ecue méthodologie de la génétique moléculaire mise en évidence et cribles basés sur des...
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ECUE Méthodologie de la Génétique Moléculaire
Mise en évidence et cribles basés sur des interactions protéiques
Cribles basés sur des critères d’expression différentielle
Mutagenèse insertionelle chez la drosophiletransgenèseVecteursMutagenèsePerte et gain de fonction
Cours sur le FRET Maïté Coppey : 12/10
Cours sur la PCR quantitativeThierry Grange19/10
TD : Claire Darzac
TD : Sandrine Caburet
TD : Alain Zider
Mise en évidence d’interactions protéiques par des méthodes biochimiques
Test d’interaction GSTCo-immunoprécipitation
Cribles permettant d’identifier des partenaires protéiquesCriblage d’une banque d’expression dans lambda GT11Clonage de molécules de surface par expression transitoireLe système double hybrideLe phage display
Protéomique et interaction protéique
GST X
plac
Culture de bactéries
Extraction protéique
Lysat bactérien
Analyse sur gel SDS page
M• marquage métabolique• produit de transcription traduction
rinçages
GST X
plac
Culture de bactéries
Extraction protéique
GST
plac
rinçages
Analyse sur gel SDS PAGE
M
X
Y
Ig
Mise en évidence Y•Coloration à l’argent•Anticorps anti Y•Marquage métabolique methionine35S•Cartographie peptidique par spectrométrie de masse
Co-immunoprécipitation
Extrait cellulaire
Anticorps anti X
Protéine A sépharoseDénaturation et analyse sur gel SDS page
Criblage d’une banque d’expression dans GT11
Criblage d’une banque d’expression dans GT11
banque de cDNAconstruite dans un vecteur d’expression eucaryote
Cellulescos
Expression transitoire
Incubation avec un premier anticorps isolement de l’ADN épisomal
Transfection dans des bactéries
Analyse des cDNA (séquençage)
étalement
Lex op
LexA
Gal4 AD
LacZ
DLA Apat PolyAProm.
ampiciline
trp2µOri coli
LexADLA gal4
DAT Proie PolyAProm.
ampiciline
leu2µOri coli
DAT Gal4VP16B42
Rapporteur PolyA
ampiciline
His2µOri coli
lacZmet
DLA
Apat
DAT
Proie
stratégie de contre sélection
5’ fluoroorotic acid
5’ fluorodexoxyuridine Thymidilate synthase
DNA synthesis
Mise en évidence d’une interaction Protéine ARN
(phage MS2)
Apat
ARN phage MS2
Transformation dans E.Coli (sup ambre)
Phage rescue
purification des phages et passage sur colonne d'affinité
Ré-infection de bactéries et isolement des plasmides
rinçages
élution
Co-Immunoprécipitation
RNA biotinylés Spliceosome humain
Analyse en gel bidimensionnel Identification parSpectrométrie de masse
Isolement du cDNA correspondant
Expression d’une protéine chimère 41-GFP
41-GFPAnti corps anti -U1-snRNP
Transfection dans des celllules HeLa