冬虫夏草を用いた生理活性物質コルジセピンの製造方法

福井大学 大学院工学研究科 生物応用化学専攻准教授 櫻井 明彦

• コルジセピンについて

• 冬虫夏草変異株の作出

• コルジセピンの生産・精製

冬虫夏草について

・ Cordyceps sinensis (中国天然産, コウモリガの幼虫に寄生)

・ Cordyceps sobolifera (セミタケ)

・ Cordyceps militaris (サナギタケ)

・ Cordyceps japonensis (アリタケ)

・ Isaria japonica (ハナサナギタケ)

昆虫に寄生するキノコ

抗菌 ⇒ コルジセピン、オフィオコルジン

抗腫瘍 ⇒ コルジセピン、デオキシアデノシン、エルゴステロールパーオキシド多糖 (ガラクトマンナン, β-(1→3)-D-グルカン)

免疫賦活 ⇒ 多糖 (β-(1→3,1→6)-D-グルカン)

免疫抑制 ⇒ ミリオシン

血糖降下 ⇒ 多糖 (ガラクトグルコマンナン, β-(1→3)-D-グルカン)

薬理活性の例

抗ガン

（アポトー

シス）

分析生産

抗菌

抗ウイル

ス

免疫、

抗炎症

誘導体その他

コルジセピンとは

Cordycepin (3’-deoxyadenosine)

プリンde novo合成の阻害

DNA, RNA合成の阻害

RNAへのpoly (A)付加阻害

mRNAの細胞質への移送阻害 白血病治療薬phase II(ClinicalTrials.gov,NIH)

研究報告例

Adenosine

コルジセピンの作用

従来技術と新技術の比較

コルジセピン生産法

概要 課題 生産性（コスト）

新技術

冬虫夏草変異株を用いた液体表面培養法

• 変異株を使用• 液体表面培養

スケールアップが困難

高い（低い）

従来技術

冬虫夏草野生株を用いた液体深部培養

• 野生株を使用• 液体タンク培養

生産性が低い低い

（高い）

冬虫夏草菌糸体の採取・抽出

• 天然の冬虫夏草生産性が著しく低い

著しく低い（著しく高い）

冬虫夏草

技術内容

コルジセピンの低コスト・高効率生産

イオンビーム照射による変異コルジセピン高生産株の作出

培養条件の最適化コルジセピン精製条件

の最適化

様々な生理活性物質を生産するが、生産性が極めて低い。

古くから、漢方薬や薬膳食材として利用されており、有効成分の大量生産が期待されている。

古くから、漢方薬や薬膳食材として利用されており、有効成分の大量生産が期待されている。

細胞 細胞

高LET：イオンビーム 低LET：X線・γ線

LETとDNA損傷の関係

植物：キクの育種

原研高崎研、農水省生物研データ

120.0 keVμm‐1

96.0 keVμm‐1

X‐ray

27.1 keVμm‐1

真核生物： 赤色酵母の変異

イオンビーム(陽子線、重粒子線)

変異誘発細胞死（DNA 修復が不可能）

高LET放射線(LET: Liner Energy Transfer)

→低LETよりも与えるエネルギーが大きい

イオンビームを用いた変異導入

イオンビーム照射による変異の特徴

逆位 転座欠失

点変異

大きなDNA構造変化

1. タンデム加速器で陽イオン化し、加速2. シンクロトロンで最終的に200MeV (H+)、660MeV (C6+)に加速3. 陽子線、重粒子線をプレート上の菌糸体に照射

Ion beam spec

イオンビーム照射設備

Ion beams

Beam energy(MeV)

LET(keV/μm) Dose (Gy)

Carbon 660 42 200 ‐ 2000Proton 200 0.5 100 – 1000Tandem 

accelerator

Synchrotron accelerator

Irradiation device

Ion source

イオンビーム照射設備

Agar plate

Culture time [d]

0 2 4 6 8 10 12

Dia

met

er o

f myc

elia

l mat

[cm

]

0

1

2

3

4

5

Wild type 600 800

Dose [Gy]

変異株のスクリーニング－１

Culture time [d]

0 2 4 6 8 10 12

Dia

met

er o

f myc

elia

l mat

[cm

]

0

1

2

3

4

5

Wild type 200 500 75010002000

Dose [Gy]

Proton (H+) Carbon (C6+)

～増殖速度による変異株の選抜～

Diameter of mycelial mat

変異株のスクリーニング－２

8‐アザアデニン

8‐アザグアニングアニン

アデニン

アデノシン

AMP

IMPR5P

ペントースリン酸経路

GMP

グアノシン

コルジセピン

～アナログ耐性菌の選抜～

フィードバック制御

フィードバック制御

変異株のスクリーニング－３

G81‐3 G82‐4

コルジセピンの増殖抑制効果

Bacillus subtilis

コルジセピン高生産株

～阻止円による変異株の選抜～

8‐azaadenine A63‐7, A63‐8 A81‐2, A81‐6

8‐azaguanine G63‐8, G81‐3 G82‐4

選抜した変異株

変異株のスクリーニング－４～液体表面培養法による変異株の選抜～

Culture time [d]

0 5 10 15 20 25 30

WildG63-8G81-3 G82-4

Cor

dyce

pin

[g/L

]

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Culture time [d]

0 5 10 15 20 25 30

Glu

cose

[g/L

]

0

5

10

15

20

WildA63-7A63-8 A81-2A81-6

最終スクリーニング

G81-3を選択

8‐アザアデニン耐性菌株 8‐アザグアニン耐性菌株NH2

N

N NH

NN

応答曲面法によるコルジセピン生産の最適化

Culture time [d]

0 5 10 15 20 25 30 35C

ordy

cepi

n [g

/L]

0

2

4

6

8

10

Mutant G81-3Wild

0

2

4

6

8

2040

6080

100120

4060

80100

120

Cor

dyce

pin

(g/l)

Glucos

e (g/l

)

Yeast extract (g/l)

世界最高のコルジセピン生産性を達成

方 法収 量

(g/L)References

深部培養 (DO制御) 0.20 Biotechnol. Progr. 20,1408-1413 (2004)

深部培養 (NH4+制御) 0.42 Enzyme Microb. Technol. 38, 348-350 (2006)

表面培養 (窒素源) 0.64 Enzyme Microb. Technol. 39, 641-646 (2006)

深部培養+表面培養 2.2 Biochem. Eng. J. 33, 193-201 (2007)

表面培養 (添加物) 2.5 Enzyme Microb. Technol. 40 1199-1205 (2007)

表面培養 (変異株) 8.6 Afr. J. Biotechnol.8, 3041-3047(2009)

コルジセピン生産性の比較

コルジセピンの精製

培養上清 精製品

Cordycepin

Main impurity

HPLCによる純度の確認ODS, 0.1%H3PO4/MeOH=98/2, UV260nm

精製収率60％以上

純度 95％以上

コルジセピンの精製の詳細

櫻井 明彦

福井大学大学院工学研究科生物応用化学専攻〒910-8507 福井市文京3-9-1

TEL: 0776-27-8924; FAX: 0776-27-8747 E-mail: a_sakura@u-fukui.ac.jp

コルジセピンの精製方法については、未公開特許のため配付資料には記載していません。当日の発表をご覧下さい。

資料内容についての問い合わせ先

試作品

コルジセピン 菌糸体粉末 菌糸体カプセル

参考（和光純薬 10,400円/1mg; Sigma 87,800円/100mg）厚労省調査結果 平均35万円/g

コルジセピン原材料費： 5000円/g以下（試薬ベース）

試作品の有害性

急性毒性試験（マウス経口）

コルジセピン：LD50 ＞ 2000 mg/kg

菌糸体:LD50 ＞ 2000 mg/kg

ControlB(a)P

Cordycepin

B(a)P+cordycepin

Col

ony

coun

t [FP

U/p

late

]

0

20

40

60

80

100エームス試験

• 急性毒性なし

• 変異原性なし

• 抗変異原性なし

まとめ

イオンビーム照射を用いてコルジセピン高生産性の冬虫夏草変異株を作出した

冬虫夏草変異株によるコルジセピン生産の基本条件を確立した（世界最高レベル）

冬虫夏草培養液からのコルジセピン精製の基本条件を確立した

コルジセピンの安価供給が可能

新たな用途開発（化粧品、医薬品 etc）

今後の検討課題（企業への期待）

コルジセピン生産のスケールアップラボスケール⇒ベンチスケール

コルジセピンの用途探索（共同研究希望）化粧品や健康食品の原料としての評価

多糖類の構造・生理活性の解析免疫賦活作用などの解析

知的財産権

発明１

冬虫夏草の突然変異体及びその変異体の培養法出願番号： 特願2007‐201235出願人： 福井大学、若狭湾エネルギー研究センター

発明者： 榊原三樹男、増田美奈、櫻井明彦、畑下昌範

発明２

コルジセピンの製造および精製方法出願番号： 特願2011‐262995出願人： 福井大学

発明者： 櫻井明彦、増田美奈

問い合わせ先

福井大学産学官連携本部 知的財産部 高岡 勉（総合戦略部門 研究推進課）

TEL 0776-27-9725FAX 0776-27-9727e-mail ttakaoka@u-fukui.ac.jp