附表六

長庚大學學生出席國際會議報告書

填寫日期： 98 年 4 月 30 日

報告人姓名 陳泰龍系所及年級 生物醫學所生技組博一

學號 D9701412

會議期間2009/4/16~4/17

核定補助日期 98 年 3 月 16 日

會議地點美國馬里蘭州

巴爾地摩

會議名稱 (中文) 2009 第 41 屆橡樹山陵年會

(英文) 41st Annual Oak Ridge Conference - 2009

發表論文題目

(請附論文全文）

(中文) 利用肽鏈核酸螢光探針偵測有抗藥性(抗濾過性病毒劑)

且微量存在的 A型流感病毒

(英文) Use of peptide nucleic acid probe for homogenous detection of

low abundant, Amantadine-resistant influenza A virus

內容摘要

Detection of drug-resistant mutant of pathogens is important for a

clinician to choose an appropriate therapeutic strategy. However, to

detect such mutants is usually difficult as they might only exist in a

low abundance in the population before treatment. In this study, we

have developed a novel method combining an anchor probe and a

fluorophore-labeled peptide nucleic acid (PNA) probe that covered

the mutation hotspot of matrix protein 2 gene of influenza A virus

for homogenous detection of Amantadine-resistant virus. PNA is a

DNA analog in which the phosphodiester backbone is replaced with

an N-(2-aminoethyl)glycine chain. A wild-type specific PNA

oligomer can selectively inhibit the amplification of wild-type

template but allow the amplification of mutant templates in

polymerase chain reaction. The fluorophore-labeled PNA was also

designed as a sensor probe to reveal the melting curve profile of the

PCR products. By the melting curve analysis after PCR

amplification, the mutant could be identified through its signature

melting peak. On a LightCycler machine, this assay can be finished

in a single tube in less than 30 minutes. The detection limit of this

assay is less than 10 copies of mutant viral genome in the existence

of 1000 fold excess of wild type genome. Using this method, we

have successfully identified 10 mutants from 21 amplifiable, throat

swap samples collected from patients before treatment, which is in

agreement with the results using traditional methods involving viral

culture, PCR, and sequencing. However, we did not find mutant

quasi species in the wild type population, indicating that the

Amantadine-resistant mutant may not co-exist with the wild-type

virus in most patients, or that the mutant exists in an even lower

ratio than the detection limit. In summary, we have developed a

rapid and sensitive method using PNA probe to enrich and detect

low abundant viral mutants. This method may also be useful for the

detection of rare drug-resistant mutants in other pathogens and

cancer cells.

一、報告內容請另頁撰寫，以 A4、標楷 12、橫寫、直式列印，內容包括：

（一）、參加會議經過

（二）、與會心得(以獲取專業新知為主，其他新知，例如人生經歷等為輔)

（三）、建 議

（四）、攜回資料名稱與內容

（五）、其 他

二、系所安排口頭心得報告時間：98 年 6 月 16 日

（未安排原因：＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿）

研發長

所長

指導教授

報告人

學生出席國際會議報告書及網路刊載由研發處備存辦理。

（一）、參加會議經過

本次會議在美國馬里蘭州的巴爾地摩市舉行，巴爾地摩位於華盛頓 DC 的東

北方車程約一小時處，會議名稱為 Oak Ridge Conference，由美國臨床化學學

會(American Association for Clinical Chemistry, AACC)主辦，會議時間是

2009 年 4 月 16, 17 日兩天。本人於會議前兩天台灣時間 4/14 晚上 11 點 55 分

從桃園國際機場搭乘長榮航空出發，先抵達洛杉磯國際機場(LAX)，因為轉機時

間只有 100 分鐘，洛杉磯國際機場又非常大，為了節省轉機時間，我沒有將行李

托運，下飛機後很快的通關(在飛機上要確實寫好通關資料)，直奔另一航廈，轉

搭美國國內航空(UA)轉機到巴爾地摩/華盛頓國際機場(BWI)，飛行總時間約 17

個小時，到當地已經是 4/15 號凌晨六點，在找到當地旅館休息一天後開始兩天

的會議。

本次會議是每年都固定舉辦的臨床化學協會中的小會議，因此場地不大，約

長庚大學工學第一會議廳，在 Baltimore Inner Harbor 的凱悅飯店舉行，於早

上七點開始註冊簽到，八點開始會議，我是貼海報。海報在第一天中午才能張貼，

第二天中午就必須撤離。回答問題的時間為第一天會議的晚間 4點~6 點半，兩

個半小時，從張貼海報以後，除了規定時間外，會議中間休息時間都可以過去看

海報(海報在會議廳隔壁)，因此可以不時過去看是否有人有問題為他們解答，同

時先瀏覽其他人的研究成果。

（二）、與會心得

本年度的會議主軸是以 POC (point of care)為主，希望研發出來的檢測方法

或產品都能以簡單為訴求，讓醫生可以帶著四處跑，不要額外複雜的儀器來反應

或偵測，大部分是以血液檢體開發的方法。會議主題以此再分成四大部分：蛋白

質(抗體)反應的應用、genomic 偵測(DNA, RNA, transcriptome)、微流道技術的開

發以及分子影像。會議第一個主題是 A human protein Atlas for biomarker

discovery，探討在檢驗技術先進、新型檢驗方法不斷產出的時代，要如何有效率

的找出新的 marker 來針對不同的疾病。首先介紹了系統生物學的概念，系統生

物學是許多”Omic”的結合，是以綜觀的方式來看，包含了常見的 Genomics、RNA

profile、Proteomics、Interactomics、Bioinformatics 等等，以前的生物學是針對各

個領域深入研究，但近十幾年來，各種快速產出大量資料的技術逐漸成熟，像是

Genomics 的 next generation sequencing 演化，從 1998 pyrosequencing 出現，能快

速精準的定序出小片段 DNA 序列，到 454 instrument、Solexa instrument 以及

SOLID 等定序技術，可以在短時間內做完數 GB 的定序，以及未來的 PacBio，

期待可以在一小時得到 100GB 的技術，藉由這些，我們可以得到完整的 DNA 序

列，先有了大量的 database 後，再藉由生物資訊方式找出病人與正常人之間基因

不同之處，可以用比較全面的觀念去觀察各種疾病在基因層次產生的變化，而不

是傳統研究，一次鎖定一條 pathway，一個基因；蛋白質方面也是，先用Mass, NMR

等機器做 protein 的掃描，再用生物資訊的分析，Protein Epitope Signature

Taq(PrEST)，一種利用生物資訊計算，選出較有意義的抗原來做抗體，再利用

antibody arrays, western blots, immunoprecipitation, ELUSA, IHC, flow sorting 及

ChIP 等方式，篩選抗體適用於臨床的可行性，如下圖所示

利用這種方式，演講者 Dr. Uhlen (Royal Institute of Technology, Stockholm)實驗室

平均每周可以篩選到 200 餘種 clone，並且做出 150 餘種新蛋白，打出 150 餘種

新抗體，這樣的高效能令人大開眼界。此外他也提供了不錯的網站給我們，

(www.antibodypedia.org)一個用來選擇或確定 antibody 效能的 database。比

較有趣的概念是，篩選出來可能有意義的新蛋白又要考慮在細胞中扮演的角色，

不是所有特異性蛋白都可以拿來當 marker，一般用於臨床的抗體目標通常是細

胞的表面蛋白或分泌性蛋白，所以找出來的新蛋白要去確認他在細胞中的位置，

通常用 IHC 來確認，cancer cell line 在這邊就有很大的功用，因此要做這樣

一個大規模的篩檢，龐大的 cell line 庫也是必須的。

在找出可用的抗體後，還有一些需要考量的事情，像是單株或多株抗體製造、靈

敏度測試等，以及 paired antibodies 的概念，像是 ELISA，針對同一個抗原可

能就需要兩個抗體，能不能找到這樣paired antibodies對於臨床設計也有影響。

另一個我比較有興趣的主題是”Streamlined Preparatory and analytical

capability enables protein quantitation for clinical diagnostics”，主

體概念是利用微流道的方式去loading檢體，並在微流道中加上polyacrylamide

做蛋白質電泳，類似DNA的毛細管電泳，藉此分離檢體中不同的蛋白質，之後再

做偵測定量。在一般的臨床診斷測方式中，蛋白質的測量可以使用centralized

laboratory，這是一種大型機台，並且有人在旁邊監督操作，大概60~120分鐘會

有結果，可以定量，雖然很麻煩，但是可以算是gold-standard；另一種是自動

化機台，不需要人在旁邊監督操作，檢體上機就可以直接做到完的Clinician’s

office系統，大約5-30分鐘可以有結果，而且根據設計不同可以用multi-analyte

panel一次測量多個標的給比較複雜的疾病；最後是本次會議最火紅的

point-of-care home use，只要3-20分鐘即可完成測試，不過只能測簡單的疾病，

而且只能定性不能定量。綜合以上的優點，Dr. Herr研發出用微流道分離的方法

來定量蛋白，不只可以定量，還可以做high throughput的分析，而且可以測到

很低濃度的蛋白，又是自動化機台，最大的優點還是使用微量檢體就夠做檢測。

要使用微流道進行檢測首先遇到的是液體流動的問題，要怎麼讓檢體與

reagent在小空間內混合、incubate。這方面許多微流道開發的廠商也做了許多

精闢的報告，有利用離心力的方式、將路徑設置在光碟般的plate上，控制轉速

與方向就可以驅動檢體流動。另一個大家比較喜歡的方式是用電流控制，像水等

液體在通電時的表面張力與不通電時是不一樣的，如果在晶片上設置像棋盤一般

的路徑，加上格子間電流的控制，就可以像控制棋子般讓液體往某個方向流動。

Dr. Herr就是利用這種電流控制的方法來驅動液流。在通道中加入gel就可以達

到電泳的目的來分離蛋白質，最後如果蛋白質一開始有經過螢光label，則可以

透過detector偵測到不同強度的訊號來定量。

上圖為protein開始分離的情形。

最後一個有興趣的主題是猶他大學所發表的利用Digital PCR測量微量突變

的方式，他的方法也有利用到微流道，他是將檢體及PCR reagent loading在光

碟盤上(如右圖)，利用離心力把template離到一個一個小well中，由於well大小

的限制，加上一些特殊buffer條件，他們可以控制一個well中只有一條template

存在，整個光碟盤大約有2000多個well，之後整盤plate一起去做PCR，並做訊號

偵測，一開始反應中加入兩種不同顏色的probe，一個針對wild-type，另一個顏

色針對mutant，在PCR結束後只要去掃描

有幾個well是mutant的signal，幾個

well是wild-type的signal就可以有效

的偵測到突變的存在，並且知道

wild-type與mutant之間

的比例，這種方法的偵測

極限為一個mutant存在

一千個wild-type中還是

測的到。

（三）、建 議

這種會議是可以學到許多東西，尤其是一些可以取代現有技術的實驗方法，

對於對新技術有興趣的學者而言，是個非常好的機會來學習與交流，像會場中就

有許多合作關係因此而建立。學校提供的機會與輔助非常好，同學們可以多加利

用。

（四）、攜回資料名稱與內容

AACC Oak Ridge 會議資料一份，包含與會貴賓名冊，各個 conference 標題，

會議流程及演講大綱等；三本 journal: “IVD Technology”volume 14, 15，

及”Genome Technology”2009 四月刊。

（五）、其 他

這是我第一次出國開會，出發前做好先做好功課，了解當地天氣狀況，以及

交通大眾運輸等，像我去美國，USA Google map就幫了很大的忙，因為住的旅館

離會議地點有點遠，因此需要使用大眾運輸，google map會幫忙規劃好路線及轉

乘地點，如果要全程搭計程車，旅費可能會大為提升。本次會議更能引導同學有

國際觀，看著來自世界各地的研究員，他們都很大方的伸出手說你好，可以深刻

了解到害羞在這種場所是沒有用的。總之這次出國除了會議上所學到的新知，還

跟不少外國朋友交流，交換名片，是個很難忘的經驗。