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試 験 管 内HbO2-KCN-H2O2反 応 系 に お け る

鉄 分 離 に 関 す る 研 究

第2編

HbO2-KCN-H2O2反 応 系 に お け る 所 謂

易 分 離 鉄(G. Barkan)の 検 討

岡山大学医学部第一内科教室(主 任:小 坂 教 授指導:九 州大学　山岡教授)

藤 原 拓 一

〔昭和34年9月5日 受稿〕

緒 言

O. Warburg及 びNegelin1)のgrunes Haemin

の 発見 以来,試 験 管 内及 び生 体 内血 色 素分 解 過 程 に

つ いて は数 多 くの 実験 及 び模 型反 応 が 試 み られ た が ,

比較 的生 理的 な 条件 で行 わ れ た 試 験 管 内 模 型 反 応

と して代 表 的 な も の にR. Lemberg2)の 血 色 素-l-

Ascorbin酸-H2O2(又 はO2)反 応 系 及 びG . Bar

kan3)のpseub0hemoglobinを 前 駆 物 質 と して 得 た

血色素-KCN-H2O2反 応 系 が挙 げ られ る.

1930年O. Warburg, E. Negelin,次 でA. B.

Anderson4), R. Lemberg, S . Eldbacher & A. von

Segesaer5), H. Fischer & H. Libowitzky6) , G. Barkan

等 に よ り,又 本 邦 に於 い て は 日本 医科 大 学 生 化 学 教

室7)-14)及 び 当教 室 に よ り,こ れ ら の 分 解 過 程 に 詳

細な 検討 が 加 え られ た.

教 室永 井15),湯 浅16),尼 子17)等 の研 究 は 血色 素-l,

aecorbin酸-O2又 はH2O2反 応 系 に つい て 行 わ れ

た もの であ り,教 室 竹 田18)の そ れ は 血 色 素-KCN-

H2O2反 応 系 に於 け る主 と して 分 光 化 学 的研 究 て あ

つ た.

G. Barkanは 血 色 素 にKCNとH2O2を 作 用 さ

せ ること に よ り緑 色 物 質 の 生 しる こと を 認 め,こ れ

に0.4%の 塩 酸 を 作 用 させ ると容 易 にion状 の 鉄 を

遊 離 す るこ とか らこれ をPseudohlmoglobinと 名 付

けた.彼 に よ るとpaeudohemoglobin鉄 特 に彼 の 謂

う易 分離 鉄 を含 むBilirerdinの 前 駆 物 質 であ る と

考 えて お り, R. Lembergの 云 うCholeglobin又 は

Verdohemoglobinと 大 概 近 似 の もの で あ る とい う.

著者 は血 色 素-KCN-H2O2反 応 系 を使 用 して 試 験 管

内 に於 け る血 色 素 分 解 過 程 中 にBarkanの 謂 う易

分 離 鉄 が 如 何 な る遊 離 状 態 を示 す か を反 応 条 件 を種

々変 え て 検 討 を加 え,本 反応 に批 判 を加 え た.

実 験 材 料 並 び に 方 法

実 験 材 料

血 色 素はM. Engel19)の 方 法 に よ り牛 血 か ら調 製

した.

反応 液 の 調製 法

血 色 素 をM/15燐 酸塩 緩 衝 液 を 以て0.5g%の 濃度

に,各 種pHに 稀 釈 した もの と,各 種 濃 度 の過 酸

化水 素 溶 液 及 び 各種 濃 度 のKCN溶 液 の三 者 を 口径

の 一 定 し た 硝 子 瓶 に 各 々40cc, 5cc, 5ccと り

反 応 系 を 完 成 し,反 応 を 進行 させ,反 応 開 始 後1分

毎 に10分 間 夫 々5ccをpipetteで 採 り,こ れ に1.2

%塩 酸2.5ccを 加 えて 易分 離鉄 を測 定 した.

反応 液 中 の 易分 離 鉄 の 測定 法

反 応 液5.0ccを と り,こ れ に1.2%の 塩 酸2.5cc

を 加 え て37℃ の恒 温槽 に16時 間放 置 した後,こ れ

に20%三 塩 化醋 酸2.5ccを 加 え,よ く振 盪 混 和 し

た 後,東 洋 濾 紙No. 6で 濾 過 し,濾 液1.0ccを 正

確 に2.0ccの 目盛 を つ け た 試 験 管 に と り,こ れ に

濃 硫酸2滴 と過 塩素 酸4滴 を 加 え,充 分 酸 化 の行 わ

れ るまで 火 焔上 て加 熟 した後, paranitrophenolを

指 示 薬 と して28% ammonia水 で 中 和 し,更 に再蒸

溜水 で2.0ccに 稀釈 す る.こ の も の に 飽 和 酪 酸 曹

達 溶液0.5cc, pH 4.7の 醋 酸 醋 酸 曹 達緩 衝液 へ の

1%硫 酸hydrazine溶 液0.5cc, 0.1% O-phenan

throlin溶 液0.5ccを 順 次 に加 え,室 温 で24時 間 放

置 して 完全 に 発 色 させ た後, Purfrichの 光 度 計 で

7566　 藤 原 拓 一

濾 光 板S50を 用 い て 吸 光 係 数 を決 定 し, A(7%)

=0.91×(E-E0)×Dに よ り 求 め る鉄 量 を算 出 し

た.

実 験 成 績

1. 過 酸 化 水 素 の濃 度 に よ る影 響

反 応 組 成 を 血 色 素0.5g% 4.0cc, KCN 0.5cc,

H2O2 0.5ccと し, H2O2の 濃 度 を1.0M, 0.1M,

0.01M, 0.001M, 0.0001M, 0.00001Mの6段 階 に

分 けて その 各 々の 濃 度 に 於 け る易分 離 鉄 を 測 定 して

み ると第1図 の 如 くで あつ た. 0.1M以 上 の 濃 度 で

は著しく大量の鉄分離が認められ,時 には殆んど全

鉄量に近い値を示す こと もある. 0.01M以 下の濃

度ではH2O2の 濃度に比例 して易分 離鉄収量は増加

し,反 応速度に於いても濃度の上昇 と共に迅速とな

るのが認められる. 0,0001M以 下 の濃度では極め

て収量が低い.従 つて0.01Mが 至適濃度 と考えら

れ る.

第1図　 H2O2の 濃度による易分離鉄収量の

消長

2. KCNの 濃 度 に よ る影 響

反 応 組 成0.5g%血 色 素 溶 液4.0cc, 0.01M

H2O2 0.5cc, KCN 0.5cc.

KCNの 濃 度 を1.0M, 0.1M, 0.01M, 0.001M,

0.0001M, 0.00001Mの6段 階 に 分 けて 各 々の 濃

度 に於 け る易分 離 鉄 を測 定 して み る と第2図 の如 く

で, 1.0Mで 最 高 の 収 量 を 示 し,反 応 速 度 も最 も速

く,反 応 開 始 後3分 で最 高 値 に 達 した. 0.00001M

で は 最 低 値 を 示 し,反 応 約5分 で最 高 値 に 達 し,そ

の 間 の 濃 度 で は 濃 度 の 上 昇 に 比 例 して 易 分 離 鉄 収 量

も増 加 す る傾 向 が 見 られ,反 応 速 度 も迅 速 とな る よ

うに 認 め られ た.

第2図　 KCNの 濃度による易分離鉄収量の

消長

3. 反 応 順 序 に よ る 易分 離 鉄 収 量 の 変 化

反 応 組 成 を0.5g%血 色 素4.0cc, 0.01M H2O2

0.5cc, 1.0M KCN 0.5ccと し,血 色 素 溶 液 に

H2O2を 加 え た もの にKCNを 加 え る ま での 時 間 の

変 化 が 易 分離 鉄 収 量 に与 え る影響 を検 討 す る 目的 で,

その 時 間 を5分, 30分 及 び60分 と変 え て 夫 々 の場 合

に於 け る易 分 離鉄 を測 定 して み る と第3図 の 如 くで,

30分及び60分に於いては殆んど差異のない値を示 し

たが, 5分 に於いては反応速度が遅 くなり,収 量も

多少低値を示 した.何 れの場合に於いても顕著な差

異は表われなかつた.な お反応系pHは7.2で あつ

た.

第3図　 反応順序による易分離鉄収量の変化

4. 血色素にKCNを 加 えたものにH2O2を 加え

るまでの時間による易分離鉄収量の変化

血色素にKCNを 加 えた ものにH2O2を 加える

まての時間を5分, 30分及び60分 の3種 類に分けて

その各々の場合に於ける易分離鉄を経時的に測定し

試 験 管 内HbO2-KCN-H2O2反 応 系 にお け る 鉄分離 に関 す る研 究　 7567

てみると第4図 の如 くで, 5分 及び30分の場合は反

応速度及び収量共に殆んど一致 した経過を示 し, 60

分に於いては反応速度は殆んど異るところはないが,

収量に於いて前2者 よりやや高値を示 した.然 し何

れの場合に於いても反応順序による著 しい差異は認

められなかつた.

第4図　 反応順序による易分離鉄収量の変化

5. 反 応 系pHに よ る易分 離 鉄 収量 の消 長

反応 組 成0.5g%血 色 素 溶液4.0cc, 0.01M H2O2

0.5cc, 1.0M KCN溶 液0.5ccと し,反 応 系 に

M/15燐 酸塩 緩 衝 液 を加 え, pHを6.2, 7.2, 8.0,

9.0の4段 階 に分 け て 各 々 のpHに 於 け る易 分 離 鉄

収 量 を経時 的 に測 定 し て み る と第5図 の 如 く, pH

7.2の 時 に易 分 離 鉄 の 収 量が 最 も多 く,そ の 他 のpH

で は8.0, 6.2, 9.0の 順 に 収 量 が減 少 す るの が 認 め

られ た.な お反 応 速 度 につ い て も同 じよ うな傾 向 が

認 め られ た.

第5図　 反応系pHに よる易分離鉄収量の変化

6. 反応系温度による易分離鉄収量の消長

反応系の温度を37℃, 20℃ 及び0℃ に分けて

その各々の場合につき上記反応組成による反応系に

於いて易分離鉄収量を観察してみると第6図 の如き

結果が得られた. 37℃ に於いては0℃ に比べて反

応速度及び収量に於いて迅速旦つ大であり,ほ ぼ3

倍の収量を得た. 20℃ に於いては0℃ と37℃ の

ほぼ中間の値を得た. 0℃ に於ける反応は極めて緩

徐て,そ の収量も血色素の易分離鉄に近似の値を示

し,反 応が殆んど進行していないように思われた.

一般に温度の上昇と共に反応速度及び易分離鉄収量

の増加するのが認められた.

第6図　 反応系温度による易分離鉄収量の変化

空気遮断による易分離鉄収量の変化

7. 空気遮断が易分離鉄収量に及ぼす影響

第7図　 空気遮断による易分離鉄収量の変化

上記反応組成を使用して反応系を完成 し, toluene

を重層して空気を遮断し,反 応を進行させた場合と,

tolueneを 重層することな く反応 を進行させた場合

の夫々の易分離鉄収量を比較してみると第7図 の如

くで,何 れの場合に於いても反応速度及び易分離鉄

収量に殆んど差異を認めなかつた.即 ち空気遮断に

よる易分離鉄収量及び反応速度に対する影響はない

7568　 藤 原 拓 一

もの と考 えて よい 結 果を得 た.

総 括 並 び に 考 按

試 験 管 内 血 色 素 分 解 過 程 をBarkanのEbO2-

KCN-N2O2反 応 系 を 使 用 して 易 分 離 鉄 の遊 離状 況

を 還元 剤 を使 用 す る ことな く定 量 して 検 討 を 加 え た

結 果 次 の如 き結 果 を 得 た.

即 ち,該 反 応 系 か ら遊 離 す る易 分離 鉄 はKCN及

びH2O2の 濃度 の増 加 と 共 に そ の 収 量 が増 加 し,

KCNは1.0M, H2O2は0.01Mに 於 い て最 高 の 収

量 を示 し,反 応 速 度 も最 も迅 速 で あ るこ とを 認 あ た.

H2O2が0.1M以 上 にな る と きは著 し く大 量 の鉄 遊

離 が 認 め られ た.

これ は 血 色素 の補 欠 簇 自体 か ら も鉄 分 離 が 認 め ら

れ るた め で あ ろ う.

更 に該 反 応 に於 け る易 分離 鉄 の分 離 は反 応 温 度 の

上 昇 と共 に増 加 し, 37℃ に於 いて 最 も大 な る収 量

を 得 た.又, pHは7.2の 時 に最 大 の 収 量 が 得 られ,

これ よ り酸 性側 に於 い て もalkali側 に 於 い て も収

量 は 低 下 す るの が 認 め られ た.

次 に該 反 応 系 に於 いて 空気 を遮 断 した 時 の 易分 離

鉄 収 量 と非 遮 断 時 の それ とは殆 ん ど差 異 が 認 め られ

ず,又,反 応順 序 に よ る易分 離 鉄 収 量 の 差 異 も著 し

い もの は 認 め られ な か つ た.

G. Barkan20)が1925年 血 色 素 に 胃液 を 作 用 させ る

と遊 離 す る鉄 の あ る こ とを見 出 して か ら, 1927年21)

に この鉄 に対 し易 分 離 鉄(leicht abspaltbares Blu

teisen)と 命 名 し,こ の鉄 は0.4%の 割 合 に塩 酸 を加

え た さい に 生 ず る も の で あ り,後 に彼 の 提 示 した

HbO2-KCN-H2O2反 応 系 の 中 間産 物pseudohemo

globinよ り 遊 離 す る鉄 に一 致 した3). R. Lemberg

ら は 彼 の 提 示 し た 血 色 素 分 解 産 物 中 に 生 ず る

choleglobin乃 至verdohemoglobinはpseudohemo

globinと ほ ぼ 同 位 に あ る こ とを 認 め,上 代,菊 地

ら も同 様 に これ を 認 め,教 室 の竹 田 も これ を 詳 細 に

検 討 して い る.

処 で 易分 離鉄 と呼 ばれ る0.4%塩 酸 に よ り遊離 す

ろ鉄 がpseudohemoglobin自 体 よ り遊 離 す る鉄 の み

で あ る か 否 か に 関 して はS. L. Tompsett22), H.

Venndt23), L. L. Miller & P. E. Hahn24)ら の 反 対

が あ る が,教 室 島 村 がR. Lembergの 提 示 し た

HbO2-l-Ascorbin酸-O2反 応 系 に つ いて 検 討 した実

験 や,生 体 内 血 色素 分解 過 程 につ い て行 つ た実験 或

は教 室 龍 治が 同 様 に詳 細 に検 討 した 実験 よ りす れ ば,

0.4%塩 酸 に よ り始 めて遊 離 す る鉄 はG. Barkanの

主 張す る如 く血 色 素 分解 過 程 の 中間 産 物 よ り遊 離 す

る鉄 を意 味 す る こ とを明 らか に して い る.

そ こで著 者 はG. Barkanの 提 示 したHbO2-KCN-

H2O2反 応 系 につ き,易 分 離 鉄 の立 場 か ら反 応 に及

ぼす 諸 条 件 を 検 討 し た の で あ るが,上 述 の如 く,

KCNとH2O2の 至 適 濃 度 に 於 いて は,教 室 永 井 や

尼 子 らが, HbO2-l-Ascorbin酸-O2反 応 系 に見 出 し

た よ うな諸 条 件 と近 似 な結 果 を 得 た.

結 論

G. Barkanの 提示 したHbO2-KCN-H2O2反 応 系

につ い て の 易分 離 鉄 の 消 長 を還 元 剤 を使 用 す る こと

な く定 量 的 に検討 し,次 の 結 果 を得 た.

1. 易 分 離鉄 の収 量 か らみ た本 反 応 系 の 至 適条 件

はKCN 1.0M, E2O2 0.01Mで あ る.

2. 本 反 応 系 に 於 い てH2O2を0.1M以 上 にす

る と,血 色 素 自体 か らも鉄 が遊 離 す る.

3. 本 反 応 系 では, 37℃, pH 7.2が 至 適 で あ る.

4. 本 反 応 系 で はKCNとH2O2の 作 用順 序 を

変 え て も,又, tolueneで 遮 断 して も変 化 は 見 られ

な か つ た.

文 献

1) O. Warburg & E. Negelin: Ber. Dtsch. Chem.

Ges. 63, 1816•`1818, (1930)

2) R. Lemberg, J. W. Legge & W. H. Lockwood:

Biochem. J. 35, 328, 339, 353, 363, (1941)

3) G. Barkan & O. Schales Z. physiol. Chem.

248, 96, (1937)

4) A. B. Anderson & P. D. Hart: J. Path. &

Bakter. 39, 465•`479, (1934)

5) S. Eldbacher & A. V. Segger: Nature. 25,

461, 557, 667, (1937)

6) H. Fischer & H. Libowitzky: Z. physiol.

Chem. 251, 198, (1938), 191, (1940)

7) Kaziro, Kikuch, Ogawa & Yamada: J. Bio

chem. 40, 205, (1953)

試 験 管 内HbO2-KCN-H2O2反 応 系 にお け る鉄 分 離 に 関す る研 究　 7569

8) Kikuchi, Makita & Saito: J. Biochem. 41,

227 (1954).

9) 菊 地:　 生 化 学, 24巻, 62,(昭28)

10) 菊 地,生 化 学, 24巻, 67,(昭28)

11) 小 川,生 化 学, 24巻, 200,(昭28)

12) 小 川:　 生 化 学. 25巻, 225,(昭29)

13) 上 代:　 綜 合 医 学, 11巻, 844,(昭29)

14) Kikuchi, Yamada: J Biochem. 41, 239, (1954)

15) 永 井:　 医 学 研 究, 22巻, 1100,(昭27)

16) 湯 浅:　 医 学 研 究, 24巻, 1353,(昭29)

17) 尼 子:　 医 学 研 究, 27巻. 1584,(昭32)

18) 竹 田　 未発 表.

19) M. Engel: Z. physiol. Chem. 266, 135, (1940)

20) G. Barkan: Z. physiol. Chem. 148, 124,

(1925)

21) G. Barkan & C. Schales; Z. physiol. Chem.

171, 179, (1927)

22) S. L. Tompsett: Biochem. J. 34, 959, (1940)

23) H. Venndt: Z. physiol. Chem. 263, 162,

(1940)

24) L. L. Miller & P. F. Hahn: J. Biol. Chem.

134, 585, (1940)

Studies on the Isolation of Iron in the HbO2-KCN-H2O2

Reaction System in vitro

Part II. Studies on So-Called Easy Split Iron (G. Barkan) in

the Hb2-KCN-H2O2 Reactionssystem

By

Takuichi Fu jiwara

The First Department of Internal Medicine, Okayama University Medical School

(Chief; Prof. K. Kosaka: Director: Prof. K. Yamaoka Kyushu University)

The vicissitude of easy split iron in the HbO2-KCN-H2O2 reaction system put forward

by G. Barkan was quantitatively observed, without the use of reducing agent. And the

resulte were as follows.

1. The most proper condition grounded on the yielded dosis of easy split iron was KCN

1.0 M and H2O2 0.01M.

2. Iron was separated from hemoglobin itself on H2O2 over 0.1M, in this reaction sy

stem.

3. The most proper condition was the pH 7.2 at 37•Ž, in this reaction system.

4. The change was not observed on the change of acting order between KCN and H2O2,

in this reaction system.