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酵 素 抗 体 法 を用 い た キ ッ トに よ るClostridium difficile toxin Aの 検 出

岐阜大学医学部附属嫌気性 菌実験施設,*現:金 沢大学 医学部微生物学教室

加 藤 直 樹 加 藤 は る*劉 承 旭

(平成10年11月2日 受付)

(平成11年3月16日 受理)

Key words: Clostridium difficile, toxin A, enzyme immunoassay, antibiotic-

associated diarrhea

要 旨

Clostridium difficile性下 痢症 ・腸 炎 の診 断 に糞便 中毒 素 の検 出 は不 可 欠で あ るが,我 が 国 で は一般検 査

室 で利 用で きるC.diffficile毒素検 出キ ッ トが な いのが 現状 で あ る.今 回,酵 素 抗体 法 を利用 したImmuno-

Card Toxin Aの 有 用 性 を,現 在 我 が 国 で 唯一C.difficile toxin A検 出用 キ ッ トと して市 販 され て い る

VIDAS CDAと 比較 検 討 した.対 象 と した糞便61検 体 中,両 方 法 陽性 は12例,両 方 法 陰性 は39例,

VIDAS陽 性-ImmunoCard陰 性 は7例,VIDAS判 定不 能-ImmunoCard陰 性 は2例,両 方 法 とも判 定

不 能 は1例 であ っ た.両 方が不 一 致 な成績 を示 した7例 を細 胞 培 養 法 に よ る糞 便 中毒 素 の 検 出 とtoxin

A産 生C.difficileの 分 離 を検討 した と ころ,VIDAS陽 性-ImmunoCard陰 性 の7例 中5例 は細 胞培 養 法

陰性 で毒 素 産生性C.difficileも 検 出 され ず,2例 は細 胞培 養法 陽性 で あ った.最 終 的 にVIDAS判 定不 能

の3例 を除 き,VIDAS陽 性-ImmunoCard陰 性 の7例 中,細 胞培 養 法 陰性5例 を陰性,細 胞培 養 法 陽性

2例 を陽性 として集計 し直 す と,ImmunoCardの 感 度 は12/14,85.7%,特 異度 は44/44,100%で あ った.

ImmunoCard Toxin AはVIDAS CDAに 比べ,感 度が や や劣 る ものの,特 異 度 は高 く,特 殊 な測 定器 や

遠心 操作 を必 要 とせず,糞 便 が微 量で す み,検 査 時 間が約15分 間 と短 い こ とか ら,手 軽 で迅速 なC.dif-

ficile性下痢 症 ・腸 炎の 診断 試薬 で ある と思 われ た.

〔感 染 症 誌73:467～472,1999〕

序 文

Clostridium difficileは偽膜性大腸 炎の原因菌で

あ り,抗菌薬関連下痢症の15～25%は 本菌が関連

していると言われている1).C.difficileは偏性嫌気

性菌であるにもかかわらず,酸 素耐性の芽胞を高

率に形成することにより手指などに付着 した糞便

や病院環境で生き残 り,院 内感染の原因となりや

すいことから,欧 米では主要な院内感染菌として

取 り扱われている2)～4).

C.difficileはtoxin A(エ ンテ ロ トキ シ ン)と

toxin B(サ イ トトキシン)を 産生 し,こ れらの毒

素により下痢症 ・腸炎を引き起こすもの と考えら

れている5)6).したがって,C.difficile性下痢症 ・腸

炎の診断には患者糞便か らこれ らの毒素を検出す

るか,毒 素産生性C.difficileを分離することが欧

米では一般的に行われている.

C.difficile性下痢症 ・腸炎の診断検査法 として

は感度が最 も優 れている細胞培養法がgold stan-

dardと 言われているが,こ の方法は細胞培養法の

ための設備や技術,細 胞の維持 など,通 常の検査

室では実施困難な方法である.そ こで,い くつ も

の毒素検出キッ トが欧米で開発 されている7)～10).

我 が 国 で はC.difficile関 連 キ ッ トと して,CD

別刷請求先:(〒500-8705)岐 阜市司町40

岐阜大学医学部附属嫌気性 菌実験施設

加藤 直樹

平成11年5月20日

468 加藤 直樹 他

チ ェ ックD-1(R)(シ オ ノギ)が 開発 され,使 用 さ れ

て い る が,こ の ラ テ ッ ク ス ・キ ッ トはC.difficile

に 特 異 的 な抗 原(glutamate dehydrogenase)を 主

に 検 出 し11),糞 便 中 のtoxin Aの 有 無 に か か わ ら

ず,C,difficileが 一定 数 以 上 存 在 す れ ば 陽性 反 応 が

出 て くる.し た が っ て,無 毒 株 のC.difficileで も陽

性 凝 集 が お こ り,C.difficile性 下 痢 症 ・腸 炎 の ス ク

リー ニ ン グ と して は有 用 で あ る が,確 定 診 断 に は

利 用 し に く い.一 方,現 在 我 が 国 で 唯 一toxin A

検 出 用 キ ッ ト と して 承 認 され,市 販 され て い る

VIDAS CDA(R)(日 本 ビ オ メ リ ュ ー ・バ イテ ッ ク,

現 在 は 改 良 型 のVIDAS CDA2(R)が 市 販 さ れ て い

る)は,使 用 に 際 し て 専 用 の 測 定 器 が 必 要 で あ り,

本 キ ッ トの普 及 の 大 き な障 害 に な っ て い る.

こ の よ う な 理 由 か ら,我 が 国 で はC.difficile性

下痢 症 ・腸 炎 の 診 断 が 極 め て 困 難 で,ま た ほ とん

どの 病 院 で 適 切 な 診 断 が 行 わ れ て い な い の が 現 状

で あ る.

今 回,著 者 ら は特 別 な設 備 を必 要 とせ ず,一 般

細 菌検 査 室 で も 手 軽 に実 施 可 能 な,糞 便 検 体 か ら

のC.difficile toxin A検 出 用enzyme immunoassay

(EIA)キ ッ トで あ るImmunoCard Toxin A(R)の有

用性 を検 討 した の で 報 告 す る.

材 料 と方 法

1.　糞 便検 体

当 施 設 で 下 痢 患 者 な どか ら採 取 し,凍 結 保 存 し

て い た 糞 便61検 体 を使 用 した.

2.　キ ッ トに よ るC.difficile toxin Aの 検 出Im-

munoCard Toxin A(R)(テ ィー エ フ ビー)と 対 照 と

して 前 述 のVIDAS CDAC(R)を 用 い た.実 施 方 法 は

原 則 と し て添 付 の 使 用 説 明 書 に 従 っ た.

略 述 す る と,ImmunoCard(R)で は 試 験 管 に200μL

の キ ッ ト添 付 の 希 釈 液 と3滴 のhorseradish per-

oxidase標 識 抗C.difficile toxin Aモ ノ ク ロ ー ナ ル

抗 体 を と り,こ の 混 合 液 に糞 便25μLか 固 形 便 の

場 合 は直 径2mmの ア プ リ ケ ー タ を用 い て,一 掻

き分 の 糞 便 を加 え,よ く混 和 した.つ い で,作 製

し た 検 体150μLず つ を キ ッ ト下 段 の2つ の ウ ェ

ル(サ ンプ ル ・ポ ー ト)に 添 加 した(Fig.1参 照).

室 温 で5分 間 放 置 し,パ ネ ル 上 段 の2つ の ウ ェ ル

(反応 ポ ー ト)に 糞 便 液 が しみ 込 ん だ とこ ろ で 洗 浄

Fig.1•@ ImmunoCard Toxin A (R) test card. Right lower

well, test sample port; right upper well, test reac-

tion port; left lower well, control sample port; left

upper well, control reaction port.

液(キ ッ ト添 付)を3滴 滴 下 し,こ れ が 完 全 に し

み 込 ん だ ら,tetramethylbenzidineとurea perox-

ideを 含 む 基 質 液 を3滴 滴 下 した.つ い で,5分 間

放 置 後,反 応 ポ ー トの 色 調 変 化 を 目視 判 定 した.

す な わ ち,キ ッ ト上 段,左 側 の コ ン トロ ー ル 反 応

ポ ー トが 明 らか な 青 色 を示 し,キ ッ ト上 段,右 側

の テ ス ト反 応 ポ ー トが わ ず か で も青 色 を 呈 す れ ば

陽性,青 色 に な らな け れ ば 陰性 と した.ま た,コ

ン トロ ー ル 反 応 ポ ー トが 青色 に な ら な け れ ば 判 定

不 能 と した.

VIDAS(R)で は,マ イ ク ロチ ュ ー ブ 中 で900μLの

希 釈 液 に0.3mLか0.3gの 糞便 を混 ぜ,15,000rpm

(18,600×g)で2分 間遠 心 後,上 清300μLを 試 薬 ス

トリ ップ の サ ンプ ル 用 ウ ェ ル に 滴 下 した.試 薬 ス

ト リ ップ を測 定 器 に 挿 入 し,測 定 器 の マ ニ ュ ア ル

に 従 い,自 動 測 定 を行 っ た.

3.　細 胞 培 養 法 に よ る毒 素 検 出

VIDAS(R)とImmunoCard(R)の 成 績 が 不 一 致 の7

例 とVIDAS判 定 不 能 の3例,合 計10例 に つ い

て,Vero細 胞 と抗toxin B血 清(TechLab,米 国)

を用 い て 先 の 報 告 に準 じて 細 胞 培 養 法 に よ り糞 便

中 の毒 素 を検 出 した12)13).略 述 す る と,糞 便 検 体 を

ウ シ胎 児 血 清 を2%添 加 し たL-グ ル タ ミ ン含 有

Eagle MEM(Gibco BRL)で10倍 希 釈 後,15.000

感染症学雑 誌 第73巻 第5号

Enzyme immunoassayに よ るC.difficile toxin A検 出 469

rpm(18.600×g)で3分 間 遠 沈 し,そ の 上 清 を0.22

μmのMillex-HAフ ィ ル ター(ミ リ ポ ア)で 濾 過 滅

菌 し,そ れ を毒 素 検 出用 検 体 と した.Vero細 胞 は

L-グ ル タ ミ ン含 有Eagle MEMに ウ シ胎 児 血 清

(8%),ペ ニ シ リ ン-G(100U/mL),ス トレプ トマ

イ シ ン(100μg/mL)を 添 加 した 培 地 を用 い て96

穴 マ イ ク ロ タ イ タ ー ・プ レ ー ト(Nunc)上 で24

時 間,5%炭 酸 ガ ス培 養 した.で き たVero細 胞 の

モ ノ レ ア ー に,原 液 お よ びEagle MEMで2倍 に

希 釈 した 検 体200μLを そ れ ぞ れ 加 え,5%炭 酸 ガ

ス培 養 を 行 い,1日 後,2日 後,3日 後 に 細 胞 変 性

効 果 を観 察 した.ま た,細 胞 変 性 効 果 がC.difficile

toxin Bに よ る もの で あ る こ と を確 認 す る た め に,

抗toxin B血 清 で37℃,1時 間 中 和 処 理 し た 糞 便

検 体 を 同様 の 手 技 で細 胞 培 養 検 査 に供 し,細 胞 変

性 効 果 が 中和 され た検 体 をtoxin B陽 性 と した.

4.　糞 便 か ら のC.difficileの 分 離 ・同 定 と毒 素

産 生 性 の検 討

細 胞 培 養 法 に よ る毒 素 検 出 と 同 様 に,VIDAS(R)

とImmunoCard(R)の 不 一 致 例 と判 定 不 能 例 の 合 計

10例 につ い て,糞 便 中 か らのC.difficileの 分 離 と

分 離 株 の 毒 素 産 生 性 を 検 討 した.糞 便 か ら のC.

difficileの分 離 は 糞 便 に 等 量 の 純 ア ル コ ー ル を 加

え,良 く攪 拌 後,30分 間室 温 で 放 置 し,栄 養 型 の

細 菌 を 死 滅 さ せ た 後,cycloserine-cefoxitin-

mannitol agar(CCMA)を 用 い て嫌 気 培 養 す る こ

とに よ り行 っ た.CCMA上 に 形 成 さ れ た コ ロ ニ ー

の 同 定 と 毒 素 産 生 性 はPCR法 を 利 用 し て 行 っ

た14)15).ま た,PCRで 毒 素 産 生 株 と判 定 さ れ た株

につ い て は,ブ レイ ンハ ー トイ ン フ ユ ー ジ ョ ンブ

イ ヨ ン(日 本 ベ ク トン ・デ ィ ッキ ン ソ ン)で3～5

日間 嫌 気 培 養 後,VIDAS(R)を 用 い てtoxin Aの 産

生 を最 終 的 に確 認 した.

5.　ImmunoCard(R)の 感 度

ImunoCard(R)の 検 出限 界 は精 製toxin A(TechLab)

を用 い て調 べ た.測 定 に は 精 製toxin A液 を 生 食

水 で 希 釈 した もの を検 体 と して,前 述 の ご と く検

査 を実 施 した.

成 績

ImmunoCard Toxin A(R)とVIDAS CDA(R)の 結 果

の 比 較 はTable1に 示 した.両 者 が と も に 陽性 は

Table1•@ Results of the detection of C. difficile toxin

A from stool specimens: ImmunoCard Toxin A (R)

vs VIDAS CDA (R).

12例,と も に 陰性 は39例,VIDASが 陽性 でIm-

munoCardが 陰 性 は7例,VIDASが 判 定 不 能 で

ImmunoCardが 陰 性 は2例,VIDASもImmuno-

Cardも 判 定 不 能 は1例 で あ っ た.

こ れ らの 不 一 致 例 と判 定 不 能 例 の10例 に つ い

て は,細 胞 培 養 法 を 用 い た 糞 便 中 のtoxin Bの 検

出 と と も に,糞 便 培 養 で 分 離 さ れ た 株 のtoxin A

産 生 性 を 検 討 し た と こ ろ,VIDAS陽 性-Im-

munoCard陰 性 の7例 中5例 で は細 胞 培 養 法 で 糞

便 中 毒 素 は 陰性 で,毒 素 産 生 性C.difficileも 検 出

さ れ な か っ た.ま た,残 りの2例 で は細 胞 培 養 法

で 糞 便 中 毒 素 陽性 で あ っ た.

VIDAS判 定 不 能-ImmunoCard陰 性 の2例 で

は,細 胞 培 養 法 で 糞 便 中毒 素 陽 性 で あ っ た.な お,

こ の 判 定 不 能 例 をVIDASで 再 検 し た と こ ろ,1

例 は 陰性,1例 は 再 度 判 定 不 能 とな っ た.

VIDASお よ びImmunoCardが と も に判 定 不 能

の1例 は,細 胞 培 養 法 に よ り糞 便 中 毒 素 陰性,毒

素 産 生 性C.difficile陰 性 で あ っ た.再 検 に よ り,

VIDASは 陽 性,ImmunoCardで は 再 び 判 定 不 能

と な っ た.な お,ImmunoCardで 判 定 不 能 に な る

の は,下 段 の ポ ー トか ら上 段 の 反 応 ポ ー トまで 検

体 液 が 展 開 し な い た め,検 査 で きな か っ た こ と に

よる.ま た,VIDASで は 内 部 陰 性 コ ン トロ ー ル が

陽性 反 応 を 示 し,判 定 不 能 と な っ た.

最 終 的 にVIDASで 判 定 不 能 の3例 を 除 き,さ

らにVIDAS陽 性-ImmunoCard陰 性 の7例 の 中,

細 胞培 養 法 で 糞 便 中毒 素 陰 性 の5例 を 陰 性,細 胞

培 養 法 陽 性2例 を 陽 性 と して 集 計 し直 す と,Im-

munoCardの 感 度 は12/14,85.7%,特 異 度 は44

/44,100%で あ っ た(Table2).

精 製toxin Aを 用 い た 実 験 で はImmunoCard

平成11年5月20日

470 加藤 直樹 他

Table2•@ Sensitivity and specifity of ImmunoCard

Toxin A (R) for detection of C. difficile toxin A from

stool specimens compared with the combined

results of VIDAS CDA (R) and cell culture assay.

の測定限界は46.9ng/mLで あった.

考 察

C.difficileは芽胞の形 で病院内で比較的容易に

患者から患者に伝播 し,軽 い下痢症から腸炎,あ

るいは症状の重い偽膜性大腸炎を引 き起 こす.一

方では,腸 管内に菌を獲得 しても発症せず,健 康

保菌者で終わる症例 も多 く見られる.し たがって,

C.difficile性下痢症 ・腸炎の診断は,ま ず臨床症状

があ り,つ いで糞便検査でC.difficile毒素が検出

されるか,毒 素産生株が検出されることにより行

われる16).

C.difficile性下痢症 ・腸炎の治療法は,基 本的に

は発症の引き金になったと思われる抗菌薬や抗癌

薬の中止があげられるが,一 方で,発 熱や高頻度

の下痢を伴う場合 には,C.difficileに強い抗菌力を

持つバ ンコマイシンの経口投与 も広 く行われてい

る10)16).しかし,不必要なバ ンコマイシンの投与は

医療費の高騰につなが り,ま た,バ ンコマイシン

耐性 菌の誘導 をお こしかね ないので,C.difficile

性下痢症 ・腸炎の正確な診断はバ ンコマイシン使

用の必要性を判断するのに不可欠である.

ひるがえって,我 が国のC.difficile性下痢症 ・

腸炎の診断体制は欧米に比べ極めて貧弱で,日 常

検査で細胞培養法 によりC.difficile毒素を検出 し

ている施設はほ とんどなく,ま た,国 内で使用で

きる毒素検出キットはVIDAS(R)し かないため,ほ

とんどの病院で正確 な検査は行われていないのが

現状である.ま た,C.difficileの分離培養は難 しい

との先入観が強 く,菌 の分離 もあまり行われてい

ない.し たがって,ど この病院でも手軽に迅速に

使用できるC.difficile毒素検出用キ ットの導入は

急務であ り,非 常に重要である.

今 回検 討 したImmunoCard Toxin A(R)は米国

Meridian社 が開発 した製品である.C.difficile用

の多 くの酵素抗体法キ ットは96穴 のマ イクロタ

イタープレー トを用いた酵素抗体法であるが,こ

のキットは1検 体1測 定プレー ト(内 部陽性 コン

トロールを含む)を 用い,判 定は目視で行 う.し

たがって,検 体数が少ない場合,便 利である.ま

た,ImunoCard(R)で は下段のポー トに入れた検体

を上段 のポー トまで特殊な濾紙で展 開させ るた

め,洗 浄操作が極めて簡単である.た だし,今 回

の検討でも1検 体見 られたように,糞 便によって

は上段まで糞便液が浸み込 まず,測 定不能になる

ものがある.

今 回,VIDAS(R)で 判 定 不 能 の3例 を除 き,

VIDAS(R)とImmunoCard(R)の 成績が不一致の例 を

細胞培養法で再検することにより58例 の成績を

解析 し直す と,ImmunoCard(R)の 感度は85.7%,特

異 度 は100%で あ っ た.本 試 験 の 実 施 中 に

VIDAS CDA(R)に 代わってVIDAS CDA2(R)が 発売

されるようになったため,精 製毒素 を使用 した

VIDAS CDA(R)珍の検出限界は検討で きなかったが,

VIDAS CDA2(R)に 関 して はImunoCard(R)と 同 じ

成績であった.細 胞培養法陽性,VIDAS(R)陽 性,Im-

munoCard(R)陰 性(す なわち,ImunoCard(R)偽 陰

性)の2検 体はVIDAS(R)のTest Value(検 体の相

対蛍光強度をキット添付のtoxin A標 品の相対蛍

光強度で除した値)が 低かったことから,糞 便中

の毒素量が低い検体では,精 製毒素を用いた場合

とは異な り,ImmunoCardの 感度は多少低下し,

陰性にな りやすいもの と思われた.

従来の欧米での検討では,細 胞培養法や毒素産

生性C.difficileの分離成績 との組み合わせなどに

よ りC.difficile下痢症 と診断 された症例 におい

て,ImunoCard Toxin A(R)は感度83%,特 異度

95%の 成績が報告 されている17).また,学 会報告

では70～89%の 感度,99～100%の 特異度が得ら

れてお り,細 胞培養法には劣るものの,C.difficile

下痢症 ・腸炎のスクリーニ ングとして有用である

と報告されている18)～20).一方,VIDAS CDA(R)は 細

感染症学雑誌 第73巻 第5号

Enzyme immunoassayに よ るC.difficile toxin A検 出 471

胞 培 養 法 との 比 較 で,感 度 と 特 異 度 が60%,75

%21)あ る い は65.4%と100%22)と や や 低 い 感 度 の

報 告 もあ る が,そ の他 の 報 告 で は 細 胞 培 養 法 との

一 致 率 が85～95%で あ っ た13)23)24).た だ し,今 回

の 検 討 で も見 られ た よ う に,VIDAS CDA(R)で は判

定 不 能 例 が 出 や す い 欠 点 が 指 摘 され て い る21).

C.difficile性 下 痢 症 ・腸 炎 の診 断 試 薬 と して は,

欧 米 で は そ の 他 にPremier C.difficile toxin A as-

say(R)(Meridian),CD-TOX C.difficile toxin A(R)

(Porton Cambridge),Cytoclone A+B EIA(R)

(Cambridge Biotech),Bartels C.difficile toxin A

EIA(R)(Baxter),TOX A TEST(R)(TechLab),

TOX A/B TEST(R)(TechLab)な どが あ り,C.dif-

ficile性 下 痢 症 ・腸 炎 の 診 断 試 薬 と し て の 有 用 性

はImunoCard Toxin A(R)やVIDAS CDA(R)と ほ ぼ

似 た成 績 が 報 告 さ れ て い る7)～10)22)23).その 中 で,

toxin Aとtoxin Bを 同 時 検 出 す る キ ッ ト(Cyto-

clone A+B EIA(R),TOX A/B TEST(R))は 感 度,特 異

度 が 単 独 毒 素 検 出 キ ッ トよ り高 く,簡 易 検 査 試 薬

と して の価 値 が 高 まっ て い る7)9)23).

最 後 に,今 回 の 検 討 で は,ImmunoCard Toxin

A(R)はVIDAS CDA(R)に 比 べ,や や 感 度 が 劣 る もの

の,特 殊 な測 定 器 や 遠 心 器 を用 い た 遠 心 操 作 を必

要 とせ ず,ま た,検 体 量 が 微 量 で す み,検 査 に要

す る時 間が 約15分 間 と極 め て 短 い こ とか ら,患 者

の 臨 床 デ ー タ と組 み 合 わ せ れ ば,検 査 室 で 手 軽 に

使 用 で き る迅 速 ・簡 便 なC.difficile性 下 痢 症 ・腸

炎 の ス ク リー ニ ン グ キ ッ トと して 有 用 で あ る と思

わ れ た.

文 献

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Detection of Clostridium difficile Toxin A from Stool Specimens by an Enzyme Immunoassay Kit

Naoki KATO, Haru KATO and Cheng-Xu LIUInstitute of Anaerobic Bacteriology, Gifu University School of Medicine

Toxin detection from stool specimens is prerequisite for Clostridium difficile-associated diarrheaand colitis. However, in Japan only one toxin detection kit is commercially available, which requirescomputerized VIDAS (R) fluorescence reader. In this study we evaluated ImmunoCard Toxin A (R),which is an enzyme immunoassay with a format of individual cassetteand needs no special equip-ment to perform, by comparing with the VIDAS CDA (R) kit. Of61stoolspecimens12were positiveand39were negative by both assays, 7were VIDAS (R) positiveImmunoCard (R) negative, 2wereVIDAS (R) invalid-ImmunoCard (R) negative, and1was invalid by both assays. Stool specimens which

gave inconsistent results between two assays were subjected to cellculture assay to detect toxin Band culture for C. difficile followed by testing of toxin producibility of isolates. Of7VIDAS (R) positive-ImmunoCard (R) negative specimens5were negative for cell culture assay and toxigenic C. difficile cul-

ture and2were positive for cell culture assay. By omitting3VIDAS (R) invalid specimens and counting

5specimens, which were cell culture negative but VIDAS (R) positive, as negative and2, which were

cell culture posotive and VIDAS (R) positive, as positive, 12of the14VIDAS (R) positive specimens were

ImmunoCard (R) positive (sensitivity, 85.7%) and all44VIDAS (R) negative were ImmunoCard (R) negative

(specificity, 100%). These results indicate that although in comparison with VIDAS CDA (R), Immuno-

Card Toxin A (R) is slightly less sensitive, ImmunoCard (R) is a rapid, simple, and reliable C. difficile toxin

A detection kit, which has the advantage of requiring no special equipment to perform and no centri-

fuge step, as small as25ƒÊL, L of a specimen, and as short as approximately15min of time to complete

the whole testing.

感染症学雑誌 第73巻 第5号