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耐熱性エタノール生産細菌を用いた耐熱性エタノール生産細菌を用いたバイオエタノール生産技術バイオエタノール生産技術

山口大学山口大学 大学院医学系研究大学院医学系研究科（農学系）科（農学系）

教授教授 山田山田 守守

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研究背景

地球温暖化の進行→ＣＯ２削減の社会的要請

代替燃料として、バイオエタノールへの注目高まる

バイオエタノール生産の高効率化発酵微生物の各種改良穀物以外の原料からのエタノール生産

技術課題

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なし2012年に2800万キロリットル

混合率20％導入目標／義務

日本米国ブラジル

出典： F.O.Licht,world Ethanol&Biofuels Report 2006、EurObserv'ER,Biofuels Barometer2006、エコ燃料利用推進会議資料、農林水産省調べ、一部換算値を含む

なし約16円／リットル

の物品税控除

約15円／リットル

の減免税制優遇措置

*揮発油等の

品質の確保等に関する法律

上限３％*１０％

E85も一部導入

２０－２５％

で義務化

E100も一部導入

混合率

サトウキビ糖蜜、建設発生木材等

トウモロコシサトウキビ原材料

単位：キロリットル

301,621万1,607万バイオエタノール生産量（実証段階, 2005）

直接混合、ETBE*1

直接混合直接混合導入方法

（直接混合 or ETBE）

諸外国と日本のバイオエタノール導入への取り組み

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耐熱性微生物とその利点

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発酵生産における微生物利用のメリット

微生物

酵素a

酵素を用いた反応：一段階反応の積み重ね

微生物を用いた反応：多段階（複合系）反応

終生産物

原料

原料

中間産物a 中間産物b酵素b 酵素c

終生産物

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生育

・生

理活

性

温 度

耐熱性30-45℃

中温菌20-30℃ 高温適応

発酵微生物における耐熱性の獲得

多くの場合高温では失活

高温下でも活性保持

至適温度 至適温度’

至適温度のシフト

遺伝子改変突然変異

etc…

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耐熱性菌を用いた高温発酵の利点

冷却エネルギー削減（発酵熱の除去コストが低減）

反応性向上（多くの場合、高温で酵素の反応速度上昇）

雑菌の混入抑制（高温下でコンタミの原因菌が抑制される、滅菌コストの抑制）

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酢酸菌

メタノ−ル資化性酵母

乳酸菌

エタノ−ル生産菌 Zymomonas mobilis

有機溶媒耐性菌

山口大学 と カセサ−ト大学（タイ）

との拠点事業

「耐熱性」をキーワードに種々の微生物を探索・検討

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エタノール生産細菌Zymomonas mobilis

の特徴

α－プロテオバクテリアのグループに属するアルコール発酵能を有し、テキーラの醸造に用いられるエタノール生産用としては活用進まず（主役は酵母）

わが国では

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グルコース

PG1

ピルビン酸

エタノールエタノール

Citrate

Isocitrate

2-Oxoglutarate

Succinyl-CoASuccinate

Fumarate

Malate

Oxaloacetate

GLF

Entner-Doudoroff(ED)経路

TCA 回路

－１ＡＴＰ

＋２ＡＴＰ

細胞膜

Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ：強力なエタノール生産経路

6-ホスホ-2-ケト-3-デオキシグルコン酸

グリセルアルデヒド-3-リン酸

アセトアルデヒド＋ＣＯ２

グルコース

ピルビン酸

解糖系

ＴＣＡ回路が不完全のため、解糖系で生じたピルビン酸がエタノール生産に流れやすい＝エタノール生産性高い

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Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓの利点まとめ

・コンパクトなゲノムサイズ

Mbp Genes

Z. mobilis 2.0 2,000

E. coli 4.6 4,500

・高いポテンシャル

～３９℃

５*

２**

２５－３０℃

１

１

発酵温度

発酵速度

エタノール生産能

Z. mobilis酵母

・強力なエタノール生産経路

高速発酵が可能

・１ＡＴＰ／１グルコース・不完全なＴＣＡ回路

高いエタノール生産性

*単位時間あたりのエタノール

生産量：実測値

**細胞内のエタノール生産経

路から計算した予測値

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耐熱性 Zymomonas mobilisによる高温エタノール発酵

ザイモモナス・モビリス ＴＩＳＴＲ４０５／５５０株

今回、タイの土壌分離株より耐熱性に着目して再スクリーニング

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30 ºCG

row

th (O

D 5

50 n

m)

0.1

0.5

1.0

2.0

0

Etha

nol (

%)

0.2

0.6

0.4

0.8

1.2

1.0

39 ºC

12 240 36 48 60 12 240 36 48 60

Time (h) Time (h)

Z. mobilis エタノール高生産株（既存株：ＺＭ４株）との比較

増殖

ＺＭ４株（既存株）

ＴＩＳＴＲ４０５株

エタノール生産能

ＺＭ４株（既存株）

ＴＩＳＴＲ５５０株ＴＩＳＴＲ４０５株ＴＩＳＴＲ５５０株

14

Gro

wth

(OD

550

nm

)

0

Etha

nol (

%)

0.2

0.6

0.4

0.8

1.2

1.0

39 ºC

12 240 36 48 60

Time (h)

0.1

0.5

1.0

2.0

酵母Saccharomyces cerevisiae 標準株（ＫＵ１株）との比較

増殖

ＫＵ１株

ＴＩＳＴＲ４０５株

エタノール生産能

ＫＵ１株

ＴＩＳＴＲ５５０株ＴＩＳＴＲ４０５株ＴＩＳＴＲ５５０株

15

0 3 6 9 12 15 18 21 24 30 48 72Time (h)

0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.5

Gro

wth

(OD

550

nm

)

0.01.01.52.02.53.03.54.0

Ethanol (%

)

好気

嫌気

○嫌気条件下での増殖・エタノール生産能が高い→かくはん・エアレーション不要。コストダウン可能

○３９℃における高いエタノール生産能３％グルコース→３６時間で１％のエタノールを生産１６％グルコース→３６時間で４％のエタノールを生産

特徴

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耐熱性 Zymomonas mobilisの改良と利用（将来の展望）

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微生物の改良手法－ザイモモナスにも適用可能

遺伝子導入

遺伝子破壊ザイモモナスでもほぼ確立

自然突然変異 耐熱性株の分離に成功

特定の代謝経路の改変－理論上可能

セルロース系バイオマスからの発酵セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、等々

ＮＡＤＨの呼吸鎖への利用を阻害生産したエタノールの取込みを阻害

その他、着目した性質でスクリーニングも

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多糖分解酵素遺伝子

セルロ−スからのエタノール生産:モデル図

セルロース グルコース

耐熱性ザイモモナス

グルコース エタノール

セルラーゼなど

エンドグルカナーゼ

β-グルコシダーゼ

セロバイオハイドロラーゼ

遺伝子導入

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エタノール生産能力を更に高めるには？→代謝経路の改変が有効

Z. mobilisグルコースグルコース

NADH

NAD

NAD

ED経路

呼吸鎖

エタノールエタノールＡＴＰＡＴＰ

排出

再取込み

エタノールエタノール

★ＮＡＤＨが呼吸鎖に使われるのをブロック

★エタノールの再取込みと利用を阻害

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耐熱性 Z. mobilisの利用：その他の有用物質

グルコース

ピルビン酸

乳酸

アミノ酸エタノ−ル

ブタノール

イソプロパノール

エタノール生産経路を破壊

→ピルビン酸を中間体とする種々の有用物質生産が可能に！

遺伝子導入保有する代謝系を活用

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発酵産業（市場：数十兆円規模）

バイオエタノール生産－現行の酵母に代わりうるポテンシャル

従来の発酵産業

食品：チーズ、ヨーグルト、納豆、酢、味噌、醤油

酒類：ビール、酒、ワイン、ウイスキー

近の発酵産業

医薬品：抗生物質、抗癌剤、抗腫瘍剤、ホルモン、ピル

化学製品：アミノ酸、核酸、糖類、有機酸

酵素産業（酵素製剤）、環境浄化発酵産業

医薬用酵素、化学工業用酵素、食糧工業用酵素、

研究用酵素

想定される技術移転先

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実用化に向けた課題と企業への期待

酵母との比較アルコール耐性、糖耐性など若干酵母が高いものの、エタノール生産に関する性質はザイモモナス優れるスケールアップした実証研究が必要 →企業への期待

セルロース系バイオマスからの一段階エタノール生産遺伝子導入（セルラーゼなど）による形質転換必要バイオマス→エタノールを一段階で行える 適な条件探索工程を確立するための研究が必要 →企業への期待

ザイモモナスを用いた新規な有用物質生産系の確立理論段階予めニーズがあればそれに基づいた反応系統の構築可能

企業への期待

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本技術に関する知的財産権

特許・発明の名称「耐熱性エタノール生産細菌及び耐熱性エタノール生産細菌を用いたエタノール生産方法」・出願番号：特願２００７－２３１０５８・出願人：国立大学法人 山口大学・発明者：山田 守

菌株・ＮＩＴＥ ＡＰ－４１０ （ＴＩＳＴＲ４０５株）・ＮＩＴＥ ＡＰ－４１１ （ＴＩＳＴＲ５５０株）

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お問い合わせ先

山口大学 産学公連携・イノベーション推進機構

ＴＥＬ： ０８３６－８５－９９６１

ＦＡＸ： ０８３６－８５－９９６２

e-mail： ｙｕｉｃ＠ｙａｍａｇｕｃｈｉ－ｕ．ａｃ．ｊｐ

担当： 産学連携コーディネーター 殿岡 裕樹