zaŠČitna vloga pegilacije pri stabilnosti zelo ...€¦ · fff pretoni sistem za loevanje...

KARMEN ĈERKIĆ

ZAŠČITNA VLOGA PEGILACIJE PRI STABILNOSTI

ZELO HIDROFOBNEGA PROTEINA V TEKOČI

FARMACEVTSKI OBLIKI

PROTECTIVE ROLE OF PEGYLATION ON

STABILITY OF VERY HYDROPHOBIC PROTEIN IN

LIQUID PHARMACEUTICAL FORMULATION

MAGISTRSKA NALOGA

Ljubljana, 2012

I

Magistrsko delo sem opravljala v podjetju Lek, ĉlan skupine Sandoz (Biofarmacevtika, Nove

generacije proteinov, meritve DLS na oddelku Razvoj izolacij). Ugotavljanje biološke

aktivnosti sem izvedla na Kemijskem inštitutu v Laboratoriju za biosintezo in

biotransformacijo v Ljubljani.

Zahvala

Za neprecenljivo strokovno pomoč pri izdelavi magistrske naloge se zahvaljujem dr. Simoni

Jevševar in dr. Katarini Fidler.

Zahvaljujem se tudi mentorju prof. dr. Urošu Urlebu za srkrben pregled magistrske naloge in

koristne napotke. Hvala tudi predsedniku komisije prof. dr. Stanku Srčiču in članu komisije

doc. dr. Damjanu Janešu za pregled dela.

Za pomoč pri izvedbi BA testov se zahvaljujem Maji Marušič in za pomoč pri izvedbi DLS

meritev hvala Dejanu Arzenšku.

Zahvaljujem se tudi vsem sodelavcem, ki so me spodbujali med nastankom magistrske naloge.

Hvala tudi vsem sorodnikom in prijateljem, ki ste verjemi vame.

Izjava:

Izjavljam, da sem magistrsko delo samostojno izdelala pod mentorstvom prof. dr. Uroša

Urleba, mag.farm.

Karmen Ĉerkić

Predsednik komisije: prof. dr. Stanko Srĉiĉ, mag. farm.

Ĉlan komisije: doc. dr. Damjan Janeš, mag. farm.

Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga KAZALO VSEBINE

II

KAZALO VSEBINE

1. UVOD ................................................................................................................................ 1

1.1 BIOLOŠKA ZDRAVILA ............................................................................................ 1

1.1.1 Podobna biološka zdravila ................................................................................... 1

1.1.2 Druga generacija bioloških zdravil....................................................................... 3

1.2 PEGILACIJA ............................................................................................................... 3

1.2.1 Reagenti PEG ....................................................................................................... 5

1.2.1.1 Prva in druga generacija reagentov PEG ...................................................... 5

1.2.2 Kemija PEGilacije ................................................................................................ 6

1.3 HIDROFOBNI PROTEINI: izziv za stabilno konĉno farmacevtsko obliko ............... 7

1.3.1 Primeri hidrofobnih proteinov .............................................................................. 9

1.4 STABILNOST PROTEINOV ................................................................................... 11

1.4.1 Kemijska stabilnost proteinov ............................................................................ 11

1.4.2 Fizikalna stabilnost proteinov ............................................................................ 12

1.4.3 Stabilizacija proteinov ........................................................................................ 13

1.5 KARAKTERIZACIJA AGREGATOV .................................................................... 14

1.5.1 Gelska filtracija .................................................................................................. 14

1.5.2 Pretoĉni sistem za loĉevanje makromolekul po velikosti (FFF) ........................ 15

1.5.3 Analizno ultracentrifugiranje ............................................................................. 15

1.5.4 MALS, tehnika statiĉnega sipanja svetlobe ....................................................... 16

1.5.4.1 Izraĉun molekulske mase ............................................................................ 17

1.5.5 DLS, tehnika dinamiĉnega sipanja svetlobe ...................................................... 19

2. NAMEN DELA ................................................................................................................ 22

3. MATERIALI IN METODE ............................................................................................. 23

3.1 MATERIALI ............................................................................................................. 23

3.1.1 Kemikalije .......................................................................................................... 23

3.1.2 Voda ................................................................................................................... 24

3.1.3 Raztopine in pufri ............................................................................................... 24

3.1.4 Vzorci (izvor, sestava, kakovost) ....................................................................... 25

3.1.5 Standardi ............................................................................................................. 25

3.1.6 Kromatografske kolone za analizno kromatografijo .......................................... 25

3.2 METODE ................................................................................................................... 26

3.2.1 Oprema ............................................................................................................... 26

3.2.2 Priprava konĉnih vzorcev za stabilnost: zamenjava pufra, koncentriranje in

sterilna filtracija ................................................................................................................ 27

3.2.2.1 Merjenje koncentracij z UV spektrofotometrom ........................................ 27

Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga KAZALO VSEBINE

III

3.2.3 Stabilnost: naĉrt in koliĉine vzorcev .................................................................. 28

3.2.4 Analizna kromatografija ..................................................................................... 29

3.2.4.1 Kromatografija na reverzni fazi (RPC) ....................................................... 29

3.2.4.2 Kationsko-izmenjevalna kromatografija (CEC) ......................................... 30

3.2.4.3 Gelska kromatografija (SEC) ...................................................................... 31

3.2.4.4 SEC-MALS ................................................................................................. 31

3.2.5 DLS, tehnika dinamiĉnega sipanja svetlobe ...................................................... 32

3.2.6 Ugotavljanje biološke aktivnosti in vitro ........................................................... 32

4. REZULTATI IN RAZPRAVA ........................................................................................ 34

4.1 Analizna kromatografija ............................................................................................ 34

4.1.1 Ĉistost RPC ........................................................................................................ 34

4.1.2 Ĉistost CEC ........................................................................................................ 37

4.1.3 Ĉistost SEC ........................................................................................................ 40

4.1.4 Ugotavljanje molekulske mase s SEC-MALS ................................................... 43

4.1.4.1 Ugotavljanje molekulske mase izhodnih vzorcev ....................................... 44

4.1.4.2 Ugotavljanje molekulske mase stabilitetnih vzorcev .................................. 46

4.2 DLS ............................................................................................................................ 49

4.3 Biološka aktivnost in vitro ......................................................................................... 53

5. ZAKLJUĈEK ................................................................................................................... 55

6. LITERATURA ................................................................................................................. 58

Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga POVZETEK

IV

POVZETEK

Razvoj tekoĉe farmacevtske oblike za zelo hidrofobne proteine je zahteven proces, saj so

zaradi slabe topnosti nagnjeni k agregaciji. Agregati so pogosto imunogeni in njihova

dovoljena vsebnost v biofarmacevtskih izdelkih je strogo omejena. Dodajanje ekscipientov

(na primer sladkorjev) je najpogostejši naĉin stabilizacije proteinov v tekoĉi farmacevtski

obliki. Drug uspešen pristop bi lahko bila PEGilacija. V prvi vrsti je PEGilacija proteinov

namenjena podaljšanju razpolovnega ĉasa v telesu, kar privede do izboljšanih

farmakokinetiĉnih in farmakodinamiĉnih lastnosti molekule. Vendar konjugacija proteina z

verigo polietilenglikola (PEG) prinaša tudi druge prednosti, kot je izboljšana topnost v vodi

oziroma izbrani formulaciji. To je še posebej pomembno pri zelo hidrofobnih proteinih.

V magistrski nalogi smo izvedli študijo stresne stabilnosti in na modelnem zelo hidrofobnem

proteinu preuĉili zašĉitno vlogo PEGilacije na nastanek agregatov. Dodatno smo preuĉili tudi

uĉinek ekscipienta, sladkorja trehaloze. Naša izhodišĉna hipoteza je bila, da bo PEGilacija

izboljšala stabilnost modelnega proteina. Modelni protein (Protein_t), v optimirani tekoĉi

farmacevtski obliki z dodatkom trehaloze smo primerjali s PEGiliranim proteinom

(PEGprotein) v dveh razliĉnih tekoĉih farmacevtskih oblikah in sicer z dodatkom trehaloze

(PEGprotein_t) in brez (PEGprotein_a). Stabilitetna študija je vkljuĉevala temperaturno

stabilnost (-60 °C, 4 °C, 25 °C in 40 °C), cikle zamrzovanja / odmrzovanja in striţne sile

(stresanje). Stabilnost vzorcev je bila ocenjena s standardnimi tehnikami HPLC RPC in CEC.

Agregacija je bila ovrednotena s tehniko dinamiĉnega sipanja svetlobe (DLS) in tehniko

HPLC SEC, sklopljeno z merjenjem statiĉnega sipanja svetlobe (SEC-MALS). Ocenili smo

tudi vpliv stresnih pogojev na biološko aktivnost in vitro.

Razlike v stabilnosti smo zaznali pri pogojih pospešene stabilnosti, pri 25 °C in 40 °C. Glede

na analize RPC in CEC, je bil nastanek razgradnih produktov v obeh PEGiliranih razliĉicah

poĉasnejši in analiza SEC je nakazala poĉasnejšo agregacijo PEGiliranih molekul.

Kombinacija PEGilacije in dodatka trehaloze je prinesla dodaten stabilizirajoĉi uĉinek. Z DLS

smo v vzorcih Protein_t v povpreĉju zaznali veĉje število populacij razliĉnih velikosti kot v

vzorcih PEGprotein, kar ravno tako kaţe na veĉjo stabilnost vzorcev PEGprotein. Raziskava

je potrdila našo izhodišĉno hipotezo, PEGilacija ima zašĉitno vlogo v stabilnosti zelo

hidrofobnega proteina v tekoĉi farmacevtski obliki. Vsi vzorci, tako Protein_t kot tudi

PEGprotein, so po izpostavitvi temperaturnemu stresu ohranili biološko aktivnost in vitro.

Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga ABSTRACT

V

ABSTRACT

Very hydrophobic proteins are especially demanding regarding the development of liquid

pharmaceutical formulations, mainly due to their low solubility which makes them prone to

aggregation. Aggregates may elicit immune response in patients and their acceptable content

in the final drug product is strictly limited. The most common method for protein stabilization

in liquid formulations is addition of excipients (e.g. sugars). Another successful approach

could be PEGylation. Protein PEGylation is primarily being introduced in cases where

improved pharmacokinetic and pharmacodynamic properties arising from the prolonged

elimination half-life are envisaged. But protein conjugation to the polyethylene glycol (PEG)

chain also brings other benefits, such as increased solubility, which is particularly important

when dealing with very hydrophobic proteins.

In the MSc thesis we have performed a stress stability study of a highly hydrophobic model

protein and tested a protective role of PEGylation on aggregation. Additionally, the effect of

sugar excipient (trehalose) was tested. Our initial hypothesis was that PEGylation will

improve stability of the model protein. The model protein (Protein_t) in an optimised liquid

pharmaceutical formulation containing trehalose was compared to the PEGylated protein

(PEGprotein) in two different liquid pharmaceutical formulations, with (PEGprotein_t) and

without (PEGprotein_a) trehalose. The stability studies included temperature stability (-60

°C, 4 °C, 25 °C and 40 °C), freeze/thaw cycles and sheer forces (shaking). Stability of the

tested samples was evaluated with standard HPLC techniques RPC and CEC. Aggregation

was evaluated using dynamic light scattering (DLS) and HPLC technique SEC coupled to

static light scattering (SEC-MALS). The influence of stress conditions to the in vitro

biological activity was also evaluated.

Differences in stability were observed at accelerated stability conditions, 25 °C and 40 °C.

According to RPC and CEC the formation of degradation products was slower for both

PEGprotein variants and SEC indicates slower formation of aggregates in PEGylated

molecules. A combination of PEGylation and the addition of trehalose proved to ensure an

even greater stabilizing effect. DLS in average detected a larger number of different size

populations in the Protein_t samples than in the PEGprotein samples, which also indicates a

higher stability of PEGprotein samples. The research confirmed our initial hypothesis,

PEGylation plays a protective role in the stability of the very hydrophobic protein in the liquid

pharmaceutical formulation. Both Protein_t and PEGprotein samples retained their in vitro

biological activities after exposure to temperature stress.

Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga OKRAJŠAVE IN SIMBOLI

VI

OKRAJŠAVE IN SIMBOLI

ACN acetonitril

Asn asparagin

BA biološka aktivnost

BSA goveji serumski albumin

(angl. Bovine Serum Albumin)

c koncentracija (mol/l)

CE-HPLC (CEC) kationsko-izmenjevalna kromatografija

Da dalton: enota za molekulsko maso, ki ustreza 1/12 mase ĉistega izotopa

12C

DLS dinamiĉno sipanje svetlobe

(angl. Dynamic Light-Scattering)

DNA deoksiribonukleinska kislina

EMA Evropska agencija za zdravila

(angl. European Medicines Agency)

FDA Ameriška agencija za hrano in zdravila

(angl. Food and Drug Administration)

FFF pretoĉni sistem za loĉevanje makromolekul po velikosti

(angl. Field Flow Fractionation)

FFFF pretoĉni sistem za loĉevanje makromolekul po velikosti z uporabo

preĉnega pretoka FFFF ali F4

(angl. Flow Field-Flow Fractionation)

G-CSF granulocitne kolonije stimulirajoĉi faktor

(angl. Granulocyte Colony Stimulating Factor)

HIFBS toplotno inaktiviran fetalni goveji serum

(angl. Heat Inactivated Fetal Bovine Serum)

HPLC tekoĉinska kromatografija visoke loĉljivosti

(angl. High Performance Liquid Chromatography)

HSA humani serumski albumin

(angl. Human Serum Albumin)

IFN interferon

IL interlevkin

Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga OKRAJŠAVE IN SIMBOLI

VII

INN mednarodno nelastniško ime

(angl. International Nonproprietary Name)

MALS sipanje svetlobe pri veĉih kotih

(angl. Multi-Angle Light Scatter)

MW molekulska masa v Da

(angl. Molecular Weight)

PAS površinsko aktivna snov

PD polidisperznost

PEG polietilenglikol

pNPP 4-nitrofenil fosfat dinatrijev heksahidrat

(angl. 4-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahidrate)

pH negativni logaritem koncentracije vodikovih ionov

RI lomni koliĉnik

(angl. Refractive Index).

RNA ribonukleinska kislina

RP-HPLC (RPC) kromatografija na reverzni fazi

rpm število obratov na minuto

(angl. revolutions per minute)

RT sobna temperatura

(angl. Room Temeprature)

SE-HPLC (SEC) gelska kromatografija

t ĉas (s, min, h)

T temperatura (°C, K)

TNF-α dejavnik tumorske nekroze alfa

(angl. Tumor Necrosis Factor)

Thr treonin

VEGF ţilni rastni dejavnik

(angl. Vascular Endothelial Growth Factor)

Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga UVOD

1

1. UVOD

1.1 BIOLOŠKA ZDRAVILA

Farmacevtska biotehnologija je v zadnjem desetletju podroĉje farmacevtske industrije, ki se

najhitreje razvija. Z odobritvijo prvega biološkega zdravila inzulina leta 1982 in z nadaljnim

razvojem bioloških zdravil so se odprle nove poti zdravljenja in prepreĉevanja bolezni, za

katere prej niso poznali primerne terapije (1, 2).

Biološka zdravila se od klasiĉnih zdravil razlikujejo predvsem zaradi visoke molekulske

mase, kompleksne tridimenzionalne zgradbe in pridobivanja s pomoĉjo ţivih organizmov.

Zanimiv je podatek, da se trţni deleţ bioloških zdravil poveĉuje kar dvakrat hitreje kot pri

klasiĉnih zdravilih (1).

Biološka zdravila razdelimo v pet skupin glede na sestavo, izvor in naĉin pridobivanja in sicer

na biološka zdravila pridobljena z izolacijo (naravni in ĉloveški hormoni, uĉinkovine iz

rastlin, kri in krvni proizvodi ter klasiĉna cepiva), biološka zdravila pridobljena s sintezo

(sintezni peptidi), genska zdravila (terapevtski geni vneseni z virusnim ali nevirusnim

transportnim sistemom, uĉinkovine RNAi, ribocimi, protismiselne (angl. antisense) molekule

RNA), monoklonska protitelesa in rekombinantna biološka zdravila, ki so najveĉja skupina

bioloških zdravil (1, 2).

1.1.1 Podobna biološka zdravila

Pri klasiĉnih zdravilih je pojem generiĉno zdravilo jasen: to je zdravilo, ki vsebuje enako

uĉinkovino v enaki farmacevtski obliki in se tudi po jakosti, kakovosti, varnosti in

uĉinkovitosti ne razlikuje od originalnega zdravila, kar proizvajalec generiĉnega zdravila

dokaţe z bioekvivalenĉnimi raziskavami. Pri bioloških zdravilih pa lahko reĉemo, da ni

generikov, zato so agencije EMA in FDA uvedle izraz podobna biološka zdravila (angl.

Biosimilars). Skoraj nemogoĉe je namreĉ izdelati popolnoma enako biološko zdravilo, saj ţe

minimalne spremembe v procesu izdelave lahko vodijo do velikih razlik v zgradbi

uĉinkovine. Razlogi zato so kompleksnost biološke molekule (velikost, struktura, stabilnost,

nastanek sprememb v zgradbi med procesom kot so npr. glikozilacija, oksidacija,

deamidacija, proces denaturacije in agregacije kot posledica reakcije s pomoţnimi snovmi),


2

uporaba ţivih organizmov za proizvodnjo uĉinkovine (ti so lahko zelo obĉutljivi na majhne

spremembe v procesu) in zapleten proces proizvodnje zdravila (priprava genskega konstrukta,

vstavljanje konstrukta v celice, rast celic v velikih reaktorjih, izolacija in ĉišĉenje produkta,

konĉna formulacija produkta in na koncu izbira primerne ovojnine za skladišĉenje in

aplikacijo zdravila). Vse te korake mora ponoviti tudi izdelovalec podobnega biološkega

zdravila, pri ĉem je najbolj zahteven korak priprava enake celiĉne banke, s pomoĉjo katere

pridobi enak produkt (1, 2).

Podobna biološka zdravila pa morajo ne glede na kompleksnost izdelave imeti primerljivo

kakovost, uĉinkovitost in varnost, kar proizvajalci podobnega biološkega zdravila dokaţejo z

lastnimi predkliniĉnimi in kliniĉnimi študijami, ki pa so obiĉajno manj obseţne kot študije

originatorskega biološkega zdravila (v skladu z Direktivo 2004/27/ES) (1, 4, 5).

Preboj na trg je za podobna biološka zdravila mnogo teţji kot za navadna generiĉna zdravila,

predvsem zaradi višjih stroškov kliniĉnih raziskav, zato je malo farmacevtskih podjetij

sposobnih proizvesti tako zdravilo (1). Trenutno se na trgu nahaja nekaj podobnih bioloških

zdravil, kar je prikazano v preglednici I.

Preglednica I: Odobrena podobna biološka zdravila v Evropi, status september 2011 (6)

INN ime Podobno biološko

zdravilo

Proizvajalec Referenčni

produkt

Datum

oddobritve

Somatropin Omnitrope® Sandoz Genotropin April, 2006

Somatropin Valtropin® Biopartners Humatrope April, 2006

Epoetin alfa Binocrit® Sandoz Erypo/Eprex Avgust, 2007

Epoetin alfa Epoetin alfa Hexal® Hexal Erypo/Eprex Avgust, 2007

Epoetin alfa Abseamed® Medice Erypo/Eprex Avgust, 2007

Epoetin zeta Silapo® Stada Erypo/Eprex December, 2007

Epoetin zeta Retacrit® Hospira Erypo/Eprex December, 2007

Filgrastim Ratiograstim® Ratiopharm Neupogen September, 2008

Filgrastim Tevagrastim® Teva Neupogen September, 2008

Filgrastim Biograstim® CT

Arzneimittel

Neupogen September, 2008

Filgrastim Filgrastim ratiopharm® Ratiopharm Neupogen September, 2008

Filgrastim Zarzio® Sandoz Neupogen Februar, 2009

Filgrastim Filgrastim Hexal® Hexal Neupogen Februar, 2009

Filgrastim Nivestim® Hospira Neupogen Junij, 2010


3

1.1.2 Druga generacija bioloških zdravil

V zadnjih letih razvoj bioloških zdravil teţi predvsem k izboljšanju lastnosti proteinov prve

generacije za dosego ţelenih farmakokinetiĉnih in farmakodinamiĉnih lastnosti. Podjetja se

odloĉajo za razvoj druge generacije bioloških zdravil zaradi medicinskih potreb, izboljšano

delovanje zdravila jim olajša prodor na trg, izognejo se tudi ĉakanju na iztek patentov (2).

Pri prvi generaciji bioloških zdravil gre predvsem za monoklonska protitelesa in biološka

zdravila, ki posnemajo ĉloveku lastne proteine (9, 10). Biološka zdravila druge generacije

imajo lahko spremenjeno farmacevtsko obliko, naĉin aplikacije ali profil uĉinkovitosti (1). Ta

zdravila so razvili z namenom izboljšati farmakokinetiĉne, farmakodinamske in imunološke

lastnosti, kot so podaljšanje razpolovnega ĉasa, manj pogost vnos zdravila (velja predvsem za

PEGilirane produkte), zmanjšana imunogenost, izboljšana topnost in stabilnost, zmanjšana

toksiĉnost in bolj prijazen naĉin vnosa zdravila (npr. inhalacijski inzulin) (1, 9).

Danes obstaja ţe kar nekaj naĉinov priprave bioloških zdravil druge generacije, kot so

spremembe aminokislinskega zaporedja (npr. druge generacije inzulinov), spremembe

glikokomponent (pri glikoziliranih proteinih, kot je epoetin), fuzije z drugimi proteini (npr.

Etanercept, Alefacept), novi dostavni sistemi (nanodelci, liposomi) ali pa postprodukcijske

spremembe, kot so konjugacije z naravnimi ali sintetiĉnimi polimeri (PEGilacija,

HESilacija®, polisialilacija) (npr. PEGiliran filgrastim) (9, 10).

1.2 PEGILACIJA

Z izrazom PEGilacija oznaĉujemo vezavo ene ali veĉ verig polietilenglikola razliĉnih

velikosti na proteine, peptide, oligonukleotide ali majhne organske molekule. Tehnologija je

ţe dobro uveljavljena in se zelo hitro razvija. Na trgu je ţe prisotnih nekaj PEGiliranih

zdravilnih uĉinkovin, kar dokazuje uĉinkovitost in varnost tako pripravljenih zdravil. Prvo

tako zdravilo je FDA oddobrila leta 1990, gre za PEGilirano obliko adenozin deaminaze

(Adagen®, Enzon Pharmaceuticals, ZDA), ki se uporablja pri zdravljenju hude kombinirane

imunske bolezni (angl. SCID, severe combined immunodeficiency). V preglednici II je

pregled PEGiliranih zdravil, ki se nahajajo na trgu (10).


4

Preglednica II: Pregled PEGiliranih produktov na trgu (10, 11)

Učinkovina Lastniško

ime

Podjetje Indikacija Leto

registracije

Adenozin deamidaza Adagen®, Enzon

Pharmaceuticals

huda kombinirana

imunska bolezen

1990

Asparaginaza Oncaspar® Enzon

Pharmaceuticals

akutna limfoblastna

levkemija

1994

Interferon α-2b PegIntron® Schering-Plough hepatitis C 2000

Interferon α-2a Pegasys® Hoffman-

LaRoche

hepatitis C 2002

GCSF Neulasta® Amgen nevtropenija 2002

Rastni hormon Somavert® Pfizer akromegalija 2002

VEGF

Oligonukleotid

Macugen® Pfizer oĉesno ţilne bolezni 2004

Eritropoetin Mircera® Hoffman-

LaRoche

anemija zaradi kroniĉne

odpovedi ledvic

2007

Fragment anti-TNF-

α monoklonskega

protitelesa

Cimzia® UCB Pharma Crohnova bolezen,

revmatoidni artritis

2008

2009

Sesalska uratna

oksidaza

Krystexxa®

Savient

Pharmaceuticals

kroniĉni protin (putika) 2010

Razlogi za PEGilacijo proteinov so zašĉita imunogenih delov molekule, prepreĉevanje

razgradnje s proteolitiĉnimi encimi, zmanjšana ledviĉna filtracija, podaljšan biološki

razpolovni ĉas, zmanjšana toksiĉnost, veĉja stabilnost zdravila, spremenjen farmakokinetiĉni

in farmakodinamiĉni profil. Glavna pomankljivost PEGilacije je zmanjšana biološka aktivnost

zdravila in vitro, kar pa kompenziramo z izboljšanimi farmakokinetiĉnimi lastnostmi in vivo.

Vse te spremembe lahko reguliramo tudi z izbiro:

velikosti in strukture PEG-a,

števila verig PEG, ki jih pripnemo na protein,

mesta pripetja PEG-a na protein,

vrste reakcije PEGilacije (12).


5

1.2.1 Reagenti PEG

Polietilenglikol je dobro uveljavljen in preuĉen polimer za kovaletno pripetje na protein. PEG

je nevtralen, kemiĉno inerten, netoksiĉen, neimunogen hidrofilen polimer. Komercialno

dostopni so linerani reagenti PEG z molekulsko maso do 40 kDa, medtem ko so razvejani

PEG-i dostopni do 80 kDa. Taki reagenti PEG imajo še ustrezno kvaliteto za uporabo pri

izdelavi bioloških zdravil. PEG je topen v vodi in v nekaterih organskih topilih (12).

Na trgu so komercialno dostopni reagenti PEG razliĉnih dolţin in oblik (linearen, razvejan).

Aktivirani so z razliĉnimi fukcionalnimi skupinami, kar jim omogoĉa pripenjanje na protein.

Komercialna podjetja, ki proizvajajo reagente PEG, so NOF Corporation (Japonska), SunBio

(Juţna Koreja), Dr. Reddy’s (Velika Britanija), JenKem (Kitajska), Creative PEGWorks

(USA) in drugi (10).

Reagenti PEG niso biorazgradljivi, kar je njihova najveĉja pomankljivost. V ĉlankih poroĉajo,

da se reagenti PEG razgradijo z alkoholno ali aldehidno dehidrogenazo in/ali se encimsko

oksidirajo s citokromom P450 v omejenih koliĉinah. PEG-i, manjši od 20 kDa, se iz telesa

izloĉijo z ledviĉno filtracijo, molekule z veĉjo molekulsko maso pa se iz telesa izloĉajo po

drugih poteh (skozi jetra, prek imunskega sistema, izloĉanje s pomoĉjo proteoliznih encimov)

(10, 12).

1.2.1.1 Prva in druga generacija reagentov PEG

Zaradi pomankljivosti prve generacije reagentov PEG so razvili reagente PEG druge

generacije z izboljšanimi lastnostmi. Najbolj znaĉilne pomankljivosti reagentov PEG prve

generacije so kratke ( 12 kDa) in linerane verige, velika polidisperznost, prisotnost

deaktiviranega reagenta PEG, difukcionalnost reagenta (na obeh koncih verige se nahaja

funkcionalna skupina), tvorba nestabilnih konjugatov in neselektivnost mesta konjugacije

(12).

Z drugo generacijo reagentov PEG so rešili teţavo difukcionalnosti PEG-a z uporabo metoksi

PEG-a, ki ima eno hidroksilno skupino zašĉiteno (metilirano), zato tam ne poteĉe aktivacija

verige PEG. Selektivnost reakcije je izboljšana tudi z uporabo daljših in razvejanih reagentov

PEG, ter z uporabo novih kemizmov in naĉinov pripetja verige PEG na protein, ki zvišujejo

selektivnost mesta konjugacije. Selektivnost konjugacije lahko še izboljšamo s spremembo


6

reakcijskih pogojev, kot so pH, molarno razmerje med proteinom in reagentom PEG,

koncentracija reaktantov, temperatura ter ĉas reakcije (12).

1.2.2 Kemija PEGilacije

Verige PEG morajo imeti za pripetje na protein aktivirano funkcionalno skupino na koncu

verige (ali na obeh koncih verige v primeru difunkcionalnih PEG-ov). Vrsta funkcionalne

skupine, ki jo izberemo, je odvisna od reaktivne skupine na proteinu.

Reaktivne skupine aminokislin, znaĉilne za proteine, so -NH2, -NH-, -COOH, -OH, -SH, kot

tudi disulfidnih vezi (-S-S-) (12).

Za izbiro primernega mehanizma reakcije moramo natanĉno preuĉiti protein, upoštevati

moramo stabilnost proteina pri reakcijskih pogojih. Izbrati moramo primerno mesto za

konjugacijo, ki bo v najveĉji meri ohranila biološko funkcijo proteina.

V grobem poznamo dva mehanizma reakcij: nespecifiĉne (nakljuĉne) in mestno-specifiĉne

PEGilacije. Pri nespecifiĉni PEGilaciji za mesto pripetja na proteinu pogosto uporabljamo

amino skupino in ε-amino skupine na stranskih verigah lizinskih ostankov. Lizini so v

proteinih zelo pogosti in se obiĉajno nahajajo na površini, zato so lahko dostopni za reakcijo z

reagentom PEG. Take reakcije poteĉejo hitro in kot rezultat dobimo kompleksno mešanico

konjugatov, ki se med seboj razlikujejo po številu in mestu pripetja verige PEG. Prva

PEGilirana produkta na trgu PEGilirana oblika adenozin deaminaze (Adagen®) in PEGilirana

asparaginaza (Oncaspar®) sta pripravljena z nespecifiĉno PEGilacijo. Tudi PEGiliran

interferon α-2b, interferon α-2a, rastni hormon in eritropoetin (PegIntron®, Pegasys®,

Somavert® in Mircera®) so kompleksne mešanice PEGiliranih proteinov (10, 11).

Vodilo za uvedbo nove mestno-specifiĉne PEGilacije so bolj definirani produkti. Kot mestno-

specifiĉna PEGilacija se velikokrat omenja PEGilacija na N-koncu z reduktivnim alkiliranjem

z aldehidnim reagentom PEG in uporabo reducenta. Tak primer je je mono-PEGiliran G-CSF

z 20 kDa linearnim aldehidnim reagentom PEG na N-koncu (Neulasta®

). Naslednji, ravno

tako znan princip, je PEGilacija na tiolni skupini na cisteinu (ta je lahko naravno prisoten ali

uveden z metodami genskega inţenirstva). V ta namen uporabljamo maleimidne, piridil

disulfidne, vinilsufonske in druge reagente PEG. Poleg PEGiliranega G-CSF (Neulaste®) sta

produkta mestno specifiĉne PEGilacije še PEGiliran eritropoetin (Cimzia®) in PEGiliran

fragment anti-TNF-α monoklonskega protitelesa (Macugen®) (10, 11).


7

1.3 HIDROFOBNI PROTEINI: izziv za stabilno končno farmacevtsko obliko

Mnogo proteinov, ki jih uporabljamo kot biološka zdravila (npr. interferoni, interlevkini in

rastni faktorji), so hidrofobni. Njihova hidrofobnost se še dodatno poveĉa, ko jih proizvajamo

v E. coli, saj ta gostiteljski organizem ne omogoĉa glikozilacije. Veĉina proteinov v naravni

obliki premore doloĉeno stopnjo glikozilacije, ta je pri veĉini omenjenih bioloških zdravil

pomembna za topnost in stabilnost, ne pa za biološko aktivnost.

Dobro znana primera hidrofobnih terapevtskih proteinov sta rekombinantni humani G-CSF ter

humani interferon beta-1b (IFN-ß-1b). G-CSF ima v svoji naravni obliki eno glikozilacijsko

mesto na Thr133, to je pomembno predvsem za topnost proteina, ne vpliva pa na njegovo

aktivnost. IFN-ß-1b je glikoziliran na mestu Asn80 na koncu heliksa C. Odsotnost

glikozilacije pri rekombinantnem humanem IFN-ß-1b, proizvedenem v E. coli, moĉno poveĉa

njegovo hidrofobnost (13).

Priprava stabilne formulacije je eden od kritiĉnih korakov v razvoju biološkega zdravila, saj

so proteini kompleksne molekule, zelo podvrţene razliĉnim procesom, ki vodijo v

nestabilnost zdravila. Teţava hidrofobnih proteinov je tudi njihova nizka topnost in s tem

priprava primerne formulacije z dovolj visoko koncentracijo. Pogosto pa so hidrofobni

proteini nagnjeni tudi k adsorbciji na površine.

Pri razvijanju konĉne formulacije biološkega zdravila moramo izbrati ustrezen pH in ionsko

moĉ pufra, ustrezne pomoţne snovi in materiale, v katerih bomo zdravilo shranjevali.

Eden od pristopov k stabilizaciji konĉnih farmacevtskih oblik za hidrofobne proteine je

dodatek HSA, ta zavira adsorpcijo proteinov in stabilizira razliĉne hidrofobne citokine v

tekoĉi formulaciji (npr. IFN-ß-1b, IFN-α-n3) in med liofilizacijo (npr. IL-1aα, IL-3,

makrofagne kolonije stimulirajoĉi faktor) (13).

Zaradi pomankljivosti HSA (npr. variabilnost med proizvodnimi serijami HSA, moţna

prisotnost s krvjo prenosljivih patogenov, teţave pri analiznih metodah) je trend razviti

formulacijo brez dodatka HSA, kar lahko storimo z dodajanjem drugih pomoţnih snovi. Na

trgu je kar nekaj formulacij brez HSA, kot najbolj uporabne so se izkazale kombinacije

neionskih površinskih snovi s sladkorji in/ali aminokislinami (npr. pri epoetinu-α so zamenjali

HSA s polisorbatom 20 in glicinom, pri IFN-ß-1a so uporabili arginin in polisorbat 20) (13).


8

Ponavadi preizkušamo stabilnost proteinov v izbrani formulaciji v obmoĉju pH od 3 do 10.

Pogosto ni mogoĉe pripraviti formulacije v optimalnem obmoĉju pH, zato izberemo tak pH,

ki omogoĉa najveĉjo topnost in hkrati ustrezno stabilnost zdravila (13, 14).

Pomoţne snovi, ki jih vkljuĉujemo v formulacije, so soli, sladkorji, polioli, ciklodekstrini,

aminokisline, polimeri, ki poveĉajo topnost in stabilnost zdravila, ter površinsko aktivne snovi

(polisorbat 20 in 80), ki zmanjšujejo adsorpcijo na površine, lahko pa prepreĉujejo tudi

agregacijo in/ali razpad proteina. Adsorpcijo na površine uĉinkovito zmanjšujemo tudi s

pravilno izbiro materialov shranjevalnih posod med procesom priprave zdravila, kot tudi z

izbiro primerne konĉne primarne ovojnine (13, 14, 15).

Najpomembnejši mehanizem stabilizacije s pomoţnimi snovmi je mehanizem preferenĉne

izkljuĉitve, to pomeni, da je protein raje v interakciji z vodo kot s pomoţno snovjo. Molekule

pomoţne snovi, ki stabilizirajo protein, imajo šibko interakcijo s proteinom. Na površini

proteina je torej veĉ molekul vode in manj molekul pomoţne snovi kot v raztopini.

Stabilizacijski uĉinek je posledica destabilizacije denaturiranega stanja, saj je preferenĉna

izkljuĉitev molekul pomoţne snovi s površine denaturiranega proteina manj ugodna kot s

površine nativnega proteina (ker ima denaturiran protein veĉjo površino kot nativni protein).

Sladkorje in poliole pogosto uporabljamo v formulacijah zdravila in delujejo kot nespecifiĉni

stabilizatorji z mehanizmom preferenĉne izkljuĉitve. Med sladkorji najpogosteje uporabljamo

saharozo in trehalozo, pa tudi sorbitol in manitol.

Z dodatkom ciklodekstrinov prepreĉujemo agregacijo in obarjanje proteinov, pogosto jih

uporabljamo tudi za zašĉito proteinov pred denaturacijo, ki jo lahko povzroĉijo neskladja med

organskimi topili in vodno fazo (protein IL-2 so npr. stabilizirali z 0,2 – 0,5 % dodatkom 2-

hidroksipropil-β-ciklodekstrina) (13).

Tudi s polimeri lahko stabiliziramo protein, najpogosteje uporabljamo polivinilpirolidon

(PVP) in dekstran.

Z dodatkom aminokislin lahko stabiliziramo protein v kombinaciji z drugimi pomoţnimi

snovmi ali samostojno, z mehanizmom preferenĉne izkljuĉitve. Ponavadi vkljuĉimo v

formulacijo aminokisline histidin, glicin in asparagin (1, 14, 15).

Ţe nizke koncentracije površinsko aktivnih snovi (PAS) lahko stabilizirajo proteine.

Najpogosteje uporabljamo Tween (20, 40 ali 80) in Pluronic (F68, F88 in F127). Uporaba


9

PAS pri zelo hidrofobnih proteinih je vprašljiva, saj ti veţejo veĉje koliĉine PAS, ker so

interakcije med PAS in proteinom po naravi hidrofobne (15).

Eden boljših naĉinov reševanja teţav zaradi hidrofobnosti bioloških zdravil je konjugacija

proteinov z verigo polietilenglikola – PEGilacija. Znano je, da s PEGilacijo zmanjšamo

hidrofobnost in s tem izboljšamo topnost proteina v tekoĉem mediju formulacije. Poleg tega

prinaša PEGilacija še mnogo drugih prednosti, kot so zmanjšana imunogenost, manj pogosta

aplikacija zdravila, veĉja proteolitska stabilnost zdravila in mnoge druge (10).

1.3.1 Primeri hidrofobnih proteinov

Predstavniki hidrofobnih proteinov so rastni faktorji, interferoni, interlevkini in drugi (13).

Interferoni spadajo med citokine in so proteini velikosti 15 – 20 kDa. Regulirajo in spodbujajo

aktivacijo imunskega odziva. Nastanejo, ko se pojavi okuţba z mikrobi, in sodelujejo pri

signaliziranju sosednjim celicam, da je prisotna okuţba. Za zdravljenje razliĉnih bolezni

uporabljamo rekombinantno pripravljene interferone (18, 19).

Poznamo veĉ vrst rekombinantnih interferonov:

rekombinantni protein interferon alfa se uporablja pri virusnih obolenjih (hepatitis B in

C) ter rakastih obolenjih (melanomi in doloĉene vrste levkemije);

rekombinantni protein interferon beta se uporablja za upoĉasnitev napredovanja

multiple skleroze in ima izrazito hidrofobno naravo. Interferon beta-1a je terapevtski

protein, ki ga proizvajajo v sesalskih celicah in je glikoziliran, medtem ko je interferon

beta-1b neglikoziliran protein, proizveden v E. coli in je še bolj hidrofoben kot

interferon beta-1a;

rekombinantni protein interferon gama pa se uporablja za zdravljenje kroniĉne

granulomatozne bolezni in maligne osteoporoze in ima za razliko od interferona beta

bolj hidrofilno naravo (19).


10

IFN-ά IFN-β

Slika 1: Struktura humanega IFN-ά (20) in IFN-β (21)

Humani granulocitne kolonije spodbujajoĉi dejavnik (hG-CSF) uvršĉamo med citokine (22).

hG–CSF je hematopoetski rastni faktor, ki spodbuja aktivacijo, proliferacijo in diferenciacijo

nevtrofilcev iz prekurzorskih celic. Poveĉa tudi aktivnost zrelih nevtrofilcev.

Rekombinantni hG–CSF se od naravnega proteina razlikuje v tem, da ima na prvem mestu

dodatno aminokislino metionin in da ni glikoziliran, zato je mnogo bolj hidrofoben. hG–CSF

povzroĉi hitro sprošĉanje nevtrofilcev iz kostnega mozga, zato se uporablja po kemoterapiji,

po presaditvi kostnega mozga (22), pri bolezensko pogojeni nevtropeniji, po presaditvi

perifernih prekurzorskih celic ter pri bolnikih z virusom HIV.

Slika 2: Struktura hG–CSF

Interlevkini (IL-1α, IL-1ß, IL-2, IL-3 in drugi) ravno tako sodijo med citokine in so topne

signalne molekule levkocitov in nekaterih drugih celic. Uravnavajo številne fiziološke in

patofiziološke dogodke (celiĉna rast normalnih in malignih celic, vsi vidiki imuskega odziva,


11

regulacije vnetja itd.). Obstaja veĉ kot 30 naravnih predstavnikov in podvrst interlevkinov.

Med rekombinantnimi interlevkini sta IL-1α, IL-1ß še posebej hidrofobna, ker nista

glikozilirana. Uporabljajo se za zdravljenje razliĉnih bolezni, npr. protein IL-1ra (antagonist,

onemogoĉi vezavo IL-1α in IL-1ß) za revmatoidni artritis, IL-2 za metastazirajoĉi rak ledvic

in melanom, IL-11 za prepreĉevanje trobmocitopenije po kemoterapiji (1).

1.4 STABILNOST PROTEINOV

Stabilitetne študije zajemajo velik del razvoja konĉne formulacije in nam podajo konĉni

odgovor, ĉe je izbrana formulacija resniĉno primerna. Kot smo ţe omenili, je razvoj stabilne

proteinske uĉinkovine v konĉni formulaciji biološkega zdravila zelo zahtevna naloga.

Stabilnost proteina je tudi rezultat ravnoteţja med stabilizacijskimi in destabilizacijskimi

silami. Merilo za stabilizacijo proteinov s hidrofobnimi interakcijami je razlika v toplotnih

kapacitetah nativnega in denaturiranega stanja, velika razlika v toplotni kapaciteti pri termiĉni

denaturaciji proteina kaţe na velik vpliv hidrofobnih interakcij pri stabilizaciji proteina (1,

15).

Spremembe, ki se dogajajo na proteinih, so posledica kemijske in fizikalne nestabilnosti

proteinov.

1.4.1 Kemijska stabilnost proteinov

Posledice kemijske nestabilnosti proteinov so:

deamidacija, ta je najpogostejša oblika kemijske nestabilnosti in se kaţe predvsem kot

razgradnja proteinov zaradi deamidacije asparagina in glutamina. Hitrost, mehanizem

in lokacija deamidacije so odvisni od pH, kar je potrebno upoštevati pri naĉrtovanju

konĉne formulacije. Deamidacija asparagina je bolj pogosta in je najbolj intenzivna v

nevtralnih in baziĉnih pogojih;

hidroliza peptidne vezi, ki pogosto sledi deamidaciji asparagina, saj je peptidna vez za

ostankom asparaginske kisline najbolj obĉutljiva vez v polipeptidni verigi;

oksidacija je precej pogosta, zanjo so najbolj dovzetne aminokisline histidin,

triptofan, tirozin, cistein in metionin. Tiolne skupine na cisteinu in metioninu so še


12

posebej obĉutljiva mesta za oksidacijo. Na stopnjo oksidacije lahko vplivamo z izbiro

ustreznega pH formulacije;

razcep in nastanek disulfidnih vezi, kjer lahko prosti cisteinski ostanki tvorijo

povezave in povzroĉajo agregacijo ali polimerizacijo proteinov, lahko pa sproţijo tudi

disulfidno izmenjavo;

sukcinimidacija, je lahko predstopnja deamidacije asparagina in in izomerizacije

asparaginske kisline;

glikoliza, ta lahko zmanjša aktivnost proteinov, nima pa znatnega vpliva na

konformacijo;

Maillardova reakcija, pri kateri se poveţe skupina reducirajoĉega sladkorja z amino

skupino proteina, poteka pa predvsem pri povišanih temperaturah (1, 15).

1.4.2 Fizikalna stabilnost proteinov

Doloĉeni pogoji, ali pa preprosto potek staranja zdravila, povzroĉijo spremembe v sekundarni,

terciarni in/ali kvartarni zgradbi proteina. Lahko pride do razvitja proteina in/ali agregacije.

Agregacija je najbolj pomembna vrsta fizikalne nestabilnosti proteina, saj imajo agregati

zmanjšano aktivnost, so manj topni in imajo spremenjeno imunogenost. Agregati so zaradi

navedenih razlogov v farmacevtskem izdelku strogo omejeni (15).

Osnovni vzrok agregacije je poveĉanje hidrofobnosti površine proteina zaradi spremembe

temperature, ionske moĉi, striţnih sil, adsorpcije na površine in/ali kemijskih sprememb (15).

Agregati ponavadi nastanejo zaradi zdruţevanja delno razvitih proteinov. Predvidevajo, da

agregati nastanejo zaradi specifiĉnih intermolekularnih interakcij med doloĉenimi

konformacijami proteinskih intermediatov.

V agregacijo vodi teţnja po zmanjšanju termodinamsko neugodnih interakcij med topilom in

izpostavljenimi hidrofobnimi deli molekul proteina. Hidrofobne interakcije so glavna gonilna

sila tako zvijanja proteinov kot tudi agregacije. Oba procesa predstavljata ravnoteţje med

hidrofobnimi deli, izpostavljenimi topilu, in hidrofobnimi deli v notranjosti molekule. To

ravnoteţje lahko porušijo razliĉni fizikalni dejavniki (temperatura, ionska moĉ, vibracijsko

mešanje in drugi), kot tudi izpostavitev hidrofobnih obmoĉij zaradi kemijske razgradnje ali

spremembe (15).

Agregacija je lahko reverzibilna ali ireverzibilna. O nereverzibilni agregaciji govorimo takrat,


13

ko agregatov ni veĉ mogoĉe raztopiti z denaturanti in reducirajoĉimi sredstvi, taki so pogosto

toplotno inducirani agregati. Z reducirajoĉi sredstvi razcepimo disulfidne vezi v dimerih,

oligomerih ali agregatih. Tako nastale disulfidne vezi razcepimo z dodatkom reducirajoĉega

sredstva, npr. ditiotreitola – DTT. Reverzibilni agregati so bolj energetsko stabilni, bolj

urejeni v strukturi in manj gosti kot ireverzibilni agregati. Znano je tudi, da zgradba in

znaĉilnosti monomernega proteina vplivajo na zgradbo in morfologijo proteinskih agregatov

(15).

Aktivnost agregatov je zelo zmanjšana ali pa je izniĉena, kar so pokazali na modelnem

proteinu interferonu-β-1b. Agregati interferona-β-1b so imeli 3x manjšo aktivnost kot

monomeren protein (15).

Poleg agregacije pod fizikalno nestabilnost uvršĉamo vse druge vrste nestabilnosti razen

kemijske. Sem spada tudi adsorpcija proteinov na površine shranjevalnih posod, ki jih

uporabljamo med izolacijo ali pa na površine konĉne ovojnine, ali na stiĉne površine dveh faz

(voda/zrak). Vzrok za adsorpcijo je visoka površinska aktivnost proteinov, kar je potrebno

upoštevati pri izbiri ovojnine. Posledica adsorpcije na površino je izguba proteinov ali

sprememba njihove konformacije. Steklo, silikonizirano steklo in polipropilen so materiali za

posode in ovojnino, na katere se proteini najmanj adsorbirajo (1, 15).

1.4.3 Stabilizacija proteinov

Za prepreĉevanje nestabilnosti proteinov moramo stabilizirati nativno konformacijo molekule

proteina (1). Splošna pravila za ohranjanje stabilnosti ţal ne obstajajo. Stabilnost biološkega

zdravila s proteinskimi uĉinkovinami doseţemo z razvojem formulacije, stabilnost

formulacije pa preizkusimo z razliĉnimi testi stabilnosti.

Temperatura je nedvomno pomemben faktor, ki vpliva na stabilnost proteinov. Pri višjih

temperaturah prihaja do denaturacije in agregacije / obarjanja proteinov. Višje temperature

lahko pospešijo tudi hidrolizo ostankov asparagina in deamidacijo asparaginskih in

glutaminskih ostankov. Tudi pH formulacije, koncentracija in ĉistost proteina imajo

pomemben vpliv na stabilnost. Neprimeren pH lahko povzroĉi denaturacijo in agregacijo

proteinov. Pri zelo kislih in moĉno baziĉnih pogojih lahko pride do deamidacije asparaginskih

in glutaminskih ostankov. Pogosto so proteini stabilni pri nevtralnem pH. Dodatki soli in

kovinskih ionov lahko stabilizirajo ali destabilizirajo protein ali pa nimajo vpliva, odvisno od


14

narave proteina. Tudi stresanje in vibracijsko mešanje proteinov lahko pripelje do

denaturacije in agregacije.

Proteine je mogoĉe stabilizirati s spreminjanjem njihove zgradbe (notranja stabilizacija) ali s

spreminjanjem lastnosti topila, s katerim so v stiku (zunanja stabilizacija). Pri razvoju

formulacije biološkega zdravila gre obiĉajno za zunanjo stabilizacijo. Zunanjo stabilizacijo

doseţemo z okrepitvijo stabilizirajoĉih sil in z destabilizacijo denaturiranega stanja. V

praktiĉnem smislu to storimo s spremembo lastnosti topila in z dodatki pomoţnih snovi (1,

15).

1.5 KARAKTERIZACIJA AGREGATOV

Proteinsko agregacijo lahko spremljamo z razliĉnimi tehnikami, kot so gelska filtracija (SEC),

pretoĉni sistem za loĉevanje makromolekul po velikosti z uporabo preĉnega pretoka (angl.

FFF, field-flow fractionation), analizno ultracentrifugiranje in tehniko sipanja svetlobe.

Vsaka metoda ima doloĉene prednosti in omejitve, zato je za zanesljivejšo karakterizacijo

agregatov priporoĉljivo uporabiti veĉ tehnik. Podajamo kratek pregled vseh navedenih tehnik,

za naše delo pa smo uporabili tehniko SEC v kombinaciji s tehniko statiĉnega sipanja svetlobe

MALS (SEC-MALS) in tehniko dinamiĉnega sipanja svetlobe (DLS).

1.5.1 Gelska filtracija

Gelsko filtracijo (SEC) najpogosteje uporabljamo za ugotavljanje proteinskih agregatov.

Metoda omogoĉa separacijo monomernega proteina od dimernega in ostalih višjih agregatov.

Loĉevanje molekul poteka na kromatografskem nosilcu v obliki gela z definirano velikostjo

por na osnovi velikosti in/ali oblike (23). Nosilci so lahko razliĉni polimeri, najpogosteje

uporabljeni so dekstran, agaroza, poliakrilamid ali polistiren (1). V idealnih okolišĉinah, ko

imajo vse proteinske molekule analiziranega vzorca enotno, sferiĉno obliko in med njimi in

gelom ni nespecifiĉnih interakcij, poteka loĉevanje zgolj po njihovi velikosti: manjše

molekule lahko vstopajo v pore gela in potujejo poĉasneje. Veĉje molekule ne prodrejo v

pore, zato potujejo hitreje (24). Vendar pa retenzijski ĉas ni odvisen samo od molekulske

mase molekule, ampak tudi od njegove oblike. Metodo odlikujejo enostavnost uporabe,

ponovljivost in obĉutljivost, njene pomanjkljivosti pa so razredĉenje vzorca med


15

kromatografijo, omejen razpon loĉevanja molekulskih mas in omejitve pri uporabi mobilnih

faz. Razredĉenje vzorca lahko povzroĉi disociacijo agregatov s šibkimi reverzibilnimi

interakcijami, kar onemogoĉi njihovo detekcijo. Poleg omejenega razpona velikosti za

loĉevanje agregatov ima metoda tudi slabo resolucijo za veĉje agregate, netopni agregati pa

pogosto ostanejo na kromatografskem nosilcu in ne pripotujejo do detektorja. V mobilno fazo

je pogosto treba dodati visoke koncentracije soli, da se prepreĉijo nespecifiĉne interakcije z

nosilcem (25).

1.5.2 Pretočni sistem za ločevanje makromolekul po velikosti (FFF)

Tehnike FFF (angl. Field-Flow Fractionation) loĉujejo molekule glede na njihovo molekulsko

maso. Razvite so bile z namenom loĉevanja in karakterizacije makromolekul in so alternativa

gelski filtraciji za karakterizacijo proteinskih agregatov. Njihova prednost je, da loĉevanje ne

poteka na nosilcu, kar omogoĉa visoko resolucijo loĉevanja v razponu od nanometrskega

obmoĉja mas do dvomestnega mikrometrskega obmoĉja mas. Mobilna faza teĉe skozi kanal v

katerem nastane laminarni paraboliĉni tok, ki je hitrejši na sredini kanala in poĉasnejši ob

stenah kanala. Pravokotno na tok mobilne faze deluje fizikalno polje, ki usmerja molekule

vzorca proti akumulacijski steni kanala. Zaradi nastalega koncentracijskega gradienta v

nasprotni smeri deluje difuzija in molekule vzorca usmerja nazaj proti sredini kanala. Nastane

ravnoteţje in razliĉno velike molekule potujejo v razliĉnih hitrostnih obmoĉjih laminarnega

toka, kar omogoĉa njihovo loĉevanje. Manjše molekule potujejo hitreje, saj zaradi veĉjega

difuzijskega koeficienta potujejo višje v laminarnem toku, kar pomeni v obmoĉju hitrejšega

toka. Za karakterizacijo agregatov se pogosto uporablja tehnika, ki za ustvarjanje fizikalnega

polja uporablja pravokotno usmerjen pretok (pretoĉni sistem za loĉevanje makromolekul po

velikosti z uporabo preĉnega pretoka F4 ali FFFF, angl. Flow Field-Flow Fractionation) (25,

26, 27).

1.5.3 Analizno ultracentrifugiranje

Tudi merjenje hitrosti sedimentacije z analiznim ultracentrifugiranjem je alternativna tehnika

gelski filtraciji. Delovanje moĉne gravitacijske (centrifugalne) sile hidrodinamsko loĉi

komponente v vzorcu. Loĉevanje ponavadi poteka pri 50000 – 60000 rpm, hitrost

sedimentacije je odvisna od molekulske mase in oblike posameznih komponent v vzorcu. V


16

radialni smeri nastane koncentracijski profil iz katerega se lahko ugotavlja koeficient

sedimentacije in relativna koncentracija posamezne komponente v vzorcu. Zaradi omejitev

optiĉnih sistemov detekcije je v nekaterih primerih vzorce potrebno redĉiti, kar podobno kot

pri SEC lahko vodi v disociacijo agregatov, povezanih s šibkimi vezmi. Prednosti analiznega

ultracentrifugiranja pa so podobne prednostim tehnik FFF: loĉevanje ne poteka na nosilcu,

manj omejitev glede puferskih pogojev in loĉevanje zelo širokega razpona molekulskih mas

(25, 28).

1.5.4 MALS, tehnika statičnega sipanja svetlobe

Za naše delo smo uporabili SEC-MALS, ki je tehnika MALS v kombinaciji z gelsko filtracijo

(SEC). MALS je metoda statiĉnega sipanja svetlobe, kjer vzorec presvetimo s primarnim

ţarkom svetlobe in z detektorjem detektiramo kotno odvisnost intenzitete svetlobe.

Poglavitna prednost detekcije MALS je v tem, da je absolutna metoda, kar pomeni, da ne

potrebujemo kalibracijskih standardov (30).

Detekcija MALS je dragoceno orodje predvsem za spremljanje agregacije ali razpada

proteinov, kar je razvidno iz spremembe molekulske mase. Je najbolj razširjena tehnika za

ugotavljanje absolutne porazdelitve molekulske mase ter za ugotavljanje povpreĉne

molekulske mase polimerov in proteinov. Detektor je zelo uĉinkovit tudi pri nizkih

koncentracijah agregatov (29, 31). Z detektorjem MALS lahko ugotovimo poleg absolutne

molske mase topljenca v raztopini (Absolute molar mass, Mw) še radij sukanja molekule

(Root mean square radius, Rg) in drugi virialni koeficient (Second virial coefficient, A2), ki

opisuje interakcije med topilom in topljencem (30).

Za ugotavljanje molekulske mase komponent vzorca potrebujemo sistem HPLC ter zaporedno

vezana detektorja, laserski fotometer - detektor MALS (angl. multi-angle light scatter) in

koncentracijski detektor - detektor RI (detektor spremembe lomnega koliĉnika, angl.

refractive index). Odziv detektorja MALS je sorazmeren produktu koncentracije in molske

mase topljenca, ci×Mi. Odziv detektorja RI pa je sorazmeren koncentraciji topljenca ci.

Detektor MALS miniDAWN TREOS zaznava statiĉno sipanje svetlobe pri treh kotih (45°,

90° in 135°) in meri razliko v intenziteti vpadne in sipane svetlobe. Detektor RI Optilab rEX

zaznava razliko v lomnem koliĉniku med referenĉno celico, napolnjeno z mobilno fazo, in


17

merilno celico, skozi katero potuje vzorec. Lomni koliĉnik je merilo za hitrost svetlobe skozi

snov (30).

1.5.4.1 Izračun molekulske mase

Iz odziva detektorja RI ugotovimo koncentracijo vzorca c po spodnji enaĉbi (enaĉba 1):

dcdncKodzivRI RI /1/

kjer je KRI umeritvena konstanta detektorja.

Poznati moramo konstantne vrednosti poveĉanja lomnega koliĉnika dn/dc za ves vzorec, kjer

je n lomni koliĉnik in c koncentracija. Poveĉanje lomnega koliĉnika dn/dc nam pove, koliko

se lomni koliĉnik spreminja s koncentracijo in je odvisen od sestave molekule ter neodvisen

od njene molekulske mase in strukture.

Enaĉbo za PEGiliran protein lahko izrazimo na naslednji naĉin (enaĉba 2):

PEGPEGproteinproteinRI dcdncdcdncKodzivRI )/()/(

/2/

Konstantna vrednost dn/dc za proteine je 0,185 in za PEG 0,140.

Osnovna enaĉba (enaĉba 3), ki jo program Astra V uporablja za izraĉun molekulske mase,

opisuje intenziteto sipane svetlobe, ki je sorazmerna molekulski masi in koncentraciji vzorca.

Enaĉba velja za razredĉene raztopine makromolekul, ki so majhne v primerjavi z valovno

dolţino vpadne svetlobe:

...32)(

1

)(

2

32

*

cAcAPMR

cK

W

/3/

kjer je:

K* optiĉna konstanta )())/(4( 4

0

22

0

2*

ANdcdnnK , /4/

n0 lomni koliĉnik topila,

dn/dc poveĉanje lomnega koliĉnika,

λ0 valovna dolţina vpadne svetlobe v vakuumu,

NA avogadrovo število,

Mw uteţno povpreĉje molske mase,

R(θ) Rayleigh-evo razmerje,


18

c koncetracija v g/cm3,

P(θ) teoretiĉno izpeljan oblikovni faktor,

A2 drugi virialni koeficient in A3 tretji variabilni koeficient; koeficienti so popravki za

interakcije molekul topljenca s topilom. Ponavadi lahko pri razredĉenih raztopinah tretjega in

višje viriabilne koeficiente zanemarimo, saj so zanemarljivo majhni v primerjavi s ĉlenom, ki

vsebuje drugi virialni koeficient.

R(θ) je Rayleigh-evo razmerje, opisano z enaĉbo (enaĉba 5):

)cos1()(

2

0

2

I

IrR /5/

kjer je:

r razdalja med molekulo, ki sipa, in detektorjem,

Iθ intenziteta sipane svetlobe pod kotom θ glede na vpadno svetlobo,

I0 intenziteta nepolarizirane vpadne svetlobe.

P(θ) je teoretiĉno izpeljan oblikovni faktor, ki opisuje kotno odvisnost sipanja svetlobe po

enaĉbi (enaĉba 6):

...)2/(sin)3/16(1)( 222

0

2

0

2 grnP /6/

kjer je rg radij sukanja, s katerim opišemo velikost delca.

Za limitni primer, ko gre θ→0, je P(θ) = 1 in lahko osnovno enaĉbo izrazimo kot (enaĉba 7)

(27, 28, 29):

cAMR

cK

W

2

*

21

)( /7/

To enaĉbo lahko rešimo na veĉ naĉinov, z Zimmovo, Debyejevo ali Berryjevo metodo. Za

izraĉun molekulskih mas komponent vzorca ali celotnega vzorca program Astra V uporablja

Zimmovo metodo. Zimmov model je primeren za molekule z radijem sukanja < 50 nm in

monodisperzne sisteme.


19

Pri Zimmovi metodi narišemo Zimmov diagram K*c / R(θ) v odvisnosti od sin

2(θ/2) + kc:

Slika 3: Zimmov diagram (32)

Zimmov diagram, prikazan na sliki 3, podaja kotno odvisnost sipane svetlobe pri konstantni

koncentraciji in koncentracijsko odvisnost sipane svetlobe pri konstantnem kotu opazovanja.

Pri vsaki koncentraciji ci ekstrapoliramo K*c / R(θ) na θ = 0 in pri vsakem kotu θi na c = 0.

Tako dobimo dve mejni premici in njuno presekališĉe je enako reciproĉni vrednosti uteţnega

povpreĉja molekulske mase – 1/ Mw (29, 31).

1.5.5 DLS, tehnika dinamičnega sipanja svetlobe

Metodo imenujemo tudi fotonska korelacijska spektroskopija (ang. PCS, Photon Correlation

Spectroscopy) ali kvazi-elastiĉno sipanje svetlobe (ang. QELS, Quasi-Elastic Light

Scattering). S to metodo preuĉujemo dinamiĉne lastnosti delcev v raztopini in detektiramo

topne ter netopne agregate (36, 37).

Metodo smo uporabili za meritve hidrodinamskih radijev in za ugotavljanje polidisperznosti

vzorca na napravi Zetasizer APS, s pomoĉjo programske opreme Zetasizer APS.

Slabosti metode DLS so:

nizka resolucija,

ne moremo razlikovati med monomeri in dimeri,

teţje loĉimo tudi agregate in oligomere,


20

za zanesljive meritve potrebujemo višje koncentracije vzorca.

Velikokrat zmotno mislimo, da ĉe dobimo dvojno vrednost hidrodinamskega radija, je

izmerjena populacija dimer iz monomera, vendar v splošnem velja, da mora obstajati vsaj

petkratna razlika v velikosti, da zaznamo drugo populacijo.

Medtem, ko nas pri statiĉnem sipanju svetlobe zanima kotna odvisnost intentzitete svetlobe,

gledamo pri dinamiĉnem sipanju svetlobe ĉasovno odvisnost intenzitete sipanja (nihanje

intenzitete sipanja) pri doloĉenem stalnem kotu.

Najpogosteje metodo uporabljamo za ugotavljanje velikosti delcev med 3 in 3000 nm v

raztopinah proteinov, nanodelcev, v koloidnih raztopinah, tekoĉih kristalih, gelih, emulzijah

ali polimerih (38).

DLS temelji na sipanju laserske svetlobe na vzorcu, kjer so delci v Brownovem gibanju.

Brownovo gibanje je nakljuĉno gibanje delcev zaradi nakljuĉnih trkov z medijem, ki jih

obdaja. Znaĉilnost Brownovega gibanja je tudi, da se majhni delci gibljejo hitreje kot veliki in

to izkorišĉa tudi metoda DLS. Veliki delci sipajo veliko veĉ svetlobe kot manjši delci, ker je

intenziteta sipane svetlobe sorazmerna z d6. Praktiĉno to pomeni, da bodo v rezultatu, ki je

porazdelitev velikosti populacij glede na intenziteto sipanja svetlobe, manjši delci imeli

mnogo manjšo površino pod vrhom kot veĉji delci, pa ĉeprav bo deleţ manjših delcev

prevladal (38).

Vzorec osvetlimo z laserjem in sipanje merimo pod kotom 90°. Zaradi Brownovega gibanja

delcev intenziteta sipane svtelobe niha. Merimo ĉasovno odvisnost nihanja intenzitete sipanja

svetlobe skozi raztopino vzorca. Avtokorelacijska funkcija je merilo za hitrost spreminjanja

signala s ĉasom in iz hitrosti padca eksponentne funkcije sklepamo na velikost delcev. Iz

avtokorelacijske funkcije dobimo informacijo o difuzijskem koeficientu, ki je v povezavi z

velikostjo delcev. S pomoĉjo programske opreme po Stokes-Einsteinovi enaĉbi (enaĉba 8)

izraĉunamo hidrodinamski radij - Rh delcev (37):

t

b

hD

TkR

6 /8/

kjer je:

kb Boltzmannova konstanta,

T temperatura, pri kateri izvajamo meritev,

viskoznost topila,


21

Dt difuzijski koeficient.

Hidrodinamski radij je vrednost, ki se nanaša na to, kako delec v raztopini difundira.

Poleg hidrodinamskega radija smo ugotovili tudi polidisperznost vzorcev (PD %), s katero

opišemo širino porazdelitve velikosti delca (41). PD % je relativni standardni odklon od

povpreĉja izmerjenih hidrodinamskih radijev vrhov v vzorcu. Monodisperzni vzorci imajo PD

% pod 20 %.

Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga NAMEN DELA

22

2. NAMEN DELA

V magistrskem delu bomo preverili vlogo PEGilacije in dodanega sladkorja (trehaloze) pri

izbranem modelnem zelo hidrofobnem proteinu med izpostavljenostjo stabilitetnim pogojem.

Naša izhodišĉna hipoteza je, da bo PEGilacija izboljšala stabilnost modelnega proteina.

Izhodni protein (Protein_t) v optimizirani tekoĉi farmacevtski obliki z dodatkom trehaloze

bomo primerjali s PEGiliranim proteinom (PEGprotein) v dveh tekoĉih farmacevtskih

oblikah, z in brez zašĉitnega sladkorja (trehaloze).

Stabilnost bomo testirali pri pogojih, ki jim je proteinsko zdravilo v tekoĉi farmacevtski obliki

dejansko izpostavljeno. Spremljali bomo stabilnost pri razliĉnih temperaturah hranjenja (4 °C,

25 °C in 40 °C), pri zamrzovanju in odmrzovanju ter vpliv striţnih sil ob transportu, ki jih

bomo simulirali s stresanjem.

Vpliv PEGilacije na stabilnost hidrofobnega proteina bomo spremljali z razliĉnimi

standardnimi tehnikami HPLC, kot so kromatografija na reverzni fazi, kationsko

izmenjevalna in gelska kromatografija. Nastale agregate v vzorcih bomo poskušali ovrednotiti

z metodo statiĉnega sipanja svetlobe (MALS) in metodo dinamiĉnega sipanja svetlobe (DLS).

Zanima nas tudi, ĉe se med izpostavljenostjo zelo hidrofobnega proteina (PEGiliranega in

nePEGiliranega) stresnim pogojem spremeni biološka aktivnost in vitro.

Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga MATERIALI IN METODE

23

3. MATERIALI IN METODE

3.1 MATERIALI

3.1.1 Kemikalije

Vse uporabljene kemikalije so analizne ĉistosti ali primerne za delo s celiĉnimi linijami ter so

navedene v preglednici III.

Preglednica III: Kemikalije

Kemikalija Proizvajalec, kataloška številka

Acetonitril Merck, 100030

BSA Equitech-Bio Inc, BAH68

Dietanolamin Sigma, D-8885

Etanol brezvodni Riedel-de-Haen, 32221

Gojišĉe F-12K Gibco-BRL Life Technologies, 21127-022

Gojišĉe F-12K, brez indikatorja pH Gibco-BRL Life Technologies, po naroĉilu

HIFBS Sigma, F-4135

Izopropanol Sigma-Aldrich, 650447

Magnezijev klorid Sigma, M-8266

Metanojska kislina Fluka, 06440

Natrijev hidroksid Sigma, S-5881

Natrijev dihidrogenfosfat Sigma, S-9638

Natrijev hidrogenfosfat Sigma, S-9763

Natrijev klorid Sigma, S-9888

Etanojska kislina Fluka, 45731

pNPP Sigma, N-2765

Trifluoroocetna kislina Sigma, T-6508

Trehaloza J.T.Baker, 4226-05

Tripsin-EDTA Sigma, T-4049


24

3.1.2 Voda

Za pripravo vseh pufrov in raztopin smo uporabili preĉišĉeno vodo (v nadaljevanju Milli-Q

voda), pripravljeno z napravo Millipore, model Milli-Q Advantage A10.

3.1.3 Raztopine in pufri

Preglednica IV: Pripravljene raztopine in pufri

Raztopina, pufer Sestava

Raztopine za analizno kromatografijo:

Mobilna faza A RPC 10 % (v/v) ACN, 0,1 % (v/v) TFA

Mobilna faza B RPC 95 % (v/v) ACN, 0,1 % (v/v) TFA

Mobilna faza A CEC 20 mM natrijev fosfat/NaOH, pH 7,5

Mobilna faza B CEC 20 mM natrijev fosfat/NaOH, 1 M NaCl, pH 7,5

Mobilna faza SEC PEGprotein 100 mM NaH2PO4/NaOH, 0,3 M NaCl, 10 %

(v/v) EtOH, pH 6,4

Mobilna faza SEC Protein 100 mM metanojska kislina, 10 % (v/v)

izopropanol

Raztopine za uravnavanje pH:

R1za dvig pH 1 M NaOH

R2za dvig pH 5 M NaOH

Končni pufri za shranjevanje proteina:

p1 10 mM CH3COOH/NaOH, pH 4,0

p2 10 mM CH3COOH/NaOH, 9 % (m/v) trehaloza,

pH 4,0

Raztopine in pufri za ugotavljanje in vitro biološke aktivnosti:

Rastni medij 90 % (v/v) gojišĉe F-12K, 10 % (v/v) HIFBS

Testni medij gojišĉe F-12K, brez indikatorja pH

Pufer za substrat 10 % (v/v) dietanolamin, 0,5 mM MgCl2, pH 9,8

Substrat 1 mg/mL pNPP v pufru za substrat


25

3.1.4 Vzorci (izvor, sestava, kakovost)

Vzorce smo prejeli shranjene v zaĉetnem pufru, nato smo jim zamenjali pufer in uravnali

koncentracijo. Poimenovali smo jih na naslednji naĉin, oznaka _t pomeni pufer z dodatkom

trehaloze in oznaka _a pufer brez dodane trehaloze.

Preglednica V: Vzorci

Vzorec Začetni pufer Začetna

koncentracija

[mg/mL]

Končni

pufer

Končna

koncentracija

[mg/mL]

Protein_t p2 8,3 p2 2,5

PEGprotein_t 10 mM aspartat, pH 4,0 7,1 p2 2,6

PEGprotein_a 10 mM aspartat, pH 4,0 7,1 p1 2,3

3.1.5 Standardi

Za analizo SEC-MALS smo pripravili standard BSA s koncentracijo 10 mg/mL v mobilni fazi

SEC PEGprotein in mobilni fazi SEC Protein.

Interni standard za merjenje biološke aktivnosti in vitro: c = 8,2 mg/mL

3.1.6 Kromatografske kolone za analizno kromatografijo

Preglednica VI: Kromatografske kolone za analizno kromatografijo

Kromatografska kolona Vrsta kromatografije Proizvajalec, kataloška številka

YMC-ODS-AQ RPC YMC, AQ20S03-1546WT

TSKgel SP-5PW CEC Tosoh Bioscience, 07161

TSKgel G3000SWXL SEC PEGprotein Tosoh Bioscience, 08541

BioBasic SEC 300 SEC Protein Thermo Hypersil-Keystone, 73505-

307846


26

3.2 METODE

3.2.1 Oprema

Preglednica VII: Oprema

Oprema Proizvajalec, tip

Avtoklav Kambiĉ, A-35/35-65/1

Centrifuga Eppendorf, 5810 R

Eppendorf, 5702 RH

Ĉitalnik mikrotitrskih plošĉ BioRad, 3550

BMG Labtechnologies, Fluostar Galaxy

Detektor dinamiĉnega sipanja svetlobe Malvern, Zetasizer APS

Hladilnik 2−8°C Angelantoni Industrie, Ekofrigolab 700/2

HPLC sistem, analizni Agilent, Agilent 1200

Inkubator Kambiĉ, I-105 CK

Inkubator CO2 THERMO FORMA, model 3308

WTC Binder, Tip 36210180003100

Invertni mikroskop Reichert-Jung, Series 1820 Biostar

Laminarij Iskra PIO, LFU 9

Magnetni mešalnik z gretjem Tehtnica, Rotamix SHP-10

MALS detektor (multy – angle light

scatter)

Wyatt Techonology, MALS miniDAWN

TREOS

Naprava za proizvodnjo posebno ĉiste vode Millipore, Milli-Q Advantage A10

pH meter Mettler Toledo, SevenEasy

RI detektor (refractive index) Wyatt Techonology, RI Optilab rEX

Spektrofotometer Varian, Cary 5000

Stresalnik mikrotitrskih plošĉ Tehtnica, EV–201

Stresalnik, namizni Tehtnica, Vibromix 10

Tehtnica, Vibromix 31


27

Oprema Proizvajalec, tip

Sušilnik Kambiĉ, SP-440C

Tehtnice Mettler Toledo, XP 205

Sartorius, CP622-0CE

Termiĉni blok Biosan, CH-100

Vodna kopel GLF

Zamrzovalna omara -70 °C Angelantoni Industrie, Platinum 750V

3.2.2 Priprava končnih vzorcev za stabilnost: zamenjava pufra, koncentriranje in

sterilna filtracija

Vzorec Protein_t smo razredĉili na ţeleno konĉno koncentracijo s pufrom p2.

Vzorcem PEGprotein smo zamenjali pufer in jih nato skoncentrirali do ţelene koncentracije.

Konĉna pufra sta bila p1 in p2. Zamenjavo in koncentriranje vzorcev smo izvedli v 14-mL

Amicon Ultra-15 kolonah (Millipore, UFC901024) s centrifugiranjem pri 3500 rpm in 6 °C.

Celico Amicon smo najprej sprali s 14 mL z Milli-Q vode in centrifugirali pri zgornjih

pogojih 10 minut. Nato smo vanjo odpipetirali ustrezno koliĉino vzorca in dopolnili s pufrom

za zamenjavo do konĉnega volumna (do 14 mL). Vsebino smo skoncentrirali do pribliţno 3

mL in celico ponovno dopolnili s pufrom. Postopek smo ponovili trikrat. Pri zadnji zamenjavi

smo vzorec skoncentrirali do ustreznega volumna, ki smo ga izraĉunali iz zaĉetne

koncentracije in volumna vzorca ter konĉne ţelene koncentracije vzorca. Na koncu smo

vzorec prenesli v sveţo centrifugirko in filter kolone sprali z 0,2 mL pufra za zamenjavo.

Vzorce smo sterilno filtrirali v laminariju skozi celulozno membrano s porami premera 0,2

µm (Corning, 431215), ki smo jih namestili na injekcijsko brizgo, in jih razdelili na enake

dele v sterilne viale. Toĉno koncentracijo smo izmerili z UV spektrofotometrom.

3.2.2.1 Merjenje koncentracij z UV spektrofotometrom

Metoda temelji na neposrednem merjenju absorbcije UV svetlobe z valovno dolţino 280 nm v

raztopini proteinov. Proteini v raztopini absorbirajo UV svetlobo valovne dolţine 280 nm

zaradi prisotnosti kromoforov v aromatskih aminokislinah, predvsem tirozina in triptofana, v

strukturi proteina. Metoda je enostavna in nedestruktivna.


28

Koncentracije vzorcev smo merili na spektrofotometru Cary Varian. Najprej smo pomerili

absorbanco za slepi vzorec, to je bil pufer p1 ali p2, in nato proteinski vzorec. Predhodno smo

vzorce redĉili s pufrom p1 ali p2 in jih prenesli v kvarĉno kiveto. Izmerili smo absorbanco pri

280 nm in odšteli signal pri 320 nm, kjer absorbirajo potencialno prisotni proteinski agregati.

Izmerjena absorbanca vzorca mora biti med 0,2 in 0,5, ker je v tem obmoĉju razmerje med

koncentracijo in absorbanco linearno in velja Beer-Lambertov zakon.

Koncentracijo proteina smo izraĉunali iz enaĉbe A = ε × c × l, pri ĉemer je A absorbanca pri

280 nm, ε molarni absorpcijski koeficient [Lmol-1

cm-1

], l dolţina optiĉne poti ţarka [cm] in c

molarna koncentracija [mol/L]. Dobljeno koncentracijo smo pomnoţili s faktorjem redĉenja

in tako izraĉunali koncentracijo proteina v vzorcu. Molarni absorpcijski koeficient za naš

modelni protein je 1,7 Lmol-1

cm-1

.

3.2.3 Stabilnost: načrt in količine vzorcev

Preglednica VIII: Naĉrt temperaturne stabilnosti

Čas / T ≤ -60 °C 2 – 8 °C 25 °C 40 °C Valikvotov

0 √ po 50 µL HPLC

po 200 µL DLS

po 200 µL BA

7d √ √

1m √ √ √ √

3m √ √ √

d: dan

m: mesec

Preglednica IX: Naĉrt stabilnosti stresanje in zamrzovanje / odmrzovanje

Stabilitetni test Izvedba Valikvotov

Stresanje 50 rpm, sobna T, 16 ur po 200 µL

Zamrzovanje / odmrzovanje 3 cikli zamrzovanja na ≤ -60 °C (24 ur) in

odmrzovanja na sobni temperatura (24 ur)

po 150 µL


29

Preglednica X: Naĉrt izvedenih analiz

Čas / Analize RPC CEC SEC +

MALS DLS BA

0 √ √ √ √ √

7d √ √ √

1m √ √ √ √ √

3m √ √ √ √ √

Stresanje √ √ √ (samo SEC)

Zamrzovanje

/odmrzovanje

√ √ √ (samo SEC)

3.2.4 Analizna kromatografija

Kromatografske analize smo izvedli na HPLC sistemu Agilent z UV detektorjem (tip DAD),

fluorescenĉnim detektorjem (FLD) in detektorjem MALS miniDAWN TREOS. Podatke smo

obdelali s programom Empower2 (za analize RPC, CEC in SEC) in Astra V (za analizo

MALS).

3.2.4.1 Kromatografija na reverzni fazi (RPC)

Pri tej metode izkorišĉamo razlike v hidrofobnosti proteinov. Loĉitev poteka na nepolarnem

nosilcu z uporabo bolj polarnih mobilnih faz. Princip metode je porazdeljevanje komponent

vzorca med fazama, bolj kot je komponenta vzorca hidrofobna, dlje se zadrţuje na koloni

(21). Stacionarna faza je silikagel, ki je ponavadi derivatiziran s hidrofobno oktilno (C8) ali

oktadecilno (C18) skupino. Najpogosteje so mobilne faze vodne raztopine acetonotrila ali

metanola.

Vzorce smo nanesli na kolono YMC-ODS-AQ, ki ima stacionarno fazo z vezanimi C18

skupinami. Za mobilni fazi A in B smo uporabili razliĉni raztopini acetonitrila, z dodatkom

trifluoroocetne kisline. Loĉitev je potekala pri pretoku 1 mL/min s 35-minutnim gradientom,

ki je prikazan v preglednici XI. Temperatura kolone je bila 65 °C. Nanos vzorcev na kolono je

bil 10 µg (vzorce smo predhodno redĉili s pufrom p1 ali p2 na 1 mg/mL). Uporabili smo

fluorescenĉno detekcijo (ekscitacija pri 280 nm in emisija pri 345 nm).


30

Preglednica XI: Gradient RPC metode

Čas [min] % Mobilna faza A RPC

0 60

2 60

27 35

27,1 0

28 0

28,1 95

29 95

29,1 0

31 0

31,1 60

35 60

3.2.4.2 Kationsko-izmenjevalna kromatografija (CEC)

Pri metodi izkorišĉamo elektrostatske interakcije med nabitimi proteini in matriksom

stacionarne faze. Stacionarna faza je sestavljena iz osnovnega matriksa, na katerega so pripeti

ionski izmenjevalci, ki imajo na svoji površini skupine z nabojem. Princip kationsko-

izmenjevalne kromatografije je vezava proteinov z pozitivnim nabojem na negativno nabite

skupine kationskega izmenjevalca. Molekule s pozitivnim nabojem se prve eluirajo s kolone.

Elucija vezanih komponent pa poteka s pomoĉjo elucijskega pufra, ki ima drugaĉno ionsko

jakost ali pH kot vezavni pufer (1, 21).

Vzorce smo nanesli na kolono TSKgel SP-5PW, ta ima na stacionarno fazo vezane moĉne

kationske izmenjevalce. Za mobilni fazi A in B smo uporabili raztopini natrijevega fosfata z

razliĉno ionsko jakostjo. Loĉitev je potekala pri pretoku 1 mL/min s 50-minutnim gradientom,

ki je prikazan v preglednici XII. Temperatura kolone je bila 25 °C. Nanos vzorcev na kolono

je bil 10 µg (vzorce smo predhodno redĉili s pufrom p1 ali p2 na 1 mg/mL). Uporabili smo

fluorescenĉno detekcijo (ekscitacija pri 280 nm in emisija pri 345 nm).


31

Preglednica XII: Gradient CEC metode

Čas [min] % Mobilna faza A CEC

0 100

3 100

43 0

45 0

45,1 100

50 100

3.2.4.3 Gelska kromatografija (SEC)

Analize SEC za vzorce PEGprotein_a in PEGprotein_t smo izvedli na koloni TSKgel

G3000SWXL z 250 Å porami. Uporabili smo mobilno fazo SEC PEGprotein pri pretoku 0,7

mL/min. Vzorce smo analizirali s 30-minutno izokratsko metodo, pri kateri je bila

temperatura kolone 30 °C. Nanos vzorcev na kolono je bil 10 µg (neredĉeni vzorci). Uporabili

smo UV detekcijo pri 214 nm.

Analize SEC za vzorce Protein_t smo izvedli na koloni BioBasic SEC 300 s 300 Å porami.

Uporabili smo mobilno fazo SEC Protein pri pretoku 0,75 mL/min. Vzorce smo analizirali s

25-minutno izokratsko metodo, analiza je bila izvedena pri sobni temperaturi (temperatura

kolone ni bila kontrolirana). Nanos vzorcev na kolono je bil 35 µg (vzorcev nismo redĉili).

Uporabili smo fluorescenĉno detekcijo (ekscitacija pri 279 nm in emisija pri 341 nm).

3.2.4.4 SEC-MALS

Separacijo smo izvedli z gelsko kromatografijo, z detekcijo MALS pa smo spremljali

agregacijo proteinov. Podatke smo obdelali z programom Astra V.

Analize SEC-MALS smo izvedli na enaki koloni, temperaturi kolone, sestavi in pretoku

mobilne faze ter nanosu vzorca kot analizo SEC. Za detekcijo smo uporabili dva detektorja.

Prvi je detektor MALS miniDAWN TREOS, ta zaznava statiĉno sipanje svetlobe pri treh

kotih (45°, 90° in 135°), in drugi je detektor RI, ta nam poda informacijo o koncentraciji

vzorca. S pomoĉjo programa Astra V smo izraĉunali molekulske mase proteina, PEG-a in

celotnega vzorca.


32

Detektor MALS miniDAWN TREOS smo pred analizo vzorcev umerili s standardom BSA,

kar zajema normalizacijo detektorja (premer BSA je 3,5 nm), poravnavo vrhov (angl.

alignment) in poravnavo širine vrhov (angl. band broadening). Pripravili smo raztopino BSA s

koncentracijo 10 mg/mL in injicirali na kolono 50 µg tako pripravljene raztopine.

3.2.5 DLS, tehnika dinamičnega sipanja svetlobe

Vzorce smo centrifugirali 10 min pri 13000 rpm in jih nanesli v jamice mikrotitrske plošĉice.

Za vsak vzorec smo izvedli meritev trikrat pri sipalnem kotu θ = 90°. Za obdelavo podatkov

smo uporabili program Zetasizer APS. Nanos vzorcev je bil 40 µL, nanesli smo neredĉene

vzorce. Meritve smo izvajali pri temperaturi 25 °C.

3.2.6 Ugotavljanje biološke aktivnosti in vitro

Ugotavljanje biološke aktivnosti in vitro smo izvajali na celiĉni liniji CHO, ki vsebuje gen za

poroĉevalski encim, sekretorno alkalno fosfatazo. CHO celiĉna linija izvira iz ovarijskih celic

kitajskega hrĉka in raste pritrjeno. Rastno gojišĉe je sestavljeno iz 90 % gojišĉa F-12K in

10 % toplotno inaktiviranega fetalnega govejega seruma brez antibiotikov.

Test temelji na principu, da se po dodatku proteina v gojišĉe izloĉa sekretorna alkalna

fosfataza. Koncentracija sekretorne alkalne fosfataze je v doloĉenemu obmoĉju

proporcionalna koncentraciji dodanega proteina. Koncentracijo izloĉene fosfataze

kvantificiramo z dodatkom reagenta 4-nitrofenilfosfata, ta se ob prisotnosti fosfataze spremeni

v obarvan produkt 4-nitrofenol, kot je prikazano na sliki 4. Raztopini produkta

spektrofotometriĉno izmerimo absorbanco pri 405 nm. Biološko aktivnost ugotovimo s

primerjavo redĉin standarda in vzorca z uporabo programa PLA 1,2 (angl Parallel-Line

Assays).


33

O P O

O

O

NO2

O

NO2

OH2 O P O

O

O

H+

Sekretorna alkalnafosfataza+ + + 2

Absorbancapri 405 nm

Slika 4: Reakcija 4-nitrofenilfosfata s sekretorno alkalno fosfatazo

Potek testa: predhodno pripravljene celice smo nasadili v jamice mikrotitrske plošĉe in plošĉe

inkubirali 24 ur ob prisotnosti CO2, 100 % relativne zraĉne vlage pri temperaturi 37 °C. Nato

smo k celicam dodali redĉitve vzorcev in standardov. Po 48-urni inkubaciji pri opisanih

pogojih smo odvzeli iz jamic mikrotitrske plošĉe del gojišĉa ter ga prenesli na novo

mikrotitrsko plošĉo. Nato smo dodali reagent 4-nitrofenilfosfat in izmerili absorbanco pri 405

nm.

Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga REZULTATI IN RAZPRAVA

34

4. REZULTATI IN RAZPRAVA

4.1 Analizna kromatografija

4.1.1 Čistost RPC

Vsi vzorci so pri -60 °C in 4 °C stabilni (slika 5, RPC ĉistost -60 °C in RPC ĉistost 4 °C), v

treh mesecih se ĉistost glavnega vrha s ĉasom ne spreminja bistveno.

Pri 25 °C nastajajo razgradni produkti in deleţ glavnega vrha se s ĉasom zmanjšuje. Analiza

kaţe podoben trend za vse tri vzorce (Protein_t, PEGprotein_t in PEGprotein_a), med njimi ni

opaznih razlik v hitrosti zmanjševanja ĉistosti, kar je razvidno iz slike 5 (RPC ĉistost 25 °C).

Razlike med vzorci so vidne pri 40 °C. Na sliki 5 (RPC ĉistost 40 °C) vidimo, da se vzorcu

Protein_t deleţ glavnega vrha najbolj zmanjša, kar pomeni, da je pri tem vzorcu hitrost

nastanka razgradnih produktov najveĉja. PEGilirani razliĉici (PEGprotein_t in PEGprotein_a)

sta med seboj bolj primerljivi, vendar tudi tu po 30 dneh opazimo razliko – PEGprotein_t ima

ohranjen nekoliko veĉji deleţ glavnega vrha kot PEGprotein_a.

Slika 5: RPC ĉistost vzorcev Protein_t; PEGprotein_t in PEGprotein_a pri -60 °C,

4 °C, 25 °C in 40 °C


35

Izbrani pogoji stresanja in cikli zamrzovanja ter odmrzovanja ne vplivajo na ĉistost proteina

(slika 6).

Slika 6: RPC ĉistost vzorcev Protein_t; PEGprotein_t in PEGprotein_a, po stresanju

in ciklih zamrzovanja ter odmrzovanja

Razgradni produkti vzorca Protein_t, ki so nastali pri 40 °C (po 7 in 30 dneh) in se na

kromatogramu analize RPC vidijo kot poveĉani vrhovi pred in za glavnim vrhom proteina, so

na sliki 7 nakazani s pušĉicami.

Slika 7: Kromatogram analize RPC za vzorec Protein_t; zaĉetno stanje, po 7 dneh in

po 30 dneh pri 40 °C

: protein_t -60°C t0 : protein_t +40°C 7d : protein_t +40°C 1m

VP4

- 7,

523

VP3

- 8,

918

VP2

- 10

,790

VP1

- 11

,279

prot

ein

- 11,

611

NP1

- 12

,216

NP2

- 12

,700

NP3

- 13

,071

NP5

- 14

,297

15,7

71

LU

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

120,00

Minutes

0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00


VP4

- 7,

523

VP3

- 8,

918

VP2

- 10

,790

VP1

- 11

,279

prot

ein

- 11,

611

NP1

- 12

,216

NP2

- 12

,700

NP3

- 13

,071

NP5

- 14

,297

15,7

71

LU

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

Minutes

8,00 10,00 12,00 14,00 16,00


36

Pri vzorcu PEGprotein_t in PEGprotein_a se po izpostavljenosti temperaturnemu stresu

poviša deleţ nePEGiliranega proteina v vzorcu (del PEGproteina se razgradi v izhodni

protein), kar nakazuje modra pušĉica na slikah 8 in 9. Razgradni produkti temperaturnega

stresa se kaţejo tudi kot povišanje vrha NP1 (ki se nahaja pred vrhom diPEGprotein), rdeĉa

pušĉica na slikah 8 in 9. V vzorcih PEGprotein_t in PEGprotein_a vrh diPEGprotein, ki

vsebuje diPEGiliran produkt, ne narašĉa niti s ĉasom in tudi ne z višanjem temperature.

Slika 8: Kromatogram analize RPC za vzorec PEGprotein_t; zaĉetno stanje, po 7 dneh

in po 30 dneh pri 40 °C

: PEGprotein_t -60°C t0 : PEGprotein_t +40°C 7d : PEGprotein_t +40°C 1m

prot

ein

- 11,

759

VP1

- 18

,969

PEG

prot

ein

- 19,

557

NP1

- 21

,023

diPE

G-p

rote

in -

22,2

42

LU

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

Minutes

0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00


prot

ein

- 11,

759

VP1

- 18

,969

PEG

prot

ein

- 19,

557

NP1

- 21

,023

diPE

G-p

rote

in -

22,2

42

LU

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

9,00

Minutes

12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00


37

Slika 9: Kromatogram analize RPC za vzorec PEGprotein_a; zaĉetno stanje, po 7

dneh in po 30 dneh pri 40 °C

Glede na rezultate analize RPC ima PEGilacija zašĉitno vlogo pri temperaturni stabilnosti

zelo hidrofobnega proteina. Rezultati nakazujejo tudi zašĉitno vlogo trehaloze.

4.1.2 Čistost CEC

Vzorci so pri -60 °C in 4 °C stabilni, v treh mesecih se ĉistost s ĉasom tudi na analizi CEC ne

spreminja bistveno (slika 10 , CEC ĉistost -60 °C in CEC ĉistost 4 °C).

Pri povišanih temperaturah, 25 °C in 40 °C, nastajajo razgradni produkti in deleţ glavnega

vrha se s ĉasom zmanjšuje. Vzorcu Protein_t se je po izpostavitvi temperaturnemu stresu

deleţ glavnega vrha po 7 dneh pri 40 °C ter po 30 dneh pri 25 °C bistveno bolj zmanjšal kot

PEGiliranima razliĉicama PEGprotein_t in PEGprotein_a, kar je razvidno iz slike 10 (CEC

ĉistost 25 °C in CEC ĉistost 40 °C). Ob koncu stabilitetne študije (po 30 dneh pri 40 °C in po

90 dneh pri 25 °C) pa je ĉistost vzorca Protein_t primerljiva PEGiliranemu proteinu brez

dodatka trehaloze (PEGprotein_a).

: PEGprotein_a -60°C t0 : PEGprotein_a+40°C 7d : PEGprotein_a +40°C 1m

prot

ein

- 11,

773

VP1

- 18

,977

PEG

prot

ein

- 19,

564

NP1

- 21

,081

diPE

G-p

rote

in -

22,2

28

LU

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

Minutes

0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00

: PEGprotein_a -60°C t0 : PEGprotein_a+40°C 7d : PEGprotein_a +40°C 1m

prot

ein

- 11,

773

VP1

- 18

,977

PEG

prot

ein

- 19,

564

NP1

- 21

,081

diPE

G-p

rote

in -

22,2

28

LU

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

9,00

Minutes

12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00


38

Slika 10: CEC ĉistost vzorcev Protein_t; PEGprotein_t in PEGprotein_a pri -60 °C,

4 °C, 25 °C in 40 °C

Razgradni produkti, ki smo jih zaznali s CEC, so se eluirali kot vrhovi pred glavnim vrhom

(pri vseh vzorcih) in kot rama za glavnim vrhom pri nePEGiliranih vzorcih (vzorci Protein_t),

na sliki 11 in 12 so razgradni produkti nakazani s pušĉicami.

Slika 11: Kromatogram analize CEC za vzorec Protein_t; zaĉetno stanje, po 7 dneh in

po 30 dneh pri 40 °C


VP2

- 20

,606

VP1

- 22

,998

prot

ein

- 25,

426

LU

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

14,00

Minutes

0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 45,00 50,00


39

Slika 12: Kromatogram analize CEC za vzorec PEGprotein_t in PEGprotein_a;

zaĉetno stanje, po 7 dneh in po 30 dneh pri 40 °C

Razgradni produkti, ki so se eluirali kot vrhovi pred glavnim vrhom (VP), vsebujejo

predvidoma deamidirane produkte in smo jih ovrednotili posebej. Deamidirani produkti se na

CEC analizi eluirajo pred glavnim vrhom zato, ker imajo manj pozitivnih nabojev in se

šibkeje veţejo na kolono.

V vzorcih pri -60 °C in 4 °C se deleţ VP ne spreminja bistveno, zato so na sliki 11 in 12

prikazani le CEC rezultati stabilitetne študije pri povišanih temperaturah, pri 25 °C in 40 °C.

Pri povišani temperaturi je deleţ predvidoma deamidiranih produktov (VP) višji v vzorcu

PEGprotein_a, kot v vzorcih z dodatkom trehaloze, Protein_t in PEGprotein_t.

Slika 13: Deleţ vrhov VP – predvidoma deamidirani produkti v vzorcih Protein_t;

PEGprotein_t in PEGprotein_a


VP

3 -

9,8

20

VP

2 -

11

,41

5V

P1

- 1

2,5

69

PE

G-p

rote

in -

14

,20

0

pro

tein

- 2

7,1

10

LU

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

100,00

Minutes

0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00


VP

3 -

9,8

20

VP

2 -

11

,41

5

VP

1 -

12

,56

9

PE

G-p

rote

in -

14

,20

0

LU

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

9,00

Minutes

8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00

: PEGprotein_a -60°C t0 : PEGprotein_a +40°C 7d : PEGprotein_a +40°C 1m

VP

3 -

9,8

80

VP

2 -

11

,41

4V

P1

- 1

2,5

49

PE

G-p

rote

in -

14

,18

8

pro

tein

- 2

7,4

24

LU

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

100,00

Minutes

0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00


VP

3 -

9,8

80 V

P2 -

11,4

14

VP

1 -

12,5

49

PE

G-p

rote

in -

14,1

88

LU

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

9,00

Minutes

8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00


40

Izbrani pogoji stresanja in cikli zamrzovanja / odmrzovanja ne vplivajo na stabilnost

PEGiliranega proteina, ne glede na dodatek trehaloze (slika 14).

Slika 14: CEC ĉistost vzorcev Protein_t; PEGprotein_t in PEGprotein_a, po stresanju

in ciklih zamrzovanja ter odmrzovanja

Glede na analizo CEC, je bil med testiranimi vzorci najbolj stabilen PEGprotein_t, t.j.

PEGiliran protein z dodatkom trehaloze. Rezultati tudi kaţejo, da pri krajši izpostavitvi

temperaturnemu stresu PEGilacija deluje zašĉitno. Ob daljši izpostavitvi imajo pomembno

zašĉitno vlogo pomoţne snovi, dodane v formulacijo, v našem primeru trehaloza.

4.1.3 Čistost SEC

Vzorci so pri -60 °C in 4 °C stabilni, v treh mesecih se deleţ višjemolekularnih produktov (t.j.

vrh hMW2 pri vzorcih Protein_t oziroma vrh hMW2+hMW3 pri vzorcih PEG_protein) s

ĉasom ne spreminja bistveno (slika 15, SEC deleţ hMW2 -60 °C in SEC deleţ hMW2 4 °C).

Pri vseh vzorcih vrh hMW1 ne narašĉa niti s ĉasom niti z višanjem temperature, ta vrh

verjetno vsebuje diPEGiliran produkt (slika 17, 18 in 19). Vrh hMW2 (v vzorcih Protein_t in

PEGprotein_t) in vsota vrhov hMW2+hMW3 (v vzorcih PEGprotein_a), ki vsebujejo

oligomere / agregate, narašĉajo z obema parametroma.


41

Slika 15: SEC deleţ agregatov v vzorcih Protein_t; PEGprotein_t in PEGprotein_a

Izbrani pogoji stresanja in cikli zamrzovanja / odmrzovanja ne vplivajo na stabilnost

nePEGiliranega in PEGiliranega proteina (slika 16).

Slika 16: SEC deleţ agregatov v vzorcih Protein_t; PEGprotein_t in PEGprotein_a,

po stresanju in ciklih zamrzovanja ter odmrzovanja

Oligomeri / agregati pospešeno nastajajo pri povišanih temperaturah. Pri 25 °C je njihov deleţ

najbolj poveĉan v vzorcu Protein_t (slika 17), sledi PEGprotein_a (slika 19). Pri vzorcu

PEGprotein_t deleţ oligomerov / agregatov pri 25 °C po 90 dneh ni poveĉan glede na stanje

po 30 dneh in izhodno stanje (slika 18).

Tudi pri 40 °C je bil najbolj stabilen vzorec PEGprotein_t (slika 18). Vzorca Protein_t (slika

17) in PEGprotein_a (slika 19) imata bistveno bolj poveĉan deleţ agregatov, po 30 dneh


42

PEGprotein_a celo bolj kot Protein_t. Vendar moramo upoštevati, da smo analizo SEC

izvajali z dvema razliĉnima metodama, posebej za Protein_t in posebej za vzorca PEGprotein.

Nobena od metod namreĉ ni omogoĉala zanesljive detekcije agregatov hkrati za protein in za

PEGprotein, zato smo izbrali kromatografski koloni in mobilni fazi, optimizirani za

posamezno vrsto molekule.

Slika 17: Kromatograma analize SEC za vzorec Protein_t; zaĉetno stanje, pri 25 °C (po

30 in po 90 dneh) ter pri 40 °C (po 7 in po 30 dneh)

Slika 18: Kromatograma analize SEC za vzorec PEGprotein_t; zaĉetno stanje, pri 25

°C (po 30 in po 90 dneh) ter pri 40 °C (po 7 in po 30 dneh)

: Protein_t -60°C t0 : Protein_t +40°C 7d : Protein_t +40°C 1m

hM

W2

- 8

,44

5h

MW

1 -

8,9

97

pro

tein

- 1

0,1

02

LU

0,00

50,00

100,00

150,00

200,00

250,00

300,00

Minutes

0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00

: Protein_t -60°C t0 : Protein_t +40°C 7d : Protein_t +40°C 1m

hM

W2

- 8

,44

5

hM

W1

- 8

,99

7 pro

tein

- 1

0,1

02

LU

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

Minutes

6,00 7,00 8,00 9,00 10,00 11,00 12,00

: Protein_t -60°C t0 : Protein_t +25°C 1m : Protein_t +25°C 3m

hM

W2

- 8

,44

5h

MW

1 -

8,9

97

pro

tein

- 1

0,1

02

LU

0,00

50,00

100,00

150,00

200,00

250,00

300,00

Minutes

0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00

: Protein_t -60°C t0 : Protein_t +25°C 1m : Protein_t +25°C 3m

hM

W2

- 8

,44

5

hM

W1

- 8

,99

7

pro

tein

- 1

0,1

02

LU

-10,00

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

Minutes

7,00 8,00 9,00 10,00 11,00 12,00

: PEGprotein_t -60°C t0 : PEGprotein_t +25°C 1m : PEGprotein_t +25°C 3m

hM

W2

- 7

,78

6h

MW

1 -

8,2

99

PE

Gp

rote

in -

9,3

68

pro

tein

- 1

5,3

01

AU

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

1,60

Minutes

0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00

: PEGprotein_t -60°C t0 : PEGprotein_t +25°C 1m : PEGprotein_t +25°C 3m

hM

W2

- 7

,78

6

hM

W1

- 8

,29

9

PE

Gp

rote

in -

9,3

68

AU

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

Minutes

7,00 8,00 9,00 10,00 11,00


hM

W2

- 7

,78

6h

MW

1 -

8,2

99

PE

Gp

rote

in -

9,3

68

pro

tein

- 1

5,3

01

AU

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

1,60

Minutes

0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00


hM

W2

- 7

,78

6

hM

W1

- 8

,29

9

PE

Gp

rote

in -

9,3

68

AU

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

Minutes

7,00 7,50 8,00 8,50 9,00 9,50 10,00 10,50 11,00


43

Slika 19: Kromatogram analize SEC za vzorec PEGprotein_a; zaĉetno stanje, pri 25 °C

(po 30 in po 90 dneh) ter pri 40 °C (po 7 in po 30 dneh)

Iz analize SEC lahko zakljuĉimo, da je imela najveĉjo zašĉitno vlogo pri agregaciji zelo

hidrofobnega proteina kombinacija PEGilacije in trehaloze (PEGprotein_t). V vzorcu

PEGprotein_a se je namreĉ kljub PEGilaciji deleţ oligomerov / agregatov poveĉal bistveno

bolj kot v vzorcu PEGprotein_t. Ravno tako se je v vzorcu Protein_t kljub prisotnosti

trehaloze deleţ oligomerov / agregatov poveĉal bistveno bolj kot v vzorcu PEGprotein_t.

4.1.4 Ugotavljanje molekulske mase s SEC-MALS

Molekulska masa proteina, ki smo ga uporabili v naši študiji, je 18,5 kDa. PEGiliran protein

ima pripeto 30 kDa verigo linearnega polietilenglikola. Na slikah 20 in 21 sta prikazana

tipiĉna kromatograma SEC-MALS za protein in PEGprotein.

: PEGprotein_a -60°C t0 : PEGprotein_a +25°C 1m : PEGprotein_a +25°C 3m

hM

W2

- 7

,78

6h

MW

1 -

8,2

99

PE

Gp

rote

in -

9,3

73

pro

tein

- 1

5,3

17

AU

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

1,60

1,80

Minutes

0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00

: PEGprotein_a -60°C t0 : PEGprotein_a +25°C 1m : PEGprotein_a +25°C 3m

hM

W2

- 7

,78

6

hM

W1

- 8

,29

9

PE

Gp

rote

in -

9,3

73

AU

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

0,20

0,22

0,24

Minutes

7,00 8,00 9,00 10,00 11,00 12,00


hM

W2

- 7

,78

6h

MW

1 -

8,2

99

PE

Gp

rote

in -

9,3

73

pro

tein

- 1

5,3

17

AU

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

1,60

1,80

Minutes

0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00


hM

W2

- 7

,78

6

hM

W1

- 8

,29

9

PE

Gp

rote

in -

9,3

73

AU

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

0,20

0,22

0,24

Minutes

7,00 8,00 9,00 10,00 11,00 12,00


44

Slika 20: Kromatogram SEC-MALS za vzorec Protein_t

Slika 21: Kromatogram SEC-MALS za vzorec PEGprotein (PEGprotein_a)

4.1.4.1 Ugotavljanje molekulske mase izhodnih vzorcev

V izhodnih vzorcih smo ugotovili molekulske mase izhodnega proteina in PEGproteina ter

vrhov hMW1 in hMW2, kar je prikazano v preglednicah XIII in XIV.

Preglednica XIII: Ocene MALS molekulskih mas posameznih vrhov, ki jih loĉimo s

kromatografijo SEC za vzorec Protein_t

MW [kDa] Razmerje MW

Vzorec Protein hMW1 hMW 2 hMW1/protein hMW2/protein

Protein_t #1 19,6 41,0 85 2 4

Oblika proteina monomer dimer oligomeri /

agregati

Legenda: # - številka meritve

hMW2Protein

hMW1

PEGprotein

hMW2

hMW3 hMW1


45

Izhodnemu vzorcu Protein_t smo ugotovili molekulsko maso 19,6 kDa, kar je za tehniko

MALS sprejemljivo odstopanje (± 10 %) od dejanske molekulske mase (18,5 kDa). Iz

razmerja molekulskih mas (razmerje MW) smo ugotovili naravo višjemolekularnih vrst, ki jih

loĉimo s kromatografijo SEC. Molekulska masa, ki smo jo ugotovili pri vrhu hMW1 je

pribliţno dvakrat veĉja od proteina, kar pomeni, da je v vrhu hMW1 preteţno dimerna oblika

proteina. Rezultat za vrh hMW2 je pribliţno štirikrat veĉja molekulska masa v primerjavi s

proteinom. V vrhu hMW2 so torej preteţno prisotni oligomeri proteina (preglednica XIII).

Preglednica XIV: Ocene MALS molekulskih mas posameznih vrhov, ki jih loĉimo s

kromatografijo SEC za vzorca PEGprotein_t in PEGprotein_a


Vzorec PEG

protein

hMW1 hMW 2 hMW1/

PEGprotein

hMW2/

PEGprotein

PEGprotein_t #1 protein 17,0 33,2 315 2 19

PEGprotein_t #2 protein 17,2 52,2 345 3 20

PEGprotein_a #1 protein 18,0 32,9 221 2 12

PEGprotein_a #2 protein 17,7 33,4 256 2 14

PEGprotein_t #1 PEG 28,5 113 485 4 17

PEGprotein_t #2 PEG 28,1 118 470 4 17

PEGprotein_a #1 PEG 29,1 119 492 4 17

PEGprotein_a #2 PEG 28,8 125 531 4 18

Oblika

PEGproteina

monomer diPEGiliran

dimer

oligomeri /

agregati

Legenda: # - številka meritve

V izhodnih vzorcih PEGprotein_t in PEGprotein_a smo loĉeno ocenili proteinski del

molekule in PEG del molekule: ugotovili smo molekulsko maso proteina in molekulsko maso

PEG v posameznih vrhovih, ki jih loĉimo s kromatografijo SEC.

Proteinu smo ugotovili molekulske mase med 17,0 kDa in 18,0 kDa in PEG-u pa molekulske

mase med 28,1 kDa in 29,1 kDa. Odstopanje molekulskih mas od dejanskih je znotraj

sprejemljivih ± 10 % od dejanskih vrednosti (18,5 kDa protein in 30 kDa PEG). Iz razmerja

molekulskih mas (razmerje MW) smo ponovno ugotovili naravo višjemolekularnih vrst v


46

vrhovih hMW1 in hMW2. V vrhu hMW1 je molekulska masa proteinskega dela molekule

pribliţno dvakrat veĉja od molekulske mase proteina v molekuli PEGprotein, molekulska

masa PEG dela molekule pa pribliţno štirikrat veĉja od molekulske mase PEG v molekuli

PEGprotein. V vrhu hMW1 je torej preteţno diPEGilirana dimerna oblika proteina.

Molekulske mase, ki smo jih ugotovili vrhovom hMW2 so v primerjavi z monomeri

PEGprotein 12 – 20-krat veĉje, kar pomeni, da so v tem vrhu prisotni preteţno oligomeri /

agregati molekul PEGprotein (preglednica XIV).

4.1.4.2 Ugotavljanje molekulske mase stabilitetnih vzorcev

V vzorcih temperaturne stabilnosti smo spremljali molekulsko maso hMW2. Deleţ hMW1 se

namreĉ s ĉasom ne spreminja, kar je razvidno iz kromatogramov in rezultatov analiz SEC.

V stabilitetnih vzorcih Protein_t smo z MALS ugotovili molekulske mase glavnega vrha med

18,0 kDa in 19,6 kDa. Odstopanje molekulskih mas od dejanske (18,5 kDa) je znotraj

sprejemljivih ± 10 %. Rezultati stabilitetnih vzorcev Protein_t so prikazani v preglednici XV

in sliki 22.

Preglednica XV: Ocene MALS molekulskih mas vrhov hMW2 za vzorec Protein_t


Vzorec Protein hMW 2 hMW2/ Protein

protein_t -60°C t0 19,6 85 4

protein_t +4°C 1m 18,4 128 7

protein_t +4°C 3m 19,3 159 8

protein_t +25°C 1m 18,1 139 8

protein_t +25°C 3m 18,3 146 8

protein_t +40°C 7d 18,6 224 12

protein_t +40°C 1m 18,0 493 27


47

Slika 22: Narašĉanje molekulske mase hMW2 s ĉasom v vzorcih Protein_t

Pri temperaturnem stresu poleg narašĉanja deleţa oligomerov / agregatov (analiza SEC, slika

15 in 17) narašĉa tudi velikost oligomerov / agregatov, ki jih s SEC loĉimo v vrhu hMW2.

Poveĉanje molekulske mase je najbolj izrazito pri 40 °C, zato sklepamo, da so po 3 mesecih

pri 40 °C nastali tudi pravi agregati.

Rezultati stabilitetnih vzorcev PEGprotein_t in PEGprotein_a so prikazani v preglednici XVI

in na slikah 23, 24. Dejanska celokupna molekulska masa konjugatov PEGprotein je 48,5 kDa

(18,5 kDa protein in 30 kDa PEG). V vzorcih PEGprotein smo spremljali celokupno

molekulsko maso hMW2 in jo primerjali s celokupno maso monomernega konjugata.

Preglednica XVI: MALS ocene molekulskih mas vrhov hMW2 za vzorca PEGprotein_t

in PEGprotein_a


Vzorec PEGprotein hMW 2 hMW2 / PEGprotein

PEGprotein_t -60°C t0 45,3 790 17

PEGprotein_t +4°C 1m 45,8 652 14

PEGprotein_t +4°C 3m 45,6 772 17

PEGprotein_t +25°C 1m 45,6 710 16

PEGprotein_t +25°C 3m 45,3 751 17

PEGprotein_t +40°C 7d 45,2 757 17

PEGprotein_t +40°C 1m 45,0 878 20

PEGprotein_a -60°C t0 46,5 787 17

PEGprotein_a +4°C 1m 45,9 713 16

PEGprotein_a +4°C 3m 45,6 741 16

PEGprotein_a +25°C 1m 45,5 809 18


48


Vzorec PEGprotein hMW 2 hMW2 / PEGprotein

PEGprotein_a +25°C 3m 46,5 1213 26

PEGprotein_a +40°C 7d 46,0 874 19

PEGprotein_a +40°C 1m 47,2 1030 22

Slika 23: Narašĉanje molekulske mase hMW2 s ĉasom v vzorcih PEGprotein_t

Slika 24: Narašĉanje molekulske mase hMW2 in hMW3 s ĉasom v vzorcih

PEGprotein_a

Z MALS smo ugotovili molekulske mase monomernega konjugata v stabilitetnih vzorcih med

45,0 kDa in 47,2 kDa. Odstopanje molekulskih mas od dejanske (48,5 kDa) je znotraj

sprejemljivih ± 10 %.

Pri temperaturnem stresu velikost oligomerov / agregatov, ki jih s SEC loĉimo v vrhu hMW2,

s ĉasom narašĉa. V vzorcih PEGprotein_t je rahlo poveĉanje opazno samo pri 40 °C, medtem

ko je v vzorcih PEGprotein_a izrazito ţe pri 25 °C. V vzorcih PEGprotein_a, hranjenih pri

25 °C, smo zaznali populacijo vrst z bistveno veĉjo molekulsko maso od hMW2 in jo


49

poimenovali hMW3. Glede na molekulsko maso so v vrhu hMW3 verjetno pravi agregati,

medtem ko so v vrhu hMW2 veĉji oligomeri / agregati.

Iz prisotnosti vrha hMW3 pri vzorcu PEGprotein_a in odsotnosti vrha hMW3 pri vzorcu

PEGprotein_t lahko sklepamo naslednje. V vzorcih PEGprotein_t populacija hMW3 ni

nastajala, kar potrjuje zašĉitno vlogo trehaloze pri agregaciji. Zanimivo je, da vrst hMW3 v

vzorcu PEGprotein_a pri 40 °C nismo zaznali. Morda so pri tej temperaturi nastali netopni

agregati, ki ne morejo potovati po matriksu gelske kolone in ostanejo na koloni.

Analiza SEC-MALS potrjuje, da pri povišani temperaturi in s ĉasom nastajajo oligomeri /

agregati z višjo molekulsko maso, ki jih je v zaĉetnem vzorcu mnogo manj. Analiza tudi

potrjuje, da so v vrhu hMW1 prisotni diPEGilirani produkti, medtem ko vrh hMW2 vsebuje

oligomere / agregate.

4.2 DLS

Vzorce smo analizirali tudi s tehniko dinamiĉnega sipanja svetlobe (DLS). Ugotovili smo

posamezne populacije v vzorcih in njihove hidrodinamske radije (Rh). DLS smo uporabili kot

dopolnilo tehniki SEC-MALS, saj s SEC ne detektiramo morebitno prisotnih netopnih

agregatov, z MALS pa ne moremo ugotoviti radija molekul, manjših od 10 nm.

V preglednici XVII so prikazani rezultati meritev – porazdelitev velikosti populacij glede na

intenziteto sipanja svetlobe v vzorcih. Zaznali smo prisotnost veĉ populacij. Prvi vrh v

vsakem posameznem vzorcu je monomeren protein ali PEGprotein. Polidisperznost (PD%)

teh vrhov je pod 20 %, kar pomeni, da so populacije teh molekul monodisperzne (preglednica

XVIII). Druge populacije najverjetneje ne ustrezajo povsem populacijam, loĉenim s

kromatografijo SEC (hMW1, hMW2 in hMW3), zato smo jih poimenovali pop1, pop2, pop3

in pop4. Posameznim populacijam smo ugotovili hidrodinamske radije (preglednice XIX-

XXI).


50

Preglednica XVII: Porazdelitev velikosti populacij glede na intenziteto sipanja svetlobe v

vzorcih Protein_t; PEGprotein_t in PEGprotein_a

Protein_t PEGprotein_t PEGprotein_a

t0

+4 °C

3m

25 °C

1m

25 °C

3m

40 °C

1m


51

Zaradi dinamike populacij v vzorcih meritve DLS niso popolnoma ponovljive. Zato smo pri

vsakem vzorcu izvedli tri ponovitve merjenja. V primerjavi z izhodnimi vzorci (t0) so pri

posameznih stabilitetnih vzorcih vidne vmesne populacije oligomerov in trend veĉanja

oligomerov do konĉne velikosti oligomerov / agregatov (preglednica XVII). V nasprotju z

monodisperznim proteinom oziroma PEGproteinom so populacije pop1 – pop4 polidisperzne.

Preglednica XVIII: Polidisperznost populacij (protein in PEGprotein) v vzorcih (PD%)

Vzorec

Protein_t

PD%

protein

Vzorec

PEGprotein_t

PD%

PEGprotein

Vzorec

PEGprotein_a

PD%

PEGprotein

-60 °C t0 17,7 -60 °C t0 10,6

-60 °C t0 8,5

4 °C 3m 22,0 4 °C 3m 10,1

4 °C 3m 10,2

25 °C 1m 19,6 25 °C 1m *

25 °C 1m 11,5

25 °C 3m 15,2 25 °C 3m 10,1

25 °C 3m 12,2

40 °C 1m 22,0 40 °C 1m 10,5

40 °C 1m 12,9

*nismo zaznali vrha PEGprotein

V vzorcih Protein_t smo poleg monomernih molekul zaznali še prisotnost štirih populacij

višjemolekularnih vrst (preglednica XIX). Rh monomernih molekul je okoli 0,6 nm. Druge

populacije predvidoma predstavljajo oligomere, prehodne populacije in agregate.

V vzorcu, hranjenem 1 mesec pri 40 °C, smo zaznali delce velikosti 1 – 2 μm (pop4).

Predvidevamo, da so to veliki netopni agregati. Mikrometrske delce smo zaznali tudi v

vzorcih t0, 4 °C, 3 meseci in 25 °C, 3 meseci, vendar le v eni od treh meritev. Upoštevati

moramo tudi dejstvo, da je metoda zelo obĉutjiva na druge delce, ki niso del vzorca (npr.

prah), ter da moţnosti prisotnosti teh delcev ne moremo povsem izkljuĉiti. Da bi jih odstranili,

smo vzorce pred meritvami centrifugirali pri visokih obratih. Vzorcev nismo filtrirali zaradi

morebitnega vpliva na deleţ prisotnih agregatov.

Preglednica XIX: Vrednosti Rh v nm za vzorce Protein_t

Rh [nm]

vzorec protein pop1 pop2 pop3 pop4

Protein_t -60°C t0 0,6 - 0,7 1,3 - 2,0 11 - 18 77 - 94 2661*

Protein_t +4°C 3m 0,6 - 0,6 1,3 - 1,4 7 - 13 77 - 82 1790*

Protein_t +25°C 1m 0,4 - 0,5 1,0 - 1,5 6 - 10 67 - 84 195 - 632

Protein_t +25°C 3m 0,6 - 0,7 2,0 - 2,4 9 - 13 61 - 85 2371*

Protein_t +40°C 1m 0,6 - 0,8 1,8 - 2,8 12 - 13 1150 - 2275 *prisoten odziv samo v eni od treh ponovitev merjenja vzorca


52

Pripetje verige PEG poveĉa hidrodinamski radij molekule. Rh monomernih molekul vzorcev

PEGprotein (PEGprotein_t in PEGprotein_a) je okoli 4 nm (preglednici XX in XXI).

Rezultati DLS so za PEGprotein_a in PEGprotein_t primerljivi. Poleg monomernih molekul

PEGproteina smo zaznali še tri populacije višjemolekularnih vrst. Pri nekaterih vzorcih

zaznamo tudi prisotnost veĉjih delcev, velikosti 1 – 2 μm (pop3), vendar preteţno samo v eni

od treh meritev vzorca, zato ne moremo trditi, da gre za veĉje agregate. Veĉji delci so prisotni

tudi v izhodnem vzorcu PEGprotein_t. Enako kot pri vzorcu protein, tudi tu ne moremo

povsem izkljuĉiti moţnosti prisotnosti prašnih delcev.

Preglednica XX: Vrednosti Rh v nm za vzorce PEGprotein_t

Rh [nm]

vzorec PEGprotein pop1 pop2 pop3

PEGprotein_t -60°C t0 3,6 - 3,8 21* 130 - 188 771 - 2190

PEGprotein_t +4°C 3m 3,8 - 4,1 170 - 178 2677*

PEGprotein_t +25°C 1m 192 - 226

PEGprotein_t +25°C 3m 4,5 - 4,7 14 - 44 160 - 183

PEGprotein_t +40°C 1m 3,5 - 4,6 17 - 31 113 - 168

* odziv smo zaznali samo v eni od treh ponovitev merjenja vzorca

Preglednica XXI: Vrednosti Rh v nm za vzorce PEGprotein_a

Rh [nm]

vzorec PEGprotein pop1 pop2 pop3

PEGprotein_a -60°C t0 3,0 - 3,1 25 - 52 143 - 216

PEGprotein_a +4°C 3m 3,2 - 3,4 18 - 29 129 - 175

PEGprotein_a +25°C 1m 3,7 - 3,8 16 - 28 140 - 171 2481*

PEGprotein_a +25°C 3m 4,5 - 4,9 22 - 33 144 - 184

PEGprotein_a +40°C 1m 4,2 - 5,5 19 - 33 75 - 159 859*

* odziv smo zaznali samo v eni od treh ponovitev merjenja vzorca

Glede na rezultate meritev DLS lahko reĉemo, da je v vzorcih PEGprotein manj populacij z

izrazito poveĉanimi hidrodinamskimi radiji kot v vzorcih Protein_t. Ta rezultat nakazuje

veĉjo stabilnost vzorcev PEGprotein, kar smo opazili tudi z vsemi drugimi analizami.


53

4.3 Biološka aktivnost in vitro

Vzorcem temperaturne stabilnosti smo ugotovili biološko aktivnost in vitro s testom za

ugotavljanje biološke aktivnosti in vitro, da bi ugotovili ali se biološka aktivnost in vitro med

potekom stabilitetne študije spreminja. Ugotovili smo, da se biološka aktivnost in vitro

nePEGiliranih (Protein_t) in PEGiliranih vzorcev (PEGprotein_t in PEGprotein_a) pri

povišani temperaturi s ĉasom ohranja (slika 25).

Slika 25: Biološka aktivnost in vitro vzorcev Protein_t; PEGprotein_t in

PEGprotein_a pri, 4 °C, 25 °C in 40 °C

Za vsak vzorec smo biološko aktivnost izmerili v treh paralelkah, rezultati meritev so precej

variabilni, predvsem za PEGilirane vzorce. Znano je, da PEGilacija proteina obiĉajno zniţa

njegovo biološko aktivnost in vitro, naše izmerjene vrednosti biološke aktivnosti in vitro pa so

za PEGilirane vzorce nepriĉakovano višje kot za nePEGilirane. Izmerjena višja biološka

aktivnost in vitro po PEGilaciji bi lahko bila tudi posledica izboljšane topnosti proteina. Gre

za izrazito hidrofoben protein, ki se zlahka adsorbira na stene vial, tako da bi bila lahko

izmerjena razlika pravzaprav posledica odsotnosti adsorpcije na stene vial pri vzorcih

PEGiliranega proteina v primerjavi z nemodificiranim proteinom.

Kljub variabilnosti in razlikam lahko trdimo, da bi s testom zaznali izrazite padce biološke

aktivnosti in vitro kot posledico razliĉnih pogojev shranjevanja za posamezne molekule.


54

Rezultati kaţejo, da so vzorci po izpostavitvi temperaturnemu stresu ohranili biološko

aktivnost in vitro.

Vsekakor pa bo za doseganje niţje variabilnosti med meritvami in bolj zanesljive rezultate

potreben nadaljnji razvoj testa za merjenje biološke aktivnosti in vitro.

Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga ZAKLJUĈEK

55

5. ZAKLJUČEK

V magistrski nalogi smo modelni hidrofobni protein v izbrani formulaciji z dodatkom

trehaloze (Protein_t) primerjali z njegovo PEGilirano razliĉico v formulaciji s trehalozo

(PEGprotein_t) in brez trehaloze (PEGprotein_a). Naš namen je bil ugotoviti, ali PEGilacija

lahko poveĉa stabilnost zelo hidrofobnega proteina. Izvedli smo test temperaturne stabilnosti

pri -60 °C, 4 °C in 25 °C (1 mesec in 3 mesece) ter pri 40 °C (7 dni in 1 mesec). Preverili smo

tudi vpliv stresanja in zamrzovanja / odmrzovanja na stabilnost vzorcev. Uporabili smo

analizne metode HPLC (RPC, CEC, SEC in SEC-MALS), DLS in vzorcem izmerili biološko

aktivnost in vitro.

Izbrani pogoji stresanja in zamrzovanja / odmrzovanja niso imeli vpliva na stabilnost izbranih

vzorcev. Prav tako so bili vzorci stabilni pri -60 °C in 4 °C. V nadaljevanju se zato

osredotoĉamo zgolj na pospešeno temperaturno stabilnost pri 25 °C in 40 °C.

S kromatografskima metodama RPC in CEC smo spremljali ĉistost vzorcev in nastanek

razgradnih produktov. Metodi sta potrdili zašĉitno vlogo PEGilacije, saj se je deleţ glavnega

vrha najbolj zmanjšal vzorcu Protein_t (Slika 5). Zašĉitno delovanje je bilo izrazito pri krajši

izpostavitvi temperaturnemu stresu (25°C 1 mesec in 40 °C 1 teden), medtem ko je ob daljši

izpostavljenosti (25 °C 3 meseci in 40 °C 1 mesec) k stabilnosti pomembno pripomogel tudi

dodatek trehaloze v tekoĉi farmacevtski obliki vzorca PEGprotein_t (slika 10). Glede na

analizo CEC je vzorec brez zašĉitnega sladkorja, PEGprotein_a, ob daljši izpostavljenosti

primerljiv vzorcu Protein_t. Dodatek trehaloze je upoĉasnil tudi nastajanje razgradnih

produktov, ki smo jih na kromatogramih CEC poimenovali VP in verjetno vsebujejo

deamidirane produkte (Slika 14).

Agregacijo vzorcev smo spremljali s tehnikami SEC, SEC-MALS in DLS. Pri rezultatih SEC

moramo upoštevati, da smo analize modelnega proteina in PEGiliranega modelnega proteina

izvajali z razliĉnima metodama, ki sta za posamezno vrsto molekule omogoĉali zanesljivo

detekcijo oligomerov / agregatov. Uporaba enotne metode ni bila mogoĉa, zato rezultatov

vzorcev Protein in PEGprotein ne moremo neposredno primerjati. Iz analize SEC lahko

zakljuĉimo, da ima trehaloza pomembno zašĉitno vlogo pri agregaciji PEGiliranega zelo

hidrofobnega proteina. Deleţ oligomerov / agregatov v vzorcu PEGprotein_a namreĉ kljub

PEGilaciji poraste bistveno bolj kot v vzorcu PEGprotein_t. Kljub temu, da smo uporabili

razliĉni metodi za Protein in PEGprotein, lahko sklepamo tudi na zašĉitno vlogo PEGilacije.


56

Deleţ oligomerov / agregatov v vzorcu Protein_t namreĉ kljub prisotnosti trehaloze moĉno

naraste (pribliţno 35 %, Slika 15), medtem ko je deleţ oligomerov / agregatov vzorcu

PEGprotein_t bistveno niţji (nekoliko nad 15 %). Vzorcev Protein brez zašĉitnega sladkorja

nismo testirali, saj je znano, da v optimizirani tekoĉi farmacevtski obliki brez dodatka

trehaloze ni stabilen.

S tehniko MALS smo ugotovili identiteto vrhov, ki jih loĉimo s kromatografijo SEC, v

izhodnih vzorcih. Vrhove z veĉjo molekulsko maso od monomernih molekul smo

poimenovali hMW1 in hMW2. Vrh hMW1 v vzorcu Protein_t predstavlja dimerne molekule

proteina in v vzorcih PEGprotein diPEGilirane dimerne molekule proteina. Vrh hMW2 v vseh

vzorcih predstavlja oligomere / agregate. Med potekom stabilitetne študije se deleţ hMW1 v

vzorcih ni spreminjal, medtem ko se je deleţ hMW2 veĉal. Poveĉevala se je tudi velikost

oligomerov / agregatov v vrhu hMW2, kar je razvidno iz preglednice XV in slike 22 za

Protein_t ter preglednice XVI in slik 23-24 za PEGprotein. Pri vzorcih PEGprotein opazimo

stabilizirajoĉi uĉinek trehaloze. Vzorcem PEGprotein_t se je namreĉ velikost oligomerov /

agregatov nekoliko poveĉala le pri 40 °C, medtem ko se je vzorcem PEG_protein_a izrazito

poveĉala ţe pri 25 °C. Poleg tega je v vzorcih PEGprotein_a pri 25 °C nastala populacija z

bistveno veĉjo molekulsko maso od hMW2, ki smo jo poimenovali hMW3. Glede na velikost

predvidevamo, da so v vrhu hMW3 pravi agregati, medtem ko so v vrhu hMW2 veĉji

oligomeri / agregati. V vzorcih PEGprotein_a, hranjenih pri 40 °C, vrha hMW3 nismo

zaznali. Sklepamo, da so pri tej temperaturi nastali netopni agregati in se niso eluirali s

kolone.

Z DLS smo ugotovili hidrodinamske radije (preglednice XIX –XXI) in polidisperznost

posameznih populacij. Rh monomerov molekul Protein_t je okoli 0,6 nm. Hidrodinamski

radij se s PEGilacijo bistveno poveĉa in je za vzorce PEGprotein okoli 4 nm. Populacije

monomerov so monodisperzne, medtem ko so ostale populacije, poimenovali smo jih pop1 –

pop4, polidisperzne. Rezultati za PEGprotein_a in PEGprotein_t so med seboj primerljivi, v

vzorcih Protein_t pa smo v povpreĉju zaznali veĉje število populacij kot v vzorcih

PEGprotein. Ta razlika bi lahko nakazovala veĉjo stabilnost vzorcev PEGprotein, vendar iz

dobljenih rezultatov DLS ne moremo zagotovo sklepati na zašĉitno delovanje PEGilacije in /

ali trehaloze. V primerjavi z izhodnimi vzorci (t0) so pri stabilitetnih vzorcih vidne predvsem

vmesne populacije oligomerov in trend veĉanja do konĉne velikosti oligomerov / agregatov

(Preglednica XVII).


57

Tako vzorci Protein kot tudi PEGprotein so po izpostavitvi temperaturnemu stresu ohranili

biološko aktivnost in vitro.

Z raziskavo smo potrdili izhodišĉno hipotezo magistrske naloge, PEGilacija zašĉitno deluje

pri stabilnosti zelo hidrofobnega proteina v tekoĉi farmacevtski obliki. Za zagotavljanje veĉje

stabilnosti je uĉinkovita predvsem kombinacija PEGilacije in stabilizirajoĉega dodatka, v

našem primeru trehaloze.

Karmen Ĉerkić: Magistrska naloga LITERATURA

58

6. LITERATURA

1. Štrukelj B, Kos J. Biološka zdravila: Od gena do uĉinkovine. Ljubljana. Slovensko

farmacevtsko društvo 2007; 673 str.

2. Kresse GB. Biosimilars - Science, status, and strategic perspective. Eur J Pharm Biopharm.

2009; 72: 479-486.

3. Rader AR. What is a Biopharmaceutical? Part 1: (Bio)Technology - Based Definitions.

BioExecutive Int 2005; 3: 60-65.

4. Wang S. Patent search on biologics as potentioal biosimilar candidates. World Patent

Inform 2011; 33: 67-71.

5. Direktiva 2004/27/ES. http://ec.europa.eu/health/files/eudralex/vol-

1/dir_2004_27/dir_2004_27_en.pdf. Dostop: september 2011.

6. Evropska agencija za zdravila.

http://www.ema.europa.eu/ema/index.jsp?curl=%2Fpages%2Fmedicines%2Flanding%2Fe

par_search.jsp&murl=menus%2Fmedicines%2Fmedicines.jsp&mid=WC0b01ac058001d1

24&searchTab=searchByAuthType&alreadyLoaded=true&isNewQuery=true&status=Aut

horised&status=Withdrawn&status=Suspended&status=Refused&keyword=Enter+keywor

ds&searchType=name&taxonomyPath=&treeNumber=&searchGenericType=biosimilars&

genericsKeywordSearch=Submit. Dostop: september 2011.

7. Rader AR. What is a generic Biopharmaceutical? Biopharmaceutical? Biogeneric? Follow-

on protein? Biosimilar? Follow-on biologic? Bioproc Intl 2007; 3: 28-38.

8. Zuniga L, Calvo B. Biosimilars approval process. Regul Toxicol Pharmacol 2010; 56: 374-

377.

9. Walsh G. Second-generation biopharmaceuticals. Eur J Pharm Biopharm 2004; 58: 185-

196.

10. Jevševar S, Kunstelj M, Gaberc Porekar V. PEGylation of therapeutic proteins. Biotechnol

J 2010; 5: 113-128.

http://ec.europa.eu/health/files/eudralex/vol-1/dir_2004_27/dir_2004_27_en.pdf

http://ec.europa.eu/health/files/eudralex/vol-1/dir_2004_27/dir_2004_27_en.pdf

http://www.ema.europa.eu/ema/index.jsp?curl=%2Fpages%2Fmedicines%2Flanding%2Fepar_search.jsp&murl=menus%2Fmedicines%2Fmedicines.jsp&mid=WC0b01ac058001d124&searchTab=searchByAuthType&alreadyLoaded=true&isNewQuery=true&status=Authorised&status=Withdrawn&status=Suspended&status=Refused&keyword=Enter+keywords&searchType=name&taxonomyPath=&treeNumber=&searchGenericType=biosimilars&genericsKeywordSearch=Submit







59

11. Kang JS, DeLuca PP, Lee KC. Emerging PEGylated drugs. Expert Opin Emerg Drugs

2009; 14: 363-380.

12. Roberts MJ, Bentley MD, Harris JM. Chemistry for peptide and protein PEGylation. Adv

Drug Deliv Rev 2002; 54: 459-476.

13. Hawe A, Friess W. Formulation development for hydrophobic therapeutic proteins.

Pharmaceut Dev Tech 2007; 12: 223-237.

14. Jorgensen L, Hostrup S, Horn Moeller E, Grohganz H. Recent trends in stabilising peptides

and proteins in pharmaceutical formulation – considerations in the choice of excipients.

Expert Opin Drug Deliv 2009; 6: 1219-1230.

15. Wang W. Instability, stabilization, and formulation of liquid protein pharmaceuticals. Int J

Pharm 1999; 185: 129-188.

16. Fidler K. Priprava in opredelitev dimerov Met-G-CSF in pegiliranih konjugatov.

Doktorska disertacija 2011. Univerza v Ljubljani, Medicinska fakulteta, Ljubljana.

17. Smilović V, Caserman S, Fonda I, Gaberc-Porekar V, Menart V. A novel reporter gene

assay for interferons based on CHO-K1 cells. J Immunol Meth 2008; 333: 192–196.

18. Bojardim CA, Ferreira PCP, Kroon EG. Interferons: Signaling, antiviral and viral evasion.

Immunol Lett 2009; 122: 1-11.

19. Pestka S, Krause CD, Walter MR. Interferons, interferonn-like cytokines, and their

receptors. Immunol Rev 2004; 202: 8-32.

20. Radhakrishnan R, Walter LJ, Hruza A, Reichert P, Trotta PP, Nagabhushan TL, Walter

MR. Zinc mediated dimer of human interferon-alpha 2b revealed by X-ray crystallography.

Structure 1996; 4: 1453-1463.

21. Karpusas M, Nolte M, Benton CB, Meier W, Lipscomb WN, Goelz S. The crystal structure

of human interferon beta at 2.2-A resolution. Proc Natl Acad Sci Unit States Am 1997; 94:

11813-11818.

22. Anderlini P, Przepiorka D, Champlin R, Korbling M. Biologic and clinical effects of

granulocyte colony-stimulating factor in normal individuals. Blood 1996; 88: 2819–2825.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Pestka%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Krause%20CD%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Walter%20MR%22%5BAuthor%5D


60

23. Crommelin DJA. Sindelar RD. Pharmaceutical biotehnology: An introduction for

pharmacists and pharmaceuticals scientists. Amsterdam, Harwood Academic Publishers

1997; 425 str.

24. Herron JN, Jiskoot W, Crommelin DJA. Chromatographic techniques for the

characterization of proteins. New York in London, Plenum Press 1995; 362 str.

25. Liu J, Andya JD, Shire SJ. A critical review of analytical ultracentrifugation and field flow

fractionation methods for measuring protein aggregation. AAPS J 2006; 8: E580-E589.

26. Fraunhofer W, Winter G. The use of asymmetrical flow field-flow fractionation in

pharmaceutics and biopharmaceutics. Eur J Pharm Biopharm 2004; 58: 369-383.

27. Messaud FA, Sanderson RD, Runyon JR, Otte T, Pasch H, Ratanathanawongs Williams

SK. An overview on field-flow fractionation techniques and their applications in the

separation and characterization of polymers. Progr Polymer Sci 2009; 34: 351-368.

28. Pekar A, Sukumar M. Quantitation of aggregates in therapeutic proteins using

sedimentation velocity analytical ultracentrifugation: Practical considerations that affect

precision and accuracy. Anal Biochem 2007; 367: 225-237.

29. Ye H. Simultaneous determination of protein aggregation, degradation, and absolute

molecular weight by size exclusion chromatography–multiangle laser light scattering. Anal

Biochem 2006; 356: 76-85.

30. Astra V User’s Guide 2008, Version 5.3.4 (M1000Rev. H). Wyatt Technology corporation

31. Tarazona MP, Saiz E. Combination of SE/MALS experimental procedures and theoretical

analysis for studying the solution properties of macromolecules. J Biochem Biophys Meth

2003; 56: 95-116.

32. Sipanje svetlobe. http://www.ias.ac.in/initiat/sci_ed/resources/chemistry/LightScat.pdf.

Dostop: september 2011.

33. Predstavitev seminar Wyatt. http://www.wyatt.eu/index.php?id=wyatt-seminar-

presentations. Dostop: september 2011.

http://www.ias.ac.in/initiat/sci_ed/resources/chemistry/LightScat.pdf

http://www.wyatt.eu/index.php?id=wyatt-seminar-presentations

http://www.wyatt.eu/index.php?id=wyatt-seminar-presentations


61

34. Wyatt PJ. Light scattering and the absolute characterization of macromolecules. Anal

Chim Acta 193; 272: 1-40.

35. Kusterle M, Jevševar S, Gaberc Porekar V. Size of pegylated protein conjugates studied by

various methods. Acta Chim Sloven 2008; 55: 594-601.

36. Arzenšek D. Proteinske interakcije v elektrolitskih raztopinah. Diplomsko delo 2010.

Univerza v Ljubljani, Fakulteta za matematiko in fiziko, Ljubljana

37. Dynamic Light Scattering: An Introduction in 30 minutes, Technical note, MRK656-01,

http://www.malvern.com, september 2011

38. Berne BJ, Pecora R. Dynamic light scattering: With application to chemistry, Biology and

Physics. New York, Dover Publications, Inc 2000; str. 376.

39. Intensity – Volume – Number, Which Size Is Correct? Technical note, MRK1357-01.

http://www.malvern.com. Dostop: september 2011.

40. What Is The Z-average? Frequently asked questions. http://www.malvern.com. Dostop:

september 2011.

41. What Does Polydispersity Mean? Frequently asked questions. http://www.malvern.com.

Dostop: september 2011.

42. Bernat BA, Lefers MA, Sanchez JC. Analysis of PEGylated Protein by Tetra Detection

Size Exclusion Chromatography. BioPharm Int Suppl 2011; 8: 10-14.

43. Filpula D, Zhao H. Releasable PEGylation of proteins with customized linkers. Adv Drug

Deliv Rev 2007; 60: 29-49.

http://www.malvern.com/




zaŠČitna vloga pegilacije pri stabilnosti zelo ...€¦ · fff pretoni sistem za loevanje...

Documents