超高速から高分離lc - 株式会社ワイエムシィ超高速から高分離lcまで...
TRANSCRIPT
超高速から高分離LCまで~誰にも使いやすい2 m YMC-UltraHTカラムのご紹介~
2008.09.03 11:35~12:252008分析展 新技術説明会
株式会社 ワイエムシィ
2
アウトライン
超高速・高分離LCの特徴(メリットとデメリット)
YMC-UltraHT seriesのコンセプト
最適な分離を実現するためのポイント
YMC-UltraHT seriesを用いた高速・高分離アプリケーション
3
超高速・高分離LCとは
高流速/ショートカラム
5 mや3 m粒子の従来サイズカラムに比べて1/5~1/10の分析時間
微粒子化充填剤による高効率化( van Deemterの法則)
充填剤の微粒子化により高流速条件でも高いカラム効率を維持
超高速LC2 m50 x 2.0 mmI.D.
コンベンショナル LC 5 m150 x 4.6 mmI.D.
同等の分離で
分析時間 約1/10溶媒使用量 約1/15感 度 約2倍※
mV
0
50
100
J060223F
mV
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 min
0.0 1.0 2.0 3.0 min
0
50
100
26 min/run ×1 mL/min = 26 mL/run
5 L Injection
3 min/run ×0.6 mL/min = 1.8 mL/run
1 L Injection
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 26.0 min
0 J060303B
mV
50
100
カラム長 ×1/3カラム断面積 ×1/5線流速 ×3
※同システムで比較
4
超高速・高分離LCのメリットとデメリット
• 微粒子による高いカラム背圧
• 従来LCが使用困難
• 既存コンベンショナルカラムとは異なる選択性(保持が小さいものが多い)
• 従来LC ⇔超高速LC間のメソッド移行の難しさ
• 分析時間の大幅な短縮
• 分離の向上
• 検出感度の向上
• 溶媒使用量の削減
• 分析メソッド開発の迅速化
• 生産性の向上
DisadvantagesAdvantages
5
高分離能
最小限の圧力損失
分離選択性
ピーク形状
再現性
耐久性
汎用性
新開発のシリカゲル粒子
最密充填
新設計カラム構造
実績ある表面修飾技術
YMC-UltraHT Pro C18優れたピーク形状と高分解能のファーストチョイスODS
YMC-UltraHT Hydrosphere C18水100%移動相でも使用可能な高極性化合物分離用ODS
高速・高分離のメリットを損なうことなく
高圧・非汎用性のデメリットを低減する
ベストバランス
YMCのカラム開発コンセプトとデザイン
6
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Optimum flow rate for 2 m(0.3-0.8 mL/min for 2 mmI.D.)
Column : 50 x 2.0 or 2.1 mmI.D.Eluent : acetonitrile / water
(60/40)Temperature : 25℃Sample : Butyl benzoate
HE
TP (m
m/p
late
s)
Interstitial linear velocity (mm/sec)
YMC 5 m
YMC 3 m
他社 sub-2 m A
YMC 2 m
他社 sub-2 m B
Optimum flow ratefor 5 m
(0.2 mL/min for 2 mmI.D.)
高流速領域においてsub-2 mに匹敵するカラム効率を実現
高速分析時のカラム効率van Deemter curves
*HETP; カラム長を理論段数で除した値、小さいほどカラム効率up*Interstitial linear velocity; カラム長を空保持時間(t0)で割って得られる線速度、大きいほど流速up
7
Interstitial linear velocity (mm/sec)
YMC 5 m
YMC 3 m
他社 sub-2 m A
YMC 2 m
他社 sub-2 m B
Col
umn
pres
sure
(MP
a)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
sub-2 mの60%以下のカラム圧力最適流速領域で従来耐圧LCにも十分適用可能
Column : 50 x 2.0 or 2.1 mmI.D.Eluent : acetonitrile / water (60/40)Temperature : 25℃Sample : Butyl benzoate
Optimum flow rate for 2 m(0.3-0.8 mL/min for 2 mmI.D.)
従来LCが適用可能な
圧力領域
従来LCで使用可能なカラム背圧線流速とカラム圧力の関係
8
YMC-UltraHT seriesのラインナップ目的・システムに応じたカラムサイズの選択
○○75 mm
○○50 mm
○○100 mm
-○30 mm
3.0 mm2.0 mmカラム長
カラム内径
溶媒量の削減カラム外拡散の影響低減
SPEED
分離能
50 x 2.0 mmI.D. -超高速LCのスタンダード
カラム長100 mm -精密分離に有用な高分解能カラム
カラム長 30 mm -分析時間の短縮を重視する場合に有効なショートカラム
内径3.0 mm -従来のシステムに適用しやすいサイズ
各カラムサイズの特長
9
最適な分離を実現するためのポイント
System volumeの影響
検出・データ取り込み速度の影響
グラジエント分析におけるdelay volumeの影響
超高速LCメソッドへの移行例
10
system volumeの低減 (1)セル容量が与える影響
スタンダードセル セミミクロセル
N 4 4500 6900
Rs(2/1) 0.90 1.61
内径2 mmカラムを用いる際は
セミミクロセルの使用を
3 min0 1 2
mAU
0
20
40
60
80
(N070608E)
1 2 3
4
3 min0 1 2
mAU
0
50
100
150
(N070608B)
1 23
4A) スタンダードセルセル容量(8 L)システム容量(600 L)
B) セミミクロセルセル容量(2.5 L)システム容量(600 L)
Column : YMC-UltraHT Pro C18 (2 m, 12 nm)System : 従来型LCシステムEluent : acetonitrile / 20mM KH2PO4 (10/90)Flow rate : 0.36 mL/minTemperature : 37℃Detection : UV at 260 nm
セフェム系抗生物質
1.Cephalexin2.Cefaclor3.Cephaloglycin4.Cephaloridine
50 X 2.0 mmI.D.(colume volume = 160 L)
11
system volumeの低減 (2)配管の内径が与える影響
0.10 mm 0.15 mm 0.25 mmN 1 7100 7100 2700
N 2 8100 8000 5500
N 3 8100 8000 6100
Column : YMC-UltraHT Pro C18 (2 m, 12 nm)50×2.0 mmI.D.
System : 超高速LC用Eluent : acetonitrile / water (60/40)Flow rate : 0.4 mL/minTemperature : 37℃Detection : UV at 270 nmInjection vol. : 1 L
Injector-検出器間の配管径は0.15 mm以下に
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 Retention Time
0
100000
200000
Intensity
0
100
200
mV
0.0 1.0 2.0 min
J060825EJ060825HJ060825F
t0
1 2
3
内径 0.25 mm
内径 0.10 mm
内径 0.15 mm
Injector-カラムIN側 カラムOUT側-検出器
内径 0.065 mm
t0. Uracil1. Methyl benzoate2. Naphthalene3. Butyl benzoate
12
system volumeの低減 (3)カラムへの接続状態が与える影響
ユニバーサルコネクタ
固定ネジ
固定フェラル
調整ネジ
シーリング
フェラル
(交換可)
・配管はネジ穴に
完全密着
(フェラル先端空隙なし)
・手締め式タイプ
(スパナ不要)
・耐圧70 MPat0. Uracil1. Methyl benzoate2. Naphthalene3. Butyl benzoate
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 Retention Time
0
100000
200000
Intensity
0
100
200
mV
0.0 1.0 2.0 min
t0
1 2
3
F060825GF060825H
Column : YMC-UltraHT Pro C18 (2 m, 12 nm)50×2.0 mmI.D.
System : 超高速LC用Eluent : acetonitrile / water (60/40)Flow rate : 0.4 mL/minTemperature : 37℃Detection : UV at 270 nmInjection vol. : 1 L
フェラル先端のわずかな空隙にも注意が必要
(ごくわずかな空隙でも段数低下を招く)
カラムの接続タイプによって
フェラル先端からの長さが異なる
空隙なし
0.15 mm I.D.
空隙あり
0.15 mm I.D.
Mismatched MatchedN 1 6400 7100
N 2 7400 8000
N 3 7500 8000
13
検出・データ取り込み速度の最適化 (1)検出器の設定値
レスポンス値
データ取り込み速度
・ピークを描く速度の設定
・データポイント数は多いほどデータ容量は大きくなる
・1ピークに10 pointsは必要
・過渡応答時定数
・ピークを検出する速度の設定
・レスポンスが短いほど応答は速い(信号追随性がよくなる)
-ピークがシャープになり、ピーク高さが増加する
-ノイズが増大する(S/N比が悪くなる)
14
検出・データ取り込み速度の最適化 (2)レスポンス値がピーク形状に与える影響
0.400 0.410 0.420 0.430 0.440 0.450 Retention Time
0
100000
200000
Inte
nsity
0.03 sec 0.1 sec 0.3 secN 1 7100 6900 5700
N 2 8200 8200 7800
N 3 7800 7800 7600
F060822GF060822HF060822I
t0. Uracil1. Methyl benzoate2. Naphthalene3. Butyl benzoate
0.3 sec
0.1 sec
0.03 secto
12
3
0.0 1.0 2.0 min
0
100
200
mV
レスポンス値は0.1 sec.以下に
Column : YMC-UltraHT Pro C18 (2 m, 12 nm)50×2.0 mmI.D.
System : 超高速LC用Eluent : acetonitrile / water (60/40)Flow rate : 0.6 mL/minTemperature : 37℃Detection : UV at 270 nmInjection vol. : 1 L
Peak 1
15
検出・データ取り込み速度の最適化 (3)データ取り込み速度がピーク形状に与える影響
0.400 0.410 0.420 0.430 0.440 0.450 Retention Time
0
100000
200000
Inte
nsity
100 pts/sec 10 pts/sec 5 pts/secN 1 7100 6800 6800
N 2 8200 8200 8000
N 3 7800 7800 7700
J060824AJ060824BJ060824C
t0. Uracil1. Methyl benzoate2. Naphthalene3. Butyl benzoate
5 points/sec
10 points/sec
100 points/secto
12
3
0.0 1.0 2.0 min
0
100
200
mV
データ取り込み速度は10 points/sec.以上に
Column : YMC-UltraHT Pro C18 (2 m, 12 nm)50×2.0 mmI.D.
System : 超高速LC用Eluent : acetonitrile / water (60/40)Flow rate : 0.6 mL/minTemperature : 37℃Detection : UV at 270 nmInjection vol. : 1 L
Peak 1
16
最適設定におけるシステム間比較
超高速LC用システム 従来型LCシステム(セミミクロセル)
超高速LC 従来型LCN 1 7100 4400 (62%)
N 2 8200 7200 (88%)
N 3 7800 7400 (95%)
t0. Uracil1. Methyl benzoate2. Naphthalene3. Butyl benzoate
F060822I
0.0 1.0 2.0 min
0
100
200
mV
to
1 2
3
0.0 1.0 2.0 min
0
100
200
mV
F060823F
to 1
2
3
データ取込速度
:100 points/secレスポンス
:0.03 sec
データ取込速度
:10 points/secレスポンス
:0.05 sec
Column : YMC-UltraHT Pro C18 (2 m, 12 nm)50×2.0 mmI.D.
Eluent : acetonitrile / water (60/40)Flow rate : 0.6 mL/minTemperature : 37℃Detection : UV at 270 nmInjection vol. : 1 L
従来型LCでも十分に高速分析可能(最高のパフォーマンスを得るには超高速LC用システムを)
17
グラジエント条件下のdelay volumeの影響 (1)delay volumeとは?-1
delay volumeとは?-移動相が混合される点からカラムIN側までのシステム容量のことグラジエント遅れ,dwell volumeとも呼ばれる
HPLCシステムの模式図
column
pump A
pump Binjector
delay volume
mixer
18
グラジエント条件下のdelay volumeの影響 (2)delay volumeとは?-2
グラジエント遅れ X 流速 = delay volume
(min) (mL/min) (mL)
2.5 - 1 X 0.4 = 0.6 mL(600 L)
-設定したグラジエントプログラム
-得られたクロマトグラム(実際のグラジエント)
Eluent : A) waterB) water / acetone (100/0.1)10%B (0-1 min), 10-90%B (1-2 min), 90%B (2-3 min), 90-10%B (3-3.01 min), 10%B (3-7 min)
Flow rate : 0.4 mL/minTemperature : 25℃Detection : UV at 254 nm
%B
0
25
50
75
0 1 2 3 4 5 6 min
mAU
0
20
30
10
2.5 min
19
グラジエント条件下のdelay volumeの影響 (3)delay volumeを考慮する必要性とは?-1
delay volumeの容量分、試料注入時間を遅らせるdelay volume(mL) ÷ 流速(mL/min)= 試料注入を遅らせる時間(min)
0.6 ÷ 0.8 = 0.75
Column : YMC-UltraHT Pro C18 (2 m, 12 nm)50 X 3.0 mmI.D.
Flow rate : 0.8 mL/min
Temperature : 40℃Detection : UV at 254 nmInjection : 1 L (0.1 mg/mL)
Eluent : A) 0.1% HCOOHB) acetonitrile
Gradient : 35-70%B (0-1 min), 70%B (1-2.5 min)
1. Methylparaben2. Ethylparaben3. Propylparaben4. Butylparaben
・・・設定したグラジエントプログラム -実際のグラジエント(カラムIN側)
F080515B
注入
▼
min0 0.5 1.0 1.5 2.00.75 min
F080519A▽
注入
▼
delay volumeの考慮なし
(inj. time調整なし)
delay volumeの考慮あり
(inj. time調整あり)
20
カラムIN側で溶媒の濃度変化が始まる
グラジエント条件下のdelay volumeの影響 (4)delay volumeを考慮する必要性とは?-2
delay volume考慮なし
(inj. time調整なし)
delay volume考慮あり
(inj. time調整あり)
カラム
IN OUT
●
●
●
●●
▲
▲
▲▲▲
●
●
●
●●
▲
▲
▲
▲▲▲
●●
●
●
●▲
▲
▲▲
●▲●
▲▲▲
▲●●●
0.75 min Injection
グラジエント条件下における、カラム内の試料および移動相のイメージ図
0 min 0.80 minグラジエントプログラム
経過時間 0.75 min
●▲●
▲▲▲
▲●●●
0 min Injection0 min Program start
0 min Program start
21
グラジエント条件下のdelay volumeの影響 (5)delay volumeを考慮する必要性とは?-3
delay volumeの考慮なし
(inj. time調整なし)
delay volumeの考慮あり
(inj. Time調整あり)
delay volumeを考慮しない場合、保持の小さい成分の分離に影響を及ぼす場合がある
delay volumeの容量分、試料注入時間を遅らせるdelay volume(mL) ÷ 流速(mL/min)= 試料注入を遅らせる時間(min)
0.6 ÷ 0.8 = 0.75
Column : YMC-UltraHT Pro C18 (2 m, 12 nm)50 X 3.0 mmI.D.
Flow rate : 0.8 mL/min
Temperature : 40℃Detection : UV at 254 nmInjection : 1 L (0.1 mg/mL)
Eluent : A) 0.1% HCOOHB) acetonitrile
Gradient : 35-70%B (0-1 min), 70%B (1-2.5 min)
1. Methylparaben2. Ethylparaben3. Propylparaben4. Butylparaben
-実際のグラジエント(カラムIN側)
F080515B
注入
▼
min0 0.5 1.0 1.5 2.00.75 min
F080519A▽
注入
▼
●
●
▲
▲
22
グラジエント条件下のdelay volumeの影響 (6)システム間およびカラム間の違い
超高速LCシステムセミミクロコンベンショナル
0.1-0.2 mL0.4 – 1.0 mL
2 – 3 mm2 – 3 mm4.6 mmカラム内径
0.125 – 0.5 min
0.4 – 0.8 mL/min
0.2 – 1.0 min
1.0 – 2.0 mL/min
従来型HPLCシステム
1.0 – 5.0 minカラムIN側で溶媒の
濃度変化が始まる時間
(delay volume/流速)
システムのdelay volume
0.2 – 0.4 mL/min一般的に使用される流速
delay volumeが大きいほど、また、流速が遅いほど、カラムIN側で溶媒の濃度変化が始まるまでの時間が長くなる(移動相が一定組成のまま流れる時間が長くなる)
23
グラジエント条件下のdelay volumeの影響 (7)異なるシステム間での再現性
delay volume考慮なし(inj. time調整なし)
delay volume考慮あり(inj. time調整あり)
Agilent 1100
delay volume= 0.4 mL
min0 0.5 1.0 1.5 2.0
mAU
0
100
200
300
F080513B
min
mAU
0
100
200
300
F080513F
Injection time0.4 / 0.8= 0.5 min
▼ ▼
▼:注入
島津 10A
delay volume = 0.6 mL
F080515B
min0 0.5 1.0 1.5 2.0
mAU
0
100
200
300
min
0 0.5 1.0 1.5 2.0
0 0.5 1.0 1.5 2.0
mAU
0
100
200
300
F080519A▼ ▼
Injection time0.6/ 0.8= 0.75 min
(*)試料注入時を0 minにしてクロマトグラムを表示
システム間の再現性 不良 良
Column : YMC-UltraHT Pro C18 (2 m, 12 nm)50 X 3.0 mmI.D.
Flow rate : 0.8 nL/min
Temperature : 40℃Detection : UV at 254 nmInjection : 1 L (0.1 mg/mL)
Eluent : A) 0.1% HCOOHB) acetonitrile
Gradient : 0-1 min (35-70%B), 1-2.5 min (70%B)
1. Methylparaben2. Ethylparaben3. Propylparaben4. Butylparaben
24
超高速LCメソッドへの移行例酸化防止剤分析の超高速化
コンベンショナルLCから超高速LCへの移行例
流速・注入量・グラジエントタイムの算出方法
流速とグラジエントタイムの関係
従来型HPLCシステムでの高速分析
25
酸化防止剤分析の超高速化 (1)コンベンショナル LCから超高速 LCへ
mAU
17 min0 2 4 6 8 10 12 14 16
0
50
100
150
(N061127A)
mAU
0
20
40
60
80
100
120
(N070406H)
コンベンショナルLC メソッドYMC-Pack Pro C18, 5 m, 150 X 4.6 mmI.D.
超高速LC メソッドYMC-UltraHT Pro C18, 2 m, 50 X 2.0 mmI.D.
1.0 mL/min5 L Inj.
0.8 mL/min1 L Inj.
17 min0 2 4 6 8 10 12 14 16
Eluent : A) water / TFA (100/0.1)B) acetonitrile / methanol / TFA (75/25/0.1)
Temperature : 30℃Detection : UV at 280 nm
酸化防止剤1. n-Propyl gallate (PG)2. 2,4,5-Trihydroxybutyrophenone (THBP)3. tert-Butylhydroquinone (TBHQ)4. Nordihydroguaiaretic acid (NDGA)5. 4-Hydroxymethyl-2,6-di-tert-butylphenol (HMBP)6. n-Octyl gallate (OG)7. n-Dodecyl gallate (DG)
1 2
3
45
67
1.4 min0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
mAU
0
20
40
60
80
100
1201
23
4 5
6
7
分析時間約1/12
溶媒使用量約1/15
(*)delay volumeの考慮あり
(*)delay volumeの考慮なし
26
酸化防止剤分析の超高速化 (2)流速・注入量・グラジエントタイムの算出方法
(1.0)2×3.14=3.14
(2.3)2×3.14=16.6
断面積(mm2)
50150 カラム長(mm)
50×2.0 mmI.D. 150×4.6 mmI.D. カラムサイズ
×1/5
流速・注入量※-断面積比により算出
グラジエントタイム-カラム長比で算出
インジェクションタイム(Inj. time)-delay volume / 流速で算出
1 mL/min
5 L Inj.
0.2 mL/min
1 L Inj.
×1/5
グラジエントタイム
×1/3
Φ4.6
Φ2.0 50 mm
150 mm
×1/3
※注入量:サンプル溶液が高濃度、溶出力が高い場合はカラム容積比で算出
27
酸化防止剤分析の超高速化 (3)カラムサイズに合わせたメソッド移行
×1/5
×1/3
短時間で同等の分離が得られる
17 min0 2 4 6 8 10 12 14 16
mAU
0
50
100
150
(N061127A)
YMC-Pack Pro C18, 5 m150 X 4.6 mmI.D.
1 2
34
5
67
5.7 min0 1 2 3 4 5
mAU
0
20
40
60
80
120
(N070406E)
100
YMC-UltraHT Pro C18, 2 m50 X 2.0 mmI.D.
1
23
45
6
7
1 mL/min
5 L Inj.
0.2 mL/min
1 L Inj.
45-70%B (0-9 min)70-95%B (9-12 min)95%B (12-17 min)
Inj. time 0 min
45-70%B (0-3 min)70-95%B (3-4 min)95%B (4-5.7 min)
Inj. time 0.7 min(delay volume = 0.14 mL)
28
酸化防止剤分析の超高速化 (4)流速とグラジエントタイム
0 1
mAU
0
40
80
(N070406G)
120
0 1 1.4 min
mAU
0
40
80
(N070406H)
120
0 1
流速に反比例させてグラジエントタイムを短縮することにより高速グラジエント分析が可能
1
23
4 5
6
7
1
23
4 5
6
7
×1/2
×1/3
×1/4
0.2 mL/min
×4
×3
×20.4 mL/min
0.6 mL/min
0.8 mL/min
2
mAU
0
40
80
(N070416E)
120 1
23
45
6
7
2.9 min
1.9 min
45-70%B (0-3 min)70-95%B (3-4 min)95%B (4-5.7 min)
Inj. time 0.7 min(delay volume = 0.14 mL)
45-70%B (0-1.5 min)70-95%B (1.5-2 min)95%B (2-2.9 min)
Inj. time 0.35 min
45-70%B (0-1 min)70-95%B (1-1.33 min)95%B (1.33-1.9 min)
Inj. time 0.23 min
45-70%B (0-0.75 min)70-95%B (0.75-1 min)95%B (1-1.4 min)
Inj. time 0.18 min
YMC-UltraHT Pro C18, 2 m, 50 X 2.0 mmI.D
0 1 2 3 4 5
mAU
0
40
80
120
(N070406E)
1
23
45
67
5.7 min
4.5-9.5 MPa
9.1-19.0 MPa
13.6-28.2 MPa
18.2-37.3 MPa
29
1. n-Propyl gallate (PG)2. 2,4,5-Trihydroxybutyrophenone (THBP)3. tert-Butylhydroquinone (TBHQ)4. Nordihydroguaiaretic acid (NDGA)5. 4-Hydroxymethyl-2,6-di-tert-butylphenol (HMBP)6. n-Octyl gallate (OG)7. n-Dodecyl gallate (DG)
2 min0 0.5 1 1.5
(N070412G)
1 23
4 5
6
7
(N070412C)
12
3
45
6
7
(N070411K)
12
34 5
6
7
大幅なピーク形状・
分離の改善
低保持成分のピーク形状改善
溶出時間の高速化
System : Agilent 1100Column : YMC-UltraHT Pro C18, 50 x 2 mmI.D. (Column Vol. 160 L)
A) 標準仕様スタンダードセル(14 L)システム容量(400 L)
B) セルの低容量化セミミクロセル(5 L)システム容量(400 L)
C) セル・インジェクタ・配管の低容量化
セミミクロセル(5 L)システム容量(160 L)
N1=900
N1=2500
N1=3600
Rs(5, 6)=1.1
Rs(5, 6)=2.7
Rs(5, 6)=2.6
酸化防止剤分析の超高速化 (5)従来型HPLCシステムを用いた場合
Eluent : A) water / TFA (100/0.1)B) acetonitrile / methanol / TFA (75/25/0.1)45-70%B (0-1 min), 70-95%B (1-1.33 min), 95%B (1.33-2 min)
Flow rate : 0.6 mL/minTemperature : 30℃Detection : UV at 280 nm
Injection : 1 LInj. time : A) 0.67 min
B) 0.67 minC) 0.3 min
30
system volumeを低減する(試料拡散の低減)(特に内径2 mmのカラムを用いる場合)
検出・データ取り込み速度を最適化する
(レスポンス値:0.1 sec. 以下,データ取り込み速度:10 points/sec. 以上)
グラジエント分析では必要に応じてdelay volumeを考慮する(ダウンサイジング,異なるシステム間の再現性を得るには必要)
超高速LC分析で最適な結果を得るためにまとめ
31
高速・高分離アプリケーションの紹介
YMC-UltraHT series の紹介
YMC-UltraHT seriesアプリケーション
32
Hydrosphere C18 Pro C18 Pro C18 RS
炭素含有率 約12% 約16% 約22%
結合様式 モノメリック モノメリック ポリメリック
エンド
キャッピング独自の E . C .技術により残存シラノール基を最小限に抑制
特 長高極性化合物の分離に最適
水100%移動相で使用可能
標準的な疎水性のODS
広範囲の化合物に適用
疎水性の大きな表面構造
優れた耐酸・耐アルカリ性
(pH1~10)
ProシリーズODSの特長
粒子径 2, 3, 5 m 3, 5 m2, 3, 5, 10 m
YMC-UltraHT seriesのラインナップ分離選択性の異なる2種類のODS
33
0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0
0
100
200
mAU
15.0 minN060811I
45.0 min0 5 10 15 20 25 30 35 40
mAU
0
40
80
(06082204.D)
5 m YMC-Pack Pro C18150 x 2.0 mmI.D.
0%B (0-5 min)0-100%B (5-40 min)100%B (40-45 min)
0%B (0-1.65 min)0-100%B (1.65-13.35 min)100%B (13.35-15 min)
2 m YMC-UltraHT Pro C1850 x 2.0 mmI.D.
カラム長(150 mm→ 50 mm)に比例させグラジェントタイムを1/3に
複雑なペプチドマッピングにおいても溶出順・分離を変えることなく2 mに移行可能
Eluent : A) acetonitrile / water / TFA (10/90/0.1)B) acetonitrile / water / TFA (35/65/0.1)
Flow rate : 0.2 mL/minTemperature : 37℃Detection : UV at 220 nm
Cytochrome c トリプシン消化物の分析
従来LCからの容易なメソッド移行粒子間で同一の選択性
34
Tf 5 = 1.13
コンベンショナルLC メソッド5 m YMC-Pack Pro C18150 x 4.6 mmI.D.
超高速 LCメソッド2 m YMC-UltraHT Pro C1850 x 2.0 mmI.D.
Tf 5 = 1.07
1.0 mL/min 5 L Inj.8.5 MPa
0.6 mL/min1 L Inj.30 MPa
12
2.0 0.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 min
0
20
40
60
mV
34
5
F060315F
1
23
4
5
0.2 0.0 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 min
0
20
40
60
mV
F060315A
アルカロイドの分析 (1)コンベンショナル LC から超高速 LCへ
塩基性化合物も移動相を変更することなく、容易にメソッド移行可能
Eluent : 20 mM CH3COOH-CH3COONH4 (pH 4.9) / acetonitrile (80/20)Temperature : 40℃Detection : UV at 220 nm
1. Scopolamine2. Atropine3. Cinchonine4. Quinine5. Dihydroquinine
35
12 3
45
0 1 2 min
0
20
40
60
mV
F060315A
2 m YMC-UltraHT Pro C18, 50 x 2.0 mmI.D.
sub-2 m Brand I7, 50 x 2.1 mmI.D.
sub-2 m Brand L4, 50 x 2.1 mmI.D.
N 5 = 106,000 /mTf 5 = 1.0730 MPa
N 5 = 89,000 /mTf 5 = 3.9950 MPa
N 5 = 78,000 /mTf 5 = 2.3540 MPa
アルカロイドの分析 (2)高分離を可能にする優れたピーク形状 (他社比較)
F060316D
12
3
45
0 1 2 min
0
20
40
60
mV
F060316E
12 3
45
0 1 2 min
0
20
40
60
mV
36
YMC-UltraHT seriesのラインナップ目的・システムに応じたカラムサイズの選択
○○75 mm
○○50 mm
○○100 mm
-○30 mm
3.0 mm2.0 mmカラム長
カラム内径
溶媒量の削減カラム外拡散の影響低減
SPEED
分離能
50 x 2.0 mmI.D. -超高速LCのスタンダード
カラム長100 mm -精密分離に有用な高分解能カラム
カラム長 30 mm -分析時間の短縮を重視する場合に有効なショートカラム
内径3.0 mm -従来のシステムに適用しやすいサイズ
各カラムサイズの特長
37
ウコンサプリメント中のクルクミン分析高分離分析に有効な100 mm長カラム
Eluent : acetonitrile / water / formic acid (50/50/0.1)Flow rate : 0.4 mL/minTemperature : 40℃Detection : UV at 250 nmInjection : 1 LSample : Tablets (6.9 mg/mL)
ウコンサプリメント1. Curcumin 3 (Bisdemethoxycurcumin) 2. Curcumin 2 (Demethoxycurcumin) 3. Curcumin 1 (Curcumin)
4 min0 1 2 3
mAU
0
10
20
30
(N070729S)
2 min0 0.5 1 1.5
mAU
0
10
20
30
(N0870727S)
2 min0 0.5 1 1.5
mAU
0
10
20
30
(N070731S)
2 min0 0.5 1 1.5
mAU
0
10
20
30
(N070730S)
YMC-Pack Pro C1850 X 2.0 mmI.D., 5 m
YMC-Pack Pro C1850 X 2.0 mmI.D., 3 m
YMC-UltraHT Pro C1850 X 2.0 mmI.D., 2 m
YMC-UltraHT Pro C18100 X 2.0 mmI.D., 2 m
1 2
3
1 2
3
1 23
1 2
3
ピーク間の不純物を検出
不純物をベースライン分離
粒子サイズを2 mに
カラムサイズを100 mmに
5 m、3 mではピーク間の不純物は検出できない
4.7 MPa
8.0 MPa
13.9 MPa
24.8 MPa
38
従来型LCに適用しやすい内径3 mmカラム
超高速LC用システム(sys. vol. = 140 L)
従来型LCシステム(標準分析用)(sys. vol. = 600 L)
Column : YMC-UltraHT Pro C18 (2 m, 12 nm)Eluent : acetonitrile / 20mM KH2PO4 (10/90)Temperature : 37℃Detection : UV at 260 nm
0 1 2 3 min
mAU
0
20
40
60
80
(N070606B)
3 min0 1 2
mAU
0
20
40
60
80
(N070608E)
50 x 3.0 mmI.D. (col. vol. = 350 L)50 x 2.0 mmI.D. (col. vol. = 160 L)Flow rate 0.36 mL/minInjection 1 LPressure 16.2 MPa
セフェム系抗生物質
1.Cephalexin2.Cefaclor3.Cephaloglycin4.Cephaloridine
3 min0 1 2
mAU
01020304050
(N070607Q)
12
3
4
2 3
4
1 2 3
4
3 min0 1 2
mAU
0
50
100
150
(N070606E)
1 2 3
4
3 min0 1 2
mAU
0
50
100
150
(N070608B)
1 23
4
N(4) 7700Rs(2/1) 2.32
N(4) 7600Rs(2/1) 2.20
N(4) 7800Rs(2/1) 2.21
N(4) 6900Rs(2/1) 1.61
N(4) 6800Rs(2/1) 1.61
N(4) 4500Rs(2/1) 0.90
最適な
組み合わせ
適した
組み合わせ
Flow rate 0.8 mL/minInjection 2 LPressure 18.6 MPa
3 min0 1 2
mAU
01020304050
(N070612B)
23
4
1
1
従来型LCシステム(セミミクロセル使用)(sys. vol. = 600 L)
39
YMC-UltraHT seriesアプリケーション
農薬の一斉分析
・LC/MSを用いた高速分析例
アロプリノール代謝物
・高極性化合物(核酸成分)の超高速分析例
ジルチアゼムのin vitro代謝物・迅速な分析メソッド開発例
プロプラノロールのin vitro代謝物・高~低極性化合物群の一斉分析
40
農薬の一斉分析 (1)
分析条件Column :YMC-Pack Pro C18, YMC-UltraHT Pro C18Elunt : A) 5 mM CH3COONH4 in water,
B) 5 mM CH3COONH4 in methanolTemprature : ambientDetection : API5000, ESI, Positive, MRMInjection : 3 L (10 ng/mL)Sample : Pesticide Mixture Standard Solution PL-7-2,
manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
1. Thiamethoxam (Q1/Q3 : 292.3/211.3) 14. Chromafenozide (Q1/Q3 : 395.4/175.1)2. Clothianidin (Q1/Q3 : 250.3/169.1) 15. Butafenacil (Q1/Q3 : 492.1/331.1)3. Chloridazon (Q1/Q3 : 222.3/77.0) 16. Simeconazole (Q1/Q3 : 249.3/70.1)4. Thiacloprid (Q1/Q3 : 253.3/126.0) 17. Cyazofamid (Q1/Q3 : 325.2/108.0)5. Thiabendazole (Q1/Q3 : 202.3/175.2) 18. Naproanilide (Q1/Q3 : 292.3/171.3)6. Azamethiphos (Q1/Q3 : 325.2/183.0) 19. Fenoxycarb (Q1/Q3 : 302.3/88.1)7. Dimethirimol (Q1/Q3 : 210.4/71.1) 20. Anilofos (Q1/Q3 : 368.2/199.1)8. Isoxaflutole (Q1/Q3 : 360.2/251.1) 21. Cyflufenamid (Q1/Q3 : 431.3/295.2)9. Pyriftalid (Q1/Q3 : 319.3/139.1) 22. Pyrazolynate (Q1/Q3 : 439.1/91.0)
10. (E)-Ferimzone (Q1/Q3 : 255.4/91.1) 23. Indoxacarb (Q1/Q3 : 528.1/203.2)11. (Z)-Ferimzone (Q1/Q3 : 255.4/91.1) 24. Benzofenap (Q1/Q3 : 431.2/105.1)12. Methoxyfenozide (Q1/Q3 : 369.4/149.3) 25. Furathiocarb (Q1/Q3 : 383.3/195.2)13. Iprovalicarb (Q1/Q3 : 321.4/119.3) 26. Cloquintocet-mexyl (Q1/Q3 : 336.3/238.2)
41
農薬の一斉分析 (2)LC/MSによる高速分離例
YMC-Pack Pro C18, 3 m, 150 X 2.0 mmI.D.
YMC-UltraHT Pro C18, 2 m, 75 X 2.0 mmI.D.
同等の分離で分析時間1/2にCourtesy of J.Watanabe, TAKARA BIO INC.
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 min
1
2
3
45
6
7
8 9
10,11
12
13,14
15
1617
18
19
20
2122
23
24
25
26
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 min
1
2
3
45
67
8 9
10,11
12
13
15
1617
18
19
20
2122
23
24
25
26
14
Gradient :15-40%B (0-1 min), 40%B (1-3.5 min), 40-50%B (3.5-6 min), 50-55%B (6-8 min), 55-95%B (8-17.5 min), 95%B (17.5-22 min)
Flow rate : 0.2 mL/min
Gradient : 15-40%B (0-0.5 min), 40%B (0.5-1.75 min), 40-50%B (1.75-3 min), 50-55%B (3-4 min), 55-95%B (4-8.75 min), 95%B (8.75-11 min)
Flow rate : 0.4 mL/min
42
コンベンショナルLC メソッドHydrosphere C18, 5 m, 150 X 4.6 mmI.D.
超高速LC メソッドYMC-UltraHT Hydrosphere C18, 2 m, 50 X 2.0 mmI.D.
1.0 mL/min7.5 L Inj.8.6 MPa
0.6 mL/min0.5 L Inj.24.6 MPa
Temperature : 37℃Detection : UV at 254 nm
分析時間約1/9
溶媒使用量約1/15
0 2 4 6 8 10 12 min
mAU
0
200
400
1
2
3
45
(F070822AE)
mAU
0
40
80
1.00 0.5 1.4 min
1
2
3
45
0 2 4 6 8 10 12 min
mAU
0
40
80
2. HypoxanthineN
NH
N
NH
O
3. XanthineNH
NH
N
NH
O
O
1. Uric acidNH
NH
NH
NH
O
O
O
4.Oxipurinol
N
N
NH
N
OH
OH
5.Allopurinol(痛風治療薬)
N
N
NH
N
OH
アロプリノール代謝物の分析 (1)高極性化合物(核酸成分)分析の超高速化
Eluent : 10mM CH3COOH-CH3COONH4 (pH 4.5)
高極性化合物用も容易に超高速分析へメソッド移行可能
43
アロプリノール代謝物の分析 (2)水100%移動相条件下での優れた再現性
Temperature : 37℃Detection : UV at 254 nmInjection : 0.5 L
保持安定性テスト
0.6 mL/minで分析(青)↓
0.2 mL/minで30 min通液(低圧条件)
↓
0.6 mL/minで分析(赤)↓
送液を停止し30 min静置(圧力:0)↓
0.6 mL/minで分析(緑)
標準的ODS、他社高極性用ODSでは使用困難な水100%移動相で安定して分析可能
1. Uric acid2. Hypoxanthine3. Xanthine4. Oxipurinol5. Allopurinol
YMC-UltraHT Hydrosphere C182 m, 50×2.0 mmI.D.
24.6 MPa (0.6 mL/min)
7.9 MPa (0.2 mL/min)
Brand G2 (標準的ODS)2.5 m, 50×2.0 mmI.D.
20.2 MPa (0.6 mL/min)
6.8 MPa (0.2 mL/min)
Brand I11 (高極性化合物用ODS)1.8 m, 50×2.1 mmI.D.
32.4 MPa (0.6 mL/min)
10.9 MPa (0.2 mL/min)
Eluent : 10mM CH3COOH-CH3COONH4 (pH 4.5)
0
40
mAU
0
40
mAU
min0 0.4 0.8 1.2
0
40
mAU
99%
62%
87%
94%
100%
98%
44
アロプリノール代謝物の分析 (3)Hydrosphere C18 vs市販高極性化合物用カラム
市販高極性化合物用sub-2 mカラムの中でも優れた保持能と分離選択性
sub-2 m高極性化合物用 ODS (Brand M3)
2.0 min1.00
mAU
0
5
10
(F070821Q)
2
3
45
1
2.0 min1.00
mAU
0
5
10
(F070822F)
12
3
4
5
2.0 min1.00
mAU
0
5
10
(F070821F)
2
3 , 4
5
1
sub-2 m高極性化合物用 (not ODS)(Brand L5)
2 m YMC-UltraHT Hydrosphere C18
1. Uric acid2. Hypoxanthine3. Xanthine4. Oxipurinol5. Allopurinol
Sample : 健常者血清(標準品添加)Eluent : 10mM CH3COOH-CH3COONH4 (pH 4.5)
45
ジルチアゼムのin vitro代謝物 (1)溶離液条件の選択
HCOOH(pH 2.8)
HCOOH-HCOONH4
(pH 4.6)
HCOONH4
(pH 6.4)
● ●
● ●
● ●
20 mM buffer / methanol 20 mM buffer / acetonitrile
4 peaks
4 peaks
7 peaks
5 peaks
7 peaks
3 peaks
: 未変化体(diltiazem)
●
: 代謝物
20 mM HCOONH4 / methanol で分離達成の可能性あり
Column : YMC-UltraHT Hydrosphere C18(2 m, 12 nm)
50 X 2.0 mmI.D.Eluent : A) 20 mM buffer
B) organic solvent0-90%B (0-3 min)
Flow rate : 0.4 mL/minTemperature : 37℃Detection : UV at 240 nmSample : metabolites of diltiazem in vitroInjection : 1 L
3 min 3 min
46
ジルチアゼムのin vitro代謝物 (2)グラジエント条件の最適化
: 未変化体(diltiazem)
●
▲ : 代謝物
Column : YMC-UltraHT Hydrosphere C18 (2 m, 12 nm) 50 X 2.0 mmI.D.
Eluent : A) 20 mM HCOONH4
B) methanol
Flow rate : 0.4 mL/minTemperature : 37℃Detection : UV at 240 nmSample : metabolites of diltiazem in vitroInjection : 1 L
グラジエント条件の最適化により、代謝物と推定される9ピークの検出が可能に
選択した溶離液条件下で、グラジエント条件検討
0-90%B (0-3 min)
25%B (0-0.5 min),25-80%B (0.5-3.5 min),80%B (3.5-4 min)
9 peaks
7 peaks
47
ジルチアゼムのin vitro代謝物 (3)超高速 LC vs コンベンショナルLC
: 未変化体(diltiazem)
●
▲ : 代謝物Eluent : A) 20 mM HCOONH4
B) methanolTemperature : 37℃Detection : UV at 240 nmSample : metabolites of diltiazem in vitro
YMC-UltraHTカラムを用いることにより、1分析あたり4分にまでの時間短縮が可能に
Gradient : 25%B (0-0.5 min),25-80%B (0.5-3.5 min),80%B (3.5-4 min)
Flow rate : 0.4 mL/minInjection : 1 L
Gradient : 25%B (0-3 min),25-80%B (3-21 min),80%B (21-24 min)
Flow rate : 0.2 mL/minInjection : 3 L
YMC-UltraHT Hydrosphere C18, 2 m, 50 X 2.0mmI.D.
4 min
24 min
超高速LCメソッド
コンベンショナルLCメソッドHydrosphere C18, 5 m, 150 X 2.0mmI.D.
48
ジルチアゼムのin vitro代謝物 (4)市販超高速LC用カラムとの比較
: 未変化体(diltiazem)
●
▲ : 代謝物
YMC-UltraHT Hydrosphere C18
標準的ODS(Brand O1)
Column : 50 X 2.0 mmI.D. or 50 X 2.1 mmI.D.Eluent : A) 20 mM HCOONH4
B) methanol25%B (0-0.5 min), 25-80%B (0.5-3.5 min), 80%B (3.5-4 min)
Flow rate : 0.4 mL/minTemperature : 37℃Detection : UV at 240 nmSample : metabolites of diltiazem in vitroInjection : 1 L
高極性化合物用ODS(Brand I11)
9 peaks
6 peaks
6 peaks
4 min
市販の超高速LC用カラムと比較して最も高い分離能を示す
49
Column : 100 X 2.0 mmI.D. or 100 X 2.1 mmI.D.Flow rate : 0.2 mL/minDetection : UV at 220 nmTemperature : 37℃Injection : 1 LInj. time : 0.7 min(delay volume = 0.14 mL)
●未変化体(propranolol)
▲代謝物
sub-2 mBrand I7
21.6-32.0 MPa
sub-2 mBrand M2
14.1-24.5 MPa
YMC-UltraHTHydrosphere C18
14.1-22.5 MPa
mAU
0
4
8
12
5 min0 1 2 3 4
▲ ●
mAU
0
4
8
12
●
▲
mAU
0
4
8
12
●
▲
F080206A
F080208D
F080205E
高極性の代謝物は強く保持し、疎水性の未変化体は早く溶出
極性の幅が広い化合物群のバランスの良い分離
プロプラノロールのin vitro代謝物 (1)ヒト肝マイクロソームによる代謝物一斉分析
Eluent : 20mM HCOOH-HCOONH4 (pH 4.6) / MeOHGradient : 5% MeOH (0-1 min), 5-100% MeOH (1-3 min), 100% MeOH (3-5 min)
50
Column : YMC-UltraHT Hydrosphere C18100 X 2.0 mmI.D.
Eluent : A) 20mM HCOOH-HCOONH4 (pH 4.6)B) methanol
Gradient : 5%B (0-1 min), 5-100%B (1-3 min),100%B (3-5 min) at 0.2 mL/min
: 5%B (0-0.5 min), 5-100%B (0.5-1.5 min),100%B (1.5-2.5 min) at 0.4 mL/min
Detection : UV at 220 nmTemperature : 37℃Injection : 1 LInj. time : 0.7 min at 0.2 mL/min
0.35 min at 0.4 mL/min(delay volume = 0.14 mL)
● 未変化体 (Propranolol)
▲ 代謝物
流量を2倍にしても分離を損なうことなく高速分析が可能
0.2 mL/min14.1-22.5 MPa
mAU
0
4
8
12
5 min0 1 2 3 4
▲ ●
F080205E
▲ ●
F080205A
mAU
0
4
8
12
2.5 min0 1 2
0.4 mL/min27.1-45.3 MPa
プロプラノロールのin vitro代謝物 (2)高~低極性化合物の短時間一斉分析に最適
51
Eluent : acetonitrile / water (60/40)Flow rate : 0.6 mL/minTemperature : 25℃Detection : UV at 270 nmInjection vol. : 1 L
t0. Uracil1. Methyl benzoate2. Naphthalene3. Butyl benzoate
YMCステンレス製プレカラムフィルタ2 m YMC-UltraHTカラムの保護に
プレカラムフィルタ接続前(メインカラムのみ) プレカラムフィルタ接続後
プレカラムフィルタ接続による
カラム効率の低下なし(101%)80007900N3
(101%)80007900N2
(100%)56005600N1
接続後接続前
UltraHT Pro C18, 2 m, 50 X 2.0 mmI.D.使用時の比較
ステンレス製プレカラムフィルタ
0.5 m フィルタ
ステンレス製プレカラムフィルタ
・カラム圧力上昇の原因となる、
試料や溶媒中の微細な不溶物をトラップ
・デッドボリュームを最小限に抑えた構造
・フィルタ孔径 2 m0.5 m (NEW)
(YMC-UltraHTカラムには0.5 mをご使用下さい)
t0 12
3t0 1 2
3
23.9 MPa 24.2 MPa
52
均一な2 m多孔性高純度シリカゲル基材と最密充填された新設計カラム
sub-2 mと同等のカラム効率を60%以下の圧力損失で達成
2, 3, 5 m が同じ分離選択性を示すため従来LC⇔超高速LC間で移動相を
変更する必要がなくメソッド移行が容易
ファーストチョイスカラムに最適なPro C18と、高極性化合物の保持・
分離の改善に有効なHydrosphere C18をラインナップ
創薬初期のスクリーニングをはじめ、農薬、食品分野など様々な分析の
ハイスループット化に威力を発揮
YMCYMC--UltraHT seriesUltraHT seriesUltra-High Throughput