기관고유연구사업 최종보고서...의 전임상 및 초기임상 시험을...

기관고유연구사업 최종보고서

(과제번호 : )

항암신약 후보물질 전임상 및 초기임상 시험

Bridging Novel Leads for Anticancer Therapeutics to

Preclinical/Early Clinical Phases

과제책임자 : 김 인 후

국 립 암 센 터

(뒷면) ( 측 면 )

↑

5cm

↓

항

암

신

약

후

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물

질

전

임

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국

립

암

센

터

↑

3cm

↓

1. 이 보고서는 국립암센터 기관고유연구

사업 최종보고서입니다.

2. 이 보고서 내용을 인용할 때에는 반드시

국립암센터 연구사업 결과임을 밝혀야

합니다.

(14 pont, 고딕체)

제 출 문

국립암센터 원장 귀하

이 보고서를 기관고유연구사업 “ 항암신약 후보물질 전임상 및 초

기임상 시험 ” 과제의 최종보고서로 제출합니다.

2010. 01 . 30

국 립 암 센 터

과 제 책 임 자 : 김 인 후

연 구 원 : 권 병 세

〃 : 정 준 호

〃 : 이 상 진

참여기업명 : 대웅제약, 앱자인, 유영제약

목 차

< 요 약 문 >

(한글)--------------------------------------- 6

(영문)--------------------------------------- 8

1. 연구의 최종목표------------------------------ 10

2. 연구의 내용 및 결과--------------------------- 10

3. 연구결과 고찰 및 결론------------------------- 63

4. 연구성과 및 목표달성도------------------------- 68

5. 연구결과의 활용계획--------------------------- 72

6. 참고문헌------------------------------------ 73

7. 첨부서류

접수번호 과제번호

과 제 명 항암신약 후보물질 전임상 및 초기임상 시험

과제책임자성 명 김 인 후

전화번호 2511 전 자 우 편

색인단어

국문전임상시험, 임상1상시험, 치료항체, 유전자치료제,

세포치료제, 보안등급

영문preclinical study, phase I clinical study,

therapeutic antibody, gene therapy, cell therapy보안 일반

◆ 연구목표

<최종목표>

새로운 개념의 과제운영을 통한 국립암센터가 보유한 유망 항암신약 후보물질의 전임상

및 초기임상 시험을 지원함으로써 임상시험 1건 전임상 1건 전임상 진입 1건 이상을 완

료하여 새로운 패러다임으로 수행되는 신약개발시스템의 필요성 및 당위성을 입증

<구체적 전략 목표>

1. 효율적인 신약개발을 위한 시스템 구축 및 이론적 근거 마련

2. 원발성뇌암과 비세포성 폐암치료제로서의 항 HGF 중화항체의 최적화 및 대량생산

기반 구축 2차년도에 전임상 진입

3. GMP 수준의 아데노바이러스 Ad5.CMV.TR.HSVtk 대량 생산하고 및 분석법 개발을

완료하여 2차년도에 전임상시험 완료

4. EBV 특이적 CD8 T 세포치료제 생산공정 및 임상시험을 위한 IND filing 완료하고

2차년도에는 임상시험 진입

◆ 연구내용 및 방법

-과제총괄

○ 후보물질의 성공적인 각 목표 단계 진입 및 달성을 위한 효과적인 과제 운영

○ 새로운 패러다임의 신약개발 프로그램의 방안 도출 및 이론적 근거 제시

○ 후보물질 발굴 및 효능분석을 위한 기반 구축

-항체치료제 개발 (전임상진입)

○ 항 HGF 중화항체 최적화 완료

○ 항체 대량생산을 위한 세포주 개발 완료

< 요 약 문 > ○ 전임상수행을 위한 항체의 대량 생산 기반기술 확립

-유전자치료제 개발 (전임상완료)

○ 전임상시험용 아데노바이러스 Ad5.CMV.TR.HSVtk 생산공정 및 분석법 개발

○ Glioblastoma Multiform (GBM), 두경부암, 전립선암, 폐암 등을 대상으로 아데노바

이러스 Ad5.CMV.TR.HSVtk의 효능 분석

○ 전임상 및 임상1상 시험을 위한 아데노바이러스 생산

○ 전임상시험 프로토콜 확립 및 전임상시험 (독성시험, 특성분석) 수행 완료

-세포치료제 개발 (임상1상 완료)

○ EBV T 세포치료제 (앱비앤티셀)의 IND filing (시설에 관한 자료, 생산에 관한 자료,

및 임상시험계획서)

○ 앱비앤티셀의 제1상 임상시험계획승인 신청 및 승인

○ 앱비앤티셀의 임상용의약품 제조승인 및 제1상 임상임상시험 수행

◆ 연구성과

○ 전임상 진입 : 1건 이상

○ 전임상 시험 완료 : 1건 이상

○ 임상1상 진입 : 1건

◆ 참여연구원

(당해연도 참여인

원)

성 명

김인후 외 44인

Title of ProjectBridging Novel Leads for Anticancer Therapeutics to

Preclinical/Early Clinical Phases

Key Wordspreclinical study, phase I clinical study, therapeutic

antibody, gene therapy, cell therapy

Project Leader In-Hoo Kim

A s s o c i a t e d Company

DaeWoong, Yuyoung

This research proposal aims at excavating and supporting

anti-cancer compound or therapy that has been discovered in National

Cancer Center and already proven to be potentially druggable. Since such

a research proposal to develop a new drug(s) has never been

implemented, a new strategy and management ought to be employed.

Through two years performance, the expected outcome would be one

entry to clinical trial, one completed pre-clinical trial and one entry to

pre-clinical trial. Furthermore, this proposal launches to demonstrate that

this kind of proposal initiated with a new paradigm is needed to develop a

new drug. First of all, this research proposal intended to support the

following four studies: 1) establishment of system and theories to

continuously develop new drugs in National Cancer Center, 2 )

optimization and mass-production of therapeutic antibody enabling to

neutralize HGF for targeting non-small cell lung carcinoma and primary

glioma, 3) completion of pre-clinical trial (toxicology, efficacy and

characterization) and of adenovirus Ad5CMV.TR.HSVtk and 4) entry of

clinical trial of EBV-positive-CD8 adoptive T-cell therapy.

To complete goals mentioned above, this research project managed to

determine whether each study would be worthy of entry to next level for

drug development, and collect theocratical evidences for development of

new system required for new drug development. This research project also

established a system to validate the efficacy of anti-cancer drug

candidates. Furthermore, a number of outcomes by performing each study

were obtained. With respect to anti-HGF therapeutic antibody, this project

Project Summary forced anti-HGF antibody to enter pre-clinical trial by completing the

optimization of initially-discovered antibody through affinity maturation and

humanization, developing cell lines for mass-production of optimized

anti-HGF antibody and obtaining techniques that would be required for

mass-production. Concerning adenovirus Ad5.CMV.TR.HSVtk, this project

developed production protocol and analytical methods of produced

adenoviruses. Subsequently, this project finished the pre-clinical trial

including toxicology, characterization to test whether produced adenovirus

would be suitable for clinical trial and efficacy validation. Lastly, this

project performed to develop the adoptive-T-cell therapy targeting

EBV-positive lymphoma. By establishing the facility and the protocol for

producing antigen-specific CD8 T cell, this project completed the first

phase of clinical trial.

2. 연구의 내용 및 결과

1) 연구의 최종목표와 2009년도 목표

최종목표:

새로운 개념의 과제운영을 통한 국립암센터가 보유한 유망 항암신약 후보물질

의 전임상 및 초기임상 시험을 지원함으로써 임상시험 1건 전임상 1건 전임

상 진입 1건 이상을 완료하여 새로운 패러다임으로 수행되는 신약개발시스템

의 필요성 및 당위성을 입증하고자 하며 아래의 구체적 목표를 달성하고자

함.

- 효율적인 신약개발을 위한 시스템 구축 및 이론적 근거 마련

- 원발성뇌암과 비세포성 폐암치료제로서의 항 HGF 중화항체의

최적화 및 대량생산 기반 구축으로 전임상 진입

- GMP 수준의 아데노바이러스 Ad5.CMV.TR.HSVtk 생산공정,

분석법 개발 확립과 독성시험, 특성분성의 완료로 임상 진입 준비

완료

- EBV T 세포치료제 생산공정 확립, 제1상 임상시험 승인신청을

위한 IND filing 및 임상1상 진입

2) 연구수행방법

과제총괄 : 효율적인 신약개발을 위한 시스템 구축 및 이론적 근거 마련

1. 후보물질의 성공적인 각 목표 단계 진입 및 달성을 위한 효과적인 과

제 운영

- 유망한 항암신약 후보물질의 임상진입을 위해, 항암신약 후보물질 심

의위원회를 구성하여 신청된 과제를 평가/심의함으로써, 개인수준에

서 수행하기 어려운 항암신약 후보물질의 전임상 및 임상시험 진입을

지원

- 운영위원회는 국립암센터 내/외의 전문가로 구성

- 효율적인 운영을 위해 외국제약회사에서 신약개발 프로젝트에 참여

한 경험이 있는 과제관리자(PM; Program manage) 영입

- 유망 후보물질의 선정 및 다음 단계로의 진행

1. Pre-preclinical stage: 항암효과는 있을 것으로 평가되었지만,

아직 전임상시험에 진입할 수 없는 후보물질로, 항암효과는 증가

시키며 부작용은 최소화하기 위한 최적화 과정을 주로 수행. 많은

비용이 소요되는 전임상시험 진입전에 후보물질의 효능 및 독성

을 small scale에서 평가하는 단계로, 전임상시험용 동물모델 (독

성/효력) 개발 및 in vitro 효력 및 독성시험을 주로 지원

2. Preclinical stage: 실험실 수준에서 효력 및 독성을 시험하였으

며, 전임상시험을 수행할만한 가치가 충분히 있는 것으로 평가된

후보물질. 전임상 및 임상시험용 시료생산, 임상시험 시료의 의약

품 승인 관련 지원, 그리고 전임상시험 수행을 지원

3. Clinical stage: 전임상시험을 수행하였으며, 제1상 임상시험을

진입할 가치가 높은 것으로 평가된 후보물질. 임상시험프로토콜

제작, IND 신청서 작성 지원 또는 위탁업무, IRB신청서 작성 및

승인, 그리고 제1상임상시험 지원

2. 새로운 패러다임의 신약개발 프로그램의 방안 도출 및 이론적 근거

제시

- 정책적 타당성 분석

분석항목 분 석 내 용

국가 전략적 중요성

․국가 또는 부처 차원에서의 필요성

․정부지원의 타당성

․사업추진의 시급성

상위계획과의 부합성

․국가차원 계획과의 부합성

- 과학기술기본계획

- 토탈로드맵, NTRM

- 국가재정운용계획

․분야별 종합발전계획 등과의 부합성

․부처 고유 업무 및 자체 계획과의 일관성

사업추진의지 및

관련기관 협조체계

․조직 및 기관의 사업추진의지

․관련 기관 및 부처의 협조체계

사업추진상의

위험요인과 대응방안

․법․제도적 요인(국제규범 포함)

․기술의 부정적 영향

․재원조달가능성

․사업의 장기화/연장요인

․권리확보계획

- 기술적 타당성 분석


기존 사업과의 중복성 ․기존 사업과의 중복성 여부

기술개발계획의 우수성

․사업의 목표, 내용, 성과의 구체성

․사업목표와 세부목표, 연구내용의 적절성

․추진전략 및 추진체계의 적절성

기술수준 및 기술개발

성공가능성

․연구개발기반

․기술수준 (특허 현황조사 포함)

․성공가능성

- 경제적 타당성 분석


경제성 ․비용편익분석(순현재가치, 내부수익률, B/C 비율)

경제사회적 파급효과

․산업적 파급효과(부가가치 증대, 새로운 산업 창출)

․수출증대 및 수입대체 효과

․고용증대효과

․사회적 비용 절감

․국가위상제고/안전보장

과학기술적 파급효과

․과학기술경쟁력 향상

․타 기술분야로의 파급효과

․과학기술 인력양성

3. 후보물질 발굴 및 효능분석을 위한 기반 구축

- 후보물질의 효능 분석을 위한 다양한 종류의 마우스 모델 확보

- 생체내 유효성 모니터링을 위한 영상 시스템의 보완

· Optical imaging 기기의 확보 및 운영

· 수소를 측정 하는 기존 MRI의 기능 확장을 위해 F 측정을 위한 시

스템을 확립 하고자 함

전임상 진입을 위한 항 HGF 중화항체의 최적화 및 대량생산 기반 구축

1. 목표: 원발성뇌암과 비소세포성 폐암 치료제로 기 개발된 항 HGF 중

화항체를 최적화하고 항체의 생산 및 분석법을 확립하여 전임상진입을

완료

2. 추진체계: 참여기업인 유영제약에서 항체대량생산공정을 확립하고, 항

체의 최적화는 본 항체에 대한 연구에 관여해온 앱자인에 위탁

3. 연구내용

- 항체의 최적화

· 비면역화와 동시에 친화도 상수 (Kd value)를 subnanomolar 수준

으로 유지

· 시험관에서 세포 신호 전달, 암세포 성장, 세포 scattering을 nM 수

준에서 억제시키는 항체 효능 확인

· 원발성 뇌암 및 비소세포성 폐암 동물 모델에서 종양 증식 억제 효

능 확인

- 항체의 생산 및 분석

· 전임상 및 임상시험을 위한 항체 대량생산; Wave system (10 -

500L) 으로 2 500mg/L 수준의 항체 배양, 정제 기술 확립

· 항체의 특성 규명을 위한 기준 및 시험법 확립

· 식약청 기준을 만족시키는 전임상시험 프로토콜 확립

유전자치료제 Ad5CMV.TR.HSVtk 아데노바이러스를 이용한 전임상시험

1. 목표: GMP 수준의 아데노바이러스 Ad5.CMV.TR.HSVtk를 제조 하

고, 독성 및 효능시험을 진행하여 전임상시험 (독성 및 효능)을 완료

2. 추진체계: 국립암센터의 연구진과 참여기업인 대웅제약의 공동연구 형

태로 진행하며, GLP수준의 전임상시험은 CRO를 통해 수행

3. 연구내용

- GMP 수준의 아데노바이러스 생산공정 및 분석법 개발

· 식약청의 임상시험에 준하는 바이러스 생산용 helper 세포주를 수립

하여 banking

· 수립된 helper 세포주를 이용하여 식약청의 임상시험에 준하는 바이

러스를 획득하여 banking

· banking된 바이러스를 증폭하는 생산공정을 개발하고, 순도 및 수득

율을 극대화 시키는 대량생산 프로토콜 확립

- Glioblastoma Multiform (GBM), 두경부암, 전립선암, 폐암 등을 대상으

로 아데노바이러스 Ad5.CMV.TR.HSVtk의 효능 분석

- 유전자치료를 위한 대상 환자의 선정에 필요한 기초자료 수집

- 전임상시험

· 전임상을 위한 시료의 대량생산

· 식약청의 요구에 맞추어진 독성 및 효능 시험을 위한 프로토콜 작성

· 전임상시험을 수행할 CRO의 선정 및 프로토콜에 맞는 전임상시험

의뢰

· 전임상시험을 위한 독성시험, 특성분석

EBV 특이적 CD8 T 세포치료제 생산 및 임상시험

1. 목표: EBV-specific CD8 T 세포의 전임상시험 (독성, 효력,

분포시험) 결과를 토대로, EBV+ 림포마, 위암, 및 인후두암 환자

대상의 EBV 세포치료제 임상시험을 수행

2. 추진체계: 국립암센터의 연구진에 의한 단독연구 형태로 진행

3. 연구내용

- EBV T 세포치료제의 임상용의약품 제조공정 확립

· 국립암센터 세포치료제생산실의 운영체계 확립: 기준서, 방법서 및

기록서 제작

· T 세포치료제의 제조공정 확립

- EBV T 세포치료제의 IND filing 및 임상용의약품 제조허가 획득

· 시설에 관한 자료: 환경모니터링 실시계획서 및 결과보고서, GMP

문서분류 및 관리목록, GMP 관리도면 목록 및 해당 도면, 제조 및

분석장비 벨리데이션 매트릭스

· 생산에 관한 자료: 자가기준및시험방법서, 제조기록서, 3 로트

연속생산에 대한 결과기록서, 안정성시험결과

· 임상시험계획서

- 제1상임상시험 수행

· 세포치료제의 의약품 인허가 및 IND 신청이 승인되면 임상시험

수행을 위한 병원제출용 IRB를 작성/신청

· 임상시험용 세포치료제 생산 및 제1상 임상시험 수행

3) 연구수행 내용 및 결과

3-1) 항암신약 후보물질 전임상 및 초기임상시험 과제관련 기술정보활동 현

황

1. 주기적으로 B&D 주례회의(주 1회)를 개최하여 B&D사업 추진현황 공유

및 현안논의

1.1 2009년 10월

손숙미 의원실과 공동으로 ‘ 글로벌 항암제 개발을 위한 B&D포럼’ 개최

○ 목적 : 미국 NCI의 항암신약 개발 현황을 파악하고 정부 및 산학연

신약개발 관계자 등과의 만남을 주선하여 우리나라의 글로벌

항암신약 개발을 위한 전기 마련

○ 일시 : 2009. 10. 1(목)

○ 장소 : 국회 의원회관 1층 소회의실

○ 프로그램(주요 연제 내용)

- NCI 항암제 개발의 현 주소 : 의사결정과정 및 FDA와의 협력 등

(Dr. J. Doroshow (NCI DCTD Director))

- NCI 전임상시험 프로그램(DTP) 소개 : Validation 과정을 중심으로

(Dr. J. Tomaszewski (NCI DCTD Deputy Director))

- NCI 항암신약 임상시험 프로그램(CTEP) 개관

(Dr. E. Trimble (NCI CTEP 항암임상연구과 부인종양 총괄책임자))

- 항암제와 관련한 글로벌 특허 출원․등록 동향 및 R&D 단계에서의

특허 출원 전략(이명진 변리사 (광개토국제특허법률사무소))

1.2 2009년 12월

‘글로벌 항암제 개발을 위한 가교적 사업 타당성 분석 보고서’ 발간

(딜로이트 컨설팅)

○ 내용

- 항암제 개발 산업의 경쟁력 파악을 위한 산업현황 및 시장분석

· 국내 항암제 개발관련 기술수준 및 산업구조 분석

· 항암제 개발 산업의 가치사슬 분석 및 특징 파악

· 항암제 개발 산업성장에 따른 시장파급효과 분석

- 기술적 타당성 분석

· 기존 사업과의 중복성 및 과제 현황 분석

· 기술개발 추진 계획의 우수성 평가

· 정책 분석, 특허 분석 등을 통한 정책적, 기술적 방향성 제시

- 주요 항암제 개발 강국을 대상으로 한 사례분석

· 해외 우수사례 산업경쟁력과 성장경로 분석 및 성공요인 분석

· 국가별 항암제 개발에 대한 정부 육성정책 및 정책시사 도출

- 항암제 개발 임상실험을 위한 사업타당성 도출 및 운영모델 제시

· 조직의 운영, 연구 및 기술개발 프로세스의 적정성, 미래 시장성을 고려

한 ROI 측정 등 전반적인 사업의 설계 방안 제시

· 국가 관련기관 협조체계 및 사업운영상의 위험요인과 대응방안 제시

1.3 2010년 1월

특허청 「지재권 중심의 기술획득 전략사업」신청

○ 목적 : 항체 분야에서 수익으로 연결될 수 있는 강한 특허 확보를 위한

기술획득 정보 및 전략 습득

○ 신청 분야 : 첨단 융합산업 분야 중 ‘치료용 항체 개발 기술’ 과제

○ 사업기간 : 2010년 1월 4일 ∼ 2010년 7월 3일(6개월)

○ 사업비 및 부담 내역 : 1.0억원(특허청 0.7억원, 국립암센터 0.3억원)

- 연구수행 주체는 특허청이고, 신청기관은 특허·시장 조사분석비의

30%를 현금으로 공동부담

1.4 2010년 4월

제2회 B&D 포럼 개최 : ‘ 글로벌 항암신약개발의 현재와 미래’

○ 일시 : 2010. 4. 5(월) 13:30～17:40

○ 장소 : 프레스센터 20층 국제회의실(서울 중구 태평로)

○ 참석 : 정부, 학계, 민간기업 등 관계자 250여명

○ 프로그램

(제1부) 좌장: 이종욱 대웅제약 사장

14:00-14:30 글로벌 신약개발의 전략과 실제 :

Factive 개발 사례를 중심으로(김인철 LG생명과학 사장)

14:30-15:00 항암제 개발의 기술적 접근

(유성은 교과부 21세기 프론티어 사업단장)

15:00-15:05 휴식

(제2부) 좌장: 이종욱 대웅제약 사장

14:05-14:25 보건복지부 신약개발 정책

(김강립 보건복지부 보건산업정책국장)

14:25-16:10 사회안전망으로서의 항암제 개발

(유근춘 한국보건사회연구원 연구위원)

16:10-16:30 가교적 글로벌 항암신약 개발 사업

(이진수 국립암센터 원장)

16:30-16:40 휴식

(제3부)

16:40-17:40 패널 토론

- 좌장 : 임기철(과학기술정책연구원 부원장)

- 패널 : 김대경(중앙대 약대 학장

김열홍(고려대 의대 교수)

박귀례(식약청 제품화지원센터장)

박방주(중앙일보 기자)

이관순(한미약품 R&D본부 사장)

조명선(특허청 약품화학심사과장)

1.5 2010년 7월

B&D사업 추진시스템설계 관련 토론회 개최

○ 일시 : 2010. 7. 13. 9:00-12:00

○ 장소 : 서울 그랜드힐튼호텔

○ 참석 : 관련분야 전문가 54인(패널 16인, 청중 38인)

○ 내용

- 보건복지부가 중점 추진하고 있는 항암신약개발(B&D) 사업의 추진 시

스템 설계 및 운영 방안 연구의 중간 결과 발표

- 정부, 학계, 연구기관 및 제약계 등 관련 분야의 전문가 및 이해관계자

의 활발한 논의를 통해 구현 가능하고 실제적인 B&D 사업 운영 방안

도출

2. 지재권 중심의 기술획득전략사업 참여로 전략기술 발굴 전략 수립

2.1 치료 표적 발굴

-정상인과 암환자의 임상시료 비교 및 단백질을 표적으로 한 핵산기

반 항 체 도출

-상투적인 forward approach를 탈피하여 핵산 기반 항체 도출을 통

한 단 백질 기반 항체의 신규 치료 표적 발굴

2.2 치료제 개발

-암 치료에 효과적인 신규 항체 및 개량형 항체 개발

-치료제로서의 혹은 치료제를 전달할 수 있는 표적지향성 물질로서

의 핵산 기반 항체 개발

-진단 및 치료를 동시에 수행할 수 있는 신개념 항체 개발

2.3 기반 기술

-핵산 기반 항체 도출을 위한 SELEX 변형 기술

-치료용 항체들의 효능 검증, 성능 향상 및 안정화 기술

3-2) HGF 중화 항체 개발

1. 항체 최적화 및 효능 확인 연구 :

1.1 항체 친화도 성숙 연구 :

- 항체의 heavy chain과 light chain의 가변 부분 (variable region)에

mutagenesis를 도입하여 HGF에 대한 여러 항체 variant를 만든 후

ELISA와 SPR (surface plasmon resonance)를 통해 HGF에 대한 친화도를

측정하여 친화도가 높은 항체 variant를 선정하였음.

- 이 중에서 2종의 항체 (HGF 41 항체와 HGF 4항체)가 0.01nM 이하의

Kd 값을 가짐을 확인함 (그림. 1).

그림. SPR를 통한 Kd값 측정

1.2 비면역화:

- in silico modeling을 통해 면역원성이 의심되는 residue의 T 세포 증식 작

용을 실험한 결과 약하게 면역원성을 가지는 residue가 한 곳이 확인됨.

그러나, 시판되고 있는 기존의 항체 약품 8개의 peptide와 비교하였을 때

그 값이 매우 낮은 것을 확인함 (그림 2).

- 면역원성이 의심되는 염기서열을 변화시켜 항체 variants를 제작하고

HEK293F 세포에서 임시발현 및 정제 과정을 거쳐 항체를 생산함. ELISA와

SPR을 통해 HGF에 대한 친화도를 측정하고 in vitro, in vivo 효능을 평가

함.

그림. 기존의 항체 약품 8종과 HGF항체의 면역원성 비교

1.3 시험관내 효능 분석 연구 :

- HGF 항체의 시험관내 효능 분석 실험을 위하여 HGF/c-Met signaling,

MDCK-2 scattering assay, U-87 cell survival assay 실험등의 조건을 확

립하였음.

- 항체 최적화 연구를 통해 도출된 선도 항체들을 기 확립된 HGF/c-Met

signaling 실험(아래그림. TOP), MDCK-2 scattering assay (아래그림.

MIDDLE), U-87 cell survival assay 실험 (그림. BOTTOM)에서 항체의

효능이 있음을 확인함 .

그림. HGF/c-Met signaling 실험

그림. MDCK-2 scattering assay

그림. U-87 cell survival assay 실험

1.4 생체내 효능 확인

- 0.01nM 이하의 Kd 값을 가지는 HGF 4 항체는 기 확립된 Xenograft

mouse model에서 생체내 효과가 있음을 확인함.

a)

b)

그림. HGF 4 항체의 생체내 효능 확인 실험 (a: 일자별 tumor size, b:

41일차 사진)

- Combination therapy (Temodar) in orthotopic model: mouse orthotopic

model을 확립하여 도출된 HGF 항체 5mg.kg과 기존은 표준요법제인

Temodar (temozolomide, TMZ) 5mg/kg을 병용투여하여 뇌암의 tumor

size를 MRI로 측정하고 mouse의 생존률을 확인한 결과, HGF 항체와 TMZ

병용투여 시 단독 투여와 비교할 때 tumor size가 현저히 줄어들며

생존률이 약 2.5배 가량 증가하는 것을 확인함.

a)

b)

그림. 기존 약물과의 병용투여를 통한 HGF 4 항체의 생체내 효능 확인 실

험 (a: 뇌암 세포 주입 후 27일째 tumor size, b: mouse 생존률)

- Xenograft model에서 농도-용량 반응 확인: 기 확립된 mouse xenograft

model을 이용하여 5, 10, 30 mg/kg HGF 항체를 복강 주사하여 tumor

size를 확인한 결과, 용량 의존적으로 tumor growth inhibition 효과가

있음을 확인함.

a) b)

그림. HGF 4 항체 농도에 따른 생체내 효능 확인 실험 (a: tumor size, b:

생존률)

- Combination therapy (Avastin) in xenograft model: mouse xenograft

model을 이용하여 기존 뇌암에 대한 항암제인 Avastin (bevacizumab)

3mg/kg과 HGF 1mg/kg을 병용투여한 결과, 단독투여시보다 뛰어난 tumor

growth inhibition효과를 확인함.

그림.기존 항체 약물과의 병용투여에 의한 HGF 4 항체 농도에 따른 생체내

효능 확인 실험

3059

105

468

710

0

100

200

300

400

500

600

700

800

초기생산성 첨가물조정 배지최적화 Fed media Fed 최적화

Increased Productivity(mg/L)

3059

105

468

710

0

100

200

300

400

500

600

700

800

초기생산성 첨가물조정 배지최적화 Fed media Fed 최적화

Increased Productivity(mg/L)

2. 항체 공정 개발 연구

2.1 배양공정의 최적화 및 scale up

- 배양방법 최적화 : flask scale에서 5종의 상업배지선별, 20여종의 첨가

제 선별, 배양기간, 배양온도조절 및 fed batch 공정 설정을 통해 초기 생산

량 30mg/L에서 최종 710mg/L으로 생산성 향상된 배양 조건 최적화 (그림.

8)

그림. 배양조건 최적화에 따른 생산성 향상

- Scale up: flask 배양을 통해 최적화를 통해 설정된 방법을 기초로 하여

wave bioreactor 시스템에서 5L → 10L → 20L scale에서 배양 공정 설정

함. 최종 20L scale에서 batch culture로 450mg/L의 생산성을 갖는 배양조

건 설정됨.

그림. 20L wave bioreactor에서 배양 그래프

- 5L와 20L규모의 wave bioreactor와 5L stirred type bioreactor등 다양한

방식의 배양기에서 배양 온도, pH, fed-batch조건 및 rpm이나 air flow등의

물리적 변수를 최적화 (그림 10). 이를 이용하여 20L 이상 scale에서

항체생산성과 항체 품질을 유지할 수 있는 대량 배양공정 설정 연구를 수행.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

120

130

140

150

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Time (day)

Via

ble

cel

l den

sity

(x1

05ce

lls/m

l)V

iab

ility

(%

)

0

100

200

300

400

500

600

700

800

Pro

du

ctiv

ity

(mg/

L)

C110829 Productivity C110829 Cell density C110829 Viability

그림. 5L jar type bioreactor에서 배양 그래프

2.2 대량 정제 공정 개발 및 적용

- 대량 배양액의 Clarification을 위한 방법으로 Depth filter 선별 및

효과적인 항체 정제방법으로 Protein A→cIEX →aIEX법을 설정하였고

정제수율은 65%이상, SEC를 이용한 순도는 98% 이상이었음.

Batch No. Total yields(%)

Purity by

SEC(%)

Protein A content (ng/mg)

HCP Content (ng/mg)

C100316 65.9 98.8 0.34 0.7

C100415-1 65.7 99.3 0.36 4.0

C100415-2 63.2 99.1 0.27 16.9

C100415-3 67.5 99.2 0.48 18.3

C100530 55.3 99.1 0.52 16.2

Test Method Specification

1. Appearance Visual examination Clear colorless

2. Sterility KP Sterile

3. Endotoxin KP <0.5EU/ml

4. Identification

4.1 Western Blot Western Blot Comparable to Standard

4.2 SDS-PAGE SDS-PAGE Comparable to Standard

4.3 N-terminal Edman degradation Comparable to Standard

4.4 IEF IEF Comparable to Standard

Batch No. Yields(%) Purity by SEC(%) Protein A content(ng/mg)

HCP Content(ng/mg)

P530 B 85.0 97.6 1.5 >278.0

0.8 22.699.696.5CX530 B

AX530 B 98.3 99.6 0.7 13.5

그림. 정제 batch별 수율 및 순도와 정제된 항체의 Size exclusion

chromatography(SEC)

- 선별된 depth filter의 대량 배양액 회수를 위한 조건 설정 실험. Protein A

및 Ion exchange chromatography scale-up을 위한 공정 변수 (유속, 머무름

속도 등) 설정 실험. 20L이상 규모에서 적용 가능한 정제 공정 설정 연구를

수행. 500mg scale에서 정제법 설정 확인됨.

표. 500mg mAb Scale 정제 결과

2.3 기준 및 시험법 설정

- 생산된 항체의 품질을 검증할 수 있는 기준 및 시험법 항목을 설정하고

각 시험법에 대한 실시조건을 설정함.

표. 설정된 기준 및 시험방법

5. Purity

5.1 Protein A ELISA ≤ 100ng/mg

5.2 Host cell derived protein ELISA ≤ 100ng/mg

5.3 Host cell derived DNA Hybridization ≤ 10pg/mg

6. Monomer SE-HPLC ≥ 98%

7. Protein content BCA method Measured value

8. Potency Bioassay 80 ~ 120%

Test Method Specification성적

1001 1002

1. pH KP - 6.5 6.5

2. Sterility KP Sterile O O

3. Endotoxin KP <0.5EU/ml O O

4. Western Blot Western Blot Comparable to Standard 첨부 첨부

5. SDS-PAGE

(reducing/non-reducing)SDS-PAGE Comparable to Standard 첨부 첨부

6. IEF IEF Comparable to Standard O O

7. Protein A ELISA ≤ 100ng/mg 0.292 0.759

8. Host cell derived protein ELISA ≤ 100ng/mg 2.6 3.5

9. Host cell derived DNA Hybridization ≤ 10pg/mg < 1.05 < 0.84

10. Monomer SE-HPLC ≥ 98% 94.26 99.95

11. Protein content UV adsorption Measured value 1.9mg/ml 2.38mg/ml

12. CIEX-HPLC HPLC 첨부 첨부

- scale-up batch로 생산된 시료에 대하여 설정된 기준 및 시험법에 따라

분석을 실시하고, 모든 항목에 대해 기준에 적합함을 확인함.

a)

b)

c)

그림. 대량 생산된 시료 분석 결과 (a: 기시법 성적, b: SEC-HPLC, c:

CEX-HPLC)

3. 항체 생산 세포주 개발 연구

- 항체 생산 세포주 개발 연구: 최종 선정된 항체 유전자를 발현 벡터에

클로닝하고, Chinese Hamster Ovary (CHO) 세포에 transfection함. G418

항생제와 Selection 배지로 형질전환된 세포주를 분리하고 limit dilution을

통해 single cell에서 유래한 clone 중 항체 생산량이 높은 clone을 선별함.

항체 생산성을 높이기 위해 MTX (methotrexate)를 처리, 항체 유전자의

copy number를 증가시키는 실험 수행. 개발된 세포주로부터 항체를

생산하여 항체의 quality를 확인한 결과 기존에 확인된 물리화학적 특성,

binding affinity, in vitro activity가 동일함.

- 항체 생산 세포주 안정성 연구: 30 계대의 세포 성장 growth 및 항체

생산량을 측정.

- Cell banking: 최종 선별된 생산세포주의 cell banking 제조를 위해 적절한

GMP 설비를 갖춘 기관을 선정.

Ad5.CMV.Rz.HSVtk Control

전립선암

뇌암Ad5.CMV.Rz.HSVtk Control

3-3) 아데노바이러스 유전자 치료제 개발

1. 아데노바이러스 AdCMV.Rz.HSVtk의 효능 연구

1.1 마우스 s.c. xenograft를 이용한 종양 억제 효과 검증

전립선암 세포주인 CWR22rv 혹은 뇌종양 세포주인 U87를 subcutaneous

xenograft를 만들고 아데노바이러스 5 x 108 pfu의 Ad5CMV.Rz.HSVtk를 종양

으로 주입하고 종양의 크기를 측정한 결과, 대조 바이러스 Ad5CMV.MOCK 과

비교하여 종양의 성장을 크게 억제하였다.

그림. 마우스의 s.c.에 1 x 106개의 CWR22rv 혹은 U87세포를

주입하고 종양이 만져질 수 있는 크기가 되었을 때, 5 x 108

pfu의 바이러스를 주입하고 종양의 크기를 측정하였음.

1.2 마우스 orthotopic xenograft를 이용한 종양 억제 효과 검증

마우스의 뇌에 5 x 108개의 U87의 세포를 주입하고 MRI를 이용하여 적당한 크

기가 되었을 때 바이러스를 주입하고 마우스의 살아 있는 기간을 측정하여 대조

바이러스와 비교하여 Ad5CMV.Rz.HSVtk가 치료 효과가 있는지를 확인한 결과,

Ad5CMV.Rz.HSVtk가 탁월한 항암 효과가 있음을 검증하였다.

AdCMV.Rz.HSVtk

Day 0

Day 7

Ad5CMV.MOCK

Day 0

Day 7

A.

B.

C.

그림. 바이러스를 주입하기 전에 MRI를 이용하여 종양의 형성을

확인하고 (A, B) 비슷한 사이즈의 종양을 가진 마우스를 두 그

룹으로 나누고 Ad5CMV.RzHSVtk 혹은 AdCMV.MOCK 바이러

Column : Resource Q (Amersham)

Flow rate : 1 min/ml

Buffer A : 50 mM HEPES (pH 7.5), 300 mM NaCl

Buffer B : 50 mM HEPES (pH 7.5), 600 mM NaCl

스를 처리하였음. 바이러스로 치료된 마우스의 survival를 그래

프로 표현하였음 (C).

1.3 마우스 간에 종양을 만들고 Ad5CMV.HSVtk의 치료 효과를 검증 하였음

마우스의 spleen에 5 x 108개의 Hep3B의 세포를 주입하고 PEP/CT를 이용하여 적당

한 크기가 되었을 때 바이러스를 주입하고 마우스의 살아 있는 기간을 측정하여 대조

바이러스와 비교하여 Ad5CMV.Rz.HSVtk가 치료 효과가 있는지를 확인한 결과,

Ad5CMV.Rz.HSVtk가 탁월한 항암 효과가 있음을 검증하였다.

그림. He3B 세포를 spleen으로 주입하여 간에 종양을 만들고

Ad5CMV.RzHSVtk 혹은 AdCMV.MOCK 바이러스를 처리하였음. 바

이러스로 치료된 마우스의 survival를 그래프로 표현하였음.

2. HPLC를 이용한 아데노바이러스 분석법 확립

HPLC를 이용한 아데노바이러스의 분석법으로 널리 사용되고 있는 Canji사의

방법에 따라 아데노바이러스 분석법을 확립하였다. HPLC 시스템으로 Waters

사의 시스템을 사용하였으며, 분석조건은 아래와 같다.

HPLC 시스템을 사용하여 아데노바이러스를 분석한 대표도는 그림1과 같다.

5개의 peak가 관찰되었으며, 각각의 peak를 분석한 결과 I, II번 peak는 배지와

cell lysate 성분, III번 peak는 free hexon, V번 peak는 DNA이었으며, IV번

peak가 아데노바이러스인 것으로 확인되었다. 이 데이터를 토대로 아데노바이

러스 분석에 HPLC 시스템을 이용하였다.

그림. 아데노바이러스 분석예 (crude cell lysate)

3. 아데노바이러스 감염조건 선정

최적의 감염조건을 선정하기 위해, 293 세포주와 Ad5CMV.TR.HSVtk 아데

노바이러스를 이용하여 조건실험을 수행하였다. 바이러스의 생산성은 HPLC를

이용한 분석법을 사용하여 비교하였다.

(1) MOI에 따른 생산성 비교

MOI에 의한 Ad5CMV.TR.HSVtk 아데노바이러스의 생산성 변화를 확인하고

최적의 MOI 조건을 확립하고자 하였다. 0.1, 1, 5, 10 MOI별로 바이러스를 감

염시킨 후 HPLC 분석법을 사용하여 각각의 생산성을 확인하였다. 그 결과 10

MOI에서 최대의 생산성을 보여주었으며, MOI 선정시 오차를 고려하여 5-10

MOI를 최적의 조건으로 선정하였다. 그 결과는 그림2와 같다.

그림. MOI별 바이러스 생산성 비교

(2) Harvest 시간 결정

바이러스의 회수율을 높이기 위해서 바이러스 감염 후 harvest 시간을 결정하

고자 하였다. 이를 위해서 바이러스 감염 후 시간별로 supernatant와 pellet을

별도로 회수하여 바이러스의 분포 양상을 확인하였다. 시험결과, 감염 초기에는

pellet 내에 다수의 바이러스가 분포하는 것을 확인할 수 있었으며, 시간이 경과

함에 따라 supernatant로 바이러스가 방출됨을 확인하였다. Empty capsid와

293 세포에 존재하는 DNA를 최소화하기 위해, harvest 시간을 바이러스 감염

후 4일로 결정하였다.

그림. Supernatant와 pellet에 존재하는 바이러스 양 비교

4. 고순도 아데노바이러스 정제 공정 개발

아데노바이러스 정제는 chromatography를 이용한 방법을 사용하였으며,

각 step별로 조건 실험을 수행하여 최적의 정제조건을 확립하였다.

Chromatography를 이용한 정제 프로세스는 아래와 같다.

그림. Chromatography를 이용한 아데노바이러스 정제 프로세스

Chromatography 정제는 ion-exchange column과 Amersham

Bioscience사의 AKTA 시스템을 사용하여 수행하였다. Elution buffer는

Tris를 기본으로 하는 buffer를 사용하였으며, tris buffer는 아데노바이러스

의 aggregation을 억제하여 아데노바이러스의 안정성을 높여준다고 보고되

어 있다.

아래 그림의 정제 프로파일에서 보듯이 바이러스 배양액은 숙주세포 (293

세포) DNA 및 단백질과 배지 내에 존재하는 불순물이 포함되어 있다. 하지만

대부분의 단백질은 column에 binding하지 않고 flow-through 단계에서 제거

가 되는 것을 확인할 수 있다. Elution 단계에서 10 ml씩 분획하여 각각의 분

획을 분석하였으며, 아데노바이러스만 포함되어 있는 분획들을 pooling하여

정제된 아데노바이러스를 얻었다. 정제된 아데노바이러스를 분석한 결과, 그

림6과 같이 숙주세포 DNA 및 단백질이 포함되지 않은 상태로, 98% 이상의

순도로 정제됨을 확인할 수 있었다.

그림. 아데노바이러스 정제 프로파일 (ion-exchange column)

그림. 정제된 아데노바이러스 분석 프로파일

5. 바이러스 뱅크 제조

확립한 생산공정에 따라 독성 및 임상시료 생산을 위한 바이러스 뱅크를 제조

하였으며, 정량한 결과, 5 x 1013 vp임을 확인하였다. 제조한 바이러스 뱅크가

임상시료 생산에 적합한 품질로 제조되었는지 확인하기 위해, CRO를 통해 분석

을 진행할 계획이다.

그림. 아데노바이러스 뱅크 분석결과

6. 분석법 개발

(1) Virus particle 정량법 (OD260 정량법)

ARMWG (Adenovirus Reference Material Working Group)에서 제시한

SOP에 따라 시험법을 확립하였다. 시험방법은 정제된 바이러스에 Excipient

(20 mM Tris, 25 mM NaCl, 25% glycerol, pH8.0)와 SDS의 최종농도가

0.1%가 되도록 첨가한 후, 15분간 반응시킨 후 Spectrophotomer를 이용하

아데노바이러스 표준품 농도 (vp/ml) 순도 (A260/A280)

1차 5.73 x 1011 1.42

2차 5.86 x 10 11 1.39

여 OD260 값을 측정한다. 바이러스 양은 아래 식에 대입하여 계산한다.

Vp/ml = A260 x 1.1 x 1012 x dilution factor

위의 SOP에 따라 아데노바이러스 표준품을 분석한 결과, 표1과 같은 결과

를 얻었다. ARMWG에서 제시하는 아데노바이러스 표준품은 5.8 x 1011

vp/ml이며 (오차는 4.8 x 1011 - 6.9 x 1011 vp/ml), A260/A280로 표시하는

순도는 1.37 - 1.39인데, 분석결과 시험법이 적합함을 확인할 수 있었다.

표1. Spectrophotometer를 이용한 아데노바이러스 정량 결과

(2) 기준 및 시험방법 설정

2차년도 연구를 통해 확립해야 할 시험항목 및 기준은 표2과 같이 설정하였

다.

표. 기준 및 시험방법 항목

시험 항목 기준

성상 무색투명

pH 7.5-8.5

무균시험 무균

엔도톡신 시험 <5 EU/ml

함량

바이러스 수(OD260) -

바이러스 수(HPLC) -

Infectious titer -

확인 제한효소 지도 예상 밴드 pattern

순도

숙주유래 DNA <10ng/1x1012

vp

숙주유래 단백질 <100ng/ml

Aggregation (OD320/OD260) 0.1-0.3

역가Infectious titer

/virus particle<30

7. 독성시험

대웅제약과 국립암센터에서 주관한 13주 반복 정맥투여 독성시험 결과

[13-WEEK TOXICITY AND BIODISTRIBUTION STUDY IN

CRL:CD1(ICR) MICE WITH A 4-WEEK RECOVERY PERIOD FOR

DWP455 (REPLICATION INCOMPETENT)]

ㅇ 시험기관: MPI Research(USA)

ㅇ Study No.: 1951-006

ㅇ 시험기간: 2011년 3월 29일 ~ 현재(1stADR검토 중: 13주 PCR data 미

도착)

ㅇ 시험 의뢰기관: 국립암센터(모니터링: 대웅제약)

ㅇ 관련 시험

- METHOD DEVELOPMENT AND VALIDATION OF qPCR ANALYSIS

FOR DWP455 BIODISTRIBUTION IN ICR MICE AND

FORMULATION(Study No.: 1951-004)

- FEASIBILITY, DEVELOPMENT & VALIDATION OF A LIGAND

BINDING METHOD TO DETECT ANTI-ADENOVIRUS ANTIBODIES IN

MOUSE SERUM(Study No.: 1951-005)

- A SINGLE DOSE TOXICITY AND BIODISTRIBUTION STUDY IN

CRL:CD1(ICR) MICE WITH DWP455 (REPLICATE INCOMPETENT)

(Study No.: 1951-002)

ㅇ 시험내용

시험 디자인

시험결과

A. 치사율

1) Day 85에 group 2 수컷 1마리 사망: 신장결석에 의한 뇨관폐색으로 사

망

2) 회복기간 중 group 4 수컷 1마리 사망: 부검결과 특이사항 없음

à 시험물질에 의한 사망례가 아님

B. 육안 검사

모든 시험물질 투여군(group 2, 3, 4)에서 항문 및 생식기 부위에 변색

(discoloration)이 관찰되었으나 수컷의 화장행동 또는 털고르기(grooming

behavior)에 기인한 것으로 판단됨

à 시험물질에 의한 변화가 아님

C. 체중 변화

모든 시험군에서 시험물질 투여에 의한 체중변화는 관찰되지 않음

D. 사료 섭취량

1) Week 1에 저용량 및 고용량 투여군(group 2 & 4)에서 유의적인 사료

섭취량 감소가 관찰됨

2) 전 시험기간 동안, 암컷 시험물질 투여군에서 유의적인 사료섭취량 감소

가 관찰됨

3) 회복기간 동안, 고용량 투여군 암수 모두에서 유의적인 사료섭취량 감소

가 관찰됨

à 유의적인 사료섭취량 감소에도 불구하고 모든 시험군에서 유의적인 체중

변화가 관찰되지 않았으므로 이러한 사료섭취량 변화는 시험물질 투여에 의

한 변화이기는 하나 부작용(독성증상)은 아님

E. 안과학적 검사

모든 시험군에서 시험물질 투여에 의한 독성증상은 관찰되지 않음

F. 혈액학 검사

1) Week 4에 암컷 중용량 투여군(group 3) 및 암컷과 수컷 고용량 투여

군(group 4)에서 임파구(lymphocyte)가 증가하였고, 모든 시험물질 투여

군에서 호중구(neutrophil)가 증가

2) Week 13에 중용량 투여군(group 3)에서 MCV 증가 및 MCHC 감소

à WeeK 4에서 임파구의 증가가 약물투여에 의한 변화인지는 확실하지 않

으며, Week 13에서 관찰된 MCV 증가 및 MCHC 감소가 망상적혈구에서

주목할만한 변화는 아님(재생성 변화에 기인한 미성숙 적혈구 생성에 기인

한다고 판단됨)

G. 혈액생화학

1) Week 4에 저용량 및 중용량 투여군(group 2 & 3)에서 AST와 ALT가

증가하였고, 중용량 투여군(group 3) 암컷에서 globulin이 증가하였으며,

이와 관련하여 albumin/globulin(A/G) ration가 저용량 및 중용량 투여군

(group 2 & 3) 암컷에서 감소하였고, 고용량 투여군(group 4)은 AST 및

ALT가 total bilirubin 증가와 관련하여 중등도 이상으로 증가하였고,

globulin 증가 및 A/G ratio 감소가 중등도 이상으로 관찰되었음

2) Week 13에 저용량 투여군(group 2) 암컷에서 A/G ratio가 감소하였

고, 중용량 투여군(group 3) 암수 모두에서 globulin이 증가하여 A/G

ratio가 감소하였으며, AST와 total bilirubin은 정상범위였으나 ALT가 고

용량 투여군(group 4)에서 증가하였다. 또한 고용량 투여군(group 4) 수

컷 1마리에서 신기능 이상에 기인한 BUN 및 phosphorus가 중등도 이상

으로 증가하였음

3) 회복군에서 globulin 및 total protein이 암컷에서 유의적으로 증가하였

으나 그 변화 값이 정상범위에 포함되므로 독성증상은 아님

à Week 4 & 13에 간효소 관련 평가항목(AST & ALT)이 고용량 투여군에

서 유의적인 증가가 관찰되었으며, 간무게 증가와 관련하여 약물에 의한 변

화로 판단됨

H. 뇨검사

뇨량이 수컷에서 다양하게 변화

à 용량상관성이 없으므로 시험물질에 의한 변화는 아님

I. Immunogenecity

부형제 대조군(group 1)에서 anti-nuclear 또는 anti-adenoviral antibody

가 검출되지 않았으며, Week 4 & 13에 anti-double stranded DNA

antibodies(α-dsDNA Abs)가 모든 대조군 동물에서 검출됨.

J. 조직분포시험

Week 4 & 13: Liver > Lung > Spleen > Kidney > Heart, Inguinal &

mandibular lymph node > Ovary, Thymus, Prostate, Epididymides,

Uterus > Testes, Brain

K. 병리육안 검사

1) 부형제 대조군(group 1) 암컷 2마리, 중용량 투여군(group 3) 암컷 1마

리 그리고 고용량 투여군(group 4) 수컷 1마리에서 피부(투여 부위) 또는

귀(동물식별 용 펀치)에 상흔(딱지)이 관찰되었고, 중용량 투여군(group

3) 암컷 1마리에서 하악 림프절(mandibular lymph node) 종대가 관찰됨

2) 중용량 투여군(group 3) 수컷 1마리에서 정낭 크기 감소가 관찰되었고,

고용량 투여군(group 4) 수컷 1마리에서 뇨가 가득찬 방광이 관찰되었으

며, 저용량 투여군(group 2) 암컷 1마리에서 자궁 크기 증가가 관찰되었

으며, 중용량 투여군(group 3) 암컷 1마리에서 신장결절(kidney nodule)

이 관찰되었으나, 약물에 의한 독성증상이 아닌 일시적인 현상으로 판단됨

3) 회복군 고용량 투여군(group 4) 암컷 1마리 및 수컷 1마리에서 자궁

크기 증가 및 귀의 상흔이 관찰되었으나 약물에 의한 독성증상이 아닌 일

시적인 현상으로 판단됨

à 피부 상처 및 하악림프절 종대, 정낭크기 감소, 뇨가 충만된 방광, 자궁크

기 증가, 신장결절 등은 용량상관성 및 성별 일관성이 없으므로 약물에 의한

독성증상이 아닌 일시적인 현상으로 판단된다.

L. 장기중량

1) 시험물질에 의한 유의적이고 생리학적 의미가 있는 변화가 관찰된 장기

는 비장(Spleen)임

비장의 중량 증가와 관련하여 조직병리학적 변화인 림프성 동맥주위집

(Periarteriolar lymphoid sheath)과가장자리 구역(marginal zone)에 영

향 받은 림프절 과형성화(Lymphoid hyperplasia)가관찰됨

2) 중용량 및 고용량 투여군(group 3 & 4) 수컷에서 상대 간무게(liver)가

유의적으로 증가함

3) 고용량 투여군(group 4) 수컷에서 상대 뇌하수체 무게(Pituitary)가 유의

적으로 증가함

4) 중용량 투여군(group 3) 수컷에서 절대 및 상대 가슴샘 무게(Thymus)

가 유의적으로 감소함

5) 중용량 투여군(group 3) 수컷에서 절대 감상샘/부갑상샘 무게

(Thyroid/parathyroid)가 유의적으로 감소하였고, 상대 갑상샘/부갑상샘

무게(Thyroid/parathyroid)가 유의적으로 증가함

6) 중용량 투여군(group 3) 암컷에서 절대 및 상대 자궁 무게(Uterus)가 유

의적으로 증가함

7) 회복군 고용량 투여군(group 4) 암컷에서 비록 유의적이지는 않지만 절

대 및 상대 비장무게(Spleen)가 증가하였고(21.88%↑), 이것은 체중감소

(12.44%↓)에 따른 변화로 판단되어 약물에 의한 직접적인 비장 독성은

아니라고 판단됨

à 중용량 투여군 이상에서 관찰된 비장(spleen) 무게의 유의적인 증가는 약

물에 의한 독성증상으로 판단되며, 조직병리학적 소견과도 일치함

M. 조직병리 검사

1) 중용량 및 고용량 투여군(group 3 & 4) 간(Liver)에서 약물에 의한 변

화로 판단되는 거대세포핵(Karyomegaly), 간세포의 세포질 변성

(Cytoplasmic alteration of hepatocytes), 간세포 괴사(Hepatocyte

necrosis)이 관찰되었다. 특히 거대세포핵은 응집/뭉쳐진 chromatin의 증

가와 핵내 세포질 응축의 증가를 가진 세포핵의 비정상적인 확대가 특징

이며, 이러한 세포질 크기 증가는 거대세포핵에 동반하여 종종 나타난다.

간세포의 세포질 변성은 세포질 호염기화(Cytoplasmic basophilia)와 과

립 발현(Granular appearance)의 증가를 포함한 세포질의 착색변화를 특

징으로 한다. 림프세포(Lymphoid dells)의 국소 응집 또한 수컷 중용량

및 고용량 투여군(group 3 & 4)과 암컷 모든 시험물질 투여군에서 증가

하였다.

2) 모든 시험물질 투여군에서 비장의 림프성 동맥주위집(Periarteriolar

lymphoid sheath)과 가장자리 구역(marginal zone)에 영향 받은 림프절

과형성화(Lymphoid hyperplasia)가 관찰됨

à 간(liver) 및 비장(spleen)의 조직병리학적 변화는 약물에 의한 독성증상으

로 판단되며, 중용량 투여군(group 3)은 중등도 이하, 고용량 투여군(group

4)은 중등도 이상의 변화가 관찰되었으며, 특히 고용량 투여군의 변화는 암

수 모두에서 관찰되므로 고용량 투여군(group 4)은 독성증상이 명확히 관찰

된다고 판단됨

3) 회복군 고용량 투여군(group 4)에서도 간세포 거대세포핵, 간세포의

세포질 변성, 국소림프 과형성이 Main study와 동일하게 관찰되었고, 비

장에서 림프 과형성 또한 관찰되었다.

8. 특성분석

3-4) 세포 치료제 개발

<최종목표>

임상시험용 EBV T 세포치료제의 제조/공급 및 이를 이용한 제1상 임상시

험 수행

I. 제1상 임상시험승인신청에 필요한 자료 작성

I-1. 시설에 관한 자료

□ 환경모니터링 실시계획서 및 결과보고서

부유입자 모니터링, 부유균 모니터링, 낙하균 모니터링, 표면균 모니

터링, 작업자 표면균 모니터링, 온습도/차압 모니터링 항목에 대해 5

일간 위의 도면에 표시된 장소에 대해 환경모니터링을 수행하였으며

(Fig. 1), 모든 측정값 및 평균값이 허용기준 이내의 결과로 나타나

제조소가 임상용의약품의 제조구역으로 적합함을 증명하였음 (임상용

의약품 제조구역 환경모니터링 종합보고서 작성).

Fig. 2는 환경모니터링 시험항목 별 측정 결과값을 나타낸 것으로

‘임상용의약품 제조구역 환경모니터링 종합보고서’에 포함된 내용임.

5일간의 환경모니터링 과정 동안 측정된 결과값을 raw data로서 기

록한 것이며, 각 항목에 대해 적합 및 부적합 여부를 표시하였음.

‘임상용의약품 제조구역 환경모니터링 종합보고서’는 앱비앤티셀의 제

1상 임상시험계획승인 신청시 첨부자료로 제출.

□ GMP 문서분류 및 관리목록

국립암센터 세포치료제 생산실은 기준서 5종, 방법서 56종, 그리고

250여 종류의 기록서를 기반으로 운영. 아래의 표는 운영중인 기준

서, 방법서, 및 기록서 목록 중 일부이며, 매년 초 기준서, 방법서, 기

록서들을 개정하여 지속적인 update를 진행 (Fig. 3).

□ GMP 관리도면 목록 및 해당 도면, 제조 및 분석장비 벨리데이션 매

트릭스

국립암센터 세포치료제 생산실을 임상용의약품의 제조구역으로 승인

받기 위해 다음과 같은 항목의 문서를 작성하여 임상시험승인계획 신

청시 제출.

- 배치도 및 위치도

- 작업장 평면도면

- 작업원 이동동선 도면

- 청정등급구분도

- 폐기물 동선

- 원료 및 자재동선

- 환경모니터링 검체 채취 위치도면 phase I & II

- 장비 배치도

- 제품 및 검체 이동동선

- 1층 조닝도

시험항목 시험기준

품질

검사

무균시험 (멤브레인필터법) 음성

마이코플라즈마부정시험PCR법 음성

직접법 ≤ 1.0 EU/ml

엔도톡신시험 음성

외래성바이러스부정시험 음성

총세포수 살아있는 세포수 ≥ 3.50×106 cell/ml,

세포생존율 ≥ 70%

확

인

시

험

CD8 T ≥ 65%

CD45RA CD8 T 세포 중 ≤20%

CD45RO CD8 T 세포 중 ≥80%

CD57 CD8 T 세포 중 ≤35%

PD-1 CD8 T 세포 중 ≤20%

순도시험 Anti-CD3 mAb 잔류량시험 음성

역가시험세포기능시험

IFN-g assay CD8 T 세포 중 ≥10%

LAMP1 assay CD8 T 세포 중 ≥10%

TCRvβ typing CD8 T 세포 중 20% 이상인 TCRβ type

- 차압도

- 공조덕트계통도 등

I-2. 생산에 관한 자료:

□ 자가기준 및 시험방법서 및 제조기록서

EBV T 세포치료제의 특성을 결정할 수 있는 항목을 결정하여 자가

기준을 마련하였으며, 각 기준을 시험하기 위한 방법을 결정함으로서

EBV T 세포치료제의 자가기준 및 시험방법을 제작. 또한 자가기준

및 시험방법과 제조흐름표시도 (Fig. 4)를 기반으로 EBV T 세포치료

제의 제조기방법 및 기록서를 제정.

□ 3 로트 연속생산에 대한 결과기록서 및 안정성시험결과

임상용의약품 제조승인을 위해서는 세포치료제 생산실에서 제조되는

EBV T 세포치료제가 안정적으로 생산 가능하다는 것을 증명해야하

며, 이를 위해 3로트 연속생산 결과 기록서 제출이 필요.

이를 위해 4명의 자원자로부터 혈액을 제공받아 Fig. 5에 기술된 과

정을 통해 EBV T 세포치료제의 시험생산을 수행.

각 피험자로부터 50cc 혈액을 채혈하여 EBV T 세포치료제의 배양

을 시작하였으며, 배양 28일째 EBV T 세포 분리 후 대량배양중인

세포의 공정중 검사를 수행. 배양 중인 4로트의 EBV T 세포치료제

(LMJ-CT-100726, KJH-CT-100726, PMO-CT-100726,

LDG-CT-100726) 중 LMJ-CT-100726는 CD8 T 세포의 비율이

기준치 미달로 나타나, 부적격인 로트로 판정되어 배양중지. 그러나

다른 3 로트의 EBV T 세포치료제는 CD8 T 세포비율, IFN-g

production 비율 및 LAMP1+ CD8 T 세포의 비율이 기준치에 적합

한 것으로 판정되어 31일까지 배양 진행 (Fig. 6).

31일째 모든 배양액을 수거하여 완제품 충전 및 포장을 진행. 각 로

트의 EBV T 세포치료제는 >1.0 × 109 cells/L 수준으로 배양되었

으며, 세포의 생존율 역시 >95% 이상으로 나타났음. 또한 최종 배양

된 EBV T 세포에는 >20%인 특정 TCRvβ T 세포가 존재함으로써,

peptide 항원 특이적으로 EBV T 세포가 배양되었음을 증명 (Fig.

7).

제조된 EBV T 세포치료제 완제품의 유통기한을 결정하는 안정성시

험은 제조 후 10시간 까지 3회에 걸쳐 안정성시험을 수행. 0, 5, 10

시간째 품질관리 (엔도톡신시험, 무균검사, 및 마이코플라즈마시험)

시험을 수행하여, 피험자에게 영향을 줄 수 있는 오염여부를 판단하

였음. 동시에 총세포수 측정시험, 세포생존율시험, 확인시험, 세포기

능검사, TCRvb typing, 잔류물 검사 (IL-2, anti-4-1BB mAb,

anti-CD3 mAb peptide)를 수행하여 완제품 EBV T 세포가 기능적

변화가 없음을 증명하기 위한 시험을 수행 (Fig. 8).

각 시험항목에 대한 시험결과를 안정성시험계획서에 첨부하여 제1상

임상시험계획승인신청시 ‘안정성시험결과보고서로 제출.

II. 세포치료제 생산실 운영/유지

- GMP 관리: HVAC (Heating, Ventilation, & Air Conditioning; 온/습

도, 차압, 풍량, 풍속, 환기횟수) 관리 및 제조위생 (미립자, 미생물, 작

업절차) 관리

- GEP 관리: 공조관리, 냉방관리 등

□ 주기적 적격성 평가 및 환경모니터링

세포치료제 생산실을 임상시험용 의약품 제조에 적합한 구역을 유지

하기 위해 년 2회 주긱적 적격성 평가 수행. 공조기 및 생물학적 안

전작업대 (clean bench)에 포함되는 중간필터 및 헤파필터 전체 교

체, 훈증/소독, T.A.B.를 수행.

또한 매월 1회, Fig. 1에 표시된 장소에 대한 환경모니터링을 수행하

여 제조소의 오염여부를 판정.

III. 임상시험용 세포치료제 생산

- 임상시험용 EBV T 세포치료제의 생산수행

- 임상시험용 EBV T 세포치료제의 품질관리 시험수행

- Epitope 스크리닝 및 피험자 투여 후 이화학적 시험 수행

III-1. 임상시험용 EBV T 세포치료제의 생산 및 품질관리

□ KHS-CT-110531

- 제1 용량 단계용 (1/4 bag; 0.875×108 cells)

- 항원: HLA-A*02-restricted EBV/LMP2A #2, 4, 5, 6 peptides

- 공정중검사시 배양 09일째 4-1BB를 발현하는 CD8 T 세포의 비

율이 기준치 이상으로 나타났으며, 배양 14일째에는 CD8 T 세포

중 4-1BB를 발현하는 세포가 감소함으로써, 정상적으로 CD8 T

세포의 resting이 유도되었음을 확인. 동일한 peptide를 사용하여

CD8 T 세포를 24시간 동안 재활성하였을 때 정상적으로 4-1BB

를 발현하는 CD8 T 세포가 형성. 이들 세포를 anti-4-1BB mAb

로 분리하여 대량배양하였으며, 배양 28일째 -3D 반제품검사에서

CD8 T 세포의 비율이 기준치에 적합하며, CD8 T 세포의 기능도

기준치에 적합함을 확인. 31일째 완제품검사에서 세포의 기능 및

품질검사에 이상이 없음을 확인.

- 완제품 포장 후 임상시험의약품으로 제공

□ HCS-CT-110628

- 제2 용량 단계용 (1/2 bag; 1.75×108 cells)













□ KMS-CT-110830

- 제3 용량 단계용 (1 bag; 3.5×108 cells)













□ SME-CT-111122

- 제4 용량 단계용 (2 bag; 7.0×108 cells)













III-2. 앱비앤티셀 투여 및 추적관찰

III-2-1. 피험자 선별을 위한 epitope screening

□ EBV T 세포치료제 생산 가능 여부를 판정하기 위한 epitope

screening을 위해 임상시험팀으로부터 피험자의 혈액을 제공 받아

스크리닝 수행.

III-2-2. EBV T 세포치료제 투여 후 피험자 추적관찰

□ 제1 용량 단계 (1/4 bag; 0.875×108 cells)

○ 피험자 정보

- 성별 및 연령 : F/62세

- HLA-A*24 type

- 암종: 비인두암 (Nasopharyngeal Cancer)

○ 앱비앤티셀

- 제품번호: KHS-CT-110531

- 항원: HLA-A*02-restricted EBV/LMP2A #2, 4, 5, 6

peptides

○ 안전성 평가

- 임상약 관련 이상 반응 없음.

○ 유효성 평가

- 세포 주입 4주 후 질병 진행

○ 면역학적 모니터링

앱비앤티셀 (KHS-CT-110531) 투여 후, 4주차까지 피험자의 추적

관찰을 수행. 앱비앤티셀 투여 후 혈액내 lymphocytes 및 CD8 T

세포가 7일째까지 증가하였지만, 14일째에는 투여준 수준으로 회

복. 앱비앤티셀 제조에 사용한 peptide에 대해 IL-6 및 IL-8이 증

가하는 현상이 나타났지만, 안정성 또는 유효성과 관련성은 확인

못함.

○ 결론

제1 용량단계의 앱비앤티셀은 독성이 없는 것으로 판정되어 두 번

째 피험자는 제2 용량단계의 앱비앤티셀을 투여하는 것으로 결정.

□ 제2 용량 단계 (1/2 bag; 1.75×108 cells)


- 성별 및 연령 : M/61세

- HLA-A*24 type

- 암종: 악성 림프종 (Hodgkin's Disease)

○ 앱비앤티셀

- 제품번호: HCS-CT-110628


peptides




- 세포 주입 4주 후 완전 반응



앱비앤티셀 (HCS-CT-110628) 투여 후, 6개월까지 피험자 추적관

찰 수행. 앱비앤티셀 투여 전체 PBMC의 수는 투여전과 비슷한 수

준을 유지하였지만, CD8 T 세포의 비율 및 숫자는 투여 전에 비해

투여 4개월째까지 높은 수준을 유지.

○ 결론



□ 제3 용량 단계 (1 bag; 3.5×108 cells)


- 성별 및 연령 : F/62세

- HLA-A*24 type

- 암종: 악성 림프종 (NK/T cell lymphoma)

○ 앱비앤티셀

- 제품번호: KMS-CT-110830


peptides




- 세포 주입 4주 후 안정화 상태



앱비앤티셀 투여 후 2개월까지 추적관찰 수행. 앱비앤티셀 투여 후

7일째부터 급격히 PBMC의 숫자가 감소하였으며, 이에 따라 CD8

T 세포 숫자 및 effec색 CD8 T 세포의 수도 감소하는 것으로 나

타남. 혈액내 각종 lymphocyte의 비율 (CD3+ T cell, CD4+ T,

CD8+ T, CD56+ NK, CD14+ monocyte, CD19+ B cell)을 측

정한 결과, 특정 lymphocyte의 감소가 아닌, 전체적인

lymphocyte 숫자의 감소인 것으로 나타남.

○ 결론



□ 제4 용량 단계 (2 bag; 7.0×108 cells)


- 성별 및 연령 : M/47세

- HLA-A*02 type

- 암종: 비인두암 (Nasopharyngeal Cancer)

○ 앱비앤티셀

- 제품번호: SME-CT-111122


peptides






앱비앤티셀 투여 후 4주차까지 추적관찰 수행하였으며, 피험자 상

태가 PD (progress disease) 상태로 판정되어 항암치료를 수행예

정. 따라서 이후 추적관찰 중지.

○ 결론

마지막 용량 단계인 제 4단계에서의 앱비앤티셀은 독성이 없는 것

으로 판정되어 이단계에서 최소한 5명의 피험자 모집하여 투여 예

정임.

IV. 결론

본 연구과제를 통해 EBV T 세포치료제를 임상용의약품으로 생산하기

위한 시설/설비/제조공정을 성공적으로 확립하였으며, 제조된 EBV T 세포치

료제의 제1상 임상시험을 수행하고 있음.

3. 연구결과 고찰 및 결론

HGF 중화 항체 개발

○ HGF 및 Met 관련 항암 항체 치료제 및 약품 개발 현황

- HGF 중화 항체 치료제의 경우 Amgen은 임상 2상 진행 중이고,

Aveo/Xoma는 임상 2상에 진입하였으며 Galaxy Biotech/Takeda는 현재

임상 1상 단계에 있음.

- Met 중화 항체 치료제의 경우 Genentech이 임상 3상 단계에 있음.

- HGF/ Met에 대한 단백질 의약품은 Kringle Pharma와 Compugen이 개

발 중이며 현재 전임상 단계에 있음.

- Pfizer외 다수의 회사에서 Met의 receptor tyrosine kinase inhibitor

(small chemical)를 개발하고 있으며, Archemix는 RNA aptamer 약품을

개발하고 있음.

- 뇌암은 발견 후 1.2년 이내에 절반의 환자가 사망하고, 2년 후에는 단지

27% 환자만이 생존하는 매우 위중한 질병으로, 효과 있는 치료법이 개발

되어 있지 않아서, orphan disease status에 있으며, 작은 규모의 임상

시험으로 짧은 기간 내 (fast track) 에 FDA의 판매 허가를 취득할 수 있

을 것으로 예상되어, 기술이전 없이 국내 기업 독자 역량으로 개발하여

볼 수 있는 품목임.

- 원발성 뇌암 (primary brain tumor)에 효과를 보이는 약품이 거의 없는

상황에서, 국내외 뇌암 치료제의 현재 시장 규모는 명확하지 않음.

- 2007년 11월 뇌암 치료용 백신으로 스위스에서 허가받은 NWBT

(Northwest Biotherapeutics)의 경우 2008년 200명의 환자에게서 $15

million의 판매액을 올려서 약 $3.3 million의 profit을 생산할 것으로 추

정되고 있으며, 2009년에는 약 $36 million의 판매액과, $11.5 million의

profit을 생산할 것으로 추정됨.1)

- 구매력이 있는 세계 7대 약품 판매 시장의 원발성 뇌암의 연간 발생 환자

수가 47,000명 정도인 점을 감안하면, 연간 시장 규모는 $3.5 billion 정

1) First brain cancer vaccine launched in Switzerland 11/07/2007 Drug Researcher.com

도에 이를 것으로 추정됨.2)

- Avastin과 같은 암혈관형성 억제제를 투여할 경우, 마우스의 경우 HGF /

Met 신호전달을 통하여 암 전이가 촉진될 수 있음이 증명되었으며,3) 인

간에서도 이것이 사실로 증명될 경우, 암혈관형성 억제제와 HGF 혹은

Met저해제를 반드시 병합투여야 할 것이며, 연간 2조 4천억원 규모의

Avastin 시장 (2006년)을 감안하면, 최소 연간 수조원대를 추가적인 시장

을 형성할 것으로 예상됨.

○ 연구결과가 국내외 기술개발에서 차지하는 위치

- Binding affinity, in vitro, in vivo 효능 실험 결과는 임상시험이 진행되

고 있는 Amgen, Aveo, Takeda 항체와 비교하여 동등 또는 우위에 있다고

볼 수 있으며, 전임상 진입을 위한 세포주 개발, 공정 개발 등이 완료 단계

에 와 있으므로 빠르게 전임상을 완료할 예정임.

- 아시아인에 주로 발병하는 질환 등 새로운 적응증을 개발하여 경쟁력을

강화하고 companion diagnostics를 활용한 적합한 환자군 선택 등의 치밀

한 임상 시험 계획을 토대로 하여 임상에서의 효력을 입증한다면 글로벌 경

쟁력이 있는 항체 약품으로 개발 가능.

아데노바이러스 유전자 치료제 독성시험

○ 아데노바이러스 유전자 치료제 현황

- 전 세계적으로 행해지는 유전자치료 임상실험의 약 70%가 여러 암을 사멸

하는 치료요법으로 개발되고 있으며 아데노바이러스는 안전성(safety)과 세

포내 전달효율(transduction efficiency)이 크게 앞서므로 임상실험의 25%

이상이 아데노바이러스를 이용하여 치료유전자를 암세포에 전달함. 이러한

통계수치는 유전자치료요법이 다른 질병보다는 암을 치료하는데 그리고 아

데노바이러스가 가장 긍정적인 효과를 보이고 있음을 반영하고 있음.

2) Shareholder Opinions: Primary Brain Cancer 2 July 2007 Datamonitor

3) Nature 2009, Vol. 458, p686: Nature 2009, Vol. 458, p679; Cancer Cell 2009, Vol. 15,

p167; Cancer Cell 2009, Vol. 15, p220; Cancer Cell 2009, Vol. 15, p232

- 기존 의약품시장을 대체할 막강한 잠재력을 지닌 유전자치료제를 개발한

동아제약과 바이로메드, 코오롱생명과학, 뉴젠팜, 포항공대 등이 임상에 박차

를 가하고 있으며 식약청은 유전자치료제 3개 품목에대해 임상시험 계획 승

인으로 국내에서 임상이 진행되고 있는 유전자치료제는 8개로 늘었음.

- 유전자치료 임상시험은 2002년 4월 기준으로 636건이 진행되고 있으며 등록된 환

자는 3496명임. 이들 중 암을 대상 질환으로 진행되고 있는 임상시험은 약69%로 여

러 질환들 중 가장 높은 빈도의 임상시험이 진행 중임. 암 유전자치료제 시장은 아

직 형성되지 않아 그 규모를 예측하기는 어려우나 세계최초로 2004년 1월에 중국에

서 발매된 Ad/p53 (p53 유전자를 함유한 아데노바이러스) 유전자치료제의 성장을

지켜보면 시장규모에 대한 윤곽을 파악할 수 있을 것임

-암 유전자치료제의 임상시험은 2002년 총 403개로 임상 I상이 256건, II상이 140

건 및 III상이 7건 임. 이중 대부분은 선진국에서 호발하는 암인 악성 흑색종 피부

암, 전립선암, 두경부암, 뇌암, 대장암 등에 집중되어 있음

- 암 유전자치료제의 본격 상용화 시점은 다양한 제품이 출시될 것으로 예상되는

2010년 이후로 예측되고 있음. 제품화 성공 후 년차별 치료환자수의 증가율은

Frost & Sullivan에서는 총 환자의 5%(1차년도), 7%(2차년도), 11%(3차년도),

15%(4차년도), 20%(5차년도)를 기준으로 예측하고 산정함

○ 연구결과가 국내외 기술개발에서 차지하는 위치

- 본 과제에서 개발한 암 유전자치료제는 “치료효능개선”과 “암 선택성증대

(안전성 확보)”의 두 가지 기술 혁신이 이루어진 치료제 임. 암세포만을 선택적으

로 사멸하고 정상세포에는 영향을 주지 않는 유전자치료제로 발전할 것으로 예상

됨.

- 본 과제에서 개발한 유전자 치료제는 치료 정도를 생체내에서 모니터하여 치료효

과를 실시간으로 판별하고 치료의 방향을 수정할 수 있는 치료 및 예방법 개발이

필요함.

- Ad5CMV.Rz.HSVtk는 hTERT를 표적하는 ribozyme을 이용하여 치료대상 부위만을 선

택적으로 표적화할 수 있는 표적지향적 유전자치료제로, 암세포에서 선택적으로 유

전자 발현을 제어함으로써 치료효과를 극대화하고 동시에 정상세포에서의 비특이적

유전자 발현에 의해 초래될 수 있는 부작용을 최소화할 수 있는 암 표적 지향성 유

전자치료제 임.

○ 아데노바이러스 Ad5CMV.Rz.HSVtk 유전자 치료제의 IND filing을 위한

전임상 결과

-고용량 투여군(group 4, 5.0x1010vp/animal)에서 혈액생화학 검사, 장기중

량, 조직병리학 검사 결과 약물에 의한 독성증상이 관찰되었으나, 중용량 투

여군(group 3, 2.5x1010vp/animal)에서는 혈액학 및 혈액생화학 검사, 장기

중량, 조직병리학 검사 결과 중등도 이하의 변화가 관찰되었으나 약물에 의

한 독성증상은 아니라고 판단되며, 추가적으로, 조직분포 결과 주요 조직(장

기)의 용량의존성 DNA level과 용량의존성 면역반응(Immunologic

response)이 관찰됨. 따라서 DWP455 1.0, 2.5, 5.0x1010vp/animal의 용량

으로마우스에 13주 반복 정맥투여한 결과 무독성량(NOAEL)은

2.5x1010vp/animal로 결정함.

-대량생산된 아데노바이러스의 특성시험을 수행하여 아데노바이러스 시료가

임상에 적용될 수 있는 안전한 시료임을 확인 함

EBV T 세포치료제

○ 국내외 T 세포치료제의 기술개발 현황

- T 세포치료제는 미국 NCI를 중심으로 가장 활발하게 임상시험이 수행

중. T 세포치료제의 효력을 증진시키기 위해서는 다양한 종류의 T 세포 중

암세포를 공격할 수 있는 T 세포만을 분리하여 대량배양 후 투여하는 것이

효과적인 방법인 것으로 최근 증명됨. 그러나 암항원 특이적 T 세포만을 분

리/대량배양하는 것은 복잡한 과정을 필요로 하기 때문에, GMP 시설로 쉽

게 이식할 수 있는 수준의 down-stream 공정을 개발하는 것이 T 세포치료

제의 일반화에 가장 큰 걸림돌임.

○ 본 연구결과의 우수성

- 본 연구진이 개발한 항원 특이적 CD8 T 세포 분리 및 대량배양 기술은

기존의 기술에 비해 단순하며 다양한 암항원에 대한 CD8 T 세포분리가 가

능. 이를 기반으로 GMP 시설에 쉽게 이식할 수 있는 down-stream 공정을

개발하였으며, 첫 번째 제품으로 EBV/LMP2a-specific CD8 T 세포치료제

(앱비앤티셀)을 개발하여 임상용의약품을 생산. 따라서 본 연구에서 제조하

고 있는 앱비앤티셀은 기존의 한계를 극복한 항원 특이적 CD8 T 세포치료

논문명 저자 학술대회명 지역1)지원과제번

호

Development of anti-HGF antibody

for glioblastoma

정준호

(교신)

IBC Antibody Asia

2010

국외


for glioblastoma

정준호

(교신)

한국미생물

생명공학회 2011

국내


for glioblastoma

정준호

(교신)

BIO KOREA 2011 국내


for glioblastoma

정준호

(교신)

IBC antibody

engineering and

therapeutics 2011

국외


for glioblastoma

정준호

(교신)

한국 생물공학회

2011

국내

구분1)

특허명 출원인 출원국 출원번호

발명특허 신규한 조건부-복제 가능 아데노바이러

스 및 그의 제조 방법 (Novel

Conditionally-Replication-Competent

Adenovirus and Method of Producing

the Same)

국립암센터 PCT 10-2010-00

22287

제임.

○ 본 연구결과의 파급효과

- 앱비앤티셀의 제1상 임상시험승인신청 과정을 통해 T 세포치료제 생산시

설 구축 및 운영체계 확립. 또한 제1상 임상시험승인신청에 필요한 절차 및

문서체계를 구축하였음. 따라서 이후 새롭게 개발되는 T 세포치료제의 제1

상 임상시험이 꾸준히 이행될 수 있을 것으로 기대.

4. 연구성과 및 목표달성도

(1) 연구성과

가. 국내 및 국제 전문학술지 논문 게재 및 신청

나. 국내 및 국제 학술대회 논문 발표

1) 지역 : 국내, 국외

다. 산업재산권

발명특허 트랜스-스플라이싱 라이보자임 및

암치료 유전자를 포함하는 재조합

아데노바이러스 및 이의 용도

국립암센터 한국 10-2011-008

3150

구분 최종목표 달성내용달성도 (%)

연차 최종

항암제 개발 기반 구축 및 항체치료제

(전임상진입)

-효율적인 신약개발을 위한 시스템 구축 및 이론적 근거 마련

-원발성뇌암과 비세포성 폐암치료제로서의 항 HGF 중화항체의 최적화 및 대량생산 기반 구축

○ 후보물질의 성공적인 각 목표 단계 진입

및 달성을 위한 효과적인 과제 운영100 100

○ 새로운 패러다임의 신약개발 프로그램의

방안 도출 및 이론적 근거 제시100 100

○ 후보물질 발굴 및 효능분석을 위한 기반

구축 100 100

○ 항체 최적화 및 1g 수준 항체 생산 70 100

○ 항체의 약효분석을 위한 동물시험 90 100

○ 항체의 대량 배양/정제 기술과 특성

규명을 위한 기준 및 시험법 확립90 100

1) 구분 : 발명특허, 실용신안, 의장등록 등

라. 기타연구성과

§ HGF 중화항체를 앱자인으로 기술이전

§ 아데노바이러스 Ad5CMV.Rz.HSVtk 의 기술이전 협의 및 임상시험

진입

§ EBV T 세포치료제 (앱비앤티셀)의 자기기준및시험방법 및

제조기록서 제작

§ 앱비앤티셀 3 로트 연속생산 및 안정성시험 결과 작성

§ 시설에 관한 자료인 환경모니터링 실시계획서 및 결과보고서, GMP

문서분류 및 관리목록, GMP 관리도면 목록과 해당 도면, 제조 및

분석장비 벨리데이션 매트릭스 제작

§ 식약청 임상시험계획승인신청 후 보완/실사를 통해 임상시험계획 및

임상용의약품 제조 승인

§ IRB 신청서 작성/제출/승인 (국립암센터)

§ 임상시험 피험자 등록 및 투여: 4명

(2) 목표달성도

가. 연구목표의 달성도

1차년도

유전자치료제(전임상)

GMP 수준의 아데노바이러스 Ad5.CMV.TR.HSVtk 생산공정 및 분석법 개발

○ 전임상시험용 아데노바이러스 생산공정

및 분석법 개발100 100

○ Glioblastoma Multiform (GBM),

두경부암, 전립선암, 폐암, 간암 등을

대상으로 아데노바이러스

Ad5.CMV.TR.HSVtk의 효능 분석

90 100

○ 독성시험, 특성분석 40 100

세포치료제(임상1상)

EBV 특이적 CD8 T 세포치료제 생산공정 및 임상시험을 위한 IND filing 완료

○ EBV T 세포치료제의 임상용의약품

제조공정 확립100 100

○ EBV T 세포치료제의 IND filing 및

임상용의약품 제조허가 신청100 100

○ EBV T 세포치료제의 임상시험계획

승인 및 임상용의약품 제조 승인100 100

구분 목표 내용 및 범위달성도 (%)

연차 최종

과제총괄항체치료제

(전임상진입)

-효율적인 신약개발을 위한 시스템 구축 및 이론적 근거 마련

-전임상을 위한 항 HGF 중화항체의 최적화 및 대량생산 기반 확립 완료

○ 후보물질의 성공적인 각 목표 단계 진입

및 달성을 위한 효과적인 과제 운영100 100

○ 국립암센터의 새로운 항암후보물질

도출, 선정, 및 단계진입100 100

○ 후보물질 발굴 및 효능분석을 위한 기반

확립100 100

○ 항체 최적화 완료 100 100

○ 항체 대량생산을 위한 세포주 개발 완료 100 100

○ 전임상수행을 위한 항체의 대량 생산

기반 기술 확립100 100

유전자치료제(전임상완료)

아데노바이러스 Ad5.CMV.TR.HSVtk의 전임상시험 완료

○ 전임상 및 임상1상 시험을 위한

아데노바이러스 생산100 100

○ 전임상시험 프로토콜 확립 및

전임상시험 (독성, 특성 분석) 수행 완료100 100

○ 임상시험 대상자 선정 및 임상시험의

프로토콜 확립50 100

세포치료제(임상1상)

EBV 특이적 CD8 T 세포치료제의 임상1상시험 ○ 임상용의약품 EBV T 세포치료제 제조 100 100

2차년도

완료 ○ 제1상 임상시험 수행 100 100

구분 평가의 착안점 자체평가

과제총괄

정책, 기술(특허 포함), 경제성 분야에서의

타당성 분석을 포함하는 새로운 신약개발

프로그램 기획보고서

l 정책, 기술(특허 포함), 경제성

분야에서의 타당성 분석을 포함하는

새로운 신약개발 프로그램

기획보고서 작성을 완료 하였음

l 항체치료제의 특허 분석을 통해

기술력획득의 전략에 관한 보고서

작성을 완료하였음

영상을 이용한 동물모델에서의 효능분석

기반 확립 및 GMP 시설에서의

세포치료제 생산 성공

l MRI, PET/CT,

Fluorescence/Luminescence를

이용한 동물모델에서의 효능분석

기반 확립하였음

l GMP 시설에서의 세포치료제 생산에

성공하였음

항체치료제

(전임상진입)

다음의 조건을 만족시키는 항체의

생산여부 : 친화도(Kd); <0.01nM, 생체외

효능 확인.

친화도가 0.01nM 이하의 2종의 항체

개발 완료 및 3종의 생체외 효능 확인

시험에서 그 효능 확인 완료.

5mg/kg 수준에서 생체내에서 종양 성장

억제 효과 확인

Xenograft mouse model에서

5mg/kg에서 항암 효과를 확인함.

항체 대량 배양 및 정제 공정 기술 및

기준 및 시험법 확립

l 20L Scale에서 450mg/L의 항체

생산성을 가지는 배양 조건과

정제수율 60%이상의 정제 공정 개발

l 항체의 기준 및 시험법 항목 설정

완료

유전자치료제

(전임상완료)

GMP 수준의 아데노바이러스 생산공정 및

대량생산 프로토콜 확립

l 대량생산 프로토콜을 작성하였음

l 생산된 바이러스의 특성을 분석하는

분석법을 확립하였음

효능분석을 통한 적합한 치료대상 암종의

제시

l 간암, 전립선암과 뇌종양 모델에서

바이러스의 효능 분석

아데노바이이러스의 독성 및 특성 분석

완료

l 독성 시험의 완료로 임상에 쓰여질

바이러스의 투여량 결정

l 바이러스가 임상에 쓰여 질 수

있음을 확인하는 특성 분석 완료

세포치료제 PQ, QA, 및 QC 기준서 작성 l EBV T 세포치료제의 임상용의약품

나. 평가의 착안점에 따른 목표달성도에 대한 자체평가

(임상1상)

제조공정 확립

승인 획득/인허가 획득l EBV T 세포치료제의 임상시험계획

및 임상용의약품 제조 승인

임상시험 진입 l EBV T 세포치료제의 임상시험

구 분 건 수 비 고

학술지 논문 게재 2

산업재산권 등록

기 타 3

-EBV T 세포치료제의 제1상 임상시험 완료

-아데노바이러스 임상1상 완료

-현재까지 진행된 동물에서의 효능과 생산 기반

기술을 활용하여 연구 종료 2년 후 전임상 시험을

완료하여 임상시험을 위한 IND 신청이 완료될 것

으로 예상됨.

5. 연구결과의 활용계획

(1) 연구종료 2년후 예상 연구성과

(2) 연구성과의 활용계획

- 확립된 항체 대량 생산 기반 기술을 활용하여 항체의 대량 생산 및 품질

확인을 통해 표준품 제작, 안정성 시험, 전임상 시험을 수행할 계획임.

- Monkey PK, 독성 시험을 시행하고 항체의 안정성, 제형 등의 데이터를

준비하여 2013년 IND 신청 예정.

- 뇌암과 비소성폐암 동물 모델에서의 약효 평가 기술을 활용하여, 위암, 간

암 등 아시아인에게서 많이 발견되는 암종에 대한 추가 효능 시험을 수

행할 예정임.

- 항체 생산 세포주의 GMP 시설에서 Cell banking (MCB, WCB 제작) 및

세포주 charaterization, Tissue cross-reactivity (human, monkey)

test를 통한 독성 시험에필요한 정보 수집, 임상 protocol 작성, GMP 시

설에서의 임상 시료 생산 등의 추가연구가 필요함.

- 제1상 임상시험 완료 후 유효성을 평가하기 위한 제2상 임상시험 신청 가

능

- 아데노바이러스를 유전자 치료제는 본 과제에서 진행한 독성시험과 특성

분석을 바탕으로 IND filing을 완료하고 간암을 대상으로 임상1상 시험

을 수행 할 예정임

- GMP에서 생산한 아데노바이러스를 이용하여 기존의 치료제와 병합하여

다양한 암종에 adjuvant 치료제로 개발 될 수 있음

-독성시험과 특성분석이 완료된 아데노바이러스의 효능을 높일 수 있는 방

법을 개발하여 다양한 고형암에 적용 할 수 있음

- EBV T 세포치료제의 제1상 임상시험 진입/수행 과정에서 축적된 문서체

계, 인력, 시설/설비, 및 경험을 토대로 새로운 T 세포치료제들의 제1상

임상시험계획승인 신청 가능

- 표준치료가 더 이상 불가능한 암환자들에게 새로운 치료기회를 제공할 수

있을 것으로 기대

6. 참고문헌

1. First brain cancer vaccine launched in Switzerland 11/07/2007 Drug Researcher.com

2. Shareholder Opinions: Primary Brain Cancer 2 July 2007 Datamonitor

3. Nature 2009, Vol. 458, p686: Nature 2009, Vol. 458, p679; Cancer Cell 2009, Vol. 15, p167; Cancer Cell 2009, Vol. 15, p220; Cancer Cell 2009, Vol. 15, p232

기관고유연구사업 최종보고서...의 전임상 및 초기임상 시험을...

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