Espectro-fotometra

Objetivos Nociones bsicas del espectro electromagntico.

Comprender los conceptos relativos a la interaccin entre la radiacin electromagntica y la materia, en los que se basan los mtodos espectroscpicos en general.

Enunciar la ley de Lambert Beer, comprender el significado de las magnitudes que intervienen en ella e interpretar la naturaleza de las desviaciones de esa ley.

Describir los componentes bsicos de los instrumentos para mediciones de absorcin de radiacin ultravioleta- visible, espectrofotmetros.

Aplicaciones de la espectrofotometra visible y ultravioleta.

Marco tericoEl espectro electromagntico:Desde Newton, sabemos que la luz blanca se descompone en los colores que la integran si la hacemos pasar a travs de un prisma. Es el efecto que se repite, por ejemplo en el arco iris, el cual se dice es el espectro de la luz visible procedente del sol, son las gotas de lluvia y el aire atmosfrico lo que hacen de espectroscopio. La principal emisin de radiacin de los cuerpos es la radiacin electromagntica en forma de luz visible, de la misma manera cada elemento qumico absorbe y emite luz de colores que componen su espectro.

La longitud de onda de la radiacin puede ser desde muy pequea, en el caso de la llamada radiacin gamma, hasta muy grande en las ondas de radio. Se mide, pues, usando desde nanmetros y ngstroms hasta cientos de metros. Recordemos que un nanmetro es la milmillonsima parte de un metro (1 m = 109 nm) y que un ngstrom es la diez mil millonsima parte de un metro (1 m = 1010 A), por lo que un nanmetro equivale a 10 ngstrom (1nm = 10 A) La luz que recibimos del Sol es radiacin electromagntica que se desplaza a 300.000 kms/s, en su totalidad, pero la longitud de onda no es la misma en todos los fotones luminosos, sino que vara entre los 4000 A y los 7000 A, aproximadamente, o lo que es lo mismo, entre los 400 nm y los 700 nm. La luz blanca se descompone, en definitiva, en un espectro de diferentes bandas coloreadas, cada una definida por una longitud de onda distinta. As, la luz de menor longitud de onda es la luz violeta, que es de alrededor de unos 4000 ngstroms, y la luz de mayor longitud de onda es la luz roja, que es de alrededor de unos 7000 mgstroms. Sin embargo, hay radiaciones de mayor y tambin de menor longitud de onda, es decir, que tienen una longitud de onda inferior a 4000 Angstroms y que tienen una longitud de onda superior a los 7000 Angstroms. Las radiaciones que van desde el violeta al rojo se dice que forman el espectro visible, pues proceden de la descomposicin de la luz blanca. Las radiaciones de longitud de onda inferior al violeta se llaman radiaciones ultravioletas, rayos X y rayos gamma, por orden decreciente en la longitud de onda. Las radiaciones de longitud de onda superior al rojo son las denominadas infrarrojas, microondas y ondas de radio, por orden creciente en longitud de onda.

Colores de la luz visible

Longitud de onda de la Color absorbidoColor observadoabsorcin mxima (nm).380 420 Violeta Amarillo - verdoso420 440Azul - violetaAmarillo440 470AzulNaranja470 500Verde - azulosoRojo500 520VerdePrpura520 550Verde amarillentoVioleta550 580AmarilloAzul - violeta580 620NaranjaAzul620 680RojoVerde - azuloso680 780Prpura Verde

TIPO DE RADIACIONIntervalos de las longitudes de onda

Rayos Gamma inferiores a 10-2 nanmetros

Rayos X entre 10-2 nanmetros y 15 nanmetros

Ultravioleta entre 15 nanmetros y 4.102 nanmetros

ESPECTRO VISIBLE entre 4.102 nanmetros y 7,8.102 nanmetros(4000 Angstroms y 7800 Angstroms)

Infrarrojo entre 7,8.102 nanmetros y 106 nanmetros

Regin de Microondas entre 106 nanmetros y 3.108 nanmetros

Ondas de Radio mayores de 3.108 nanmetros

(1 metro = 102 cms = 103 mms = 109 nanmetros = 1010 angstroms)

Carlos S. Chinea DidacticaFisica@casanchi.com. Enero, 2003

La luz visibleEs una regin muy estrecha pero la ms importante, ya que nuestra retina es sensible a las radiaciones de estas frecuencias. A su vez, se subdivide en seis intervalos que definen los colores bsicos (rojo, naranja, amarillo, verde, azul y violeta).Radiacin ultravioletaLos tomos y molculas sometidos a descargas elctricas producen este tipo de radiacin. No debemos olvidar que la radiacin ultravioleta es la componente principal de la radiacin solar.La energa de los fotones de la radiacin ultravioleta es del orden de la energa de activacin de muchas reacciones qumicas lo que explica muchos de sus efectos.

La radiacin electromagntica y su interaccin con la materia: Los modelos explicativos de la estructura de la materia que tienen como fundamento las caractersticas ondulatorias de las partculas que la constituyen proporcionan un marco de referencia conveniente para describir las interacciones entre la radiacin electromagntica y la materia. Estas interacciones a su vez son el fundamento de las aplicaciones espectroscpicas. La energa radiante se encuentra constituida por fotones cada uno de los cuales tiene como caracterstica una longitud de onda. Toda la radiacin electromagntica se mueve a la misma velocidad en el vaco y esa velocidad de desplazamiento en el vaco es la mxima observada en el universo. En algn medio material, la interaccin entre los campos elctricos y magnticos que existen en la materia y los correspondientes de la radiacin pueden llegara a reducir esa velocidad de propagacin; por esta razn es solamente en el vaco en donde se observa esa velocidad mximaSi se asigna una longitud de onda caracterstica a cada tipo de radiacin, la propagacin de esa onda se har con una frecuencia tal que al multiplicarla por su longitud debe dar la velocidad de propagacin. Esto es: = c / , de manera que: = c / La letra griega lambda (), representa la longitud de onda.La letra griega nu (), representa la frecuencia de esa onda.La letra c representa la velocidad de la luz en el vaco y su valor es: 2,99792458108 ms-1.

La radiacin electromagntica que constituyen las ondas de radio de banda AM, de la frecuencia 1000 kHz (kilohercios) tiene, en consecuencia, una longitud de 2,99792458108 ms-1/1,0106 s-1 = 299,8 m. Esta onda se convierte en seal, la cual se interpreta mediante el uso de un circuito apropiado que se encuentra en el aparato receptor de radio. Ondas ms cortas que la referida antes son las que se interpretan con los ojos, sin ayuda de ningn traductor construido artificialmente. La radiacin electromagntica que se percibe como color rojo tiene una longitud del orden de los 700 nm, por lo tanto su frecuencia debe ser 2,99792458108 ms-1/7,010-7 m = 4,281014 s-1. Es decir 428 THz (terahercios). La energa asociada con cada una de esas ondas, se obtiene mediante la ecuacin de Planck:E = h . v

Para las dos ondas descritas antes las energas respectivas sern: ERF = 6,626075510-34 Js1,0106 s-1 = 6,62610-28 J [0,0006626 yJ (yoctoJulios)] Eroja = 6,626075510-34 Js4,281014 s-1 = 2,83610-19 J [0,2836 aJ (attoJulios)]

Absorcin y emisin de radiacin por parte de la materia.Una descripcin simplificada de la estructura de la materia permite explicar los enlaces entre los tomos para formar molculas en trminos de la localizacin de ciertas partculas subatmicas, los electrones, entre esos tomos. Esas partculas evidencian sus caractersticas ondulatorias ya que interactan con la radiacin electromagntica. La molcula en su forma estable bajo las condiciones ambientales corrientes se encuentra en un determinado nivel energtico. Si se logra hacer incidir sobre esa molcula un fotn de radiacin electromagntica con la energa apropiada, la molcula incrementa su contenido energtico absorbiendo ese fotn. Se dice entonces que la molcula pas a un estado excitado.La molcula energizada se encuentra en un estado que no es estable en las condiciones ambientales corrientes; por lo tanto tiende a regresar a la condicin estable y para lograrlo emite un fotn con la energa que logr excitarla antes; por lo tanto cuando un elemento irradia energa no lo hace en todas las longitudes de onda. Solamente en aquellas de las que est provisto. Esas longitudes de onda sirven para caracterizar, a cada elemento. Tambin ocurre que cuando un elemento recibe energa no absorbe todas las longitudes de onda, sino solo aquellas de las que es capaz de proveerse. Coinciden por tanto, las bandas del espectro en las que emite radiacin con los huecos o lneas negras del espectro de absorcin de la radiacin, como si un espectro fuera el negativo del otro. Ley de Bourguer-Lambert- Beer:Bourguer, Lambert y Beer, a travs de sus observaciones establecieron relaciones de la variacin de la intensidad de luz transmitida por una muestra con el espesor de ella o con la concentracin de la sustancia, para materiales translcidos. Estas relaciones se conocen como la ley de Bourguer-Lambert-Beer o ley general de la espectrofotometra que permite hallar la concentracin de una especie qumica a partir de la medida de la intensidad de luz absorbida por la muestra.Esta ley se puede expresar en trminos de potencia de luz o de intensidad de luz, asumiendo luz monocromtica, como:It / I0 = 10 -e bcDonde: It, es la intensidad de la luz transmitida por la muestra.I0, es la intensidad de la luz que incide sobre la muestra y que proviene de la fuente. e, es el coeficiente de absortividad molar en unidades de M-3. cm-1b, es la longitud de la trayectoria del haz de luz a travs de la muestra o el espesor de la celda en cm o lo que se conoce como paso ptico.

La relacin It / I0 se conoce como transmitancia, T, y es la medida primaria que se realiza en los instrumentos para medir la absorcin de luz por parte de una muestra. Si la relacin se expresa en forma porcentual, entonces se llama porcentaje de transmitancia: % T = 100.It / I0La luz absorbida sera I0 It, es decir, la diferencia entre la intensidad de la luz incidente y la intensidad transmitida despus de pasar a travs de la muestra. A veces se expresa en forma porcentual, en funcin de la transmitancia medida como:Porcentaje de absorcin = (Tblanco Tmuestra) x 100 o absorbancia.Cuando se toma el logaritmo decimal negativo de la relacin It / I0, entonces:-log It / I0 = - log T log I0 /It = logI0 - logIt

La relacin que representa la cantidad de luz absorbida por la muestra es -log It / I0 = - log T, y recibe el nombre de Absorbancia, y se designa con la letra A.

La ley de Bourguer-Lambert-Beer se puede entonces escribir de las siguientes formas: It / I0 = 10 -e bc -log T = e . b . c -log T = A = e . b . cDonde: C, es la concentracin del soluto en moles / litro de solucin. e, es una constante denominada coeficiente de absortividad molar cuyas unidades son: cm -1 litro / mol.b, es la longitud de la trayectoria en cm.Se llega, entonces, a que la absorbancia es adimensional.El coeficiente de absortividad molar e es funcin de la longitud de onda, del ndice de refraccin de la solucin y es caracterstico de cada sistema soluto-solvente. Es una propiedad intensiva, que no depende de la concentracin de la sustancia y representa la absorcin de luz por parte de un mol de soluto para una longitud de onda dada.Si no se conoce el peso molecular de la sustancia la ley de Beer se puede expresar como:A = a . b . c

Donde a se denomina coeficiente de absortividad y sus unidades dependen de las unidades de concentracin utilizadas, que pueden estar en g/L o g/100mL.El registro de la variacin del coeficiente de absortividad molar e , o de la absorbancia A, o de la transmitancia T, en funcin de la longitud de onda da origen a lo que se denomina "espectro" o curva espectral de una sustancia qumica e indica las caractersticas de absorcin de dicha sustancia con relacin a la longitud de onda. En muchas ocasiones la curva espectral se presenta como Absorbancia vs longitud de onda y el espectro se denomina espectro de absorcin, o en funcin de la transmitancia, denominndose el espectro, espectro de transmisin.De igual forma cuando se registra la emisin de radiacin en funcin de la longitud de onda, los espectros se denominan como espectros de emisin, o espectros de fluorescencia.Espectrofotmetro:La absorbancia y la transmitancia de una sustancia en disolucin se miden con un aparato denominado espectrofotmetro, el cual consta bsicamente de los siguientes componentes:Fuente de luz: Lmpara que emite una mezcla de longitudes de onda. Colimador: Conjunto de lentes que enfocan la luz convirtindola en un haz de rayos paralelos.Monocromador: Dispositivo que selecciona luz de una nica longitud de onda. Detector fotoelctrico: Transductor de luz en electricidad. La luz provoca el desplazamiento de electrones en el metal del detector, produciendo una corriente elctrica que es proporcional a la intensidad de la luz recibida.Registrador: Mide la seal del detector, la compara y genera una medida en una escala determinada.

A) Esquema de un espectrofotmetro de un solo haz

B) Esquema de un espectrofotmetro de doble haz, en el cual se corrigen las variaciones espectrales de los diferentes elementos pticos que lo componen

Espectrofotmetro uv visible.

DEFINICION DE ESPECTROFOTOMETRALa espectrofotometra es un mtodo analtico que utiliza los efectos de la interaccin de las radiaciones electromagnticas con la materia (tomos y molculas) para medir la absorcin o la transmisin de luz por las sustancias o la espectrofotometra se refiere a los mtodos, cuantitativos, de anlisis qumico que utilizan la luz para medir la concentracin de las sustancias qumicas. Se conocen como mtodos espectrofotomtricos y, segn sea la radiacin utilizada, como espectrofotometra de absorcin visible (colorimetra), ultravioleta, infrarroja.Aplicaciones de la espectrofotometra visible y ultravioleta.La espectrofotometra es de gran utilidad en el anlisis de espacies qumicas sobre todo para el qumico analtico.

En bioqumica se utiliza por ejemplo para:1. Identificar compuestos por su espectro de absorcin.

2. Conocer la concentracin de un compuesto en una disolucin.

3. Determinar la glucosa en sangre en un laboratorio de anlisis qumico.

4. Seguir el curso de reacciones qumicas y enzimticas.

- El espectrofotmetro es de gran utilidad en anlisis cuantitativo de protenas, en la determinacin de cidos nucleicos incluyendo ADN / ARN, enzimas.

Fase experimental

1.Preparar la siguiente batera de tubos:

Tubo ITubo IITubo IIITubo IVTUBO X

Bicromato de potasio1 ml2 ml3 ml4 ml1 ml

Agua destilada9 ml 8 ml7 ml6 ml9 ml

Concentracin (mg %)

Muestra X

Solucin stock: Bicromato de Potasio 80 mg%.Calcular la concentracin en mg% de bicromato de K en cada uno de los tubos Standard (I-II-II-IV).Leer las absorbancia de los cuatro tubos a 350 nm de longitud de onda () en el espectrofotmetro contra el H2O destilada (Abs. H2O=0).

2.Con los datos obtenidos construir en un papel milimetrado la grfica de absorbancia en el eje de las Ordenadas vs concentracin de bicromato de K en el eje de las Abscisas.

3.Una vez obtenida la curva de calibracin, medir la absorbancia de la muestra problema (Problema X).

4. Obtener el factor de calibracin (Fc) promedio con las soluciones standard y sus Absorbancia utilizadas para construir las curvas de calibracin ajustadas.

5. Calcular la concentracin de la muestra problema por los siguientes mtodos:A.- Grficamente extrapolando su absorbancia en la curva de calibracin.B.- Usando Factor de Calibracin, multiplicando su absorbancia por el factor de calibracin del standard.

Conclusin Se ha llegado a la conclusin de que la espectrofotometra es un mtodo analtico indirecto porque se basa en la medicin de la absorbancia o transmitancia de las radiaciones; es de gran utilidad en la actualidad para la identificacin de un analizo en una muestra problema.

La espectrofotometra es el mtodo ms usado, debido a que es sencillo, especfico y sensible.

Cuestionario1.-Explique el mecanismo de funcionamiento de un espectrofotmetro.El funcionamiento de un espectrofotmetro consiste bsicamente en iluminar la muestra con luz blanca y calcular la cantidad de luz que refleja dicha muestra en una serie de intervalos de longitudes de onda. Lo ms usual es que los datos se recojan en 31 intrvalos de longitudes de onda (los cortes van de 400 nm, 410 nm, 420 nm 700 nm). Esto se consigue haciendo pasar la luz a travs de un dispositivo monocromtico que fracciona la luz en distintos intrvalos de longitudes de onda. El instrumento se calibra con una muestra o loseta blanca cuya reflectancia en cada segmento de longitudes de onda se conoce en comparacin con una superficie de reflexin difusa perfecta.

2.-Qu diferencias existen entre un fotocolormetro y un espectrofotmetro?El fotocolormetro mide la intensidad de a luz absorbida por una solucin y el especrofotmetro relaciona la capacidad de absorcin de la radiacin ultravioleta y visible con la concentracin de una sustancia.

3.-Grafique el espectro de luz, tanto en el rango visible como no visible con sus respectivas longitudes de ondas.

4.-Qu relacin matemtica existe entre Absorbancia y Transmitancia? Abs = -log T = -log (It/Io), donde Abs es absorbancia, T es transmitancia, I es intensidad transmitida (la intensidad de la luz luego de atravesar la muestra) y Io es intensidad incidente (la intensidad de luz antes de atravesar la muestra).

5.- Construya una curva de calibracin con los siguientes valores:Standard 1Standard 2Standard 3Standard 4Standard 5

Concentration5 mg/dl10 mg/dl20 mg/dl30 mg/dl40 mg/dl

Absorbancia0.0250.0500.1000.1500.200

Con la curva obtenida hallar la concentracin de las siguientes muestras, sabiendo que sus absorbancia fueron:Muestra A0.015Muestra B0.125Muestra C0.350