酵素の安定性を高める植物由来因子

福井大学 大学院 工学研究科

生物応用化学専攻 准教授 寺田 聡

繊維工業研究ｾﾝﾀー 助教 佐久間 紹子

産学官連携本部 研究員 柳原 佳奈

2010年 8月 4日 新技術説明会 (科学技術振興機構)

背景

生体で起こる化学反応に対して触媒として機能する分子

特定の分子にしか触媒作用をもたないタンパク質

酵素

食品分野、化学工業分野、医薬分野、研究分野など多岐にわたる分野に応用

産業分野

240億円

食品加工

洗剤

飼料

燃料エタノール

繊維／皮革

医薬・

研究分野

160億円

医薬原体

研究・その他

診断薬

400億円

産業酵素の応用技術と最新動向（2009年 シーエムシー出版）

≪食品・日用品加工業≫

ビール製造に利用（βアミラーゼ）

→ 大麦を麦芽糖に分解する

味の素製造に利用（グルタミナーゼ）

→ さとうきびの糖蜜をグルタミン酸に分解する

洗剤に添加（プロテアーゼおよびリパーゼ）

→ タンパク質および油汚れを分解する

≪医療・製薬業≫

臨床検査に利用

→ 体内の代謝酵素の存在量の測定により疾病を診断する

バイオセンサーの実用化

→ 酵素の基質特異性と反応性を利用して化学物質を検出する

（例）市販の血糖値測定器（グルコースセンサー）

酵素の利用分野

酵素活性 ： 酵素を構成するタンパク質の 立体構造 が深く関与

熱、凍結融解、乾燥、pH変化、

塩濃度、溶媒、他の酵素による作用で

不可逆的に変化

いかに安定な状態に保つか

・溶液状態

・至適温度外 で活性を維持

・長期間

従来の酵素安定化剤 ウシ血清アルブミン （BSA）

公知の感染性病原体の検査・検出しか不可能 ＝ 院内感染の恐れ

品質の良いＢＳＡの大量で安定的な入手が困難 ＝ コスト高

院内感染、コスト高酵素製品

利点

• 溶解性が高い

• 高塩濃度の条件下でも析出しない

• 比較的広いｐＨ域で使用できる

欠点

• 原料（牛血清）由来のプロテアーゼが含まれる

• 血液中の黄色の色素であるビリルビンが混入し、着色や酸化還元反応の阻害が生じる

• ロットによって品質にばらつきがある

• ウシ海面脳症（ＢＳＥ）や口蹄疫などの人畜共通感染症の懸念がある

酵素液の凍結乾燥過程における、劣化防止に使用

ショ糖（スクロース）、トレハロース

ラッキョウ フルクタン

冷水にも可溶

120℃でも安定

廃棄物の再利用

冷水にも可溶

120℃でも安定

廃棄物の再利用

酵素安定化剤 ラッキョウ フルクタン

ラッキョウフルクタン

フルクタンの特徴・ 分子量 : 6 ～100 kDa・ n : m = 3 : 1・ 高い水溶性水100 mlに40 g以上溶解

・ 沸騰水中でも安定m

CH2OH

HOH2C

CH2OH

H2C O

CH2

HO

HO

OO

HO

HO

O

O

HOHO

OH

OO

OH

HO

HOH2C

CH2

n

b-2,6 bond

b-2,1 bond

期待される効果

医療・研究用酵素の市場は約160 億円

これら酵素の50％にBSAが使用されていると仮定した場合、

その半数に代替できれば、40億円の市場

医療・研究用酵素の市場は約160 億円

これら酵素の50％にBSAが使用されていると仮定した場合、

その半数に代替できれば、40億円の市場

現行品である

BSAの代替

市場の拡大

人畜共通感染症の懸念の払しょく

品質の安定化

供給の安定化

コスト削減

近年需要が拡大している、バイオエタノールや

洗剤といった産業用酵素にも利用できる可能性

近年需要が拡大している、バイオエタノールや

洗剤といった産業用酵素にも利用できる可能性

産業用酵素分野への展開

これまでに得られた研究成果の紹介

フルクタンの酵素安定化能の評価

高温加熱後の残存活性

溶液状態、高温（至適温度+10℃以上）で

静置した後の酵素の活性を測定

DNAポリメラーゼ（PCR反応に用いる酵素）

ペルオキシダーゼ（ELISAの呈色反応に用いる酵素）

目的

実験１

DNAポリメラーゼ

PCR反応に用いる酵素

PCR法とはPCR（polymerase chain reaction）とは、ポリメラーゼ

連鎖反応の略称である。DNAを増幅するための手法であ

る。次のような長所を持つことから、遺伝子型の判定や

ウイルス感染の有無を評価するといった、臨床での診断

に広く利用されている。

・ ヒトのゲノム（30億塩基対）のような非常に長大な

DNA分子の中から、自分の望んだ特定のDNA断片（数百か

ら数千塩基対）だけを選択的に増幅させることができる。

しかも極めて微量なDNA溶液で目的を達成できる。

・増幅に要する時間が2時間程度と短い。

・プロセスが単純で、全自動の卓上用装置で増幅できる。

フルクタンのDNAポリメラーゼに対する安定化能

加熱時間条件 ： 85℃、30min

フルクタン濃度 ： 0、0.05、0.10、0.20、0.50％ （in DEPC処理水）

cDNA ： HepG2から抽出したもの

検出遺伝子 ： ハウスキーピング遺伝子のACTB（β-actin）

プライマープローブ ： TaqMan®Gene Expression Assays

ACTB gene (Applied Biosystems)

リアルタイムPCR装置 ： Light Cycler®480 （Roche）

step1

• 各濃度のフルクタン水溶液を調製

• DNAポリメラーゼ（5units/μL）と混合

step2

• 酵素‐フルクタン

水溶液を85℃で

30分加熱

step3

• PCR反応液を調製

• リアルタイムPCR

フルクタンのDNAポリメラーゼに対する安定化能

サイクル数

Intensity

0.2％フルクタンで加熱未処理と同等の活性を維持

フルクタンのDNAポリメラーゼに対する安定化能

フルクタン含有でも Ct値に影響なし

加熱処理（85℃、30分）加熱未処理

フルクタン濃度

0% 0.05% 0.1% 0.2% 0.5% 0%

最大 Intensity（39サイクル）

11.8 27.1 31.5 32.8 30.3 33.0

残存活性（％）（加熱/未処理）

35.7 82.2 95.6 99.4 91.7 －

平均Ct値 20.21 20.83 20.92 20.95 20.63 21.12

標準偏差 0.11 0.02 0.02 0.02 0.02 0.04

実験２

ペルオキシダーゼ

ELISAの呈色反応に用いる酵素

ELISAELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) は、試

料中に含まれる抗体あるいは抗原の濃度を検出・定量する際に用いられる方法である。生体試料中には、種々雑多なタンパク質が存在するた

め、特定のタンパク質を検出・定量するには、特に他のタンパク質と比べて微量にしか存在しない場合が多く、特異性の高さ（夾雑物からどれだけ正確に区別できるか）と定量性の良さ（微量であっても検出できる、あるいは低濃度における再現性の良さ）が求めらる。ELISAは特異性の高い抗原抗体反応を利用し、酵素反応に基づく発色・発光をシグナルに用いることで上記の条件をクリアしている。感染の有無やアレルギーなど、医療分野で診断として

広く利用されている。

加熱時間条件 ： 60℃、10min

フルクタン濃度 ： 0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、 1、2％

（in リン酸緩衝液）

コントロールサンプル： BSA、イヌリン、レバン、トレハロース、フルクトース

（0.2、2％）

基質 ： o-フェニレンジアミン＋30%過酸化水素

反応緩衝液： リン酸クエン酸緩衝液

step1

• 各濃度のフルクタン溶液を調製

• ペルオキシダーゼ（0.8μg/mL）と混合

step2

• 酵素‐フルクタン溶液を 60℃で10分加熱

step3

• 基質と混合

• プレートリーダーで

カイネティック測定

フルクタン濃度（％）

0 0.01 0.02 0.05 0.1 0.50.2 1 2

残存相対活性（％）

（加熱/非加熱）

残存活性（％）（加熱/未処理）

70.9 85.3 93.7 88.9 96.8 102.2 93.1 93.3 99.9

フルクタン含有で、加熱後も活性を維持

残存相対活性（％）

（加熱/非加熱）

BSA、トレハロースよりも高い活性維持効果

2% 0.2% 2% 0.2% 2% 0.2% 2% 0.2% 2% 0.2% 2%

フルクタン イヌリン レバン トレハロース フルクトース BSA PBS

残存活性（％）

（加熱/未処理）

95.2 89.1 49.0 46.0 81.2 82.2 60.4 85.1 17.3 32.8 89.9 85.9

今後の展開

1．多様な酵素に対する保護効果を実証

これまでに系統的な分類の違う2種類の酵素について

保護効果を確認、より多様な酵素に対して実証

2．長期保存に対する保護効果を検証

酵素保護剤として最も期待されている、長期間にわたる

保護効果を実証

3．分画し、保護剤として最も有効な分子構造を探索

将来的に一層の展開をはかるべく、分画を検討

本技術に関する知的財産権

• 発明名称 ：酵素安定化剤

• 出願番号 ：特願2010‐029438

• 出願人 ：福井大学、福井県

• 発明者 ：寺田 聡、 佐久間紹子、

柳原佳奈、竹下悟史、

小林恭一、大浦 剛

産学連携の経歴

絹タンパク質セリシンに関して• 2002年‐2010年

セーレン社と共同研究実施• 2007年‐2009年

JST育成事業に採択• 2009年

セリシンGIT培地(日本製薬)の市販

ラッキョウ多糖フルクタンに関して• 2009年‐2011年

農水省 新しい農業政策事業に採択

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