudi njihova nizka topnost in s tem
priprava primerne formulacije z dovolj visoko koncentracijo. Pogosto pa so hidrofobni
proteini nagnjeni tudi k adsorbciji na površine.
Pri razvijanju konĉne formulacije biološkega zdravila moramo izbrati ustrezen pH in ionsko
moĉ pufra, ustrezne pomoţne snovi in materiale, v katerih bomo zdravilo shranjevali.
Eden od pristopov k stabilizaciji konĉnih farmacevtskih oblik za hidrofobne proteine je
dodatek HSA, ta zavira adsorpcijo proteinov in stabilizira razliĉne hidrofobne citokine v
tekoĉi formulaciji (npr. IFN-ß-1b, IFN-α-n3) in med liofilizacijo (npr. IL-1aα, IL-3,
makrofagne kolonije stimulirajoĉi faktor) (13).
Zaradi pomankljivosti HSA (npr. variabilnost med proizvodnimi serijami HSA, moţna
prisotnost s krvjo prenosljivih patogenov, teţave pri analiznih metodah) je trend razviti
formulacijo brez dodatka HSA, kar lahko storimo z dodajanjem drugih pomoţnih snovi. Na
trgu je kar nekaj formulacij brez HSA, kot najbolj uporabne so se izkazale kombinacije
neionskih površinskih snovi s sladkorji in/ali aminokislinami (npr. pri epoetinu-α so zamenjali
HSA s polisorbatom 20 in glicinom, pri IFN-ß-1a so uporabili arginin in polisorbat 20) (13).
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga UVOD
8
Ponavadi preizkušamo stabilnost proteinov v izbrani formulaciji v obmoĉju pH od 3 do 10.
Pogosto ni mogoĉe pripraviti formulacije v optimalnem obmoĉju pH, zato izberemo tak pH,
ki omogoĉa najveĉjo topnost in hkrati ustrezno stabilnost zdravila (13, 14).
Pomoţne snovi, ki jih vkljuĉujemo v formulacije, so soli, sladkorji, polioli, ciklodekstrini,
aminokisline, polimeri, ki poveĉajo topnost in stabilnost zdravila, ter površinsko aktivne snovi
(polisorbat 20 in 80), ki zmanjšujejo adsorpcijo na površine, lahko pa prepreĉujejo tudi
agregacijo in/ali razpad proteina. Adsorpcijo na površine uĉinkovito zmanjšujemo tudi s
pravilno izbiro materialov shranjevalnih posod med procesom priprave zdravila, kot tudi z
izbiro primerne konĉne primarne ovojnine (13, 14, 15).
Najpomembnejši mehanizem stabilizacije s pomoţnimi snovmi je mehanizem preferenĉne
izkljuĉitve, to pomeni, da je protein raje v interakciji z vodo kot s pomoţno snovjo. Molekule
pomoţne snovi, ki stabilizirajo protein, imajo šibko interakcijo s proteinom. Na površini
proteina je torej veĉ molekul vode in manj molekul pomoţne snovi kot v raztopini.
Stabilizacijski uĉinek je posledica destabilizacije denaturiranega stanja, saj je preferenĉna
izkljuĉitev molekul pomoţne snovi s površine denaturiranega proteina manj ugodna kot s
površine nativnega proteina (ker ima denaturiran protein veĉjo površino kot nativni protein).
Sladkorje in poliole pogosto uporabljamo v formulacijah zdravila in delujejo kot nespecifiĉni
stabilizatorji z mehanizmom preferenĉne izkljuĉitve. Med sladkorji najpogosteje uporabljamo
saharozo in trehalozo, pa tudi sorbitol in manitol.
Z dodatkom ciklodekstrinov prepreĉujemo agregacijo in obarjanje proteinov, pogosto jih
uporabljamo tudi za zašĉito proteinov pred denaturacijo, ki jo lahko povzroĉijo neskladja med
organskimi topili in vodno fazo (protein IL-2 so npr. stabilizirali z 0,2 – 0,5 % dodatkom 2-
hidroksipropil-β-ciklodekstrina) (13).
Tudi s polimeri lahko stabiliziramo protein, najpogosteje uporabljamo polivinilpirolidon
(PVP) in dekstran.
Z dodatkom aminokislin lahko stabiliziramo protein v kombinaciji z drugimi pomoţnimi
snovmi ali samostojno, z mehanizmom preferenĉne izkljuĉitve. Ponavadi vkljuĉimo v
formulacijo aminokisline histidin, glicin in asparagin (1, 14, 15).
Ţe nizke koncentracije površinsko aktivnih snovi (PAS) lahko stabilizirajo proteine.
Najpogosteje uporabljamo Tween (20, 40 ali 80) in Pluronic (F68, F88 in F127). Uporaba
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga UVOD
9
PAS pri zelo hidrofobnih proteinih je vprašljiva, saj ti veţejo veĉje koliĉine PAS, ker so
interakcije med PAS in proteinom po naravi hidrofobne (15).
Eden boljših naĉinov reševanja teţav zaradi hidrofobnosti bioloških zdravil je konjugacija
proteinov z verigo polietilenglikola – PEGilacija. Znano je, da s PEGilacijo zmanjšamo
hidrofobnost in s tem izboljšamo topnost proteina v tekoĉem mediju formulacije. Poleg tega
prinaša PEGilacija še mnogo drugih prednosti, kot so zmanjšana imunogenost, manj pogosta
aplikacija zdravila, veĉja proteolitska stabilnost zdravila in mnoge druge (10).
1.3.1 Primeri hidrofobnih proteinov
Predstavniki hidrofobnih proteinov so rastni faktorji, interferoni, interlevkini in drugi (13).
Interferoni spadajo med citokine in so proteini velikosti 15 – 20 kDa. Regulirajo in spodbujajo
aktivacijo imunskega odziva. Nastanejo, ko se pojavi okuţba z mikrobi, in sodelujejo pri
signaliziranju sosednjim celicam, da je prisotna okuţba. Za zdravljenje razliĉnih bolezni
uporabljamo rekombinantno pripravljene interferone (18, 19).
Poznamo veĉ vrst rekombinantnih interferonov:
rekombinantni protein interferon alfa se uporablja pri virusnih obolenjih (hepatitis B in
C) ter rakastih obolenjih (melanomi in doloĉene vrste levkemije);
rekombinantni protein interferon beta se uporablja za upoĉasnitev napredovanja
multiple skleroze in ima izrazito hidrofobno naravo. Interferon beta-1a je terapevtski
protein, ki ga proizvajajo v sesalskih celicah in je glikoziliran, medtem ko je interferon
beta-1b neglikoziliran protein, proizveden v E. coli in je še bolj hidrofoben kot
interferon beta-1a;
rekombinantni protein interferon gama pa se uporablja za zdravljenje kroniĉne
granulomatozne bolezni in maligne osteoporoze in ima za razliko od interferona beta
bolj hidrofilno naravo (19).
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga UVOD
10
IFN-ά IFN-β
Slika 1: Struktura humanega IFN-ά (20) in IFN-β (21)
Humani granulocitne kolonije spodbujajoĉi dejavnik (hG-CSF) uvršĉamo med citokine (22).
hG–CSF je hematopoetski rastni faktor, ki spodbuja aktivacijo, proliferacijo in diferenciacijo
nevtrofilcev iz prekurzorskih celic. Poveĉa tudi aktivnost zrelih nevtrofilcev.
Rekombinantni hG–CSF se od naravnega proteina razlikuje v tem, da ima na prvem mestu
dodatno aminokislino metionin in da ni glikoziliran, zato je mnogo bolj hidrofoben. hG–CSF
povzroĉi hitro sprošĉanje nevtrofilcev iz kostnega mozga, zato se uporablja po kemoterapiji,
po presaditvi kostnega mozga (22), pri bolezensko pogojeni nevtropeniji, po presaditvi
perifernih prekurzorskih celic ter pri bolnikih z virusom HIV.
Slika 2: Struktura hG–CSF
Interlevkini (IL-1α, IL-1ß, IL-2, IL-3 in drugi) ravno tako sodijo med citokine in so topne
signalne molekule levkocitov in nekaterih drugih celic. Uravnavajo številne fiziološke in
patofiziološke dogodke (celiĉna rast normalnih in malignih celic, vsi vidiki imuskega odziva,
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga UVOD
11
regulacije vnetja itd.). Obstaja veĉ kot 30 naravnih predstavnikov in podvrst interlevkinov.
Med rekombinantnimi interlevkini sta IL-1α, IL-1ß še posebej hidrofobna, ker nista
glikozilirana. Uporabljajo se za zdravljenje razliĉnih bolezni, npr. protein IL-1ra (antagonist,
onemogoĉi vezavo IL-1α in IL-1ß) za revmatoidni artritis, IL-2 za metastazirajoĉi rak ledvic
in melanom, IL-11 za prepreĉevanje trobmocitopenije po kemoterapiji (1).
1.4 STABILNOST PROTEINOV
Stabilitetne študije zajemajo velik del razvoja konĉne formulacije in nam podajo konĉni
odgovor, ĉe je izbrana formulacija resniĉno primerna. Kot smo ţe omenili, je razvoj stabilne
proteinske uĉinkovine v konĉni formulaciji biološkega zdravila zelo zahtevna naloga.
Stabilnost proteina je tudi rezultat ravnoteţja med stabilizacijskimi in destabilizacijskimi
silami. Merilo za stabilizacijo proteinov s hidrofobnimi interakcijami je razlika v toplotnih
kapacitetah nativnega in denaturiranega stanja, velika razlika v toplotni kapaciteti pri termiĉni
denaturaciji proteina kaţe na velik vpliv hidrofobnih interakcij pri stabilizaciji proteina (1,
15).
Spremembe, ki se dogajajo na proteinih, so posledica kemijske in fizikalne nestabilnosti
proteinov.
1.4.1 Kemijska stabilnost proteinov
Posledice kemijske nestabilnosti proteinov so:
deamidacija, ta je najpogostejša oblika kemijske nestabilnosti in se kaţe predvsem kot
razgradnja proteinov zaradi deamidacije asparagina in glutamina. Hitrost, mehanizem
in lokacija deamidacije so odvisni od pH, kar je potrebno upoštevati pri naĉrtovanju
konĉne formulacije. Deamidacija asparagina je bolj pogosta in je najbolj intenzivna v
nevtralnih in baziĉnih pogojih;
hidroliza peptidne vezi, ki pogosto sledi deamidaciji asparagina, saj je peptidna vez za
ostankom asparaginske kisline najbolj obĉutljiva vez v polipeptidni verigi;
oksidacija je precej pogosta, zanjo so najbolj dovzetne aminokisline histidin,
triptofan, tirozin, cistein in metionin. Tiolne skupine na cisteinu in metioninu so še
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga UVOD
12
posebej obĉutljiva mesta za oksidacijo. Na stopnjo oksidacije lahko vplivamo z izbiro
ustreznega pH formulacije;
razcep in nastanek disulfidnih vezi, kjer lahko prosti cisteinski ostanki tvorijo
povezave in povzroĉajo agregacijo ali polimerizacijo proteinov, lahko pa sproţijo tudi
disulfidno izmenjavo;
sukcinimidacija, je lahko predstopnja deamidacije asparagina in in izomerizacije
asparaginske kisline;
glikoliza, ta lahko zmanjša aktivnost proteinov, nima pa znatnega vpliva na
konformacijo;
Maillardova reakcija, pri kateri se poveţe skupina reducirajoĉega sladkorja z amino
skupino proteina, poteka pa predvsem pri povišanih temperaturah (1, 15).
1.4.2 Fizikalna stabilnost proteinov
Doloĉeni pogoji, ali pa preprosto potek staranja zdravila, povzroĉijo spremembe v sekundarni,
terciarni in/ali kvartarni zgradbi proteina. Lahko pride do razvitja proteina in/ali agregacije.
Agregacija je najbolj pomembna vrsta fizikalne nestabilnosti proteina, saj imajo agregati
zmanjšano aktivnost, so manj topni in imajo spremenjeno imunogenost. Agregati so zaradi
navedenih razlogov v farmacevtskem izdelku strogo omejeni (15).
Osnovni vzrok agregacije je poveĉanje hidrofobnosti površine proteina zaradi spremembe
temperature, ionske moĉi, striţnih sil, adsorpcije na površine in/ali kemijskih sprememb (15).
Agregati ponavadi nastanejo zaradi zdruţevanja delno razvitih proteinov. Predvidevajo, da
agregati nastanejo zaradi specifiĉnih intermolekularnih interakcij med doloĉenimi
konformacijami proteinskih intermediatov.
V agregacijo vodi teţnja po zmanjšanju termodinamsko neugodnih interakcij med topilom in
izpostavljenimi hidrofobnimi deli molekul proteina. Hidrofobne interakcije so glavna gonilna
sila tako zvijanja proteinov kot tudi agregacije. Oba procesa predstavljata ravnoteţje med
hidrofobnimi deli, izpostavljenimi topilu, in hidrofobnimi deli v notranjosti molekule. To
ravnoteţje lahko porušijo razliĉni fizikalni dejavniki (temperatura, ionska moĉ, vibracijsko
mešanje in drugi), kot tudi izpostavitev hidrofobnih obmoĉij zaradi kemijske razgradnje ali
spremembe (15).
Agregacija je lahko reverzibilna ali ireverzibilna. O nereverzibilni agregaciji govorimo takrat,
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga UVOD
13
ko agregatov ni veĉ mogoĉe raztopiti z denaturanti in reducirajoĉimi sredstvi, taki so pogosto
toplotno inducirani agregati. Z reducirajoĉi sredstvi razcepimo disulfidne vezi v dimerih,
oligomerih ali agregatih. Tako nastale disulfidne vezi razcepimo z dodatkom reducirajoĉega
sredstva, npr. ditiotreitola – DTT. Reverzibilni agregati so bolj energetsko stabilni, bolj
urejeni v strukturi in manj gosti kot ireverzibilni agregati. Znano je tudi, da zgradba in
znaĉilnosti monomernega proteina vplivajo na zgradbo in morfologijo proteinskih agregatov
(15).
Aktivnost agregatov je zelo zmanjšana ali pa je izniĉena, kar so pokazali na modelnem
proteinu interferonu-β-1b. Agregati interferona-β-1b so imeli 3x manjšo aktivnost kot
monomeren protein (15).
Poleg agregacije pod fizikalno nestabilnost uvršĉamo vse druge vrste nestabilnosti razen
kemijske. Sem spada tudi adsorpcija proteinov na površine shranjevalnih posod, ki jih
uporabljamo med izolacijo ali pa na površine konĉne ovojnine, ali na stiĉne površine dveh faz
(voda/zrak). Vzrok za adsorpcijo je visoka površinska aktivnost proteinov, kar je potrebno
upoštevati pri izbiri ovojnine. Posledica adsorpcije na površino je izguba proteinov ali
sprememba njihove konformacije. Steklo, silikonizirano steklo in polipropilen so materiali za
posode in ovojnino, na katere se proteini najmanj adsorbirajo (1, 15).
1.4.3 Stabilizacija proteinov
Za prepreĉevanje nestabilnosti proteinov moramo stabilizirati nativno konformacijo molekule
proteina (1). Splošna pravila za ohranjanje stabilnosti ţal ne obstajajo. Stabilnost biološkega
zdravila s proteinskimi uĉinkovinami doseţemo z razvojem formulacije, stabilnost
formulacije pa preizkusimo z razliĉnimi testi stabilnosti.
Temperatura je nedvomno pomemben faktor, ki vpliva na stabilnost proteinov. Pri višjih
temperaturah prihaja do denaturacije in agregacije / obarjanja proteinov. Višje temperature
lahko pospešijo tudi hidrolizo ostankov asparagina in deamidacijo asparaginskih in
glutaminskih ostankov. Tudi pH formulacije, koncentracija in ĉistost proteina imajo
pomemben vpliv na stabilnost. Neprimeren pH lahko povzroĉi denaturacijo in agregacijo
proteinov. Pri zelo kislih in moĉno baziĉnih pogojih lahko pride do deamidacije asparaginskih
in glutaminskih ostankov. Pogosto so proteini stabilni pri nevtralnem pH. Dodatki soli in
kovinskih ionov lahko stabilizirajo ali destabilizirajo protein ali pa nimajo vpliva, odvisno od
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga UVOD
14
narave proteina. Tudi stresanje in vibracijsko mešanje proteinov lahko pripelje do
denaturacije in agregacije.
Proteine je mogoĉe stabilizirati s spreminjanjem njihove zgradbe (notranja stabilizacija) ali s
spreminjanjem lastnosti topila, s katerim so v stiku (zunanja stabilizacija). Pri razvoju
formulacije biološkega zdravila gre obiĉajno za zunanjo stabilizacijo. Zunanjo stabilizacijo
doseţemo z okrepitvijo stabilizirajoĉih sil in z destabilizacijo denaturiranega stanja. V
praktiĉnem smislu to storimo s spremembo lastnosti topila in z dodatki pomoţnih snovi (1,
15).
1.5 KARAKTERIZACIJA AGREGATOV
Proteinsko agregacijo lahko spremljamo z razliĉnimi tehnikami, kot so gelska filtracija (SEC),
pretoĉni sistem za loĉevanje makromolekul po velikosti z uporabo preĉnega pretoka (angl.
FFF, field-flow fractionation), analizno ultracentrifugiranje in tehniko sipanja svetlobe.
Vsaka metoda ima doloĉene prednosti in omejitve, zato je za zanesljivejšo karakterizacijo
agregatov priporoĉljivo uporabiti veĉ tehnik. Podajamo kratek pregled vseh navedenih tehnik,
za naše delo pa smo uporabili tehniko SEC v kombinaciji s tehniko statiĉnega sipanja svetlobe
MALS (SEC-MALS) in tehniko dinamiĉnega sipanja svetlobe (DLS).
1.5.1 Gelska filtracija
Gelsko filtracijo (SEC) najpogosteje uporabljamo za ugotavljanje proteinskih agregatov.
Metoda omogoĉa separacijo monomernega proteina od dimernega in ostalih višjih agregatov.
Loĉevanje molekul poteka na kromatografskem nosilcu v obliki gela z definirano velikostjo
por na osnovi velikosti in/ali oblike (23). Nosilci so lahko razliĉni polimeri, najpogosteje
uporabljeni so dekstran, agaroza, poliakrilamid ali polistiren (1). V idealnih okolišĉinah, ko
imajo vse proteinske molekule analiziranega vzorca enotno, sferiĉno obliko in med njimi in
gelom ni nespecifiĉnih interakcij, poteka loĉevanje zgolj po njihovi velikosti: manjše
molekule lahko vstopajo v pore gela in potujejo poĉasneje. Veĉje molekule ne prodrejo v
pore, zato potujejo hitreje (24). Vendar pa retenzijski ĉas ni odvisen samo od molekulske
mase molekule, ampak tudi od njegove oblike. Metodo odlikujejo enostavnost uporabe,
ponovljivost in obĉutljivost, njene pomanjkljivosti pa so razredĉenje vzorca med
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga UVOD
15
kromatografijo, omejen razpon loĉevanja molekulskih mas in omejitve pri uporabi mobilnih
faz. Razredĉenje vzorca lahko povzroĉi disociacijo agregatov s šibkimi reverzibilnimi
interakcijami, kar onemogoĉi njihovo detekcijo. Poleg omejenega razpona velikosti za
loĉevanje agregatov ima metoda tudi slabo resolucijo za veĉje agregate, netopni agregati pa
pogosto ostanejo na kromatografskem nosilcu in ne pripotujejo do detektorja. V mobilno fazo
je pogosto treba dodati visoke koncentracije soli, da se prepreĉijo nespecifiĉne interakcije z
nosilcem (25).
1.5.2 Pretočni sistem za ločevanje makromolekul po velikosti (FFF)
Tehnike FFF (angl. Field-Flow Fractionation) loĉujejo molekule glede na njihovo molekulsko
maso. Razvite so bile z namenom loĉevanja in karakterizacije makromolekul in so alternativa
gelski filtraciji za karakterizacijo proteinskih agregatov. Njihova prednost je, da loĉevanje ne
poteka na nosilcu, kar omogoĉa visoko resolucijo loĉevanja v razponu od nanometrskega
obmoĉja mas do dvomestnega mikrometrskega obmoĉja mas. Mobilna faza teĉe skozi kanal v
katerem nastane laminarni paraboliĉni tok, ki je hitrejši na sredini kanala in poĉasnejši ob
stenah kanala. Pravokotno na tok mobilne faze deluje fizikalno polje, ki usmerja molekule
vzorca proti akumulacijski steni kanala. Zaradi nastalega koncentracijskega gradienta v
nasprotni smeri deluje difuzija in molekule vzorca usmerja nazaj proti sredini kanala. Nastane
ravnoteţje in razliĉno velike molekule potujejo v razliĉnih hitrostnih obmoĉjih laminarnega
toka, kar omogoĉa njihovo loĉevanje. Manjše molekule potujejo hitreje, saj zaradi veĉjega
difuzijskega koeficienta potujejo višje v laminarnem toku, kar pomeni v obmoĉju hitrejšega
toka. Za karakterizacijo agregatov se pogosto uporablja tehnika, ki za ustvarjanje fizikalnega
polja uporablja pravokotno usmerjen pretok (pretoĉni sistem za loĉevanje makromolekul po
velikosti z uporabo preĉnega pretoka F4 ali FFFF, angl. Flow Field-Flow Fractionation) (25,
26, 27).
1.5.3 Analizno ultracentrifugiranje
Tudi merjenje hitrosti sedimentacije z analiznim ultracentrifugiranjem je alternativna tehnika
gelski filtraciji. Delovanje moĉne gravitacijske (centrifugalne) sile hidrodinamsko loĉi
komponente v vzorcu. Loĉevanje ponavadi poteka pri 50000 – 60000 rpm, hitrost
sedimentacije je odvisna od molekulske mase in oblike posameznih komponent v vzorcu. V
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga UVOD
16
radialni smeri nastane koncentracijski profil iz katerega se lahko ugotavlja koeficient
sedimentacije in relativna koncentracija posamezne komponente v vzorcu. Zaradi omejitev
optiĉnih sistemov detekcije je v nekaterih primerih vzorce potrebno redĉiti, kar podobno kot
pri SEC lahko vodi v disociacijo agregatov, povezanih s šibkimi vezmi. Prednosti analiznega
ultracentrifugiranja pa so podobne prednostim tehnik FFF: loĉevanje ne poteka na nosilcu,
manj omejitev glede puferskih pogojev in loĉevanje zelo širokega razpona molekulskih mas
(25, 28).
1.5.4 MALS, tehnika statičnega sipanja svetlobe
Za naše delo smo uporabili SEC-MALS, ki je tehnika MALS v kombinaciji z gelsko filtracijo
(SEC). MALS je metoda statiĉnega sipanja svetlobe, kjer vzorec presvetimo s primarnim
ţarkom svetlobe in z detektorjem detektiramo kotno odvisnost intenzitete svetlobe.
Poglavitna prednost detekcije MALS je v tem, da je absolutna metoda, kar pomeni, da ne
potrebujemo kalibracijskih standardov (30).
Detekcija MALS je dragoceno orodje predvsem za spremljanje agregacije ali razpada
proteinov, kar je razvidno iz spremembe molekulske mase. Je najbolj razširjena tehnika za
ugotavljanje absolutne porazdelitve molekulske mase ter za ugotavljanje povpreĉne
molekulske mase polimerov in proteinov. Detektor je zelo uĉinkovit tudi pri nizkih
koncentracijah agregatov (29, 31). Z detektorjem MALS lahko ugotovimo poleg absolutne
molske mase topljenca v raztopini (Absolute molar mass, Mw) še radij sukanja molekule
(Root mean square radius, Rg) in drugi virialni koeficient (Second virial coefficient, A2), ki
opisuje interakcije med topilom in topljencem (30).
Za ugotavljanje molekulske mase komponent vzorca potrebujemo sistem HPLC ter zaporedno
vezana detektorja, laserski fotometer - detektor MALS (angl. multi-angle light scatter) in
koncentracijski detektor - detektor RI (detektor spremembe lomnega koliĉnika, angl.
refractive index). Odziv detektorja MALS je sorazmeren produktu koncentracije in molske
mase topljenca, ci×Mi. Odziv detektorja RI pa je sorazmeren koncentraciji topljenca ci.
Detektor MALS miniDAWN TREOS zaznava statiĉno sipanje svetlobe pri treh kotih (45°,
90° in 135°) in meri razliko v intenziteti vpadne in sipane svetlobe. Detektor RI Optilab rEX
zaznava razliko v lomnem koliĉniku med referenĉno celico, napolnjeno z mobilno fazo, in
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga UVOD
17
merilno celico, skozi katero potuje vzorec. Lomni koliĉnik je merilo za hitrost svetlobe skozi
snov (30).
1.5.4.1 Izračun molekulske mase
Iz odziva detektorja RI ugotovimo koncentracijo vzorca c po spodnji enaĉbi (enaĉba 1):
dcdncKodzivRI RI /1/
kjer je KRI umeritvena konstanta detektorja.
Poznati moramo konstantne vrednosti poveĉanja lomnega koliĉnika dn/dc za ves vzorec, kjer
je n lomni koliĉnik in c koncentracija. Poveĉanje lomnega koliĉnika dn/dc nam pove, koliko
se lomni koliĉnik spreminja s koncentracijo in je odvisen od sestave molekule ter neodvisen
od njene molekulske mase in strukture.
Enaĉbo za PEGiliran protein lahko izrazimo na naslednji naĉin (enaĉba 2):
PEGPEGproteinproteinRI dcdncdcdncKodzivRI )/()/(
/2/
Konstantna vrednost dn/dc za proteine je 0,185 in za PEG 0,140.
Osnovna enaĉba (enaĉba 3), ki jo program Astra V uporablja za izraĉun molekulske mase,
opisuje intenziteto sipane svetlobe, ki je sorazmerna molekulski masi in koncentraciji vzorca.
Enaĉba velja za razredĉene raztopine makromolekul, ki so majhne v primerjavi z valovno
dolţino vpadne svetlobe:
...32)(
1
)(
2
32
*
cAcAPMR
cK
W
/3/
kjer je:
K* optiĉna konstanta )())/(4( 4
0
22
0
2*
ANdcdnnK , /4/
n0 lomni koliĉnik topila,
dn/dc poveĉanje lomnega koliĉnika,
λ0 valovna dolţina vpadne svetlobe v vakuumu,
NA avogadrovo število,
Mw uteţno povpreĉje molske mase,
R(θ) Rayleigh-evo razmerje,
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga UVOD
18
c koncetracija v g/cm3,
P(θ) teoretiĉno izpeljan oblikovni faktor,
A2 drugi virialni koeficient in A3 tretji variabilni koeficient; koeficienti so popravki za
interakcije molekul topljenca s topilom. Ponavadi lahko pri razredĉenih raztopinah tretjega in
višje viriabilne koeficiente zanemarimo, saj so zanemarljivo majhni v primerjavi s ĉlenom, ki
vsebuje drugi virialni koeficient.
R(θ) je Rayleigh-evo razmerje, opisano z enaĉbo (enaĉba 5):
)cos1()(
2
0
2
I
IrR /5/
kjer je:
r razdalja med molekulo, ki sipa, in detektorjem,
Iθ intenziteta sipane svetlobe pod kotom θ glede na vpadno svetlobo,
I0 intenziteta nepolarizirane vpadne svetlobe.
P(θ) je teoretiĉno izpeljan oblikovni faktor, ki opisuje kotno odvisnost sipanja svetlobe po
enaĉbi (enaĉba 6):
...)2/(sin)3/16(1)( 222
0
2
0
2 grnP /6/
kjer je rg radij sukanja, s katerim opišemo velikost delca.
Za limitni primer, ko gre θ→0, je P(θ) = 1 in lahko osnovno enaĉbo izrazimo kot (enaĉba 7)
(27, 28, 29):
cAMR
cK
W
2
*
21
)( /7/
To enaĉbo lahko rešimo na veĉ naĉinov, z Zimmovo, Debyejevo ali Berryjevo metodo. Za
izraĉun molekulskih mas komponent vzorca ali celotnega vzorca program Astra V uporablja
Zimmovo metodo. Zimmov model je primeren za molekule z radijem sukanja < 50 nm in
monodisperzne sisteme.
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga UVOD
19
Pri Zimmovi metodi narišemo Zimmov diagram K*c / R(θ) v odvisnosti od sin
2(θ/2) + kc:
Slika 3: Zimmov diagram (32)
Zimmov diagram, prikazan na sliki 3, podaja kotno odvisnost sipane svetlobe pri konstantni
koncentraciji in koncentracijsko odvisnost sipane svetlobe pri konstantnem kotu opazovanja.
Pri vsaki koncentraciji ci ekstrapoliramo K*c / R(θ) na θ = 0 in pri vsakem kotu θi na c = 0.
Tako dobimo dve mejni premici in njuno presekališĉe je enako reciproĉni vrednosti uteţnega
povpreĉja molekulske mase – 1/ Mw (29, 31).
1.5.5 DLS, tehnika dinamičnega sipanja svetlobe
Metodo imenujemo tudi fotonska korelacijska spektroskopija (ang. PCS, Photon Correlation
Spectroscopy) ali kvazi-elastiĉno sipanje svetlobe (ang. QELS, Quasi-Elastic Light
Scattering). S to metodo preuĉujemo dinamiĉne lastnosti delcev v raztopini in detektiramo
topne ter netopne agregate (36, 37).
Metodo smo uporabili za meritve hidrodinamskih radijev in za ugotavljanje polidisperznosti
vzorca na napravi Zetasizer APS, s pomoĉjo programske opreme Zetasizer APS.
Slabosti metode DLS so:
nizka resolucija,
ne moremo razlikovati med monomeri in dimeri,
teţje loĉimo tudi agregate in oligomere,
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga UVOD
20
za zanesljive meritve potrebujemo višje koncentracije vzorca.
Velikokrat zmotno mislimo, da ĉe dobimo dvojno vrednost hidrodinamskega radija, je
izmerjena populacija dimer iz monomera, vendar v splošnem velja, da mora obstajati vsaj
petkratna razlika v velikosti, da zaznamo drugo populacijo.
Medtem, ko nas pri statiĉnem sipanju svetlobe zanima kotna odvisnost intentzitete svetlobe,
gledamo pri dinamiĉnem sipanju svetlobe ĉasovno odvisnost intenzitete sipanja (nihanje
intenzitete sipanja) pri doloĉenem stalnem kotu.
Najpogosteje metodo uporabljamo za ugotavljanje velikosti delcev med 3 in 3000 nm v
raztopinah proteinov, nanodelcev, v koloidnih raztopinah, tekoĉih kristalih, gelih, emulzijah
ali polimerih (38).
DLS temelji na sipanju laserske svetlobe na vzorcu, kjer so delci v Brownovem gibanju.
Brownovo gibanje je nakljuĉno gibanje delcev zaradi nakljuĉnih trkov z medijem, ki jih
obdaja. Znaĉilnost Brownovega gibanja je tudi, da se majhni delci gibljejo hitreje kot veliki in
to izkorišĉa tudi metoda DLS. Veliki delci sipajo veliko veĉ svetlobe kot manjši delci, ker je
intenziteta sipane svetlobe sorazmerna z d6. Praktiĉno to pomeni, da bodo v rezultatu, ki je
porazdelitev velikosti populacij glede na intenziteto sipanja svetlobe, manjši delci imeli
mnogo manjšo površino pod vrhom kot veĉji delci, pa ĉeprav bo deleţ manjših delcev
prevladal (38).
Vzorec osvetlimo z laserjem in sipanje merimo pod kotom 90°. Zaradi Brownovega gibanja
delcev intenziteta sipane svtelobe niha. Merimo ĉasovno odvisnost nihanja intenzitete sipanja
svetlobe skozi raztopino vzorca. Avtokorelacijska funkcija je merilo za hitrost spreminjanja
signala s ĉasom in iz hitrosti padca eksponentne funkcije sklepamo na velikost delcev. Iz
avtokorelacijske funkcije dobimo informacijo o difuzijskem koeficientu, ki je v povezavi z
velikostjo delcev. S pomoĉjo programske opreme po Stokes-Einsteinovi enaĉbi (enaĉba 8)
izraĉunamo hidrodinamski radij - Rh delcev (37):
t
b
hD
TkR
6 /8/
kjer je:
kb Boltzmannova konstanta,
T temperatura, pri kateri izvajamo meritev,
viskoznost topila,
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga UVOD
21
Dt difuzijski koeficient.
Hidrodinamski radij je vrednost, ki se nanaša na to, kako delec v raztopini difundira.
Poleg hidrodinamskega radija smo ugotovili tudi polidisperznost vzorcev (PD %), s katero
opišemo širino porazdelitve velikosti delca (41). PD % je relativni standardni odklon od
povpreĉja izmerjenih hidrodinamskih radijev vrhov v vzorcu. Monodisperzni vzorci imajo PD
% pod 20 %.
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga NAMEN DELA
22
2. NAMEN DELA
V magistrskem delu bomo preverili vlogo PEGilacije in dodanega sladkorja (trehaloze) pri
izbranem modelnem zelo hidrofobnem proteinu med izpostavljenostjo stabilitetnim pogojem.
Naša izhodišĉna hipoteza je, da bo PEGilacija izboljšala stabilnost modelnega proteina.
Izhodni protein (Protein_t) v optimizirani tekoĉi farmacevtski obliki z dodatkom trehaloze
bomo primerjali s PEGiliranim proteinom (PEGprotein) v dveh tekoĉih farmacevtskih
oblikah, z in brez zašĉitnega sladkorja (trehaloze).
Stabilnost bomo testirali pri pogojih, ki jim je proteinsko zdravilo v tekoĉi farmacevtski obliki
dejansko izpostavljeno. Spremljali bomo stabilnost pri razliĉnih temperaturah hranjenja (4 °C,
25 °C in 40 °C), pri zamrzovanju in odmrzovanju ter vpliv striţnih sil ob transportu, ki jih
bomo simulirali s stresanjem.
Vpliv PEGilacije na stabilnost hidrofobnega proteina bomo spremljali z razliĉnimi
standardnimi tehnikami HPLC, kot so kromatografija na reverzni fazi, kationsko
izmenjevalna in gelska kromatografija. Nastale agregate v vzorcih bomo poskušali ovrednotiti
z metodo statiĉnega sipanja svetlobe (MALS) in metodo dinamiĉnega sipanja svetlobe (DLS).
Zanima nas tudi, ĉe se med izpostavljenostjo zelo hidrofobnega proteina (PEGiliranega in
nePEGiliranega) stresnim pogojem spremeni biološka aktivnost in vitro.
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga MATERIALI IN METODE
23
3. MATERIALI IN METODE
3.1 MATERIALI
3.1.1 Kemikalije
Vse uporabljene kemikalije so analizne ĉistosti ali primerne za delo s celiĉnimi linijami ter so
navedene v preglednici III.
Preglednica III: Kemikalije
Kemikalija Proizvajalec, kataloška številka
Acetonitril Merck, 100030
BSA Equitech-Bio Inc, BAH68
Dietanolamin Sigma, D-8885
Etanol brezvodni Riedel-de-Haen, 32221
Gojišĉe F-12K Gibco-BRL Life Technologies, 21127-022
Gojišĉe F-12K, brez indikatorja pH Gibco-BRL Life Technologies, po naroĉilu
HIFBS Sigma, F-4135
Izopropanol Sigma-Aldrich, 650447
Magnezijev klorid Sigma, M-8266
Metanojska kislina Fluka, 06440
Natrijev hidroksid Sigma, S-5881
Natrijev dihidrogenfosfat Sigma, S-9638
Natrijev hidrogenfosfat Sigma, S-9763
Natrijev klorid Sigma, S-9888
Etanojska kislina Fluka, 45731
pNPP Sigma, N-2765
Trifluoroocetna kislina Sigma, T-6508
Trehaloza J.T.Baker, 4226-05
Tripsin-EDTA Sigma, T-4049
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga MATERIALI IN METODE
24
3.1.2 Voda
Za pripravo vseh pufrov in raztopin smo uporabili preĉišĉeno vodo (v nadaljevanju Milli-Q
voda), pripravljeno z napravo Millipore, model Milli-Q Advantage A10.
3.1.3 Raztopine in pufri
Preglednica IV: Pripravljene raztopine in pufri
Raztopina, pufer Sestava
Raztopine za analizno kromatografijo:
Mobilna faza A RPC 10 % (v/v) ACN, 0,1 % (v/v) TFA
Mobilna faza B RPC 95 % (v/v) ACN, 0,1 % (v/v) TFA
Mobilna faza A CEC 20 mM natrijev fosfat/NaOH, pH 7,5
Mobilna faza B CEC 20 mM natrijev fosfat/NaOH, 1 M NaCl, pH 7,5
Mobilna faza SEC PEGprotein 100 mM NaH2PO4/NaOH, 0,3 M NaCl, 10 %
(v/v) EtOH, pH 6,4
Mobilna faza SEC Protein 100 mM metanojska kislina, 10 % (v/v)
izopropanol
Raztopine za uravnavanje pH:
R1za dvig pH 1 M NaOH
R2za dvig pH 5 M NaOH
Končni pufri za shranjevanje proteina:
p1 10 mM CH3COOH/NaOH, pH 4,0
p2 10 mM CH3COOH/NaOH, 9 % (m/v) trehaloza,
pH 4,0
Raztopine in pufri za ugotavljanje in vitro biološke aktivnosti:
Rastni medij 90 % (v/v) gojišĉe F-12K, 10 % (v/v) HIFBS
Testni medij gojišĉe F-12K, brez indikatorja pH
Pufer za substrat 10 % (v/v) dietanolamin, 0,5 mM MgCl2, pH 9,8
Substrat 1 mg/mL pNPP v pufru za substrat
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga MATERIALI IN METODE
25
3.1.4 Vzorci (izvor, sestava, kakovost)
Vzorce smo prejeli shranjene v zaĉetnem pufru, nato smo jim zamenjali pufer in uravnali
koncentracijo. Poimenovali smo jih na naslednji naĉin, oznaka _t pomeni pufer z dodatkom
trehaloze in oznaka _a pufer brez dodane trehaloze.
Preglednica V: Vzorci
Vzorec Začetni pufer Začetna
koncentracija
[mg/mL]
Končni
pufer
Končna
koncentracija
[mg/mL]
Protein_t p2 8,3 p2 2,5
PEGprotein_t 10 mM aspartat, pH 4,0 7,1 p2 2,6
PEGprotein_a 10 mM aspartat, pH 4,0 7,1 p1 2,3
3.1.5 Standardi
Za analizo SEC-MALS smo pripravili standard BSA s koncentracijo 10 mg/mL v mobilni fazi
SEC PEGprotein in mobilni fazi SEC Protein.
Interni standard za merjenje biološke aktivnosti in vitro: c = 8,2 mg/mL
3.1.6 Kromatografske kolone za analizno kromatografijo
Preglednica VI: Kromatografske kolone za analizno kromatografijo
Kromatografska kolona Vrsta kromatografije Proizvajalec, kataloška številka
YMC-ODS-AQ RPC YMC, AQ20S03-1546WT
TSKgel SP-5PW CEC Tosoh Bioscience, 07161
TSKgel G3000SWXL SEC PEGprotein Tosoh Bioscience, 08541
BioBasic SEC 300 SEC Protein Thermo Hypersil-Keystone, 73505-
307846
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga MATERIALI IN METODE
26
3.2 METODE
3.2.1 Oprema
Preglednica VII: Oprema
Oprema Proizvajalec, tip
Avtoklav Kambiĉ, A-35/35-65/1
Centrifuga Eppendorf, 5810 R
Eppendorf, 5702 RH
Ĉitalnik mikrotitrskih plošĉ BioRad, 3550
BMG Labtechnologies, Fluostar Galaxy
Detektor dinamiĉnega sipanja svetlobe Malvern, Zetasizer APS
Hladilnik 2−8°C Angelantoni Industrie, Ekofrigolab 700/2
HPLC sistem, analizni Agilent, Agilent 1200
Inkubator Kambiĉ, I-105 CK
Inkubator CO2 THERMO FORMA, model 3308
WTC Binder, Tip 36210180003100
Invertni mikroskop Reichert-Jung, Series 1820 Biostar
Laminarij Iskra PIO, LFU 9
Magnetni mešalnik z gretjem Tehtnica, Rotamix SHP-10
MALS detektor (multy – angle light
scatter)
Wyatt Techonology, MALS miniDAWN
TREOS
Naprava za proizvodnjo posebno ĉiste vode Millipore, Milli-Q Advantage A10
pH meter Mettler Toledo, SevenEasy
RI detektor (refractive index) Wyatt Techonology, RI Optilab rEX
Spektrofotometer Varian, Cary 5000
Stresalnik mikrotitrskih plošĉ Tehtnica, EV–201
Stresalnik, namizni Tehtnica, Vibromix 10
Tehtnica, Vibromix 31
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga MATERIALI IN METODE
27
Oprema Proizvajalec, tip
Sušilnik Kambiĉ, SP-440C
Tehtnice Mettler Toledo, XP 205
Sartorius, CP622-0CE
Termiĉni blok Biosan, CH-100
Vodna kopel GLF
Zamrzovalna omara -70 °C Angelantoni Industrie, Platinum 750V
3.2.2 Priprava končnih vzorcev za stabilnost: zamenjava pufra, koncentriranje in
sterilna filtracija
Vzorec Protein_t smo razredĉili na ţeleno konĉno koncentracijo s pufrom p2.
Vzorcem PEGprotein smo zamenjali pufer in jih nato skoncentrirali do ţelene koncentracije.
Konĉna pufra sta bila p1 in p2. Zamenjavo in koncentriranje vzorcev smo izvedli v 14-mL
Amicon Ultra-15 kolonah (Millipore, UFC901024) s centrifugiranjem pri 3500 rpm in 6 °C.
Celico Amicon smo najprej sprali s 14 mL z Milli-Q vode in centrifugirali pri zgornjih
pogojih 10 minut. Nato smo vanjo odpipetirali ustrezno koliĉino vzorca in dopolnili s pufrom
za zamenjavo do konĉnega volumna (do 14 mL). Vsebino smo skoncentrirali do pribliţno 3
mL in celico ponovno dopolnili s pufrom. Postopek smo ponovili trikrat. Pri zadnji zamenjavi
smo vzorec skoncentrirali do ustreznega volumna, ki smo ga izraĉunali iz zaĉetne
koncentracije in volumna vzorca ter konĉne ţelene koncentracije vzorca. Na koncu smo
vzorec prenesli v sveţo centrifugirko in filter kolone sprali z 0,2 mL pufra za zamenjavo.
Vzorce smo sterilno filtrirali v laminariju skozi celulozno membrano s porami premera 0,2
µm (Corning, 431215), ki smo jih namestili na injekcijsko brizgo, in jih razdelili na enake
dele v sterilne viale. Toĉno koncentracijo smo izmerili z UV spektrofotometrom.
3.2.2.1 Merjenje koncentracij z UV spektrofotometrom
Metoda temelji na neposrednem merjenju absorbcije UV svetlobe z valovno dolţino 280 nm v
raztopini proteinov. Proteini v raztopini absorbirajo UV svetlobo valovne dolţine 280 nm
zaradi prisotnosti kromoforov v aromatskih aminokislinah, predvsem tirozina in triptofana, v
strukturi proteina. Metoda je enostavna in nedestruktivna.
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga MATERIALI IN METODE
28
Koncentracije vzorcev smo merili na spektrofotometru Cary Varian. Najprej smo pomerili
absorbanco za slepi vzorec, to je bil pufer p1 ali p2, in nato proteinski vzorec. Predhodno smo
vzorce redĉili s pufrom p1 ali p2 in jih prenesli v kvarĉno kiveto. Izmerili smo absorbanco pri
280 nm in odšteli signal pri 320 nm, kjer absorbirajo potencialno prisotni proteinski agregati.
Izmerjena absorbanca vzorca mora biti med 0,2 in 0,5, ker je v tem obmoĉju razmerje med
koncentracijo in absorbanco linearno in velja Beer-Lambertov zakon.
Koncentracijo proteina smo izraĉunali iz enaĉbe A = ε × c × l, pri ĉemer je A absorbanca pri
280 nm, ε molarni absorpcijski koeficient [Lmol-1
cm-1
], l dolţina optiĉne poti ţarka [cm] in c
molarna koncentracija [mol/L]. Dobljeno koncentracijo smo pomnoţili s faktorjem redĉenja
in tako izraĉunali koncentracijo proteina v vzorcu. Molarni absorpcijski koeficient za naš
modelni protein je 1,7 Lmol-1
cm-1
.
3.2.3 Stabilnost: načrt in količine vzorcev
Preglednica VIII: Naĉrt temperaturne stabilnosti
Čas / T ≤ -60 °C 2 – 8 °C 25 °C 40 °C Valikvotov
0 √ po 50 µL HPLC
po 200 µL DLS
po 200 µL BA
7d √ √
1m √ √ √ √
3m √ √ √
d: dan
m: mesec
Preglednica IX: Naĉrt stabilnosti stresanje in zamrzovanje / odmrzovanje
Stabilitetni test Izvedba Valikvotov
Stresanje 50 rpm, sobna T, 16 ur po 200 µL
Zamrzovanje / odmrzovanje 3 cikli zamrzovanja na ≤ -60 °C (24 ur) in
odmrzovanja na sobni temperatura (24 ur)
po 150 µL
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga MATERIALI IN METODE
29
Preglednica X: Naĉrt izvedenih analiz
Čas / Analize RPC CEC SEC +
MALS DLS BA
0 √ √ √ √ √
7d √ √ √
1m √ √ √ √ √
3m √ √ √ √ √
Stresanje √ √ √ (samo SEC)
Zamrzovanje
/odmrzovanje
√ √ √ (samo SEC)
3.2.4 Analizna kromatografija
Kromatografske analize smo izvedli na HPLC sistemu Agilent z UV detektorjem (tip DAD),
fluorescenĉnim detektorjem (FLD) in detektorjem MALS miniDAWN TREOS. Podatke smo
obdelali s programom Empower2 (za analize RPC, CEC in SEC) in Astra V (za analizo
MALS).
3.2.4.1 Kromatografija na reverzni fazi (RPC)
Pri tej metode izkorišĉamo razlike v hidrofobnosti proteinov. Loĉitev poteka na nepolarnem
nosilcu z uporabo bolj polarnih mobilnih faz. Princip metode je porazdeljevanje komponent
vzorca med fazama, bolj kot je komponenta vzorca hidrofobna, dlje se zadrţuje na koloni
(21). Stacionarna faza je silikagel, ki je ponavadi derivatiziran s hidrofobno oktilno (C8) ali
oktadecilno (C18) skupino. Najpogosteje so mobilne faze vodne raztopine acetonotrila ali
metanola.
Vzorce smo nanesli na kolono YMC-ODS-AQ, ki ima stacionarno fazo z vezanimi C18
skupinami. Za mobilni fazi A in B smo uporabili razliĉni raztopini acetonitrila, z dodatkom
trifluoroocetne kisline. Loĉitev je potekala pri pretoku 1 mL/min s 35-minutnim gradientom,
ki je prikazan v preglednici XI. Temperatura kolone je bila 65 °C. Nanos vzorcev na kolono je
bil 10 µg (vzorce smo predhodno redĉili s pufrom p1 ali p2 na 1 mg/mL). Uporabili smo
fluorescenĉno detekcijo (ekscitacija pri 280 nm in emisija pri 345 nm).
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga MATERIALI IN METODE
30
Preglednica XI: Gradient RPC metode
Čas [min] % Mobilna faza A RPC
0 60
2 60
27 35
27,1 0
28 0
28,1 95
29 95
29,1 0
31 0
31,1 60
35 60
3.2.4.2 Kationsko-izmenjevalna kromatografija (CEC)
Pri metodi izkorišĉamo elektrostatske interakcije med nabitimi proteini in matriksom
stacionarne faze. Stacionarna faza je sestavljena iz osnovnega matriksa, na katerega so pripeti
ionski izmenjevalci, ki imajo na svoji površini skupine z nabojem. Princip kationsko-
izmenjevalne kromatografije je vezava proteinov z pozitivnim nabojem na negativno nabite
skupine kationskega izmenjevalca. Molekule s pozitivnim nabojem se prve eluirajo s kolone.
Elucija vezanih komponent pa poteka s pomoĉjo elucijskega pufra, ki ima drugaĉno ionsko
jakost ali pH kot vezavni pufer (1, 21).
Vzorce smo nanesli na kolono TSKgel SP-5PW, ta ima na stacionarno fazo vezane moĉne
kationske izmenjevalce. Za mobilni fazi A in B smo uporabili raztopini natrijevega fosfata z
razliĉno ionsko jakostjo. Loĉitev je potekala pri pretoku 1 mL/min s 50-minutnim gradientom,
ki je prikazan v preglednici XII. Temperatura kolone je bila 25 °C. Nanos vzorcev na kolono
je bil 10 µg (vzorce smo predhodno redĉili s pufrom p1 ali p2 na 1 mg/mL). Uporabili smo
fluorescenĉno detekcijo (ekscitacija pri 280 nm in emisija pri 345 nm).
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga MATERIALI IN METODE
31
Preglednica XII: Gradient CEC metode
Čas [min] % Mobilna faza A CEC
0 100
3 100
43 0
45 0
45,1 100
50 100
3.2.4.3 Gelska kromatografija (SEC)
Analize SEC za vzorce PEGprotein_a in PEGprotein_t smo izvedli na koloni TSKgel
G3000SWXL z 250 Å porami. Uporabili smo mobilno fazo SEC PEGprotein pri pretoku 0,7
mL/min. Vzorce smo analizirali s 30-minutno izokratsko metodo, pri kateri je bila
temperatura kolone 30 °C. Nanos vzorcev na kolono je bil 10 µg (neredĉeni vzorci). Uporabili
smo UV detekcijo pri 214 nm.
Analize SEC za vzorce Protein_t smo izvedli na koloni BioBasic SEC 300 s 300 Å porami.
Uporabili smo mobilno fazo SEC Protein pri pretoku 0,75 mL/min. Vzorce smo analizirali s
25-minutno izokratsko metodo, analiza je bila izvedena pri sobni temperaturi (temperatura
kolone ni bila kontrolirana). Nanos vzorcev na kolono je bil 35 µg (vzorcev nismo redĉili).
Uporabili smo fluorescenĉno detekcijo (ekscitacija pri 279 nm in emisija pri 341 nm).
3.2.4.4 SEC-MALS
Separacijo smo izvedli z gelsko kromatografijo, z detekcijo MALS pa smo spremljali
agregacijo proteinov. Podatke smo obdelali z programom Astra V.
Analize SEC-MALS smo izvedli na enaki koloni, temperaturi kolone, sestavi in pretoku
mobilne faze ter nanosu vzorca kot analizo SEC. Za detekcijo smo uporabili dva detektorja.
Prvi je detektor MALS miniDAWN TREOS, ta zaznava statiĉno sipanje svetlobe pri treh
kotih (45°, 90° in 135°), in drugi je detektor RI, ta nam poda informacijo o koncentraciji
vzorca. S pomoĉjo programa Astra V smo izraĉunali molekulske mase proteina, PEG-a in
celotnega vzorca.
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga MATERIALI IN METODE
32
Detektor MALS miniDAWN TREOS smo pred analizo vzorcev umerili s standardom BSA,
kar zajema normalizacijo detektorja (premer BSA je 3,5 nm), poravnavo vrhov (angl.
alignment) in poravnavo širine vrhov (angl. band broadening). Pripravili smo raztopino BSA s
koncentracijo 10 mg/mL in injicirali na kolono 50 µg tako pripravljene raztopine.
3.2.5 DLS, tehnika dinamičnega sipanja svetlobe
Vzorce smo centrifugirali 10 min pri 13000 rpm in jih nanesli v jamice mikrotitrske plošĉice.
Za vsak vzorec smo izvedli meritev trikrat pri sipalnem kotu θ = 90°. Za obdelavo podatkov
smo uporabili program Zetasizer APS. Nanos vzorcev je bil 40 µL, nanesli smo neredĉene
vzorce. Meritve smo izvajali pri temperaturi 25 °C.
3.2.6 Ugotavljanje biološke aktivnosti in vitro
Ugotavljanje biološke aktivnosti in vitro smo izvajali na celiĉni liniji CHO, ki vsebuje gen za
poroĉevalski encim, sekretorno alkalno fosfatazo. CHO celiĉna linija izvira iz ovarijskih celic
kitajskega hrĉka in raste pritrjeno. Rastno gojišĉe je sestavljeno iz 90 % gojišĉa F-12K in
10 % toplotno inaktiviranega fetalnega govejega seruma brez antibiotikov.
Test temelji na principu, da se po dodatku proteina v gojišĉe izloĉa sekretorna alkalna
fosfataza. Koncentracija sekretorne alkalne fosfataze je v doloĉenemu obmoĉju
proporcionalna koncentraciji dodanega proteina. Koncentracijo izloĉene fosfataze
kvantificiramo z dodatkom reagenta 4-nitrofenilfosfata, ta se ob prisotnosti fosfataze spremeni
v obarvan produkt 4-nitrofenol, kot je prikazano na sliki 4. Raztopini produkta
spektrofotometriĉno izmerimo absorbanco pri 405 nm. Biološko aktivnost ugotovimo s
primerjavo redĉin standarda in vzorca z uporabo programa PLA 1,2 (angl Parallel-Line
Assays).
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga MATERIALI IN METODE
33
O P O
O
O
NO2
O
NO2
OH2 O P O
O
O
H+
Sekretorna alkalnafosfataza+ + + 2
Absorbancapri 405 nm
Slika 4: Reakcija 4-nitrofenilfosfata s sekretorno alkalno fosfatazo
Potek testa: predhodno pripravljene celice smo nasadili v jamice mikrotitrske plošĉe in plošĉe
inkubirali 24 ur ob prisotnosti CO2, 100 % relativne zraĉne vlage pri temperaturi 37 °C. Nato
smo k celicam dodali redĉitve vzorcev in standardov. Po 48-urni inkubaciji pri opisanih
pogojih smo odvzeli iz jamic mikrotitrske plošĉe del gojišĉa ter ga prenesli na novo
mikrotitrsko plošĉo. Nato smo dodali reagent 4-nitrofenilfosfat in izmerili absorbanco pri 405
nm.
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga REZULTATI IN RAZPRAVA
34
4. REZULTATI IN RAZPRAVA
4.1 Analizna kromatografija
4.1.1 Čistost RPC
Vsi vzorci so pri -60 °C in 4 °C stabilni (slika 5, RPC ĉistost -60 °C in RPC ĉistost 4 °C), v
treh mesecih se ĉistost glavnega vrha s ĉasom ne spreminja bistveno.
Pri 25 °C nastajajo razgradni produkti in deleţ glavnega vrha se s ĉasom zmanjšuje. Analiza
kaţe podoben trend za vse tri vzorce (Protein_t, PEGprotein_t in PEGprotein_a), med njimi ni
opaznih razlik v hitrosti zmanjševanja ĉistosti, kar je razvidno iz slike 5 (RPC ĉistost 25 °C).
Razlike med vzorci so vidne pri 40 °C. Na sliki 5 (RPC ĉistost 40 °C) vidimo, da se vzorcu
Protein_t deleţ glavnega vrha najbolj zmanjša, kar pomeni, da je pri tem vzorcu hitrost
nastanka razgradnih produktov najveĉja. PEGilirani razliĉici (PEGprotein_t in PEGprotein_a)
sta med seboj bolj primerljivi, vendar tudi tu po 30 dneh opazimo razliko – PEGprotein_t ima
ohranjen nekoliko veĉji deleţ glavnega vrha kot PEGprotein_a.
Slika 5: RPC ĉistost vzorcev Protein_t; PEGprotein_t in PEGprotein_a pri -60 °C,
4 °C, 25 °C in 40 °C
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga REZULTATI IN RAZPRAVA
35
Izbrani pogoji stresanja in cikli zamrzovanja ter odmrzovanja ne vplivajo na ĉistost proteina
(slika 6).
Slika 6: RPC ĉistost vzorcev Protein_t; PEGprotein_t in PEGprotein_a, po stresanju
in ciklih zamrzovanja ter odmrzovanja
Razgradni produkti vzorca Protein_t, ki so nastali pri 40 °C (po 7 in 30 dneh) in se na
kromatogramu analize RPC vidijo kot poveĉani vrhovi pred in za glavnim vrhom proteina, so
na sliki 7 nakazani s pušĉicami.
Slika 7: Kromatogram analize RPC za vzorec Protein_t; zaĉetno stanje, po 7 dneh in
po 30 dneh pri 40 °C
: protein_t -60°C t0 : protein_t +40°C 7d : protein_t +40°C 1m
VP4
- 7,
523
VP3
- 8,
918
VP2
- 10
,790
VP1
- 11
,279
prot
ein
- 11,
611
NP1
- 12
,216
NP2
- 12
,700
NP3
- 13
,071
NP5
- 14
,297
15,7
71
LU
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
120,00
Minutes
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00
: protein_t -60°C t0 : protein_t +40°C 7d : protein_t +40°C 1m
VP4
- 7,
523
VP3
- 8,
918
VP2
- 10
,790
VP1
- 11
,279
prot
ein
- 11,
611
NP1
- 12
,216
NP2
- 12
,700
NP3
- 13
,071
NP5
- 14
,297
15,7
71
LU
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
Minutes
8,00 10,00 12,00 14,00 16,00
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga REZULTATI IN RAZPRAVA
36
Pri vzorcu PEGprotein_t in PEGprotein_a se po izpostavljenosti temperaturnemu stresu
poviša deleţ nePEGiliranega proteina v vzorcu (del PEGproteina se razgradi v izhodni
protein), kar nakazuje modra pušĉica na slikah 8 in 9. Razgradni produkti temperaturnega
stresa se kaţejo tudi kot povišanje vrha NP1 (ki se nahaja pred vrhom diPEGprotein), rdeĉa
pušĉica na slikah 8 in 9. V vzorcih PEGprotein_t in PEGprotein_a vrh diPEGprotein, ki
vsebuje diPEGiliran produkt, ne narašĉa niti s ĉasom in tudi ne z višanjem temperature.
Slika 8: Kromatogram analize RPC za vzorec PEGprotein_t; zaĉetno stanje, po 7 dneh
in po 30 dneh pri 40 °C
: PEGprotein_t -60°C t0 : PEGprotein_t +40°C 7d : PEGprotein_t +40°C 1m
prot
ein
- 11,
759
VP1
- 18
,969
PEG
prot
ein
- 19,
557
NP1
- 21
,023
diPE
G-p
rote
in -
22,2
42
LU
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
Minutes
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00
: PEGprotein_t -60°C t0 : PEGprotein_t +40°C 7d : PEGprotein_t +40°C 1m
prot
ein
- 11,
759
VP1
- 18
,969
PEG
prot
ein
- 19,
557
NP1
- 21
,023
diPE
G-p
rote
in -
22,2
42
LU
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
Minutes
12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga REZULTATI IN RAZPRAVA
37
Slika 9: Kromatogram analize RPC za vzorec PEGprotein_a; zaĉetno stanje, po 7
dneh in po 30 dneh pri 40 °C
Glede na rezultate analize RPC ima PEGilacija zašĉitno vlogo pri temperaturni stabilnosti
zelo hidrofobnega proteina. Rezultati nakazujejo tudi zašĉitno vlogo trehaloze.
4.1.2 Čistost CEC
Vzorci so pri -60 °C in 4 °C stabilni, v treh mesecih se ĉistost s ĉasom tudi na analizi CEC ne
spreminja bistveno (slika 10 , CEC ĉistost -60 °C in CEC ĉistost 4 °C).
Pri povišanih temperaturah, 25 °C in 40 °C, nastajajo razgradni produkti in deleţ glavnega
vrha se s ĉasom zmanjšuje. Vzorcu Protein_t se je po izpostavitvi temperaturnemu stresu
deleţ glavnega vrha po 7 dneh pri 40 °C ter po 30 dneh pri 25 °C bistveno bolj zmanjšal kot
PEGiliranima razliĉicama PEGprotein_t in PEGprotein_a, kar je razvidno iz slike 10 (CEC
ĉistost 25 °C in CEC ĉistost 40 °C). Ob koncu stabilitetne študije (po 30 dneh pri 40 °C in po
90 dneh pri 25 °C) pa je ĉistost vzorca Protein_t primerljiva PEGiliranemu proteinu brez
dodatka trehaloze (PEGprotein_a).
: PEGprotein_a -60°C t0 : PEGprotein_a+40°C 7d : PEGprotein_a +40°C 1m
prot
ein
- 11,
773
VP1
- 18
,977
PEG
prot
ein
- 19,
564
NP1
- 21
,081
diPE
G-p
rote
in -
22,2
28
LU
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
Minutes
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00
: PEGprotein_a -60°C t0 : PEGprotein_a+40°C 7d : PEGprotein_a +40°C 1m
prot
ein
- 11,
773
VP1
- 18
,977
PEG
prot
ein
- 19,
564
NP1
- 21
,081
diPE
G-p
rote
in -
22,2
28
LU
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
Minutes
12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga REZULTATI IN RAZPRAVA
38
Slika 10: CEC ĉistost vzorcev Protein_t; PEGprotein_t in PEGprotein_a pri -60 °C,
4 °C, 25 °C in 40 °C
Razgradni produkti, ki smo jih zaznali s CEC, so se eluirali kot vrhovi pred glavnim vrhom
(pri vseh vzorcih) in kot rama za glavnim vrhom pri nePEGiliranih vzorcih (vzorci Protein_t),
na sliki 11 in 12 so razgradni produkti nakazani s pušĉicami.
Slika 11: Kromatogram analize CEC za vzorec Protein_t; zaĉetno stanje, po 7 dneh in
po 30 dneh pri 40 °C
: protein_t -60°C t0 : protein_t +40°C 7d : protein_t +40°C 1m
VP2
- 20
,606
VP1
- 22
,998
prot
ein
- 25,
426
LU
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
Minutes
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 45,00 50,00
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga REZULTATI IN RAZPRAVA
39
Slika 12: Kromatogram analize CEC za vzorec PEGprotein_t in PEGprotein_a;
zaĉetno stanje, po 7 dneh in po 30 dneh pri 40 °C
Razgradni produkti, ki so se eluirali kot vrhovi pred glavnim vrhom (VP), vsebujejo
predvidoma deamidirane produkte in smo jih ovrednotili posebej. Deamidirani produkti se na
CEC analizi eluirajo pred glavnim vrhom zato, ker imajo manj pozitivnih nabojev in se
šibkeje veţejo na kolono.
V vzorcih pri -60 °C in 4 °C se deleţ VP ne spreminja bistveno, zato so na sliki 11 in 12
prikazani le CEC rezultati stabilitetne študije pri povišanih temperaturah, pri 25 °C in 40 °C.
Pri povišani temperaturi je deleţ predvidoma deamidiranih produktov (VP) višji v vzorcu
PEGprotein_a, kot v vzorcih z dodatkom trehaloze, Protein_t in PEGprotein_t.
Slika 13: Deleţ vrhov VP – predvidoma deamidirani produkti v vzorcih Protein_t;
PEGprotein_t in PEGprotein_a
: PEGprotein_t -60°C t0 : PEGprotein_t +40°C 7d : PEGprotein_t +40°C 1m
VP
3 -
9,8
20
VP
2 -
11
,41
5V
P1
- 1
2,5
69
PE
G-p
rote
in -
14
,20
0
pro
tein
- 2
7,1
10
LU
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
100,00
Minutes
0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00
: PEGprotein_t -60°C t0 : PEGprotein_t +40°C 7d : PEGprotein_t +40°C 1m
VP
3 -
9,8
20
VP
2 -
11
,41
5
VP
1 -
12
,56
9
PE
G-p
rote
in -
14
,20
0
LU
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
Minutes
8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00
: PEGprotein_a -60°C t0 : PEGprotein_a +40°C 7d : PEGprotein_a +40°C 1m
VP
3 -
9,8
80
VP
2 -
11
,41
4V
P1
- 1
2,5
49
PE
G-p
rote
in -
14
,18
8
pro
tein
- 2
7,4
24
LU
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
100,00
Minutes
0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00
: PEGprotein_a -60°C t0 : PEGprotein_a +40°C 7d : PEGprotein_a +40°C 1m
VP
3 -
9,8
80 V
P2 -
11,4
14
VP
1 -
12,5
49
PE
G-p
rote
in -
14,1
88
LU
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
Minutes
8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga REZULTATI IN RAZPRAVA
40
Izbrani pogoji stresanja in cikli zamrzovanja / odmrzovanja ne vplivajo na stabilnost
PEGiliranega proteina, ne glede na dodatek trehaloze (slika 14).
Slika 14: CEC ĉistost vzorcev Protein_t; PEGprotein_t in PEGprotein_a, po stresanju
in ciklih zamrzovanja ter odmrzovanja
Glede na analizo CEC, je bil med testiranimi vzorci najbolj stabilen PEGprotein_t, t.j.
PEGiliran protein z dodatkom trehaloze. Rezultati tudi kaţejo, da pri krajši izpostavitvi
temperaturnemu stresu PEGilacija deluje zašĉitno. Ob daljši izpostavitvi imajo pomembno
zašĉitno vlogo pomoţne snovi, dodane v formulacijo, v našem primeru trehaloza.
4.1.3 Čistost SEC
Vzorci so pri -60 °C in 4 °C stabilni, v treh mesecih se deleţ višjemolekularnih produktov (t.j.
vrh hMW2 pri vzorcih Protein_t oziroma vrh hMW2+hMW3 pri vzorcih PEG_protein) s
ĉasom ne spreminja bistveno (slika 15, SEC deleţ hMW2 -60 °C in SEC deleţ hMW2 4 °C).
Pri vseh vzorcih vrh hMW1 ne narašĉa niti s ĉasom niti z višanjem temperature, ta vrh
verjetno vsebuje diPEGiliran produkt (slika 17, 18 in 19). Vrh hMW2 (v vzorcih Protein_t in
PEGprotein_t) in vsota vrhov hMW2+hMW3 (v vzorcih PEGprotein_a), ki vsebujejo
oligomere / agregate, narašĉajo z obema parametroma.
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga REZULTATI IN RAZPRAVA
41
Slika 15: SEC deleţ agregatov v vzorcih Protein_t; PEGprotein_t in PEGprotein_a
Izbrani pogoji stresanja in cikli zamrzovanja / odmrzovanja ne vplivajo na stabilnost
nePEGiliranega in PEGiliranega proteina (slika 16).
Slika 16: SEC deleţ agregatov v vzorcih Protein_t; PEGprotein_t in PEGprotein_a,
po stresanju in ciklih zamrzovanja ter odmrzovanja
Oligomeri / agregati pospešeno nastajajo pri povišanih temperaturah. Pri 25 °C je njihov deleţ
najbolj poveĉan v vzorcu Protein_t (slika 17), sledi PEGprotein_a (slika 19). Pri vzorcu
PEGprotein_t deleţ oligomerov / agregatov pri 25 °C po 90 dneh ni poveĉan glede na stanje
po 30 dneh in izhodno stanje (slika 18).
Tudi pri 40 °C je bil najbolj stabilen vzorec PEGprotein_t (slika 18). Vzorca Protein_t (slika
17) in PEGprotein_a (slika 19) imata bistveno bolj poveĉan deleţ agregatov, po 30 dneh
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga REZULTATI IN RAZPRAVA
42
PEGprotein_a celo bolj kot Protein_t. Vendar moramo upoštevati, da smo analizo SEC
izvajali z dvema razliĉnima metodama, posebej za Protein_t in posebej za vzorca PEGprotein.
Nobena od metod namreĉ ni omogoĉala zanesljive detekcije agregatov hkrati za protein in za
PEGprotein, zato smo izbrali kromatografski koloni in mobilni fazi, optimizirani za
posamezno vrsto molekule.
Slika 17: Kromatograma analize SEC za vzorec Protein_t; zaĉetno stanje, pri 25 °C (po
30 in po 90 dneh) ter pri 40 °C (po 7 in po 30 dneh)
Slika 18: Kromatograma analize SEC za vzorec PEGprotein_t; zaĉetno stanje, pri 25
°C (po 30 in po 90 dneh) ter pri 40 °C (po 7 in po 30 dneh)
: Protein_t -60°C t0 : Protein_t +40°C 7d : Protein_t +40°C 1m
hM
W2
- 8
,44
5h
MW
1 -
8,9
97
pro
tein
- 1
0,1
02
LU
0,00
50,00
100,00
150,00
200,00
250,00
300,00
Minutes
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00
: Protein_t -60°C t0 : Protein_t +40°C 7d : Protein_t +40°C 1m
hM
W2
- 8
,44
5
hM
W1
- 8
,99
7 pro
tein
- 1
0,1
02
LU
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
Minutes
6,00 7,00 8,00 9,00 10,00 11,00 12,00
: Protein_t -60°C t0 : Protein_t +25°C 1m : Protein_t +25°C 3m
hM
W2
- 8
,44
5h
MW
1 -
8,9
97
pro
tein
- 1
0,1
02
LU
0,00
50,00
100,00
150,00
200,00
250,00
300,00
Minutes
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00
: Protein_t -60°C t0 : Protein_t +25°C 1m : Protein_t +25°C 3m
hM
W2
- 8
,44
5
hM
W1
- 8
,99
7
pro
tein
- 1
0,1
02
LU
-10,00
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
Minutes
7,00 8,00 9,00 10,00 11,00 12,00
: PEGprotein_t -60°C t0 : PEGprotein_t +25°C 1m : PEGprotein_t +25°C 3m
hM
W2
- 7
,78
6h
MW
1 -
8,2
99
PE
Gp
rote
in -
9,3
68
pro
tein
- 1
5,3
01
AU
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1,40
1,60
Minutes
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00
: PEGprotein_t -60°C t0 : PEGprotein_t +25°C 1m : PEGprotein_t +25°C 3m
hM
W2
- 7
,78
6
hM
W1
- 8
,29
9
PE
Gp
rote
in -
9,3
68
AU
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
Minutes
7,00 8,00 9,00 10,00 11,00
: PEGprotein_t -60°C t0 : PEGprotein_t +40°C 7d : PEGprotein_t +40°C 1m
hM
W2
- 7
,78
6h
MW
1 -
8,2
99
PE
Gp
rote
in -
9,3
68
pro
tein
- 1
5,3
01
AU
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1,40
1,60
Minutes
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00
: PEGprotein_t -60°C t0 : PEGprotein_t +40°C 7d : PEGprotein_t +40°C 1m
hM
W2
- 7
,78
6
hM
W1
- 8
,29
9
PE
Gp
rote
in -
9,3
68
AU
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
Minutes
7,00 7,50 8,00 8,50 9,00 9,50 10,00 10,50 11,00
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga REZULTATI IN RAZPRAVA
43
Slika 19: Kromatogram analize SEC za vzorec PEGprotein_a; zaĉetno stanje, pri 25 °C
(po 30 in po 90 dneh) ter pri 40 °C (po 7 in po 30 dneh)
Iz analize SEC lahko zakljuĉimo, da je imela najveĉjo zašĉitno vlogo pri agregaciji zelo
hidrofobnega proteina kombinacija PEGilacije in trehaloze (PEGprotein_t). V vzorcu
PEGprotein_a se je namreĉ kljub PEGilaciji deleţ oligomerov / agregatov poveĉal bistveno
bolj kot v vzorcu PEGprotein_t. Ravno tako se je v vzorcu Protein_t kljub prisotnosti
trehaloze deleţ oligomerov / agregatov poveĉal bistveno bolj kot v vzorcu PEGprotein_t.
4.1.4 Ugotavljanje molekulske mase s SEC-MALS
Molekulska masa proteina, ki smo ga uporabili v naši študiji, je 18,5 kDa. PEGiliran protein
ima pripeto 30 kDa verigo linearnega polietilenglikola. Na slikah 20 in 21 sta prikazana
tipiĉna kromatograma SEC-MALS za protein in PEGprotein.
: PEGprotein_a -60°C t0 : PEGprotein_a +25°C 1m : PEGprotein_a +25°C 3m
hM
W2
- 7
,78
6h
MW
1 -
8,2
99
PE
Gp
rote
in -
9,3
73
pro
tein
- 1
5,3
17
AU
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1,40
1,60
1,80
Minutes
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00
: PEGprotein_a -60°C t0 : PEGprotein_a +25°C 1m : PEGprotein_a +25°C 3m
hM
W2
- 7
,78
6
hM
W1
- 8
,29
9
PE
Gp
rote
in -
9,3
73
AU
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
0,22
0,24
Minutes
7,00 8,00 9,00 10,00 11,00 12,00
: PEGprotein_a -60°C t0 : PEGprotein_a +40°C 7d : PEGprotein_a +40°C 1m
hM
W2
- 7
,78
6h
MW
1 -
8,2
99
PE
Gp
rote
in -
9,3
73
pro
tein
- 1
5,3
17
AU
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1,40
1,60
1,80
Minutes
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00
: PEGprotein_a -60°C t0 : PEGprotein_a +40°C 7d : PEGprotein_a +40°C 1m
hM
W2
- 7
,78
6
hM
W1
- 8
,29
9
PE
Gp
rote
in -
9,3
73
AU
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
0,22
0,24
Minutes
7,00 8,00 9,00 10,00 11,00 12,00
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga REZULTATI IN RAZPRAVA
44
Slika 20: Kromatogram SEC-MALS za vzorec Protein_t
Slika 21: Kromatogram SEC-MALS za vzorec PEGprotein (PEGprotein_a)
4.1.4.1 Ugotavljanje molekulske mase izhodnih vzorcev
V izhodnih vzorcih smo ugotovili molekulske mase izhodnega proteina in PEGproteina ter
vrhov hMW1 in hMW2, kar je prikazano v preglednicah XIII in XIV.
Preglednica XIII: Ocene MALS molekulskih mas posameznih vrhov, ki jih loĉimo s
kromatografijo SEC za vzorec Protein_t
MW [kDa] Razmerje MW
Vzorec Protein hMW1 hMW 2 hMW1/protein hMW2/protein
Protein_t #1 19,6 41,0 85 2 4
Oblika proteina monomer dimer oligomeri /
agregati
Legenda: # - številka meritve
hMW2Protein
hMW1
PEGprotein
hMW2
hMW3 hMW1
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga REZULTATI IN RAZPRAVA
45
Izhodnemu vzorcu Protein_t smo ugotovili molekulsko maso 19,6 kDa, kar je za tehniko
MALS sprejemljivo odstopanje (± 10 %) od dejanske molekulske mase (18,5 kDa). Iz
razmerja molekulskih mas (razmerje MW) smo ugotovili naravo višjemolekularnih vrst, ki jih
loĉimo s kromatografijo SEC. Molekulska masa, ki smo jo ugotovili pri vrhu hMW1 je
pribliţno dvakrat veĉja od proteina, kar pomeni, da je v vrhu hMW1 preteţno dimerna oblika
proteina. Rezultat za vrh hMW2 je pribliţno štirikrat veĉja molekulska masa v primerjavi s
proteinom. V vrhu hMW2 so torej preteţno prisotni oligomeri proteina (preglednica XIII).
Preglednica XIV: Ocene MALS molekulskih mas posameznih vrhov, ki jih loĉimo s
kromatografijo SEC za vzorca PEGprotein_t in PEGprotein_a
MW [kDa] Razmerje MW
Vzorec PEG
protein
hMW1 hMW 2 hMW1/
PEGprotein
hMW2/
PEGprotein
PEGprotein_t #1 protein 17,0 33,2 315 2 19
PEGprotein_t #2 protein 17,2 52,2 345 3 20
PEGprotein_a #1 protein 18,0 32,9 221 2 12
PEGprotein_a #2 protein 17,7 33,4 256 2 14
PEGprotein_t #1 PEG 28,5 113 485 4 17
PEGprotein_t #2 PEG 28,1 118 470 4 17
PEGprotein_a #1 PEG 29,1 119 492 4 17
PEGprotein_a #2 PEG 28,8 125 531 4 18
Oblika
PEGproteina
monomer diPEGiliran
dimer
oligomeri /
agregati
Legenda: # - številka meritve
V izhodnih vzorcih PEGprotein_t in PEGprotein_a smo loĉeno ocenili proteinski del
molekule in PEG del molekule: ugotovili smo molekulsko maso proteina in molekulsko maso
PEG v posameznih vrhovih, ki jih loĉimo s kromatografijo SEC.
Proteinu smo ugotovili molekulske mase med 17,0 kDa in 18,0 kDa in PEG-u pa molekulske
mase med 28,1 kDa in 29,1 kDa. Odstopanje molekulskih mas od dejanskih je znotraj
sprejemljivih ± 10 % od dejanskih vrednosti (18,5 kDa protein in 30 kDa PEG). Iz razmerja
molekulskih mas (razmerje MW) smo ponovno ugotovili naravo višjemolekularnih vrst v
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga REZULTATI IN RAZPRAVA
46
vrhovih hMW1 in hMW2. V vrhu hMW1 je molekulska masa proteinskega dela molekule
pribliţno dvakrat veĉja od molekulske mase proteina v molekuli PEGprotein, molekulska
masa PEG dela molekule pa pribliţno štirikrat veĉja od molekulske mase PEG v molekuli
PEGprotein. V vrhu hMW1 je torej preteţno diPEGilirana dimerna oblika proteina.
Molekulske mase, ki smo jih ugotovili vrhovom hMW2 so v primerjavi z monomeri
PEGprotein 12 – 20-krat veĉje, kar pomeni, da so v tem vrhu prisotni preteţno oligomeri /
agregati molekul PEGprotein (preglednica XIV).
4.1.4.2 Ugotavljanje molekulske mase stabilitetnih vzorcev
V vzorcih temperaturne stabilnosti smo spremljali molekulsko maso hMW2. Deleţ hMW1 se
namreĉ s ĉasom ne spreminja, kar je razvidno iz kromatogramov in rezultatov analiz SEC.
V stabilitetnih vzorcih Protein_t smo z MALS ugotovili molekulske mase glavnega vrha med
18,0 kDa in 19,6 kDa. Odstopanje molekulskih mas od dejanske (18,5 kDa) je znotraj
sprejemljivih ± 10 %. Rezultati stabilitetnih vzorcev Protein_t so prikazani v preglednici XV
in sliki 22.
Preglednica XV: Ocene MALS molekulskih mas vrhov hMW2 za vzorec Protein_t
MW [kDa] Razmerje MW
Vzorec Protein hMW 2 hMW2/ Protein
protein_t -60°C t0 19,6 85 4
protein_t +4°C 1m 18,4 128 7
protein_t +4°C 3m 19,3 159 8
protein_t +25°C 1m 18,1 139 8
protein_t +25°C 3m 18,3 146 8
protein_t +40°C 7d 18,6 224 12
protein_t +40°C 1m 18,0 493 27
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga REZULTATI IN RAZPRAVA
47
Slika 22: Narašĉanje molekulske mase hMW2 s ĉasom v vzorcih Protein_t
Pri temperaturnem stresu poleg narašĉanja deleţa oligomerov / agregatov (analiza SEC, slika
15 in 17) narašĉa tudi velikost oligomerov / agregatov, ki jih s SEC loĉimo v vrhu hMW2.
Poveĉanje molekulske mase je najbolj izrazito pri 40 °C, zato sklepamo, da so po 3 mesecih
pri 40 °C nastali tudi pravi agregati.
Rezultati stabilitetnih vzorcev PEGprotein_t in PEGprotein_a so prikazani v preglednici XVI
in na slikah 23, 24. Dejanska celokupna molekulska masa konjugatov PEGprotein je 48,5 kDa
(18,5 kDa protein in 30 kDa PEG). V vzorcih PEGprotein smo spremljali celokupno
molekulsko maso hMW2 in jo primerjali s celokupno maso monomernega konjugata.
Preglednica XVI: MALS ocene molekulskih mas vrhov hMW2 za vzorca PEGprotein_t
in PEGprotein_a
MW [kDa] Razmerje MW
Vzorec PEGprotein hMW 2 hMW2 / PEGprotein
PEGprotein_t -60°C t0 45,3 790 17
PEGprotein_t +4°C 1m 45,8 652 14
PEGprotein_t +4°C 3m 45,6 772 17
PEGprotein_t +25°C 1m 45,6 710 16
PEGprotein_t +25°C 3m 45,3 751 17
PEGprotein_t +40°C 7d 45,2 757 17
PEGprotein_t +40°C 1m 45,0 878 20
PEGprotein_a -60°C t0 46,5 787 17
PEGprotein_a +4°C 1m 45,9 713 16
PEGprotein_a +4°C 3m 45,6 741 16
PEGprotein_a +25°C 1m 45,5 809 18
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga REZULTATI IN RAZPRAVA
48
MW [kDa] Razmerje MW
Vzorec PEGprotein hMW 2 hMW2 / PEGprotein
PEGprotein_a +25°C 3m 46,5 1213 26
PEGprotein_a +40°C 7d 46,0 874 19
PEGprotein_a +40°C 1m 47,2 1030 22
Slika 23: Narašĉanje molekulske mase hMW2 s ĉasom v vzorcih PEGprotein_t
Slika 24: Narašĉanje molekulske mase hMW2 in hMW3 s ĉasom v vzorcih
PEGprotein_a
Z MALS smo ugotovili molekulske mase monomernega konjugata v stabilitetnih vzorcih med
45,0 kDa in 47,2 kDa. Odstopanje molekulskih mas od dejanske (48,5 kDa) je znotraj
sprejemljivih ± 10 %.
Pri temperaturnem stresu velikost oligomerov / agregatov, ki jih s SEC loĉimo v vrhu hMW2,
s ĉasom narašĉa. V vzorcih PEGprotein_t je rahlo poveĉanje opazno samo pri 40 °C, medtem
ko je v vzorcih PEGprotein_a izrazito ţe pri 25 °C. V vzorcih PEGprotein_a, hranjenih pri
25 °C, smo zaznali populacijo vrst z bistveno veĉjo molekulsko maso od hMW2 in jo
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga REZULTATI IN RAZPRAVA
49
poimenovali hMW3. Glede na molekulsko maso so v vrhu hMW3 verjetno pravi agregati,
medtem ko so v vrhu hMW2 veĉji oligomeri / agregati.
Iz prisotnosti vrha hMW3 pri vzorcu PEGprotein_a in odsotnosti vrha hMW3 pri vzorcu
PEGprotein_t lahko sklepamo naslednje. V vzorcih PEGprotein_t populacija hMW3 ni
nastajala, kar potrjuje zašĉitno vlogo trehaloze pri agregaciji. Zanimivo je, da vrst hMW3 v
vzorcu PEGprotein_a pri 40 °C nismo zaznali. Morda so pri tej temperaturi nastali netopni
agregati, ki ne morejo potovati po matriksu gelske kolone in ostanejo na koloni.
Analiza SEC-MALS potrjuje, da pri povišani temperaturi in s ĉasom nastajajo oligomeri /
agregati z višjo molekulsko maso, ki jih je v zaĉetnem vzorcu mnogo manj. Analiza tudi
potrjuje, da so v vrhu hMW1 prisotni diPEGilirani produkti, medtem ko vrh hMW2 vsebuje
oligomere / agregate.
4.2 DLS
Vzorce smo analizirali tudi s tehniko dinamiĉnega sipanja svetlobe (DLS). Ugotovili smo
posamezne populacije v vzorcih in njihove hidrodinamske radije (Rh). DLS smo uporabili kot
dopolnilo tehniki SEC-MALS, saj s SEC ne detektiramo morebitno prisotnih netopnih
agregatov, z MALS pa ne moremo ugotoviti radija molekul, manjših od 10 nm.
V preglednici XVII so prikazani rezultati meritev – porazdelitev velikosti populacij glede na
intenziteto sipanja svetlobe v vzorcih. Zaznali smo prisotnost veĉ populacij. Prvi vrh v
vsakem posameznem vzorcu je monomeren protein ali PEGprotein. Polidisperznost (PD%)
teh vrhov je pod 20 %, kar pomeni, da so populacije teh molekul monodisperzne (preglednica
XVIII). Druge populacije najverjetneje ne ustrezajo povsem populacijam, loĉenim s
kromatografijo SEC (hMW1, hMW2 in hMW3), zato smo jih poimenovali pop1, pop2, pop3
in pop4. Posameznim populacijam smo ugotovili hidrodinamske radije (preglednice XIX-
XXI).
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga REZULTATI IN RAZPRAVA
50
Preglednica XVII: Porazdelitev velikosti populacij glede na intenziteto sipanja svetlobe v
vzorcih Protein_t; PEGprotein_t in PEGprotein_a
Protein_t PEGprotein_t PEGprotein_a
t0
+4 °C
3m
25 °C
1m
25 °C
3m
40 °C
1m
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga REZULTATI IN RAZPRAVA
51
Zaradi dinamike populacij v vzorcih meritve DLS niso popolnoma ponovljive. Zato smo pri
vsakem vzorcu izvedli tri ponovitve merjenja. V primerjavi z izhodnimi vzorci (t0) so pri
posameznih stabilitetnih vzorcih vidne vmesne populacije oligomerov in trend veĉanja
oligomerov do konĉne velikosti oligomerov / agregatov (preglednica XVII). V nasprotju z
monodisperznim proteinom oziroma PEGproteinom so populacije pop1 – pop4 polidisperzne.
Preglednica XVIII: Polidisperznost populacij (protein in PEGprotein) v vzorcih (PD%)
Vzorec
Protein_t
PD%
protein
Vzorec
PEGprotein_t
PD%
PEGprotein
Vzorec
PEGprotein_a
PD%
PEGprotein
-60 °C t0 17,7 -60 °C t0 10,6
-60 °C t0 8,5
4 °C 3m 22,0 4 °C 3m 10,1
4 °C 3m 10,2
25 °C 1m 19,6 25 °C 1m *
25 °C 1m 11,5
25 °C 3m 15,2 25 °C 3m 10,1
25 °C 3m 12,2
40 °C 1m 22,0 40 °C 1m 10,5
40 °C 1m 12,9
*nismo zaznali vrha PEGprotein
V vzorcih Protein_t smo poleg monomernih molekul zaznali še prisotnost štirih populacij
višjemolekularnih vrst (preglednica XIX). Rh monomernih molekul je okoli 0,6 nm. Druge
populacije predvidoma predstavljajo oligomere, prehodne populacije in agregate.
V vzorcu, hranjenem 1 mesec pri 40 °C, smo zaznali delce velikosti 1 – 2 μm (pop4).
Predvidevamo, da so to veliki netopni agregati. Mikrometrske delce smo zaznali tudi v
vzorcih t0, 4 °C, 3 meseci in 25 °C, 3 meseci, vendar le v eni od treh meritev. Upoštevati
moramo tudi dejstvo, da je metoda zelo obĉutjiva na druge delce, ki niso del vzorca (npr.
prah), ter da moţnosti prisotnosti teh delcev ne moremo povsem izkljuĉiti. Da bi jih odstranili,
smo vzorce pred meritvami centrifugirali pri visokih obratih. Vzorcev nismo filtrirali zaradi
morebitnega vpliva na deleţ prisotnih agregatov.
Preglednica XIX: Vrednosti Rh v nm za vzorce Protein_t
Rh [nm]
vzorec protein pop1 pop2 pop3 pop4
Protein_t -60°C t0 0,6 - 0,7 1,3 - 2,0 11 - 18 77 - 94 2661*
Protein_t +4°C 3m 0,6 - 0,6 1,3 - 1,4 7 - 13 77 - 82 1790*
Protein_t +25°C 1m 0,4 - 0,5 1,0 - 1,5 6 - 10 67 - 84 195 - 632
Protein_t +25°C 3m 0,6 - 0,7 2,0 - 2,4 9 - 13 61 - 85 2371*
Protein_t +40°C 1m 0,6 - 0,8 1,8 - 2,8 12 - 13 1150 - 2275 *prisoten odziv samo v eni od treh ponovitev merjenja vzorca
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga REZULTATI IN RAZPRAVA
52
Pripetje verige PEG poveĉa hidrodinamski radij molekule. Rh monomernih molekul vzorcev
PEGprotein (PEGprotein_t in PEGprotein_a) je okoli 4 nm (preglednici XX in XXI).
Rezultati DLS so za PEGprotein_a in PEGprotein_t primerljivi. Poleg monomernih molekul
PEGproteina smo zaznali še tri populacije višjemolekularnih vrst. Pri nekaterih vzorcih
zaznamo tudi prisotnost veĉjih delcev, velikosti 1 – 2 μm (pop3), vendar preteţno samo v eni
od treh meritev vzorca, zato ne moremo trditi, da gre za veĉje agregate. Veĉji delci so prisotni
tudi v izhodnem vzorcu PEGprotein_t. Enako kot pri vzorcu protein, tudi tu ne moremo
povsem izkljuĉiti moţnosti prisotnosti prašnih delcev.
Preglednica XX: Vrednosti Rh v nm za vzorce PEGprotein_t
Rh [nm]
vzorec PEGprotein pop1 pop2 pop3
PEGprotein_t -60°C t0 3,6 - 3,8 21* 130 - 188 771 - 2190
PEGprotein_t +4°C 3m 3,8 - 4,1 170 - 178 2677*
PEGprotein_t +25°C 1m 192 - 226
PEGprotein_t +25°C 3m 4,5 - 4,7 14 - 44 160 - 183
PEGprotein_t +40°C 1m 3,5 - 4,6 17 - 31 113 - 168
* odziv smo zaznali samo v eni od treh ponovitev merjenja vzorca
Preglednica XXI: Vrednosti Rh v nm za vzorce PEGprotein_a
Rh [nm]
vzorec PEGprotein pop1 pop2 pop3
PEGprotein_a -60°C t0 3,0 - 3,1 25 - 52 143 - 216
PEGprotein_a +4°C 3m 3,2 - 3,4 18 - 29 129 - 175
PEGprotein_a +25°C 1m 3,7 - 3,8 16 - 28 140 - 171 2481*
PEGprotein_a +25°C 3m 4,5 - 4,9 22 - 33 144 - 184
PEGprotein_a +40°C 1m 4,2 - 5,5 19 - 33 75 - 159 859*
* odziv smo zaznali samo v eni od treh ponovitev merjenja vzorca
Glede na rezultate meritev DLS lahko reĉemo, da je v vzorcih PEGprotein manj populacij z
izrazito poveĉanimi hidrodinamskimi radiji kot v vzorcih Protein_t. Ta rezultat nakazuje
veĉjo stabilnost vzorcev PEGprotein, kar smo opazili tudi z vsemi drugimi analizami.
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga REZULTATI IN RAZPRAVA
53
4.3 Biološka aktivnost in vitro
Vzorcem temperaturne stabilnosti smo ugotovili biološko aktivnost in vitro s testom za
ugotavljanje biološke aktivnosti in vitro, da bi ugotovili ali se biološka aktivnost in vitro med
potekom stabilitetne študije spreminja. Ugotovili smo, da se biološka aktivnost in vitro
nePEGiliranih (Protein_t) in PEGiliranih vzorcev (PEGprotein_t in PEGprotein_a) pri
povišani temperaturi s ĉasom ohranja (slika 25).
Slika 25: Biološka aktivnost in vitro vzorcev Protein_t; PEGprotein_t in
PEGprotein_a pri, 4 °C, 25 °C in 40 °C
Za vsak vzorec smo biološko aktivnost izmerili v treh paralelkah, rezultati meritev so precej
variabilni, predvsem za PEGilirane vzorce. Znano je, da PEGilacija proteina obiĉajno zniţa
njegovo biološko aktivnost in vitro, naše izmerjene vrednosti biološke aktivnosti in vitro pa so
za PEGilirane vzorce nepriĉakovano višje kot za nePEGilirane. Izmerjena višja biološka
aktivnost in vitro po PEGilaciji bi lahko bila tudi posledica izboljšane topnosti proteina. Gre
za izrazito hidrofoben protein, ki se zlahka adsorbira na stene vial, tako da bi bila lahko
izmerjena razlika pravzaprav posledica odsotnosti adsorpcije na stene vial pri vzorcih
PEGiliranega proteina v primerjavi z nemodificiranim proteinom.
Kljub variabilnosti in razlikam lahko trdimo, da bi s testom zaznali izrazite padce biološke
aktivnosti in vitro kot posledico razliĉnih pogojev shranjevanja za posamezne molekule.
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga REZULTATI IN RAZPRAVA
54
Rezultati kaţejo, da so vzorci po izpostavitvi temperaturnemu stresu ohranili biološko
aktivnost in vitro.
Vsekakor pa bo za doseganje niţje variabilnosti med meritvami in bolj zanesljive rezultate
potreben nadaljnji razvoj testa za merjenje biološke aktivnosti in vitro.
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga ZAKLJUĈEK
55
5. ZAKLJUČEK
V magistrski nalogi smo modelni hidrofobni protein v izbrani formulaciji z dodatkom
trehaloze (Protein_t) primerjali z njegovo PEGilirano razliĉico v formulaciji s trehalozo
(PEGprotein_t) in brez trehaloze (PEGprotein_a). Naš namen je bil ugotoviti, ali PEGilacija
lahko poveĉa stabilnost zelo hidrofobnega proteina. Izvedli smo test temperaturne stabilnosti
pri -60 °C, 4 °C in 25 °C (1 mesec in 3 mesece) ter pri 40 °C (7 dni in 1 mesec). Preverili smo
tudi vpliv stresanja in zamrzovanja / odmrzovanja na stabilnost vzorcev. Uporabili smo
analizne metode HPLC (RPC, CEC, SEC in SEC-MALS), DLS in vzorcem izmerili biološko
aktivnost in vitro.
Izbrani pogoji stresanja in zamrzovanja / odmrzovanja niso imeli vpliva na stabilnost izbranih
vzorcev. Prav tako so bili vzorci stabilni pri -60 °C in 4 °C. V nadaljevanju se zato
osredotoĉamo zgolj na pospešeno temperaturno stabilnost pri 25 °C in 40 °C.
S kromatografskima metodama RPC in CEC smo spremljali ĉistost vzorcev in nastanek
razgradnih produktov. Metodi sta potrdili zašĉitno vlogo PEGilacije, saj se je deleţ glavnega
vrha najbolj zmanjšal vzorcu Protein_t (Slika 5). Zašĉitno delovanje je bilo izrazito pri krajši
izpostavitvi temperaturnemu stresu (25°C 1 mesec in 40 °C 1 teden), medtem ko je ob daljši
izpostavljenosti (25 °C 3 meseci in 40 °C 1 mesec) k stabilnosti pomembno pripomogel tudi
dodatek trehaloze v tekoĉi farmacevtski obliki vzorca PEGprotein_t (slika 10). Glede na
analizo CEC je vzorec brez zašĉitnega sladkorja, PEGprotein_a, ob daljši izpostavljenosti
primerljiv vzorcu Protein_t. Dodatek trehaloze je upoĉasnil tudi nastajanje razgradnih
produktov, ki smo jih na kromatogramih CEC poimenovali VP in verjetno vsebujejo
deamidirane produkte (Slika 14).
Agregacijo vzorcev smo spremljali s tehnikami SEC, SEC-MALS in DLS. Pri rezultatih SEC
moramo upoštevati, da smo analize modelnega proteina in PEGiliranega modelnega proteina
izvajali z razliĉnima metodama, ki sta za posamezno vrsto molekule omogoĉali zanesljivo
detekcijo oligomerov / agregatov. Uporaba enotne metode ni bila mogoĉa, zato rezultatov
vzorcev Protein in PEGprotein ne moremo neposredno primerjati. Iz analize SEC lahko
zakljuĉimo, da ima trehaloza pomembno zašĉitno vlogo pri agregaciji PEGiliranega zelo
hidrofobnega proteina. Deleţ oligomerov / agregatov v vzorcu PEGprotein_a namreĉ kljub
PEGilaciji poraste bistveno bolj kot v vzorcu PEGprotein_t. Kljub temu, da smo uporabili
razliĉni metodi za Protein in PEGprotein, lahko sklepamo tudi na zašĉitno vlogo PEGilacije.
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga ZAKLJUĈEK
56
Deleţ oligomerov / agregatov v vzorcu Protein_t namreĉ kljub prisotnosti trehaloze moĉno
naraste (pribliţno 35 %, Slika 15), medtem ko je deleţ oligomerov / agregatov vzorcu
PEGprotein_t bistveno niţji (nekoliko nad 15 %). Vzorcev Protein brez zašĉitnega sladkorja
nismo testirali, saj je znano, da v optimizirani tekoĉi farmacevtski obliki brez dodatka
trehaloze ni stabilen.
S tehniko MALS smo ugotovili identiteto vrhov, ki jih loĉimo s kromatografijo SEC, v
izhodnih vzorcih. Vrhove z veĉjo molekulsko maso od monomernih molekul smo
poimenovali hMW1 in hMW2. Vrh hMW1 v vzorcu Protein_t predstavlja dimerne molekule
proteina in v vzorcih PEGprotein diPEGilirane dimerne molekule proteina. Vrh hMW2 v vseh
vzorcih predstavlja oligomere / agregate. Med potekom stabilitetne študije se deleţ hMW1 v
vzorcih ni spreminjal, medtem ko se je deleţ hMW2 veĉal. Poveĉevala se je tudi velikost
oligomerov / agregatov v vrhu hMW2, kar je razvidno iz preglednice XV in slike 22 za
Protein_t ter preglednice XVI in slik 23-24 za PEGprotein. Pri vzorcih PEGprotein opazimo
stabilizirajoĉi uĉinek trehaloze. Vzorcem PEGprotein_t se je namreĉ velikost oligomerov /
agregatov nekoliko poveĉala le pri 40 °C, medtem ko se je vzorcem PEG_protein_a izrazito
poveĉala ţe pri 25 °C. Poleg tega je v vzorcih PEGprotein_a pri 25 °C nastala populacija z
bistveno veĉjo molekulsko maso od hMW2, ki smo jo poimenovali hMW3. Glede na velikost
predvidevamo, da so v vrhu hMW3 pravi agregati, medtem ko so v vrhu hMW2 veĉji
oligomeri / agregati. V vzorcih PEGprotein_a, hranjenih pri 40 °C, vrha hMW3 nismo
zaznali. Sklepamo, da so pri tej temperaturi nastali netopni agregati in se niso eluirali s
kolone.
Z DLS smo ugotovili hidrodinamske radije (preglednice XIX –XXI) in polidisperznost
posameznih populacij. Rh monomerov molekul Protein_t je okoli 0,6 nm. Hidrodinamski
radij se s PEGilacijo bistveno poveĉa in je za vzorce PEGprotein okoli 4 nm. Populacije
monomerov so monodisperzne, medtem ko so ostale populacije, poimenovali smo jih pop1 –
pop4, polidisperzne. Rezultati za PEGprotein_a in PEGprotein_t so med seboj primerljivi, v
vzorcih Protein_t pa smo v povpreĉju zaznali veĉje število populacij kot v vzorcih
PEGprotein. Ta razlika bi lahko nakazovala veĉjo stabilnost vzorcev PEGprotein, vendar iz
dobljenih rezultatov DLS ne moremo zagotovo sklepati na zašĉitno delovanje PEGilacije in /
ali trehaloze. V primerjavi z izhodnimi vzorci (t0) so pri stabilitetnih vzorcih vidne predvsem
vmesne populacije oligomerov in trend veĉanja do konĉne velikosti oligomerov / agregatov
(Preglednica XVII).
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga ZAKLJUĈEK
57
Tako vzorci Protein kot tudi PEGprotein so po izpostavitvi temperaturnemu stresu ohranili
biološko aktivnost in vitro.
Z raziskavo smo potrdili izhodišĉno hipotezo magistrske naloge, PEGilacija zašĉitno deluje
pri stabilnosti zelo hidrofobnega proteina v tekoĉi farmacevtski obliki. Za zagotavljanje veĉje
stabilnosti je uĉinkovita predvsem kombinacija PEGilacije in stabilizirajoĉega dodatka, v
našem primeru trehaloze.
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga LITERATURA
58
6. LITERATURA
1. Štrukelj B, Kos J. Biološka zdravila: Od gena do uĉinkovine. Ljubljana. Slovensko
farmacevtsko društvo 2007; 673 str.
2. Kresse GB. Biosimilars - Science, status, and strategic perspective. Eur J Pharm Biopharm.
2009; 72: 479-486.
3. Rader AR. What is a Biopharmaceutical? Part 1: (Bio)Technology - Based Definitions.
BioExecutive Int 2005; 3: 60-65.
4. Wang S. Patent search on biologics as potentioal biosimilar candidates. World Patent
Inform 2011; 33: 67-71.
5. Direktiva 2004/27/ES. http://ec.europa.eu/health/files/eudralex/vol-
1/dir_2004_27/dir_2004_27_en.pdf. Dostop: september 2011.
6. Evropska agencija za zdravila.
http://www.ema.europa.eu/ema/index.jsp?curl=%2Fpages%2Fmedicines%2Flanding%2Fe
par_search.jsp&murl=menus%2Fmedicines%2Fmedicines.jsp&mid=WC0b01ac058001d1
24&searchTab=searchByAuthType&alreadyLoaded=true&isNewQuery=true&status=Aut
horised&status=Withdrawn&status=Suspended&status=Refused&keyword=Enter+keywor
ds&searchType=name&taxonomyPath=&treeNumber=&searchGenericType=biosimilars&
genericsKeywordSearch=Submit. Dostop: september 2011.
7. Rader AR. What is a generic Biopharmaceutical? Biopharmaceutical? Biogeneric? Follow-
on protein? Biosimilar? Follow-on biologic? Bioproc Intl 2007; 3: 28-38.
8. Zuniga L, Calvo B. Biosimilars approval process. Regul Toxicol Pharmacol 2010; 56: 374-
377.
9. Walsh G. Second-generation biopharmaceuticals. Eur J Pharm Biopharm 2004; 58: 185-
196.
10. Jevševar S, Kunstelj M, Gaberc Porekar V. PEGylation of therapeutic proteins. Biotechnol
J 2010; 5: 113-128.
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga LITERATURA
59
11. Kang JS, DeLuca PP, Lee KC. Emerging PEGylated drugs. Expert Opin Emerg Drugs
2009; 14: 363-380.
12. Roberts MJ, Bentley MD, Harris JM. Chemistry for peptide and protein PEGylation. Adv
Drug Deliv Rev 2002; 54: 459-476.
13. Hawe A, Friess W. Formulation development for hydrophobic therapeutic proteins.
Pharmaceut Dev Tech 2007; 12: 223-237.
14. Jorgensen L, Hostrup S, Horn Moeller E, Grohganz H. Recent trends in stabilising peptides
and proteins in pharmaceutical formulation – considerations in the choice of excipients.
Expert Opin Drug Deliv 2009; 6: 1219-1230.
15. Wang W. Instability, stabilization, and formulation of liquid protein pharmaceuticals. Int J
Pharm 1999; 185: 129-188.
16. Fidler K. Priprava in opredelitev dimerov Met-G-CSF in pegiliranih konjugatov.
Doktorska disertacija 2011. Univerza v Ljubljani, Medicinska fakulteta, Ljubljana.
17. Smilović V, Caserman S, Fonda I, Gaberc-Porekar V, Menart V. A novel reporter gene
assay for interferons based on CHO-K1 cells. J Immunol Meth 2008; 333: 192–196.
18. Bojardim CA, Ferreira PCP, Kroon EG. Interferons: Signaling, antiviral and viral evasion.
Immunol Lett 2009; 122: 1-11.
19. Pestka S, Krause CD, Walter MR. Interferons, interferonn-like cytokines, and their
receptors. Immunol Rev 2004; 202: 8-32.
20. Radhakrishnan R, Walter LJ, Hruza A, Reichert P, Trotta PP, Nagabhushan TL, Walter
MR. Zinc mediated dimer of human interferon-alpha 2b revealed by X-ray crystallography.
Structure 1996; 4: 1453-1463.
21. Karpusas M, Nolte M, Benton CB, Meier W, Lipscomb WN, Goelz S. The crystal structure
of human interferon beta at 2.2-A resolution. Proc Natl Acad Sci Unit States Am 1997; 94:
11813-11818.
22. Anderlini P, Przepiorka D, Champlin R, Korbling M. Biologic and clinical effects of
granulocyte colony-stimulating factor in normal individuals. Blood 1996; 88: 2819–2825.
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga LITERATURA
60
23. Crommelin DJA. Sindelar RD. Pharmaceutical biotehnology: An introduction for
pharmacists and pharmaceuticals scientists. Amsterdam, Harwood Academic Publishers
1997; 425 str.
24. Herron JN, Jiskoot W, Crommelin DJA. Chromatographic techniques for the
characterization of proteins. New York in London, Plenum Press 1995; 362 str.
25. Liu J, Andya JD, Shire SJ. A critical review of analytical ultracentrifugation and field flow
fractionation methods for measuring protein aggregation. AAPS J 2006; 8: E580-E589.
26. Fraunhofer W, Winter G. The use of asymmetrical flow field-flow fractionation in
pharmaceutics and biopharmaceutics. Eur J Pharm Biopharm 2004; 58: 369-383.
27. Messaud FA, Sanderson RD, Runyon JR, Otte T, Pasch H, Ratanathanawongs Williams
SK. An overview on field-flow fractionation techniques and their applications in the
separation and characterization of polymers. Progr Polymer Sci 2009; 34: 351-368.
28. Pekar A, Sukumar M. Quantitation of aggregates in therapeutic proteins using
sedimentation velocity analytical ultracentrifugation: Practical considerations that affect
precision and accuracy. Anal Biochem 2007; 367: 225-237.
29. Ye H. Simultaneous determination of protein aggregation, degradation, and absolute
molecular weight by size exclusion chromatography–multiangle laser light scattering. Anal
Biochem 2006; 356: 76-85.
30. Astra V User’s Guide 2008, Version 5.3.4 (M1000Rev. H). Wyatt Technology corporation
31. Tarazona MP, Saiz E. Combination of SE/MALS experimental procedures and theoretical
analysis for studying the solution properties of macromolecules. J Biochem Biophys Meth
2003; 56: 95-116.
32. Sipanje svetlobe. http://www.ias.ac.in/initiat/sci_ed/resources/chemistry/LightScat.pdf.
Dostop: september 2011.
33. Predstavitev seminar Wyatt. http://www.wyatt.eu/index.php?id=wyatt-seminar-
presentations. Dostop: september 2011.
Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga LITERATURA
61
34. Wyatt PJ. Light scattering and the absolute characterization of macromolecules. Anal
Chim Acta 193; 272: 1-40.
35. Kusterle M, Jevševar S, Gaberc Porekar V. Size of pegylated protein conjugates studied by
various methods. Acta Chim Sloven 2008; 55: 594-601.
36. Arzenšek D. Proteinske interakcije v elektrolitskih raztopinah. Diplomsko delo 2010.
Univerza v Ljubljani, Fakulteta za matematiko in fiziko, Ljubljana
37. Dynamic Light Scattering: An Introduction in 30 minutes, Technical note, MRK656-01,
http://www.malvern.com, september 2011
38. Berne BJ, Pecora R. Dynamic light scattering: With application to chemistry, Biology and
Physics. New York, Dover Publications, Inc 2000; str. 376.
39. Intensity – Volume – Number, Which Size Is Correct? Technical note, MRK1357-01.
http://www.malvern.com. Dostop: september 2011.
40. What Is The Z-average? Frequently asked questions. http://www.malvern.com. Dostop:
september 2011.
41. What Does Polydispersity Mean? Frequently asked questions. http://www.malvern.com.
Dostop: september 2011.
42. Bernat BA, Lefers MA, Sanchez JC. Analysis of PEGylated Protein by Tetra Detection
Size Exclusion Chromatography. BioPharm Int Suppl 2011; 8: 10-14.
43. Filpula D, Zhao H. Releasable PEGylation of proteins with customized linkers. Adv Drug
Deliv Rev 2007; 60: 29-49.